HUT63461A - Process for producing phky334 plasmid, its ek-bgh expression vector and host cells transformed by it - Google Patents
Process for producing phky334 plasmid, its ek-bgh expression vector and host cells transformed by it Download PDFInfo
- Publication number
- HUT63461A HUT63461A HU9203686A HU9203686A HUT63461A HU T63461 A HUT63461 A HU T63461A HU 9203686 A HU9203686 A HU 9203686A HU 9203686 A HU9203686 A HU 9203686A HU T63461 A HUT63461 A HU T63461A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plasmid
- amíg
- dna
- phky334
- leu
- Prior art date
Links
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 89
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 18
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title abstract description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 55
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 29
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 26
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 17
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 12
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 12
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 12
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 12
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 10
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 10
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 9
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 9
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 9
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 8
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 7
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 7
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 6
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N N-tris(hydroxymethyl)methyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCS(O)(=O)=O JOCBASBOOFNAJA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000007994 TES buffer Substances 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 4
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 101150078341 rop gene Proteins 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 2-cyanoethoxyphosphonamidous acid Chemical compound NP(O)OCCC#N KMEMIMRPZGDOMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- OEDJQRXNDRUGEU-SRVKXCTJSA-N Asp-Leu-His Chemical compound N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)O OEDJQRXNDRUGEU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N Glu-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SRZLHYPAOXBBSB-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- HFPVRZWORNJRRC-UWVGGRQHSA-N Gly-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CN HFPVRZWORNJRRC-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- BPOHQCZZSFBSON-KKUMJFAQSA-N His-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(=O)[C@@H](N)Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O BPOHQCZZSFBSON-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N Ile-Ser-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- PKKMDPNFGULLNQ-AVGNSLFASA-N Leu-Met-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O PKKMDPNFGULLNQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- RATXDYWHIYNZLE-DCAQKATOSA-N Met-Lys-Cys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N RATXDYWHIYNZLE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- HLZORBMOISUNIV-DCAQKATOSA-N Met-Ser-Leu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(C)C HLZORBMOISUNIV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 2
- FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N Ser-Cys Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O FFOKMZOAVHEWET-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 2
- GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N Ser-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CO GZFAWAQTEYDKII-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- SLCSPPCQWUHPPO-JYJNAYRXSA-N Tyr-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 SLCSPPCQWUHPPO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;ethanol Chemical compound CCO.O=C=O OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 2
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 108010066198 glycyl-leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 239000007160 ty medium Substances 0.000 description 2
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GSUFZRURORXYTM-STQMWFEESA-N Arg-Phe-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CC1=CC=CC=C1 GSUFZRURORXYTM-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- QHUOOCKNNURZSL-IHRRRGAJSA-N Arg-Tyr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QHUOOCKNNURZSL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ICDDSTLEMLGSTB-GUBZILKMSA-N Asn-Met-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ICDDSTLEMLGSTB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N Asn-Thr Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)O VBKIFHUVGLOJKT-FKZODXBYSA-N 0.000 description 1
- YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N Asn-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O FRYULLIZUDQONW-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VPSHHQXIWLGVDD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N Asp-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O SVABRQFIHCSNCI-FOHZUACHSA-N 0.000 description 1
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- YWLDTBBUHZJQHW-KKUMJFAQSA-N Asp-Lys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N YWLDTBBUHZJQHW-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- GXHDGYOXPNQCKM-XVSYOHENSA-N Asp-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O GXHDGYOXPNQCKM-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 238000009631 Broth culture Methods 0.000 description 1
- PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N CTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 PCDQPRRSZKQHHS-XVFCMESISA-N 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- CHRCKSPMGYDLIA-SRVKXCTJSA-N Cys-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHRCKSPMGYDLIA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N Glu-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N Glu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N Glu-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RGJKYNUINKGPJN-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- VHPVBPCCWVDGJL-IRIUXVKKSA-N Glu-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O VHPVBPCCWVDGJL-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- BXICSAQLIHFDDL-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Asn Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BXICSAQLIHFDDL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FFALDIDGPLUDKV-ZDLURKLDSA-N Gly-Thr-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FFALDIDGPLUDKV-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- TVYWVSJGSHQWMT-AJNGGQMLSA-N Ile-Leu-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N TVYWVSJGSHQWMT-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O BBIXOODYWPFNDT-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical class CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- DLFAACQHIRSQGG-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DLFAACQHIRSQGG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N Leu-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QVFGXCVIXXBFHO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- FAELBUXXFQLUAX-AJNGGQMLSA-N Leu-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C FAELBUXXFQLUAX-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N KIZIOFNVSOSKJI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- QYOXSYXPHUHOJR-GUBZILKMSA-N Lys-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QYOXSYXPHUHOJR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DUTMKEAPLLUGNO-JYJNAYRXSA-N Lys-Glu-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O DUTMKEAPLLUGNO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N Lys-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YSZNURNVYFUEHC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MGKFCQFVPKOWOL-CIUDSAMLSA-N Lys-Ser-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N MGKFCQFVPKOWOL-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QVTDVTONTRSQMF-WDCWCFNPSA-N Lys-Thr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QVTDVTONTRSQMF-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- NTYQUVLERIHPMU-HRCADAONSA-N Met-Phe-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O)N NTYQUVLERIHPMU-HRCADAONSA-N 0.000 description 1
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N N-alpha-L-glutamyl-L-phenylalanine Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XMBSYZWANAQXEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- YYRCPTVAPLQRNC-ULQDDVLXSA-N Phe-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 YYRCPTVAPLQRNC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- HPECNYCQLSVCHH-BZSNNMDCSA-N Phe-Cys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=CC=C2)C(=O)O)N HPECNYCQLSVCHH-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- ZLGQEBCCANLYRA-RYUDHWBXSA-N Phe-Gly-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZLGQEBCCANLYRA-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N Phe-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- YCCUXNNKXDGMAM-KKUMJFAQSA-N Phe-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YCCUXNNKXDGMAM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- WWPAHTZOWURIMR-ULQDDVLXSA-N Phe-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WWPAHTZOWURIMR-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- JHSRGEODDALISP-XVSYOHENSA-N Phe-Thr-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JHSRGEODDALISP-XVSYOHENSA-N 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920002594 Polyethylene Glycol 8000 Polymers 0.000 description 1
- 239000004353 Polyethylene glycol 8000 Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N Pro-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 NMELOOXSGDRBRU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 1
- DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N Pro-Thr-Gly Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(O)=O DCHQYSOGURGJST-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- XSYJDGIDKRNWFX-SRVKXCTJSA-N Ser-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O XSYJDGIDKRNWFX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FVFUOQIYDPAIJR-XIRDDKMYSA-N Ser-Trp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CO)N FVFUOQIYDPAIJR-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- QNJZOAHSYPXTAB-VEVYYDQMSA-N Thr-Asn-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O QNJZOAHSYPXTAB-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N Thr-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- VGYVVSQFSSKZRJ-OEAJRASXSA-N Thr-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@H](O)C)CC1=CC=CC=C1 VGYVVSQFSSKZRJ-OEAJRASXSA-N 0.000 description 1
- WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N Thr-Tyr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 WCRFXRIWBFRZBR-GGVZMXCHSA-N 0.000 description 1
- BZTSQFWJNJYZSX-JRQIVUDYSA-N Thr-Tyr-Asp Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BZTSQFWJNJYZSX-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- JAWUQFCGNVEDRN-MEYUZBJRSA-N Thr-Tyr-Leu Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N)O JAWUQFCGNVEDRN-MEYUZBJRSA-N 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)=CNC2=C1 LYMVXFSTACVOLP-ZFWWWQNUSA-N 0.000 description 1
- KCPFDGNYAMKZQP-KBPBESRZSA-N Tyr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCPFDGNYAMKZQP-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- OHOVFPKXPZODHS-SJWGOKEGSA-N Tyr-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N OHOVFPKXPZODHS-SJWGOKEGSA-N 0.000 description 1
- QPOUERMDWKKZEG-HJPIBITLSA-N Tyr-Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QPOUERMDWKKZEG-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 229960001456 adenosine triphosphate Drugs 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L disodium;[[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-oxidophosphoryl] hydrogen phosphate;trihydrate Chemical compound O.O.O.[Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP([O-])(=O)OP(O)([O-])=O)C(O)C1O MWEQTWJABOLLOS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011491 glass wool Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229940085678 polyethylene glycol 8000 Drugs 0.000 description 1
- 235000019446 polyethylene glycol 8000 Nutrition 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000005496 tempering Methods 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010060175 trypsinogen activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A pHKY334 PLAZMID, AZ EK-BGH EXPRESSZIÓS VEKTORA, ÉS AZ
EZZEL TRANSZFORMÁLT GAZDASEJTEK cCocvOjut<Ó\ ciktt
ÉLI LILLY AND COMPANY, INDIANAPOLIS, Indiana,
AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK
Feltalálók:
HERSHBERGER Charles Lee, NEW PALESTINE,
LARSON Jeffrey Lynn, INDIANAPOLIS,
Indiana, AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK k
A bejelentés napja: 1992. 11. 2|^.
F ©elsőbbsége: 1991. 11. 27. (07/801,164),
AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK
2Számos prokarióta és eukarióta gén nagy mennyiségben expresszálódik a prokariótákban, például az Escherichia coliban. Általában a klónozott gén transzkripciációja és transzlációja hatásos riboszóma kötőhelyeivel és erős promoterével rendelkező sok-kópiás vektorokat alkalmaznak (Masui, Y., Coleman, J., és Inouye, M. (1983) Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. Inouye, M. (Academic, New York), pp. 15-32; Crowl, R., Seamans, C., Lomedico, P., és McAndrew, S. (1985) Gene 38:31-38). Ugyanakkor ezekkel a vektorokkal a gén-expresszió erőteljesen változik a különböző eukarióta génekre nézve. Kismértékű expressziót tulajdonítottak az E. coli proteázok fehérje degradációjának (Emerick, A. W., Bertolani, B. L., Ben-Bassat, A., White, T. J., és Konrad, M. W. (1984) Bio/Technology 2:165-168), vagy a heterológ génszekvenciákat tartalmazó mRNS-ek hatástalan transzlációs iniciációjának (Ray, Ρ. N., és Pearson, M. L. (1974) J. Mól. Bioi. 85:163-175; Ray, Ρ. N., és Pearson, M. L. (1975) Natúré (London) 253, 647-650; Kelley, R. L., és Yanofsky, C. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79:31203124; Nagai, K., és Thorgesen, H. C. (1984) Natúré (London) 309, 810-812; Varadarajan, R., Szabó, A., és Boxer, S. G. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:5681-5684). Számos tanulmány említette, hogy a transzláció iniciációjának hatásossága a Shine-Dalgarno (SD) szekvencia és a 16S RNS közötti komplementaritás mértékétől, az SD szekvencia és az iniciációs kodon távolságától, valamint ennek az ablakrégiónak a nukleinsav szekvenciájától függ ((Shine, J., és
-3Dalgarno, L. (1975) Natúré (London) 254, 34-38; Gold, L.,
Pribnow, D., Schneider, T., Shineding, S., Singer, B. S., és
| Stormo, | G. | D. | (1981) | Annu. | Rév. | Microbiol. 35.:365-403,- |
| Stromo, | G. | D. | , Schneider, | T. D. , | és Gold, L. M. (1982) | |
| Nucleic | Acids | Rés. 10 | :2971 | -2996; | Kozák, M. (1983) Microbiol. | |
| Rév. 47 | :1- | 45; | Hűi, A. | , Hayflick, | J., Dinkelspiel, K., és | |
| deBoer, | H. | A. | (1984) | EMBO | J. 3:623-629; Shepard, M. G., | |
| Yelverton, | E. | , és Goeddel, | D. V. | (1982) DNA 1:125-131; | ||
| deBoer, | H. | A. | Hűi, A. | , Comstock, | L. J., Wong, E., és Vasser, |
M. (1983) DNS 2:231-235; Whitehorn, E. A., Livak, K. J., és Petteway, S. R., Jr. (1985) Gene 36:375-379). Egyértelmű, hogy a transzláció hatékonysága az mRNS 5'-le-nem-fordított területének külső SD szekvenciájától, és a fehérje kódoló terület 5'-végének szekvenciájától is függ (Stanssens, P., Remaut, E., és Fiers, W. (1985) Gene 36:211-223; Roberts, T. M., Kacich, R., és Ptashne, M. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76:760-764É Gold, L., Stormo, G., és Saunders, R. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81:7061-7065), illetve az mRNS 3'-le-nem-fordított területétől.
Ezeknek a megfigyeléseknek az összehangolása céljából a transzláció gátlását javasolták a helyi másodlagos szerkezet SD szekvenciát tartalmazó területeivel, és/vagy az AUG start kodonnal, úgy, hogy a riboszómák ne tudják iniciálni a transzlációt (Gheysen, D., Iserentant, D., és Fiers, W. (1980) Gene 9:1-12; Schwartz, M., Roa, M. , és Debarbouille, M. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:2937-2941; Hall, Μ. N., Gabay, J., Debarbouille, M. , és Schwartz, M. (1982) Natúré (London) 295, 616-618; Das, A., Urbanowsky, J.,
-4Weissbach, H., Nestor, J., és Yanofsky, C. (1983) Proc .
Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:2879-2883; Berkhout, B., és van Dilin, J. (1985) Nucleic Acids Rés. 13:6955-6967) . Az ilyen másodlagos szerkezetek képződésével indokolhatjuk a metionil szarvasmarha növekedési hormon (Met-bGH) expresszió gyengülését annak nagy mennyiségű natív kodonjával (George, H. J., L'Italien, J. J., Pilacinski, W. P., Glassman, D. L., és .Krzyzek, R. A. (1985) DNS 4:273-281; Seeburg, Ρ. H., Sias, S., Adelman, J., deBoer, H. A., Hayflick, J., Jhurani, P., Goeddel, D. V., és Heynecker, H. L. (1983) DNS 2:37-45). Ennek az alapvető problémának a megoldására Seeburg és társai a szarvasmarha növekedési hormon (bGH) gén 5'-végén néhány bázis kicserélését tervezték, így az expresszált humán növekedési hormon (hGH) gén 5'-végéhez hasonló szekvenciát hoztak létre. Hasonlóképpen George és társai a bGH génben 13 kodon kicserélése után nagy mértékű expresszióról számoltak be (az összes sejtfehérje 15 %-a). Ezeket a közelítéseket a fehérjék aminosav szekvenciája megvédésének igénye korlátozza. A policisztronikus expressziós rendszereket úgy hozták létre, hogy a fenti korlátok elkerülhetők legyenmek.
A policisztronikus expressziós rendszerek előnyei közé tartozik egy promoter, mely a policisztronikus mRNS expresszióját irányítja, egy, vagy több riboszóma kötőhely, az egyes cisztronok transzlációs iniciációs kodonjai, és az egyes cisztronok transzlációs terminációs kodonjai. A szőbanforgó polipeptid termékek expressziós szintje függ a promoter hosszától, a policisztronikus üzenet riboszóma
-5kötőhelyeinek hatékonyságától, és a transzlációs iniciációs helyeknek a riboszóma kötőhelyekhez képest helyes elhelyezkedésétől.
A policisztronikus expressziós rendszerek létrehozása ellenére mind a szarvasmarha növekedési hormon, és származékai, mint például az EK-BGH (Met-Phe-Pro-Leu-(Asp)4-Leu-BGH, problémás marad. Összevetve a fenti problémákat, ezek elsősorban az expressziós vektorok szerkezeti labilitásából adódnak. A rekombináns DNS expressziós vektorok szerkezeti labilitása DNS deléciókat és átrendeződéseket eredményez, ami megváltoztatja a vektor szerkezetét. Ez jelentős probléma az említett expressziós vektorok által kódolt polipeptideket termelő nagy méretű tenyészetek esetén. Ezeket a vektorokat a kódolt polipeptidek expressziéját megakadályozó utakon módosíthatjuk. így amikor a tenyészetekben a polipeptidek expresszióját indukáljuk, a polipeptid expresszió hiánya irányában jelentkező negatív szelektív nyomás gyakran eredményezi a módosított expressziós vektorok akkumulációj át.
A fentiek alapján a szabályozó kirendeltségek, például a Food and Drog Administration az orvosi, vagy mezőgazdasági alkalmazásban levő polipeptid termékek termelésében alkalmazott rekombináns DNS expressziós vektorok teljes jellemzését követelik meg. Egyértelműen igazolni kell, hogy a rekombináns expressziós vektor a fermentáció végén azonos az inokulumban levő expressziós vektorral.
-6Ezt az expressziós vektor szerkezeti, és méret szerinti analízisével, valamint a kívánt terméket, és az ezt kódoló szekvenciát körülvevő területet, különösképpen a fontos funkciókat - így például a promotert -körülvevő régiók nukleotid szekvenciájának igazolásával bizonyíthatjuk.
A működőképesen kapcsolt gén transzkripciójához Escherichia coli bakteriofágot alkalmazó rekombináns DNS vektorok a szerkezeti labilitás következtében gyakran válnak problémássá. Ezeknek a vektoroknak a szerkezete a fermentációs eljárás végére sok esetben módosul. A jelen találmány fontos szempontja egy stabil expressziós vektor létrehozása, valamint az EK-BGH transzkriptum szabályozható transzkripciójának biztosítása.
A jelen találmány egy expressziós vektort nyújt az EKBGH termeléséhez, mely stabil, jól szabályozott, és magas színtű EK-BGH termelést tesz lehetővé. így a jelen találmány jelentős előnyt nyújt az EK-BGH, és a kapcsolódó polipeptidek termelése területén.
AZ ÁBRÁK RÖVID ISMERTETÉSE
A mellékelt ábrák nem méretarányosak.
Az 1. ábra a pCZR125 plazmid restrikciós helyét, és funkciós térképét mutatja be.
A 2. ábra a pHPR91 plazmid restrikciós helyét, és funkciós térképét mutatja be.
A 3. ábra a pHPR97 plazmid restrikciós helyét, és
-7funkciós térképét mutatja be.
A 4. ábra a pHKY334 plazmid restrikciós helyét, és funkciós térképét mutatja be.
A jelen találmány szerinti rekombináns DNS expressziós vektort pHKY334-ként jelöltük. A pHKY334 plazmid restrikciós helyét, és funkciós térképét a 4. ábrán mutatjuk be. A pHKY334 plazmid két cisztronból álló expressziós rendszert mutat be, melyet egy lambda pL promoter, egy szelektálható markerként működő tetraciklin rezisztencia gén, egy a pHKY334 plazmidból származó replikációs origin, és egy rop gén vezet, mely a replikációs originból származó pBR322-t tartalmazó vektorok plazmidjainak másolását ellenőrzi.
A pBR322 plazmid, és a pLUO plazmid öszehasonlítása, melyet a 4.874.703 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás - melyet 1989. október 17-én jegyeztek be - ismertet, számos általános szerkezeti vonást mutat be. a pLUO plazmid a szarvasmarha növekedési hormon analóg egyik expressziós vektora, melyet EK-BGH-nek neveztek el. A pCZR125 plazmid restrikciós helyét, és funkciós térképét az 1. ábrán mutatjuk be. A pCZR125 plazmid, és a pHKY334 plazmid közötti általános szerkezeti vonások ellenére szükséges volt a pCZR125 plazmidot egy bakteriosztatikus, vagy baktericid koncentrációjú antibiotikum jelenlétében az EK-BGH expresszió indukálásakor megakadályozni a struktúrális deléciókat tartalmazó, és így az EK-BGH expressziót megszűntető plazmidok akkumulációját. A pCZR125 plazmid szerkezeti labilitása miatt bakteriosztatikus, vagy
-8bakterícid koncentrációjú antibiotikumok hozzáadása volt szükséges akkor, amikor az EK-BGH termelést indukáltuk. Ezzel szemben a pHKY334 plazmid stabil az EK-BGH expresszió indukálása során, és így nem igényel további antitesteket a hiányzó, vagy hibás plazmidok jelenlétének kizárásához, melyek megakadályozzák az EK-BGH további termelését.
A pHKY334 plazmid fokozott stabilitása részben az EKBGH transzkripció irányítására alkalmazott lambda pL prromoter fág módosulásainak tulajdonítható. A lambda pL prromotert a 3. példa B. fejezetében bemutatásra kerülő EKBGH szintézis során az expresszió irányítására alkalmazzuk. A lambda pL promoter szintézise a lambda pL promoterrel idegen 5'DNS szekvenciák kizárásához szükséges. A lambda pL promoterrel idegen 51 DNS szekvenciák jelenléte részben hozzájárult a plazmidok, így például a pLUO plazmid, és a pCZR125 plazmid labilitásához. A pLUO plazmidban, és a pCZR125 plazmidban jelenlevő, de a pHKY334 plazmidból eltávolított idegen DNS szekvencia a pBR322 plazmidból klónozott tetraciklin rezisztencia gén restrikciós fragmentumának invert megismétlése volt. Ezt a promotert p97-ként jelöltük a mellékelt ábrán.
A pHKY334 plazmidban alkalmazott tetraciklin rezisztencia gén a pBR322 plazmidból származott, mint szelketálható marker. A tetraciklin rezisztencia gént a mellékelt ábrákon mint tét R, vagy tét jelöltük. A pHKY334 plazmidban alkalmazott replikációs origint a mellékelt ábrákon mint őri, vagy origin jelöltük. A pHKY334 plazmid két rop gént tartalmazott, melyeket a pPR12 plazmidból
-9állítottunk elő, amit a 4.436.815 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás ismertet, melyet 1984. március 13-án jegyeztek be. A rop gén a replikációs originből származó pBR322-t tartalmazó plazmidokban a plazmidmásolatok számát ellenőrzi. A pHKY334 plazmidnak megközelítőleg 15-30 másolata van sejtenként. A rop gént a mellékelt ábrákon mint rop jelöltük. Az itt bemutatott vektorok mindegyikében a hőérzékeny cI857 lambda-pL represzort alkalmaztuk, melyet a mellékelt ábrákon mint CI857 jelöltük.
Számos gazdasejt alkalmazható a pHKY334 plazmid esetén. A pHKY334 plazmid legelőnyösebb gazdasejtje az E. coli K12 RV308. Az E. coli K12 RV308 NRLL B-15624 számon az alábbi helyről szerezhető be: Northern Régiónál Research Laboratory, Peoria, Illinois. Az E. coli MM294 (ATCC 31446), az E. coli C600 RM, mely C660-ként is ismert (ATCC 33525), és az E. coli JM109 (ATCC 53323) szintén megfelelő gazdasejt.
Az alábbi példákban bemutatásra kerülő restrikciós endonukleázokat, és a T4 DNS ligázt, melyeket a DNS fragmentumok manipulálása során alkalmaztunk, az alábbi helyekről szereztük be: Boehringer Mannheim Biochemicals, P. O. Box 50414, Indianapolis, Indiana 46250, vagy New England Biolabs, 32 Tozer Road, Beverly, Massachusetts 01915-5510. Amennyiben másképpen nem jelöltük, a reagensek vagy a Boehringer Mannheim-tői, vagy a New England Biolabs-tól származtak, a jelen találmány céljaira ekvivalensnek, és egymással helyettesíthetőek voltak.
-10Az alábbi példák korlátozások nélkül szemléltetik a jelen találmányt.
1. példa
A PCZR125 plazmid létrehozása
A. A pLUO 5.8 kb méretű Xbal-BamHI restrikciós fragmentumának létrehozása
A pLUO plazmidot a 4.874.703 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertették, melyet 1989. október 17-én jegyeztek be. A 4.874.703 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírást itt teljes egészében referenciaként említjük meg.
A pLUO plazmidból 25 gg mennyiséget teljes mértékben feltártunk 15 μΐ (150 egység) Xbal 500 μΐ reakciótérfogatú elegyével, mely 60 mM Tris-HCl-t (pH 7.5), 10 mM MgC^-t, 100 mM NaCl-t, és 1 mM β-merkapto-etanolt tartalmazott. A Trisz Trisz-[hidroximetil]-amino-metán volt. Az elegyet 37°C-on egy órát inkubáltuk. A feltárt DNS-t kétszer extraháltuk fenol-kloroform (50:50) eleggyel, majd a vizes fázist visszanyertük. A vizes fázisból a DNS-t 2.5 térfogatnyi abszolút etanol, és 0.1 térfogatnyi 3.0 M nátrium-acetát hozzáadásával nyertük vissza. A DNS-t centrifugálással összegyűjtöttük, és 50 μΐ vízben feloldottuk.
-11A fenti DNS-t BamHI alkalmazásával, az alábbi eljárás szerint, részlegesen feltártuk. 50 μΐ Xbal-el feltárt DNS-t elegyítettünk 0.2 μΐ (2 egység) BamHI 150 μΐ reakciótérfogatú elegyével, mely 10 mM Tris-HCl-t (pH 7.8), 7 mM MgCl2-t, 150 mM NaCl-t, és 6 mM β-merkapto-etanolt tartalmazott. Az elegyet 37°C-on öt percig inkubáltuk. Az anyagot a fenti eljárás szerint megtisztítottuk, a mintát visszanyertük, és 150 μΐ TE-ben (10 mM Trisz-HCl (pH 7.4), és 1 mM etilén-diamin-tetraecetsav [EDTA]) felszuszpendáltuk. A mintához 5 μΐ futtató puffért (25 % v/v glicerol, 0.05 % w/v brómfenol-kék, és 0.5 % w/v xiléncianol) adtunk, és a feltárt DNS-t 1 %-os agaróz gélen gélelektroforézissel frakcionáltuk, Maniatis és társai eljárása szerint (Maniatis és társai, 1982, Molecular Cloning; Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., pl50-172). Az agaróz gélt hígított etidium-bromidal festettük meg, és a megközelítőleg
5.8 kb méretű Xbal-BamHI restrikciós fragmentumokat 300 nmes UV fénnyel tettük láthatóvá. A gélnek a restrikciós fragmentumot tartalmazó részét megtartottuk. A DNS-t a gél darabokra vágásával, fenol-kloroform (50:50) eleggyel történő kétszeri extrahálásával, és a DNS etanolos kicsapásával tisztítottuk, lásd fent.
B. Az Xbal-Ndel linker létrehozása
Az alábbi komplementer DNS szegmenst automata DNS • ·
-12szintetizátoron (Applied Biosystems 380B) szintetizáltuk meg, a β-cianoetil-foszforamidit kémia szerint:
' -CTAGAGGGTATTAATAATGTATATTGATTTTAATAAGGA
GGAATAATCA-3' (SEQ ID NO: 1)
5'-TATGATTATTCCTCCTTATTAAAATCAATATACATTATT
AATACCCT-3' (SEQ ID NO: 2).
Ezt az egyszálú DNS szegmenst általánosan ismert módon tisztítottuk meg, és vízben felszuszpendáltuk.
Az egyszálú DNS szegmensből 5 μΐ-t elegyítettünk, és 70°C-ra felmelegítettünk. Ezután az elegyet szobahőmérsékletűre hűtöttük, és temperálódul hagytuk a DNS szegmenseket.
A temperálódott DNS szegmenseket 1 μΐ (10 egység) T4 polinukleotid kinázzal kezeltük, 70 mM Trisz-HCl (pH 7.6), 0.1 M KC1, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, és 0.2 mM adenin-5'trifoszfát elegyében, 20 μΐ reakciótérfogatban. Az elegyet 37°C-on 30 percig inkubáltuk. Ezután az elegyet 70°C-on öt percig inkubáltuk, majd szobahőmérsékletre hűtöttük.
C. Szintetikus EK-BGH gén előállítása
Az EK-BGH gént kódoló DNS fragmentumot az l.B. példa eljárása szerint szintetizáltuk. Az EK-BGH-t kódoló gént az egyszálú DNS 16 kémiaialg szintetizált darabjából hoztuk • ·
-13létre, melyek hossza 71-83 nukleotid között volt, és amelyek a temperálódás után az EK-BGH gén összes komplementer szálát tartalmazták. A szintetikus EK-BGH gén szekvenciája az alábbi:
' -TATGTTCCCATTGGATGATGATGATAAGTTCCCAGCCATGTCCTT
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I l.l I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ACAAGGGTAACCTACTACTACTATTCAAGGGTCGGTACAGGAA
GTCCGGCCTGTTTGCCAACGCTGTGCTCCGGGCTCAGCACCTGCATCAGCTGGCTGCTGA
I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I CAGGCCGGACAAACGGTTGCGACACGAGGCCCGAGTCGTGGACGTAGTCGACCGACGACT
CACCTTCAAAGAGTTTGAGCGCACCTACATCCCGGAGGGACAGAGATACTCCATCCAGAA
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I GTGGAAGTTTCTCAAACTCGCGTGGATGTAGGGCCTCCCTGTCTCTATGAGGTAGGTCTT
CACCCAGGTTGCCTTCTGCTTCTCTGAAACCATCCCGGCCCCCACGGGCAAGAATGAGGC
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I GTGGGTCCAACGGAAGACGAAGAGACTTTGGTAGGGCCGGGGGTGCCCGTTCTTACTCCG
CCAGCAGAAATCAGACTTGGAGCTGCTTCGCATCTCACTGCTCCTCATCCAGTCGTGGCT I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I
GGTCGTCTTTAGTCTGAACCTCGACGAAGCGTAGAGTGACGAGGAGTAGGTCAGCACCGA
TGGGCCCCTGCAGTTCCTCAGCAGAGTCTTCACCAACAGCTTGGTGTTTGGCACCTCGGA
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I ACCCGGGGACGTCAAGGAGTCGTCTCAGAAGTGGTTGTCGAACCACAAACCGTGGAGCCT
CCGTGTCTATGAGAAGCTGAAGGACCTGGAGGAAGGCATCCTGGCCCTGATGCGGGAGCT
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I GGCACAGATACTCTTCGACTTCCTGGACCTCCTTCCGTAGGACCGGGACTACGCCCTCGA
GGAAGATGGCACCCCCCGGGCTGGGCAGATCCTCAAGCAGACCTATGACAAATTTGACAC
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I H CCTTCTACCGTGGGGGGCCCGACCCGTCTAGGAGTTCGTCTGGATACTGTTTAAACTGTG
AAACATGCGCAGTGACGACGCGCTGCTCAAGAACTACGGTCTGCTCTCCTGCTTCCGGAA
I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I TTTGTACGCGTCACTGCTGCGCGACGAGTTCTTGATGCCAGACGAGAGGACGAAGGCCTT
GGACCTGCATAAGACGGAGACGTACCTGAGGGTCATGAAGTGCCGCCGCTTCGGGGAGGC
I I I I I I I I I l 'l I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I l 'l I I I I I I I I I I I CCTGGACGTATTCTGCCTCTGCATGGACTCCCAGTACTTCACGGCGGCGAAGCCCCTCCG
CAGCTGTGCCTTCTAG-3'
I I I I I I I I I I I I I I I I
GTCGACACGGAAGATCCTAG-51.
-14A szintetikus EK-BGH gén kódoló szálát mint SEQ ID NO: 3 mutatjuk be.
D. DNS ligálás
Az l.A. példa eljárása szerint előállított pLUO restrikciós fragmentumból 2 μΐ-t (0.2 pg), az l.B. példa eljárása szerint előállított DNS fragmentumból 2 μΐ-t (8.75 pmol), és az l.C. példa eljárása szerint előállított DNS fragmentumból 2 μΐ-t (0.1 μg') 1 μΐ (10 egység) T4 DNS ligázzal, 50 mM Trisz-HCl-el (pH 7.6), 10 mM MgCl2-vel, 1 mM ditioeritrollal, 1 mM adenozin-5'-trifoszfáttal, és 5 % (w/v) polietilén-glikol-8000-el, összesen 10 μΐ reakciótérfogatban ligáltunk a pCZR125 plazmid létrehozása céljából. A pCZR125 plazmid restrikciós helyét, és funkciós térképét az 1. ábrán mutatjuk be. Az elegyet 16°C-on 16 órán keresztül inkubáltuk. Az így kapott elegy egy részét használtuk fel az Escherichia coli sejtek transzformálására, lásd lent.
E. A transzformálás eljárása
Az Escherichia coli K12 RV308 sejteket NRRL B-15624 számon az alábbi helyről szereztük be: Northern Régiónál Research Laboratory, Peoria, Illinois. Az E. coli K12 RV308 sejtek tenyészetéből 50 ml-t L-broth (10 g tripton, 10 g • 4
-15NaCl, és 5 g élesztő extraktum per liter víz) táptalajon O.D.j-go~en θ·5 abszorbancia egység értékig tenyésztettük. A tenyészetet jégen 10 percig hűtöttük, majd a sejteket centrifugálissal összegyűjtöttük. A sejt pelletet 25 ml hideg oldatban (50 ml CaC^^O mM Trisz-HCl; pH 8.0) szuszpendáltuk, és 15 percig jégen inkubáltuk. A sejteket centrifugálással összegyűjtöttük, a sejt pelletet 2.5 ml hideg oldatban (50 ml CaC^ílO mM Trisz-HCl; pH 8.0) szuszpendáltuk, és a mintát 4°C-on 16 órán keresztül tartottuk.
Ebből a sejtszuszpenzióból 200 μΐ-t a fenti DNS készítmény 50 μΐ-ével elegyítettünk, és jégen 60 percig inkubáltunk. Az elegyet 32°C-on 45 percig inkubáltuk, majd 2 percre jégbe helyeztük. Öt ml TY tápközeget (1 % tripton, 0.5 % élesztő extraktum, és 1 % nátrium-klorid) adtunk az elegyhez, és 32°C-on további két órán keresztül inkubáltuk. Ennek a tenyészetnek 100 μΐ mennyiségét TY agar lemezekre (1 % tripton, 0.5 % élesztő extraktum, 1 % nátrium-klorid, és
1.5 % agar, pH 7.4) oltottuk, melyek 5 μg/ml tetraciklint tartalmaztak. A lemezeket 16 órán keresztül 32°C-on inkubáltuk. A tetraciklin rezisztens tenyészeteket egyenként kiválasztottuk, és 2 ml TY tápközegre inokuláltuk. A tenyészeteket 37°C-on 16 órán keresztül inkubáltuk, levegőztetés mellett.
F· A DNS izolálási eljárás
A transzformánsok tenyészetéből a plazmid DNS-t az alábbiak szerint izoláltuk. Amennyiben másképpen nem jeleztük, az alábbi eljárás minden lépését környezeti hőmérsékleten hajtottuk végre. Az egyes tenyészetekből 1.5 ml-t mikrocentrifuga csövekbe vittünk. A sejteket centrifugálással gyűjtöttük össze. Ά felülúszót fine-tip pipettával eltávolítottuk, és a sejt pelletet 100 μΐ térfogatú, 50 mM glükózt, 10 mM EDTA-t, és 25 mM Trisz-HCl-t (pH 8.0) tartalmazó oldatban felszuszpenzáltuk. Szobahőmérsékleten 5 percig inkubáltuk, majd 200 μΐ alkalikus nátrium-dodecil-szulfát (SDS) oldatot (0.2 N NaOH, 1 % SDS) adtunk hozzá. Az elegyet enyhe rázás után öt percig jégen tartottuk. Ezután 150 μΐ kálium-acetát oldatot készítettünk (11.5 ml jégecetsav, és 28.5 ml víz 60 ml 5 M kálium-acetáthoz). A keletkező oldatot (mely a káliumra nézve 3 M-os, és az acetátra nézve 5 M-os volt) enyhe rázás mellett a mintát tartalmazó csőhöz adtuk. A mintát öt percig jégen tartottuk, majd 10 percig centrifugáltuk. A felülúszót egy másik centrifuga csőbe vittük át. Azonos térfogatú fenolt (0.1 M Trisz-szel telítve; pH 8.0) adtunk hozzá. A mintát elegyítettük, és 5 percig centrifugáltuk. A felülúszót összegyűjtöttük, és a fenolos extrakciót megismételtük. A felülúszóhoz 1 ml jéghideg abszolút etanolt adtunk. A mintát elegyítettük, és szárazjégen tartottuk,
-17ί • * ·»· • · · « · a · · amíg erősen viszkózussá vált, de meg nem fagyott. A DNS-t öt perces centrifugálással gyűjtöttük össze. A felülúszót leszívással eltávolítottuk, és a DNS pellethez 500 μΐ 70 %os etanolt adtunk. A mintát a pelletek mosása céljából enyhén ráztuk, és két percig centrfugáltuk. A felülúszót eltávolítottuk, és a DNS pelletet vákumban megszárítottuk. A DNS-t 50 μΐ TE (10 mM Trisz-HCl (pH 8.0) és 1 mM EDTA) oldatban feloldottuk, és 4°C-on tároltuk.
G. Nagy mennyiségű DNS izolálása
A nagy mennyiségű pCZR125 plazmid DNS izolálását az alábbiak szerint végeztük el. Egy liter mennyiségű, 5 Mg/ml tetraciklint tartalmazó L-broth táptalajt inokuláltunk az Escherichia coli RV308/pCZR125 tenyészettel. A tenyészet 32°C-on 16 órán keresztül növekedett. A tenyészetet GSA rotorban (Sorvall) 6000 rpm mellett, 4°C-on 5 percig centrifugáltuk. A keletkező felülúszót elöntöttük, és a sejt pelletet 40 ml TES pufferben (10 mM Trisz-HCl (pH 7.5), 10 mM HC1, és 1 mM EDTA) mostuk, majd centrifugálással összegyűjtöttük. A felülúszót elöntöttük, és a sejt pelletet szárazjég-etanol fürdőben megfagyasztottuk, majd felolvasztottuk. A felolvasztott sejt pelletet 10 ml mennyiségű, 25 % szukrózt és 50 mM EDTA-t tartalmazó oldatban felszuszpendáltuk. Az oldathoz 1 ml 5 mg/ml lizozim oldatot, 3 ml 0.25 M EDTA-t (pH 8.0), és 100 μΐ 10 mg/ml forralt RNS-áz A-t (beszerezhető az alábbi helyről: Sigma
-18: .·' • » 4 · « ♦ ·*· 4 « ··
Chemical Co., P.O. Box 14508, St. Louis, Mo.) adtunk, majd 15 percig jégen inkubáltuk. A lizozimmal kezelt sejtekhez 3 ml lizáló oldatot adtunk (3 ml 10 %-os Triton X-100, 75 ml 0.25 M EDTA (pH 8.0), 15 ml Trisz-HCl (pH 8.0), és 7 ml ^O), az oldatot elegyítettük, és az így kapott elegyet további 15 percig jégen inkubáltuk. A lizált sejteket szárazjég-etanol fürdőben megfagyasztottuk, majd felolvasztottuk.
A sejttörmeléket az elegyből 25.000 rpm melletti, 40 perces centrifugálással, SW28.1 rotor alkalmazásával (Beckman, Scientific Instrument Division, Campus Drive at Jamboree Blvd., Irvine, CA 92713), és puffereit fenolos extrakcióval eltávolítottuk. A sejt extraktumhoz körülbelül 30.44 g CsCl-t és megközelítőleg 1 ml 5 mg/ml etidiumbromidot adtunk, majd a térfogatot TES pufferrel (10 mM Trisz-HCl (pH 7.5), 10 mM HC1, és 1 mM EDTA) 40 ml-re egészítettük ki. Az elegyet VTÍ50 ultracentrifuga csőbe (Beckman) dekantáltuk, lezártuk azt, és VTÍ50 rotorban 42.000 rpm mellett 16 órát centrifugáltuk. Az így kapott, ultraviola fénnyel láthatóvá tett plazmid sávokat izoláltuk, és Ti75 csőben, és rotorban (Beckman) 50.000 rpm mellett 16 órát centrifugáltuk. A szükséges térfogat beállítást 0.761 g/ml CsCl-t tartalmazó TES pufferrel végeztük el. A plazmid sávokat ismét izoláltuk, az etidium-bromid eltávolítása céljából sóval telített 2-propanollal extraháltuk, és TES pufferrel 1:3 arányban hígítottuk. Egy térfogatnyi nátriumacetátot és két térfogatnyi abszolút etanolt adtunk az oldathoz, majd -20°C-on 16 órát inkubáltuk. A plazmid DNS-t : .·· • « *·♦ <··· · • *·
-1910.000 rpm melletti, 15 perces centrifugálással, SS34 rotor (Sorvall) alkalmazásával pelletizáltuk. Az így kapott plazmid DNS-t TE pufferben szuszpendáltuk, és -20°C-on tároltuk.
2. példa
A pHPR91 létrehozása
A. A pCZR125 1876 bázispárből álló EcoRI-Scal restrikciós fragmentumának létrehozása
A pCZR125 plazmidból 10 ^g-ot 30 egység EcoRI 100 μΐ teljes rekciótérfogatú elegyével, mely 100 ^g/ml BSA-t (szarvasmarha szérum albumin), 50 mM Trisz-HCl-t (pH 8.0), 10 mM MgCl2~t, és 100 mM NaCl-t tartalmazott, 37°C-on egy óra alatt teljesen feltártunk. Ezután a mintát 70°C-on 10 percig inkubáltuk az inaktív EcoRI eltávolítása céljából.
Az EcoRI-el feltárt plazmidot DNS polimeráz I alkalmazásával (Klenow Fragment) az alábbi eljárással tettük tompa-végűvé (blunt-ended). A fenti reakcióelegy 25 μΐ-ét 50 μΐ-re állítottuk be, úgy hogy az 250 μΐ dATP-t (dezoxiadenozin-5'-trifoszfát), 250 μΐ dCTP-t (dezoxi-citozin-5'trifoszfát), 250 μΐ dGTP-t (dezoxi-guanadin-5'-trifoszfát), 250 μΐ dTTP-t (dezoxi-timidin-5'-trifoszfát), 50 mM TriszHCl-t (pH 7.8), 10 mM MgCl2-t, 10 mM β-merkapto-etanolt, és 5 egység DNS polimeráz I-et (Klenow Fragment) tartalmazott.
• ·
-20A mintát 37°C-on 30 percig, az egyszálú restrikciós fragment kinyúlás komplementer szintézisének befejezéséig inkubáltuk. Ezután a reakcióelegyet 70°C-on 15 percig inkubáltuk a Klenow fragment inaktiválása céljából.
Az EcoRI-el feltárt, Klenow fragmenttel kezelt pCZR125 plazmid DNS-t ezután Scal alkalmazásával, 37°C-on történő egy órás inkubálással, 150 μΐ reakciótérfogatban, mely 50 mM Trisz-HCl-t (pH 7.8), 10 mM MgC^-t, 100 mM NaCl-t, 100 μg/ml BSA-t, és 18 egység Scal-t tartalmazott, teljesen feltártuk. A Scal-t ezután a minta 70°C-on történő 15 perces inkubálásával inaktiváltuk.
B. A pBR12 5051 bázispárból álló Aval restrikciós fragmentumának létrehozása
A pBR12 plazmidot a 4.436.815 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertették, melyet 1984. március 13-án jegyeztek be, és melyet itt teljes egészében referenciaként említünk meg.
A pBR12 plazmidból 10 μg mennyiséget teljes mértékben feltártunk 30 egység Aval 500 μΐ reakciótérfogatú elegyével, mely 100 gg/ml BSA-t, 50 mM Tris-HCl-t (pH 8.0), 10 mM MgCl2-t, és 50 mM NaCl-t tartalmazott. Az elegyet 37°C-on egy órát inkubáltuk. Az elegyet ezután 70°C-on 15 percig inkubáltuk a Aval inaktiválása céljából.
Az Aval-el feltárt pBR12 plazmid mintát az alábbi eljárással tettük tompa-végűvé (blunt-ended). A fenti
-21reakcióelegy 25 μΐ-ét 50 μΐ-re állítottuk be, úgy hogy az
250 μΐ dATP-t (dezoxi-adenozin-51-trifoszfát), 250 μΐ dCTP-t (dezoxi-citozin-51-trifoszfát) , 250 μΐ dGTP-t (dezoxiguanadin-5'-trifoszfát), 250 μΐ dTTP-t (dezoxi-timidin-5'trifoszfát), 50 mM Trisz-HCl-t (pH 7.8), 10 mM MgC^-t, 10 mM β-merkapto-etanolt, és 5 egység DNS polimeráz I-et (Klenow Fragment) tartalmazott. A mintát 37°C-on 30 percig, az egyszálú restrikciós fragment kinyúlás komplementer szintézisének befejezéséig inkubáltuk. Ezután a reakcióelegyet 70°C-on 15 percig inkubáltuk a Klenow fragment inaktiválása céljából.
C. A pHPR91 végső összeillesztése
A 2.A., és a 2.B. példa eljárása szerint előállított DNS mintákat az 1. példa eljárása szerint megtisztítottuk, és etanollal kicsaptuk. A DNS-t centrifugálással visszanyertük, megszárítottuk, és 10 μΐ vízben felszuszpendáltuk. A DNS fragmenteket ezután 4°C-on, egy éjszaka alatt, 40 μΐ reakciótérfogatban, mely 50 mM Tris-HCl-t (pH 7.8), 10 mM MgCl2-t, 5 mM DTT-t (ditioeritrol), 5 % glicerolt, 0.2 mM adenozin-51-trifoszfátot, és 40 egység DNS ligázt tartalmazott, ligáltuk.
A ligáló elegy egy részét alkalmaztuk az Escherichia coli K12 MM294 sejteknek az l.E. példa eljárása szerint történő transzformálására. Az E. coli K12 MM294 sejteket ATCC 31446 számon az alábbi helyről szereztük be: American
-22Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852. A transzformáns sejteket 10 gg/ml tetraciklint tartalmazó Lagaron szelektáltuk. Az egyes tenyészeteket kiszúrtuk, és 10 ^g/ml tetraciklint tartalmazó L-húsleves táptalajon tenyésztettük. A kívánt pHPR91 plazmidot tartalmazó tetraciklin rezisztens transzformánsokat restrikciós enzimes analízist alkalmazó plazmid tisztítási eljárás után azonosítottuk. A pHPR91 plazmid Pvul-el történő feltárása egy 1450 bázispárból álló fragmentet eredményezett. A pHPR91 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 2. ábrán mutatjuk be.
3. példa
A pHPR97 plazmid megszerkesztése
A. Az EcoRI-BqlII-el feltárt PCZR125 plazmid létrehozása
A pCZR125 plazmid DNS-ből 10 μ$ mennyiséget teljes mértékben feltártunk 5 μΐ (55 egység) EcoRI és 5 μΐ (55 egység) BgLII 60 μΐ reakciótérfogatú elegyével, mely 10 mM Tris-HCl-t (pH 7.5), 10 mM MgC^-t, 100 mM NaCl-t, és 10 mM merkapto-etanolt tartalmazott. Az elegyet 37°C-on két órát inkubáltuk. A feltárt DNS-t megtisztítottuk, és a 6.0 kb méretű fragmentet az l.A. példa eljárása szerint preparatív agaróz gélelektroforézissel izoláltuk.
-23Β. Transzkripcionális aktiváló DNS szekvencia létrehozása
A transzkripcionális aktiváló DNS szekvenciát az alábbi egyszálú DNS szekvencia szintézisével hoztuk létre:
(SEQ ID NO: 5)
5'-AATTCGATCTCTCACCTACCAAACAATGCCCCCCTGCAAA
AAATAAATTCATATAAAAAACATACAGATAACCATCTGCG gtgataaattatctctggcggtgttgacataaataccact GGCGGTGATACTGAGCACATCA-31 (SEQ ID NO: 6)
Ezeket az egyszálú DNS szegmenseket egy automata DNS.· szintetizátoron (Applied Biosystems 380B) szintetizáltuk meg, a β-cianoetil-foszforamidit kémia szerint. A szintetikus DNS szegmenseket megtisztítottuk, és TE pufferben 0°C-on tároltuk.
Az egyszálú DNS szegmensből 10 /xl-t elegyítettünk, és 70°C-on 5 percig melegítettünk. Ezután az elegyet szobahőmérsékletűre hútöttük, és 30 percig temperálódni
-24hagytuk a DNS szegmenseket.
A temperálódott DNS szegmenseket 1 μΐ (10 egység) T4 polinukleotid kinázzal kezeltük, 70 mM Trisz-HCl (pH 7.6), 0.1 M KC1, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, és 0.2 mM adenin-5'trifoszfát elegyében, 20 μΐ reakciótérfogatban. Az elegyet 37°C-on 30 percig inkubáltuk. Ezután az elegyet 70°C-on öt percig inkubáltuk, majd szobahőmérsékletre hűtöttük.
C. A pHPR97 végső összeillesztése
A 3.A. példa eljárása szerint előállított restrikciós fragment 2 /ig mennyiségét, és a 3.B. példa eljárása szerint előállított kinázzal kezelt DNS fragment 1 ^g mennyiségét az l.D példa eljárása szerint ligáltuk, azzal az eltéréssel, hogy az elegyet szobahőmérsékleten 1 órát inkubáltuk, 5 percre 70°C-ra melegítettük, majd szobahőmérsékletre hűtöttük. A ligáit DNS egy részét alkalmaztuk az Escherichia coli K12 MM294 sejteknek az l.E. példa eljárása szerint történő transzformálására. Az E. coli K12 MM294 sejteket ATCC 31446 számon az alábbi helyről szereztük be: American Type Culture Collection, Rockville, Maryland 20852. A tetraciklin rezisztens transzformánsokat szelektáltuk, és plazmid DNS-üket az l.F. példa szerinti alkalikus-lízises eljárással izoláltuk. Restrikciós analízist alkalmaztunk a pHPR97 plazmid szerkezetének igazolása céljából. A pHPR97 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 3. ábrán mutatjuk be.
-254. példa __
A PHKY334 plazmid megszerkesztése
A. Áttekintés
A pHKY334 plazmidot a pHPR97 plazmid transzkripcionális aktiváló szekvenciájának a pHPR97 plazmid transzkripcionális aktiváló szekvenciájával történő kicserélésével hoztuk létre. A 2. ábrára hivatkozva (pHPR91), és a 3. ábrára hivatkozva (pHPR97) az látható, hogy a pHKY334 plazmid megszerkesztése csak a pHPR91 és pHPR97 plazmidok Sáli és Xbal restrikciós endonukleázzal történő kettős feltárását igényli, majd a gélen való izolálást, és a pHPR91 nagyobb, és a pHPR97 kisebb fragmentjének ligálását.
B. A pHPR91 plazmid megközelítőleg 5.718 kb méretű Sall/Xbal fragmentiének létrehozása
A pHPR91 plazmidból 10 μg mennyiséget teljes mértékben feltártunk 50 μΐ Boehringer Mannheim-féle H pufferben (50 mM Trisz-HCl, 100 mM NaCl, 100 mM MgCl2, 1 mM ditioeritrol (DTT), pH 7.5, 37°C-on, és 100 μ$ szarvasmarha szérum albumin), megközelítőleg 20 U Xbal és megközelítőleg 20 U Sáli enzim alkalmazásával (Boehringer Mannheim). A feltárt
-26anyagot 37°C-on megközelítőleg két órán keresztül inkubáltuk. A pHPR91 plazmid megközelítőleg 5.718 kb méretű Sall/Xbal fragmentjét a feltárt anyagból agaróz gélelektroforézis alkalmazásával izoláltuk. A gélt etidiumbromid oldattal megfestettük, és a sávokat 260 nm-es UV fénnyel tettük láthatóvá. A kívánt sávok alatt és felett a gélt bemetszettük, és a hasítékokba egy darab DEAE papírt helyeztünk. A gélt visszatettük az elektroforézis kamrába, és a DNS-t elektroforézissel átvittük a papírra. A papírt új csőbe helyeztük, és 5 ml mennyiségű 1.0 M NaCl-t, és 10 mM Trisz-HCl-t (pH 8.0) tartalmazó oldattal eluáltuk. Az így kapott szuszpenziót 10 ml-es fecskendőbe helyezett szilikonozott üveggyapoton szűrtük át, melyhez 0.45 μ-os steril szűrőt kapcsoltunk (Acrodisc-Gelman Sciences, Incorporated, 600 South Wagner Road, Ann Arbor, Michigan 48106). Az elegyhez 10 ml 100 %-os etanolt adtunk, és a csövet összeráztuk. Egy éjszakára -20°C-ra helyeztük. A DNS csapadékot HB4 rotorban (DuPont Sorval) 10.000 rpm melletti 20 perces (4°C) centrifugálással nyertük vissza. A DNS pelletet levegőn megszárítottuk, és 100 μΐ TE pufferben felszuszpendáltuk.
C. A pHPR97 plazmid megközelítőleg 0.938 kb méretű Sall/XbaT fragment~i ének létrehozása
A pHPR97 plazmidból 10 ^g mennyiséget a 4.B. példa eljárása szerint Xbal és Sáli enzim alkalmazásával
-27feltártunk. A pHPR97 plazmid megközelítőleg 0.938 kb méretű
Sall/Xbal fragmentjét a 4.B. példa eljárása szerint gélelektroforézis alkalmazásával megtisztítottuk, extraháltuk, és kicsaptuk.
D. A PHPR91 plazmid megközelítőleg 5.718 kb méretű Sall/Xbal fragmentjének (4.B. példa), és a pHPR97 plazmid megközelítőleg 0.938 kb méretű Sall/Xbal frátmentjének (4.C. példa) ligálása a kívánt PHKR334 plazmid létrehozása céljából
A pHPR91 plazmádból származó fragment megközelítőleg
0.6 gg mennyiségét a pHPR97 plazmádból származó fragment megközelítőleg 0.3 /zg mennyiségével ligái tűk. A DNS-eket kicsaptuk, levegőn megszárítottuk, 10 μΐ oldatban (30 mM Trisz-HCl, pH 7.5, 0.5 mM ATP, 10 mM DTT, 6 mM MgCl2, és 1 U T4 ligáz (Boehringer Mannheim)) felszuszpendáltuk.
A pHPR91, és a pHPR97 fragmentek ligálása során keletkezett pHKY334 plazmidot fent már ismertettük.
E. Az E. coli RV308 sejtek transzformálása a PHKY334 plazmáddal
A transzformálást az l.E. példa eljárása szerint hajtottuk végre. A transzformánsok egyedi tenyészeteit kiválasztottuk, és 10 gg/ml tetraciklint tartalmazó Lk
-28húsleves táptalajon tenyésztettük. A pHPR91 plazmidot restrikciós endonukleázos térképezéssel és DNS szekvenálással azonosítottuk. A pHKY334 plazmid restrikciós helyét és funkciós térképét a 2. ábrán mutatjuk be.
-29SZEKVENCIA JEGYZÉK (1) ÁLTALÁNOS INFORMÁCIÓK:
(i) FELTALÁLÓK: Hershberger, Charles W.
Larson, Jeffrey L.
(ii) A TALÁLMÁNY CÍME: A pHKY334 PLAZMID, AZ EK-BGH
EXPRESSZIÓS VEKTORA, ÉS AZ EZZEL
TRANSZFORMÁLT GAZDASEJTEK (iii) A SZEKVENCIÁK SZÁMA: 6 (iv) PONTOS CÍM:
(A) CÍM: Éli Lilly and Company (B) UTCA: Lilly Corporate Center (C) VÁROS: Indianapolis (D) ÁLLAM: Indiana (E) ORSZÁG: Amerikai Egyesült Államok (F) IRÁNYÍTÓSZÁM: 46285 (v) A SZÁMÍTÓGÉP ÁLTAL OLVASHATÓ FORMÁTUM:
(A) ÁTVITEL TÍPUSA: Floppy disk (B) KOMPUTER: IBM PC kompatibilis (C) OPERÁCIÓS RENDSZER: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, 1.25 verzió (vi) A JELEN TALÁLMÁNY ADATAI:
| (A) | SZABADALOM | SZÁM: |
| (B) | KÖZZÉTÉTEL | SZAMA |
| (C) | OSZTÁLY: |
(viii) JOGI MEGHATALMAZOTT/MEGBÍZOTT TUDATAI:
(A) NÉV: Conrad, Róbert A.
(B) REGISZTRÁCIÓS SZÁM: 32.089 (C) REFERENCIA/JEGYZÉK SZÁM: X-8677 (ix) TELEKOMMUNIKÁCIÓS INFORMÁCIÓ:
(A) TELEFON: 317-275-6013 (2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:1-ROL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:
(A) HOSSZÚSÁG: 49 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomikus) (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:1:
CTAGAGGGTA TTAATAATGT ATATTGATTT TAATAAGGAG GAATAATCA (2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:2-RŐL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:
(A) HOSSZÚSÁG: 47 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomikus) (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:2:
TATGATTATT CCTCCTTATT AAAATCAATA TACATTATTA ATACCCT (2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:3-RÓL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:
(A) HOSSZÚSÁG: 601 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomikus) (ix) JELLEMZŐK:
(A) NÉV/KULCS: CDS (B) ELHELYEZKEDÉS : 2..601 (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:3:
-33T ATG TTC CCA TTG GAT GAT GAT GAT AAG TTC CCA GCC ATG TCC TTG 46
Met Phe Pro Leu Asp Asp Asp Asp Lys Phe Pro Alá Met Ser Leu
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||||
| TCC | GGC | CTG | TTT | GCC | AAC | GCT | GTG | CTC | CGG | GCT | CAG | CAC | CTG | CAT | CAG | 94 |
| Ser | Gly | Leu | Phe | Alá | Asn | Alá | Val | Leu | Arg | Alá | Gin | His | Leu | His | Gin | |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||||
| CTG | GCT | GCT | GAC | ACC | TTC | AAA | GAG | ITT | GAG | CGC | ACC | TAC | ATC | CCG | GAG | 142 |
| Leu | Alá | Alá | Asp | Thr | Phe | Lys | Glu | Phe | Glu | Arg | Thr | Tyr | Ile | Pro | Glu | |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||||
| GGA | CAG | AGA | TAC | TCC | ATC | CAG | AAC | ACC | CAG | GTT | GCC | TTC | TGC | TTC | TCT | 190 |
| Gly | Gin | Arg | Tyr | Ser | Ile | Gin | Asn | Thr | Gin | val | Alá | Phe | Cys | Phe | Ser | |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||||
| GAA | ACC | ATC | CCG | GCC | CCC | ACG | GGC | AAG | AAT | GAG | GCC | CAG | CAG | AAA | TCA | 238 |
| Glu | Thr | Ile | , Pro | Alá | Pro | Thr | Gly | Lys | Asn | Glu | Alá | Gin | Gin | Lys | Ser | |
| 65 | 70 | 75 | ||||||||||||||
| GAC | TTG | GAG | CTG | CTT | CGC | ATC | TCA | CTG | CTC | CTC | ATC | CAG | TCG | TGG | CTT | 286 |
| Asp | Leu | Glu | Leu | Leu | Arg | Ile | Ser | Leu | Leu | Leu | Ile | Gin | Ser | Trp | Leu | |
| 80 | 85 | 90 | 95 | |||||||||||||
| GGG | CCC | CTG | CAG | TTC | CTC | AGC | AGA | GTC | TTC | ACC | AAC | AGC | TTG | GTG | TTT | 334 |
| Gly | Pro | Leu | Gin | Phe | Leu | Ser | Arg | Val | Phe | Thr | Asn | Ser | Leu | Val | Phe | |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||||
| GGC | ACC | TCG | GAC | CGT | GTC | TAT | GAG | AAG | CTG | AAG | GAC | CTG | GAG | GAA | GGC | 382 |
| Gly | Thr | Ser | Asp | Arg | Val | Tyr | Glu | Lys | Leu | Lys | Asp | Leu | Glu | Glu | Gly | |
| 115 | 120 | 125 | ||||||||||||||
| ATC | CTG | GCC | CTG | ATG | CGG | GAG | CTG | GAA | GAT | GGC | ACC | CCC | CGG | GCT | GGG | 430 |
| Ile | Leu | Alá | Leu | Met | Arg | Glu | Leu | G1U | Asp | Gly | Thr | Pro | Arg | Alá | Gly | |
| 130 | 135 | 140 | ||||||||||||||
| CAG | ATC | CTC | AAG | CAG | ACC | TAT | GAC | AAA | TTT | GAC | ACA | AAC | ATG | CGC | AGT | 47 8 |
| Gin | Ile | Leu | Lys | Gin | Thr | Tyr | Asp | Lys | Phe | Asp | Thr | Asn | Met | Arg | Ser | |
| 145 | 150 | 155 | 4 | |||||||||||||
| GAC | GAC | GCG | CTG | CTC | AAG | AAC | TAC | GGT | CTG | CTC | TCC | TGC | TTC | CGG | AAG | 526 |
| Asp | Asp | Alá | Leu | Leu | Lys | Asn | Tyr | Gly | Leu | Leu | Ser | Cys | Phe | Arg | Lys | |
| 160 | 165 | 17 0 | 17 5 | |||||||||||||
| GAC | CTG | CAT | AAG | ACG | GAG | ACG | TAC | CTG | AGG | GTC | ATG | AAG | TGC | CGC | CGC | 57 4 |
| Asp | Leu | His | Lys | Thr | Glu | Thr | Tyr | Leu | Arg | Val | Met | Lys | Cys | Arg | Arg | |
| 180 | 185 | 190 | ||||||||||||||
| TTC | GGG | GAG | GCC | AGC | TGT | GCC | TTC | TAG | 601 | |||||||
| Phe | Gly | Glu | Alá | Ser | Cys | Alá | Phe |
195
200
-34(2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:4-RŐL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:
(A) HOSSZÚSÁG: 199 aminosav (B) TÍPUS: aminosav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:4:
| Met 1 | Phe | Pro | Leu | Asp 5 | Asp | Asp | Asp | Lys | Phe 10 | Pro | Alá | Met | Ser | Leu 15 | Ser |
| Gly | Leu | Phe | Alá 20 | Asn | Alá | Val | Leu | Arg 25 | Alá | Gin | His | Leu | His 30 | Gin | Leu |
| Alá | Alá | Asp 35 | Thr | Phe | Lys | Glu | Phe 40 | Glu | Arg | Thr | Tyr | Ile 45 | Pro | Glu | Gly |
| Gin | Arg 50 | Tyr | Ser | Ile | Gin | Asn 55 | Thr | Gin | Val | Alá | Phe 60 | Cys | Phe | Ser | Glu |
| Thr 65 | Ile | Pro | Alá | Pro | Thr 70 | Gly | Lys | Asn | Glu | Alá 75 | Gin | Gin | Lys | Ser | Asp 80 |
| Leu | Glu | Leu | Leu | Arg 85 | Ile | Ser | Leu | Leu | Leu 90 | Ile | Gin | Ser | Trp | Leu 95 | Gly |
| Pro | Leu | Gin | Phe 100 | Leu | Ser | Arg | Val | Phe 105 | Thr | Asn | Ser | Leu | Val 110 | Phe | Gly |
| Thr | Ser | Asp 115 | Arg | Val | Tyr | Glu | Lys 120 | Leu | Lys | Asp | Leu | Glu 125 | Glu | Gly | Ile |
| Leu | Alá 130 | Leu | Met | Arg | Glu | Leu 135 | Glu | Asp | Gly | Thr | Pro 140 | Arg | Alá | Gly | Gin |
| Ile 145 | Leu | Lys | Gin | Thr | Tyr 150 | Asp | Lys | Phe | Asp | Thr 155 | Asn | Met | Arg | Ser | Asp 160 |
| Asp | Alá | Leu | Leu | Lys 165 | Asn | Tyr | Gly | Leu | Leu 17 0 | Ser | Cys | Phe | Arg | Lys 175 | Asp |
| Leu | His | Lys | Thr 180 | Glu | Thr | Tyr | Leu | Arg 185 | Val | Met | Lys | Cys | Arg 190 | Arg | Phe |
| Gly | Glu | Alá 195 | Ser | Cys | Alá | Phe |
(2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:5-RŐL·:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:
(A) HOSSZÚSÁG: 142 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomikus) (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:5:
| AATTCGATCT | CTCACCTACC | AAACAATGCC | CCCCTGCAAA | AAATAAATTC | ATATAAAAAA | 60 |
| CATACAGATA | ACCATCTGCG | GTGATAAATT | ATCTCTGGCG | GTGTTGACAT | AAATACCACT | 120 |
| GGCGGTGATA | CTGAGCACAT | CA | 14 2 |
(2) INFORMÁCIÓK A SEQ ID NO:6-RÓL:
(i) A SZEKVENCIA JELLEMZÉSE:
(A) HOSSZÚSÁG: 142 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁL TÍPUSA: egyszálú (D) TOPOLÓGIA: lineáris «-37:
* ·«·♦ « « Ak •4 * (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomikus) (xi) SZEKVENCIA LEÍRÁS: SEQ ID NO:6:
GATCTGATGT
TATCACCGCA
TTGTTTGGTA
GCTCAGTATC
GATGGTTATC
GGTGAGAGAT
ACCGCCAGTG
TGTATGTTTT
CG
GTATTTATGT
TTATATGAAT
CAACACCGCC
TTATTTTTTG
AGAGATAATT
CAGGGGGGCA
Claims (8)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. pHKY334 plazmid.
- 2. Az 1. igénypont szerinti plazmáddal transzformált gazdasejt.
- 3. A 2. igénypont szerint transzformált gazdasejt, azzal jellemezve, hogy az E. coli RV308/pHKY334 gazdasejt.
- 4. A 2. igénypont szerint transzformált gazdasejt, azzal jellemezve, hogy az E. coli MM294/pHKY334 gazdasejt.
- 5. A 2. igénypont szerint transzformált gazdasejt, azzal jellemezve, hogy az E. coli C600/pHKY334 gazdasejt.
- 6. A 2. igénypont szerint transzformált gazdasejt, azzal jellemezve, hogy az E. coli JM109/pHKY334 gazdasejt.
- 7. Eljárás EK-BGH létrehozására, azzal jellemezve, hogy az említett eljárás (a) a 2.-7. igénypont szerinti transzformált gazdasejteknek a megfelelő táptalajon történő tenyésztése, és EK-BGH termelés, valamint (b) az EK-BGH visszanyerése a transzformált gazdasejtekből.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a transzformált gazdasejt E. coli RV308/pHKY334 gazdasejt.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/801,164 US5395761A (en) | 1991-11-27 | 1991-11-27 | Plasmid pHKY334, an expression vector for EK-BGH and host cells transformed therewith |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT63461A true HUT63461A (en) | 1993-08-30 |
Family
ID=25180366
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9203686A HUT63461A (en) | 1991-11-27 | 1992-11-24 | Process for producing phky334 plasmid, its ek-bgh expression vector and host cells transformed by it |
| HU9203686A HU9203686D0 (en) | 1991-11-27 | 1992-11-24 | Phky354 plasmide expression vector applicable for ek-bgh and host cells transformed by it |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9203686A HU9203686D0 (en) | 1991-11-27 | 1992-11-24 | Phky354 plasmide expression vector applicable for ek-bgh and host cells transformed by it |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5395761A (hu) |
| EP (1) | EP0544467A2 (hu) |
| JP (1) | JPH06113855A (hu) |
| AU (1) | AU2970692A (hu) |
| CA (1) | CA2083529A1 (hu) |
| HU (2) | HUT63461A (hu) |
| IL (1) | IL103848A0 (hu) |
| MX (1) | MX9206747A (hu) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0569604A1 (en) * | 1992-04-07 | 1993-11-18 | Societe Des Produits Nestle S.A. | Integrative gene-expression in Streptococcus salivarius ssp.thermophilus |
| FR2873411B1 (fr) * | 2004-07-21 | 2009-08-21 | Snecma Moteurs Sa | Turboreacteur avec des moyens de protection pour un dispositif d'injection de carburant, dispositif d'injection et tole de protection pour le turboreacteur |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BG49718A3 (en) * | 1983-07-15 | 1992-01-15 | Bio Technology General Corp | Method for preparing of polypeptid with superoxiddismutasne activitty |
| US4710473A (en) * | 1983-08-10 | 1987-12-01 | Amgen, Inc. | DNA plasmids |
| US4874703A (en) * | 1985-08-26 | 1989-10-17 | Eli Lilly And Company | Expression vectors for use in E. coli |
| ES2076318T3 (es) * | 1989-06-26 | 1995-11-01 | Lilly Co Eli | Control de la acumulacion de vectores de expresion aberrantes durante procedimientos de fermentacion. |
| IL99100A0 (en) * | 1990-08-13 | 1992-07-15 | Lilly Co Eli | Improved bacteriophage lambda pl promoters |
| CA2057715A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-20 | Charles L. Hershberger | Method for enhancing the structural stability of recombinant dna expression vectors |
-
1991
- 1991-11-27 US US07/801,164 patent/US5395761A/en not_active Expired - Fee Related
-
1992
- 1992-11-20 EP EP92310617A patent/EP0544467A2/en not_active Ceased
- 1992-11-23 IL IL103848A patent/IL103848A0/xx unknown
- 1992-11-23 CA CA002083529A patent/CA2083529A1/en not_active Abandoned
- 1992-11-24 HU HU9203686A patent/HUT63461A/hu unknown
- 1992-11-24 HU HU9203686A patent/HU9203686D0/hu unknown
- 1992-11-24 MX MX9206747A patent/MX9206747A/es unknown
- 1992-11-27 JP JP4318634A patent/JPH06113855A/ja not_active Withdrawn
- 1992-11-27 AU AU29706/92A patent/AU2970692A/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2970692A (en) | 1993-06-03 |
| HU9203686D0 (en) | 1993-03-29 |
| JPH06113855A (ja) | 1994-04-26 |
| EP0544467A3 (hu) | 1994-03-16 |
| CA2083529A1 (en) | 1993-05-28 |
| US5395761A (en) | 1995-03-07 |
| MX9206747A (es) | 1993-05-01 |
| EP0544467A2 (en) | 1993-06-02 |
| IL103848A0 (en) | 1993-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR900005776B1 (ko) | 인터페론의 제조방법 | |
| EP0198015B2 (en) | Production of streptavidin-like polypeptides | |
| EP0095361B1 (en) | Cloning vectors for expression of exogenous protein | |
| Murotsu et al. | Identification of the minimal essential region for the replication origin of miniF plasmid | |
| EP0111389A2 (en) | Substantially pure porcine growth hormone, DNA sequences therefor, and expression vehicles and transfected microorganisms for the production of porcine growth hormone | |
| JP2544602B2 (ja) | 新規プラスミドベクタ− | |
| US4795706A (en) | Novel expression control sequences | |
| US5914395A (en) | Desmin enhancer sequences, vectors comprising these sequences and their uses in compositions for the expression of nucleotide sequences in transfected cells | |
| US5063158A (en) | Recombinant DNA expression vector comprising both transcriptional and translational activating sequences | |
| US5192669A (en) | Method to produce recombinant proteins using an expression vector comprising transcriptional and translational activating sequences | |
| HUT63461A (en) | Process for producing phky334 plasmid, its ek-bgh expression vector and host cells transformed by it | |
| KR900001014B1 (ko) | 소 성장 호르몬 유도체 발현 벡터의 제조방법 | |
| EP0196223B1 (en) | Dedicated ribosomes and their use in producing protein in cell culture | |
| EP0146901A1 (en) | A promotor and use thereof | |
| US5378613A (en) | Method for increased expression of low molecular weight recombinant polypeptides | |
| KR900001015B1 (ko) | 재조합체 dna 발현 벡터의 제조방법 | |
| JPH0746994A (ja) | ポリペプチドの製造方法 | |
| EP0547873B1 (en) | A novel translational activating sequence | |
| EP0471514A2 (en) | Improved bacteriophage lambda pL promoters | |
| US5576190A (en) | Bacteriophage Lambda pL promoters | |
| EP0493926A1 (en) | A method for enhancing the structural stability of recombinant DNA expression vectors | |
| Churchward et al. | In vitro recombinant DNA technology | |
| EP0222869A1 (en) | Expression vector |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |