JP2515488B2 - ポリペプチドの製造方法 - Google Patents
ポリペプチドの製造方法Info
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- JP2515488B2 JP2515488B2 JP6095174A JP9517494A JP2515488B2 JP 2515488 B2 JP2515488 B2 JP 2515488B2 JP 6095174 A JP6095174 A JP 6095174A JP 9517494 A JP9517494 A JP 9517494A JP 2515488 B2 JP2515488 B2 JP 2515488B2
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- JP
- Japan
- Prior art keywords
- plasmid
- promoter
- dna
- gene
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規発現調節ＤＮＡ配
列、ベクターおよび形質転換株を用いて原核および真核
細胞たん白質を生産する方法に関するものである。
列、ベクターおよび形質転換株を用いて原核および真核
細胞たん白質を生産する方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】宿主中に於けるたん白合成のレベルは主
に三つの要因により制御される。宿主中での遺伝子のコ
ピー数、その遺伝子コピーが転写される効率および生成
したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＡＮ）が翻訳される効
率である。転写および翻訳の効率は、通常目的とするコ
ード配列或いは遺伝子の前に位置するヌクレオチド配列
に依存している。これらのヌクレオチド配列（発現調節
ＤＮＡ配列）は特に、転写を開始するためのＲＮＡポリ
メラーゼ結合部位（プロモーター配列）および翻訳開始
のためのリボゾームがｍＲＮＡ（転写の産物）に結合す
る部位を規定する。
に三つの要因により制御される。宿主中での遺伝子のコ
ピー数、その遺伝子コピーが転写される効率および生成
したメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＡＮ）が翻訳される効
率である。転写および翻訳の効率は、通常目的とするコ
ード配列或いは遺伝子の前に位置するヌクレオチド配列
に依存している。これらのヌクレオチド配列（発現調節
ＤＮＡ配列）は特に、転写を開始するためのＲＮＡポリ
メラーゼ結合部位（プロモーター配列）および翻訳開始
のためのリボゾームがｍＲＮＡ（転写の産物）に結合す
る部位を規定する。
【０００３】発現調節ＤＮＡ配列の全てが同じ効率で作
用するわけではない。従って目的たん白をコードする特
有の配列或いは遺伝子を隣接のヌクレオチド配列と切断
し、他の発現調節ＤＮＡ配列と結合してより高いレベル
の発現を行なうことがしばしば有利となる。これが成功
すれば、新たに操作したＤＮＡ断片を高コピープラスミ
ドまたはバクテリオファージ誘導体に挿入し、細胞内の
遺伝子コピー数を増加して目的たん白質の収量を改善す
ることができる。
用するわけではない。従って目的たん白をコードする特
有の配列或いは遺伝子を隣接のヌクレオチド配列と切断
し、他の発現調節ＤＮＡ配列と結合してより高いレベル
の発現を行なうことがしばしば有利となる。これが成功
すれば、新たに操作したＤＮＡ断片を高コピープラスミ
ドまたはバクテリオファージ誘導体に挿入し、細胞内の
遺伝子コピー数を増加して目的たん白質の収量を改善す
ることができる。
【０００４】通常無毒な遺伝子産物でも過剰生産により
宿主に害を及ぼし、個有の宿主−ベクター系の安定性を
低下させるため、クローン化した遺伝子の転写や翻訳の
効率を改良するのに加えて、発現調節ＤＮＡ配列が宿主
の生育中には発現を調節できるように制御可能にしてお
く必要がある。例えば、制御可能な発現調節ＤＮＡ配列
とは宿主細胞が発現調節ＤＮＡ配列の制御下で、最初は
遺伝子産物の過剰生産なしに宿主細胞が増殖できるよう
にスイッチオフにし、後に目的たん白質の多量発現を促
進するようにスイッチオンにするものである。
宿主に害を及ぼし、個有の宿主−ベクター系の安定性を
低下させるため、クローン化した遺伝子の転写や翻訳の
効率を改良するのに加えて、発現調節ＤＮＡ配列が宿主
の生育中には発現を調節できるように制御可能にしてお
く必要がある。例えば、制御可能な発現調節ＤＮＡ配列
とは宿主細胞が発現調節ＤＮＡ配列の制御下で、最初は
遺伝子産物の過剰生産なしに宿主細胞が増殖できるよう
にスイッチオフにし、後に目的たん白質の多量発現を促
進するようにスイッチオンにするものである。
【０００５】上述の要件を満すような発現調節ＤＮＡ配
列がいくつかバクテリア宿主中でたん白質やポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列および遺伝子の発現に既に用
いられている。例えば以下のような例がある。Ｅ．ｃｏ
ｌｉのラクトースオペロンのオペレーター、プロモータ
ーおよびリボゾーム結合関連の配列（Ｋ．Ｉｔａｋｕｒ
ａら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉｏｆ ａ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｇｅｎｅ ｆｏｒｔｈｅ ｈ
ｏｒｍｏｎｅ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ”，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ １９８巻、１０５６〜１０６３頁〔１９７７
年〕；Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｇ
ｅｎｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎｉｎｓｕｌｉｎ”，ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ，７６巻、１０６〜１１０頁〔１９７９
年〕）、Ｅ．ｃｏｌｉのトリプトファン合成系の同様な
配列（Ｊ．Ｓ．Ｅｍｔａｇｅら、“Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ａ
ｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｆｒｏｍ Ｈａｅｍａｇｇ
ｌｕｔｉｎｉｎｇｅｎｅｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”，Ｎａｔｕｒｅ ２８
３巻、１７１〜１７４頁〔１９８０年〕；Ｊ．Ａ．Ｍａ
ｒｔｉａｌら、“Ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍ
ｏｎｅ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａ
ｃｔｅｒｉａ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０５巻、６０２〜
６０７頁〔１９７９年〕）およびλファージのオペレー
タープロモーター主要領域（Ｈ．Ｂｅｒｎａｒｄら、
“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ
ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｔｈａｔ ｐｒｏ
ｍｏｔｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｒｏｍ
ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ
ＰL ｐｒｏｍｏｔｅｒ”，Ｇｅｎｅ，５巻，５９〜７
６頁〔１９７９年〕；ヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ．４
１７６７）がある。
列がいくつかバクテリア宿主中でたん白質やポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ配列および遺伝子の発現に既に用
いられている。例えば以下のような例がある。Ｅ．ｃｏ
ｌｉのラクトースオペロンのオペレーター、プロモータ
ーおよびリボゾーム結合関連の配列（Ｋ．Ｉｔａｋｕｒ
ａら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏｌｉｏｆ ａ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ
ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｇｅｎｅ ｆｏｒｔｈｅ ｈ
ｏｒｍｏｎｅ ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ”，Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ １９８巻、１０５６〜１０６３頁〔１９７７
年〕；Ｄ．Ｖ．Ｇｏｅｄｄｅｌら、“Ｅｘｐｒｅｓｓｉ
ｏｎ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｏｆ
Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ ｇ
ｅｎｅｓ ｆｏｒ ｈｕｍａｎｉｎｓｕｌｉｎ”，ＰＮ
ＡＳ ＵＳＡ，７６巻、１０６〜１１０頁〔１９７９
年〕）、Ｅ．ｃｏｌｉのトリプトファン合成系の同様な
配列（Ｊ．Ｓ．Ｅｍｔａｇｅら、“Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ
ａｎｔｉｇｅｎｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ａ
ｒｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｆｒｏｍ Ｈａｅｍａｇｇ
ｌｕｔｉｎｉｎｇｅｎｅｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎ Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ”，Ｎａｔｕｒｅ ２８
３巻、１７１〜１７４頁〔１９８０年〕；Ｊ．Ａ．Ｍａ
ｒｔｉａｌら、“Ｈｕｍａｎ ｇｒｏｗｔｈ ｈｏｒｍ
ｏｎｅ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ ｃｌｏ
ｎｉｎｇ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｂａ
ｃｔｅｒｉａ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２０５巻、６０２〜
６０７頁〔１９７９年〕）およびλファージのオペレー
タープロモーター主要領域（Ｈ．Ｂｅｒｎａｒｄら、
“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ
ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｈｉｃｌｅｓ ｔｈａｔ ｐｒｏ
ｍｏｔｅ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｒｏｍ
ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ ｌａｍｂｄａ
ＰL ｐｒｏｍｏｔｅｒ”，Ｇｅｎｅ，５巻，５９〜７
６頁〔１９７９年〕；ヨーロッパ特許出願公開Ｎｏ．４
１７６７）がある。
【０００６】本発明は、大腸菌ファージＴ５プロモータ
ーとプロモーター活性の調節を行なう大腸菌ｌａｃオペ
レーターを含むＤＮＡ配列（制御配列）とが結合したも
のより成る新規でかつ改良された発現調節ＤＮＡ配列を
使用するポリペプチドの製造方法を提供するものであ
る。
ーとプロモーター活性の調節を行なう大腸菌ｌａｃオペ
レーターを含むＤＮＡ配列（制御配列）とが結合したも
のより成る新規でかつ改良された発現調節ＤＮＡ配列を
使用するポリペプチドの製造方法を提供するものであ
る。
【０００７】本発明によればプロモーター活性の調節を
行なうＤＮＡ配列と大腸菌ファージＴ５のプロモーター
を大腸菌ファージＴ５プロモーターのプロモーター効率
を高く保ちながらかつ結合することが出来る。
行なうＤＮＡ配列と大腸菌ファージＴ５のプロモーター
を大腸菌ファージＴ５プロモーターのプロモーター効率
を高く保ちながらかつ結合することが出来る。
【０００８】本発明中ではＴ５プロモーターを大腸菌フ
ァージＴ５群のゲノム中に存在するプロモーター機能を
仲介するＤＮＡ配列および該配列に由来する機能を有し
た組み合せと定義する。
ァージＴ５群のゲノム中に存在するプロモーター機能を
仲介するＤＮＡ配列および該配列に由来する機能を有し
た組み合せと定義する。
【０００９】天然に存在するＴ５プロモーターは効率の
よい転写開始シグナルであることが知られており、
（Ａ．ｖｏｎ Ｇａｂａｉｎ ａｎｄ Ｈ． Ｂｕｊａ
ｒ，“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ
ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｗｉｔｈ ｐｒｏｍｏｔ
ｅｒｓ ｏｆ ｃｏｌｉｐｈａｇｅ Ｔ５”，Ｍｏｌｅ
ｃ． ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．，１５７巻、３０１〜３
１１頁〔１９７７年〕）、以下のような性質を有してい
る。 （ｉ） プロモーター配列と、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポ
リメラーゼとの間での複合体形成に関し高い正の速度定
数を示す（Ａ． ｖｏｎ Ｇａｂａｉｎ ａｎｄＨ．
Ｂｕｊａｒｄ，“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｗｉｔｈ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｆ ｓｅ
ｖｅｒａｌ ｃｏｌｉｐｈａｇｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍ
ｉｄ ＤＮＡｓ”，ＰＮＡＳ，７６巻，１８９〜１９３
頁〔１９７９年〕）、（ｉｉ） ｉｎ ｖｉｖｏおよび
ｉｎ ｖｉｔｒｏで異常に高い速度でＲＡＮ合成を開始
する、（ｉｉｉ） ＲＮＡポリメラーゼ結合部位の５領
域に保存された配列を含む（Ｈ．Ｂｕｊａｒｄら、“Ｉ
ｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐ
ｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｙ
ｓｔｅｍ ｉｎｔｏ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ
ｓ”，「Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ
Ａｎａｌｙｓｉｓ」、第３巻：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｃｌｏｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏ
ｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃ
ｅｌｌｓ，Ｔ．Ｓ．Ｐａｐａｓ，Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇおよびＪ．Ｇ．Ｃｈｉｒｉｋｊｉａｎ編集；Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｏ
ｘｆｏｒｄ，６５〜８７頁〔１９８３年〕）、および
（ｉｖ） 発現ベクターに挿入されてもこれらのプロモ
ーターは制御を受けない。
よい転写開始シグナルであることが知られており、
（Ａ．ｖｏｎ Ｇａｂａｉｎ ａｎｄ Ｈ． Ｂｕｊａ
ｒ，“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅ．ｃｏｌｉ
ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｗｉｔｈ ｐｒｏｍｏｔ
ｅｒｓ ｏｆ ｃｏｌｉｐｈａｇｅ Ｔ５”，Ｍｏｌｅ
ｃ． ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ．，１５７巻、３０１〜３
１１頁〔１９７７年〕）、以下のような性質を有してい
る。 （ｉ） プロモーター配列と、Ｅ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポ
リメラーゼとの間での複合体形成に関し高い正の速度定
数を示す（Ａ． ｖｏｎ Ｇａｂａｉｎ ａｎｄＨ．
Ｂｕｊａｒｄ，“Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅ
ｒａｓｅ ｗｉｔｈ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｆ ｓｅ
ｖｅｒａｌ ｃｏｌｉｐｈａｇｅ ａｎｄ ｐｌａｓｍ
ｉｄ ＤＮＡｓ”，ＰＮＡＳ，７６巻，１８９〜１９３
頁〔１９７９年〕）、（ｉｉ） ｉｎ ｖｉｖｏおよび
ｉｎ ｖｉｔｒｏで異常に高い速度でＲＡＮ合成を開始
する、（ｉｉｉ） ＲＮＡポリメラーゼ結合部位の５領
域に保存された配列を含む（Ｈ．Ｂｕｊａｒｄら、“Ｉ
ｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｐ
ｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ．ｃｏｌｉ ｓｙ
ｓｔｅｍ ｉｎｔｏ ｐｌａｓｍｉｄ ｖｅｃｔｏｒ
ｓ”，「Ｇｅｎｅ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄ
Ａｎａｌｙｓｉｓ」、第３巻：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｃｌｏｓｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎｔｏ ｐｒｏ
ｋａｒｙｏｔｉｃ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃ
ｅｌｌｓ，Ｔ．Ｓ．Ｐａｐａｓ，Ｍ．Ｒｏｓｅｎｂｅｒ
ｇおよびＪ．Ｇ．Ｃｈｉｒｉｋｊｉａｎ編集；Ｅｌｓｅ
ｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ−Ａｍｓｔｅｒｄａｍ−Ｏ
ｘｆｏｒｄ，６５〜８７頁〔１９８３年〕）、および
（ｉｖ） 発現ベクターに挿入されてもこれらのプロモ
ーターは制御を受けない。
【００１０】本発明において有用なプロモーターはファ
ージの“前初期”、“初期”および“後期”発現クラス
のプロモーターであり、特にＲ．Ｇｅｎｔｚの学位論文
（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１
９８４年）に記載されている配列である：Ｐ207 ，Ｐ25
（本明細書ではＰN25 と命名されている）、Ｐ26，
Ｇ 30，Ｐ28a （Ｂｕｊａｒｄらの上記論文ではＰ28と命
名されている）、Ｐ28b ，Ｇ22，Ｇ5 ，Ｇ25，Ｇ28，Ｇ
20である。上述の好ましいＴ５プロモーターのいくつか
のＤＮＡ配列を下の第一表に示す。
ージの“前初期”、“初期”および“後期”発現クラス
のプロモーターであり、特にＲ．Ｇｅｎｔｚの学位論文
（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，１
９８４年）に記載されている配列である：Ｐ207 ，Ｐ25
（本明細書ではＰN25 と命名されている）、Ｐ26，
Ｇ 30，Ｐ28a （Ｂｕｊａｒｄらの上記論文ではＰ28と命
名されている）、Ｐ28b ，Ｇ22，Ｇ5 ，Ｇ25，Ｇ28，Ｇ
20である。上述の好ましいＴ５プロモーターのいくつか
のＤＮＡ配列を下の第一表に示す。
【００１１】
【表１】
【００１２】第一表にはＥ．ｃｏｌｉ ＲＮＡポリメラ
ーゼと速かに反応するこれら４つのＴ５プロモーターの
ヌクレオチド配列を示す。主な共通配列領域を四角で囲
んである。最も顕著なのは−１０，−３０，−３３，−
４３および＋７領域の共通性と−１０と−３３の間の正
確なスペース（１８ｂｐ）の共通性である。−４３付近
の下線を施した配列はＧＣ塩基対に対した強い選択性が
存在している領域を示す。
ーゼと速かに反応するこれら４つのＴ５プロモーターの
ヌクレオチド配列を示す。主な共通配列領域を四角で囲
んである。最も顕著なのは−１０，−３０，−３３，−
４３および＋７領域の共通性と−１０と−３３の間の正
確なスペース（１８ｂｐ）の共通性である。−４３付近
の下線を施した配列はＧＣ塩基対に対した強い選択性が
存在している領域を示す。
【００１３】プロモーター活性の調節を行なうＤＮＡ配
列は知られている。そのような配列は各種オペロン（発
現制御ユニット）に存在している（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅ
ｒａｎｄ Ｗ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，“Ｔｈｅ ｏ
ｐｅｒｏｎ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂａｒａｔｏｒｙ〔１９８０年〕）そのようなタイ
プの一つに、その本質成分がレプレッサーたん白質と相
互作用するオペレーター配列がある。レプレッサーたん
白をコードする配列はオペレーターを含むプラスミド上
か或いは別のベクターか、または宿主染色体中に存在し
得る。本発明で利用するプロモーター活性調節のための
好ましいＤＮＡ配列はオペレーター／レプレッサー系で
ある。特に好ましいのは天然のｌａｃオペレーター或い
はそれに由来する機能を有する配列および天然或いは修
飾したレプレッサー分子を生成するレプレッサーをコー
ドするＤＮＡ配列より成るｌａｃオペロンの系である
（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＷ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏ
ｆｆ，前述）。
列は知られている。そのような配列は各種オペロン（発
現制御ユニット）に存在している（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅ
ｒａｎｄ Ｗ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，“Ｔｈｅ ｏ
ｐｅｒｏｎ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂａｒａｔｏｒｙ〔１９８０年〕）そのようなタイ
プの一つに、その本質成分がレプレッサーたん白質と相
互作用するオペレーター配列がある。レプレッサーたん
白をコードする配列はオペレーターを含むプラスミド上
か或いは別のベクターか、または宿主染色体中に存在し
得る。本発明で利用するプロモーター活性調節のための
好ましいＤＮＡ配列はオペレーター／レプレッサー系で
ある。特に好ましいのは天然のｌａｃオペレーター或い
はそれに由来する機能を有する配列および天然或いは修
飾したレプレッサー分子を生成するレプレッサーをコー
ドするＤＮＡ配列より成るｌａｃオペロンの系である
（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＷ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏ
ｆｆ，前述）。
【００１４】本発明に係る発現調節ＤＮＡ配列は以下の
ように調製できる。大腸菌ファージＴ５プロモーター配
列を衆知の方法でプロモーター活性の調節を行なう一つ
又はそれ以上の配列（制御配列）とその制御配列、即ち
オペレーターの位置が種々変わり得るように結合して機
能を有するユニットとする。そのような組合せでは制御
配列はＴ５プロモーター配列の内部又は外側に位置でき
る。即ち、制御配列はプロモーター内部に挿入され、或
いは部分的に重複し、或いは重複することなくプロモー
ターの上流又は下流に種々の距離で位置させることがで
きる。好ましくは、制御配列はプロモーター配列の＋１
と＋２０の間、−１３と−３０の間、および／或いは−
３４と−５０の間の位置（位置の番号は第一表の通り）
に重複する。さらに好ましい位置は＋２０から＋２００
までの下流域である。特に好ましい部位は制御配列、例
えばｌａｃオペレーター配列がＴ５プロモーター配列の
＋２の位置までに、丁度Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃオペロン
と同じように、図７に示すように重複しているような位
置である。
ように調製できる。大腸菌ファージＴ５プロモーター配
列を衆知の方法でプロモーター活性の調節を行なう一つ
又はそれ以上の配列（制御配列）とその制御配列、即ち
オペレーターの位置が種々変わり得るように結合して機
能を有するユニットとする。そのような組合せでは制御
配列はＴ５プロモーター配列の内部又は外側に位置でき
る。即ち、制御配列はプロモーター内部に挿入され、或
いは部分的に重複し、或いは重複することなくプロモー
ターの上流又は下流に種々の距離で位置させることがで
きる。好ましくは、制御配列はプロモーター配列の＋１
と＋２０の間、−１３と−３０の間、および／或いは−
３４と−５０の間の位置（位置の番号は第一表の通り）
に重複する。さらに好ましい位置は＋２０から＋２００
までの下流域である。特に好ましい部位は制御配列、例
えばｌａｃオペレーター配列がＴ５プロモーター配列の
＋２の位置までに、丁度Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃオペロン
と同じように、図７に示すように重複しているような位
置である。
【００１５】本発明の発現調節ＤＮＡ配列はそれぞれの
ＤＮＡ配列の全化学合成を含むＤＮＡ化学でよく知られ
る方法により得られる。本発明の好ましい様態として
は、ｌａｃオペレーターがｌａｃ Ｉ−遺伝子にコード
されるｌａｃレプレッサーたん白により負に制御され得
る。細胞内に十分量のレプレッサー分子を得るためには
下記のような従来法により対応する遺伝子を過剰発現す
る。例えばｌａｃ Ｉq 遺伝子（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ
およびＷ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，前述；Ｍ．Ｐ．Ｃ
ａｌｏｓ，“ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｌ
ｏｗ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ
ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａｎ
‘ｕｐ’ｐｒｏｍｏｔｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ”，Ｎａｔ
ｕｒｅ，２７４巻，７６２〜７６５頁〔１９７８年〕）
を上述の発現調節配列を含むベクターに挿入する方法で
ある。本発明の発現配列はプラスミド或いはファージ由
来の便利などんな発現ベクターにもそれ自体知られてい
る方法で導入することができる。プラスミド或いはファ
ージ由来の便利な発現ベクターについては例えばＭａｎ
ｉａｔｉｓらによる実験操作書“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２年の中に記載され
ている。
ＤＮＡ配列の全化学合成を含むＤＮＡ化学でよく知られ
る方法により得られる。本発明の好ましい様態として
は、ｌａｃオペレーターがｌａｃ Ｉ−遺伝子にコード
されるｌａｃレプレッサーたん白により負に制御され得
る。細胞内に十分量のレプレッサー分子を得るためには
下記のような従来法により対応する遺伝子を過剰発現す
る。例えばｌａｃ Ｉq 遺伝子（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ
およびＷ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，前述；Ｍ．Ｐ．Ｃ
ａｌｏｓ，“ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｌ
ｏｗ−ｌｅｖｅｌ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ
ｌａｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ａｎ
‘ｕｐ’ｐｒｏｍｏｔｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ”，Ｎａｔ
ｕｒｅ，２７４巻，７６２〜７６５頁〔１９７８年〕）
を上述の発現調節配列を含むベクターに挿入する方法で
ある。本発明の発現配列はプラスミド或いはファージ由
来の便利などんな発現ベクターにもそれ自体知られてい
る方法で導入することができる。プラスミド或いはファ
ージ由来の便利な発現ベクターについては例えばＭａｎ
ｉａｔｉｓらによる実験操作書“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｃｌｏｎｉｎｇ”，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８２年の中に記載され
ている。
【００１６】ｐＤＳ１群のプラスミドは異常に強い転写
シグナルを安定して挿入するのに適することが示されて
いる（Ｄ．ＳｔｕｂｅｒおよびＨ．Ｂｕｊａｒｄ，“Ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｅｆｆｉｃｉｅ
ｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｃａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ
ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｄｉｍｉｎｉｓｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｇｅｎ
ｅｓ”，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．１巻，１
３９９〜１４０４頁〔１９８２年〕）。
シグナルを安定して挿入するのに適することが示されて
いる（Ｄ．ＳｔｕｂｅｒおよびＨ．Ｂｕｊａｒｄ，“Ｔ
ｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｅｆｆｉｃｉｅ
ｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓｃａｎ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅ
ｗｉｔｈ ｐｌａｓｍｉｄ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｄｉｍｉｎｉｓｅｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ ｇｅｎ
ｅｓ”，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ．１巻，１
３９９〜１４０４頁〔１９８２年〕）。
【００１７】従って、本発明で使用する好ましいベクタ
ーはｐＤＳ１群のベクターである。この群のプラスミド
はプラスミドｐＢＲ３２２に由来し、例えばｐＤＳ１，
ｔ0１+ およびｐＤＳ１，ｔ0 ２+ より成り、ｐＤＳ２
／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ およびｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O'
ｔ0 ２+ のようなプラスミドが構築される。このような
構築に有用なプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ菌株（ｐＤ
Ｓ１，ｔ0１+ ；ｐＤＳ１，ｔ0 ２+ ；ｐＤＳ１Ｘ，１
で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５）はゲッチンゲン
のＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉ
ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に１９８４年１
２月１１日に寄託されており、寄託番号はそれぞれＤＳ
Ｍ３１３５，ＤＳＭ３１３６，ＤＳＭ３１３７である。
ーはｐＤＳ１群のベクターである。この群のプラスミド
はプラスミドｐＢＲ３２２に由来し、例えばｐＤＳ１，
ｔ0１+ およびｐＤＳ１，ｔ0 ２+ より成り、ｐＤＳ２
／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ およびｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O'
ｔ0 ２+ のようなプラスミドが構築される。このような
構築に有用なプラスミドを含むＥ．ｃｏｌｉ菌株（ｐＤ
Ｓ１，ｔ0１+ ；ｐＤＳ１，ｔ0 ２+ ；ｐＤＳ１Ｘ，１
で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５）はゲッチンゲン
のＤｅｕｔｓｃｈｅ Ｓａｍｍｌｕｎｇ ｖｏｎ Ｍｉ
ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ（ＤＳＭ）に１９８４年１
２月１１日に寄託されており、寄託番号はそれぞれＤＳ
Ｍ３１３５，ＤＳＭ３１３６，ＤＳＭ３１３７である。
【００１８】本発明で使用する発現ベクターにより発現
されるＤＮＡ配列はｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで原核細胞或いは真核細胞ポリペプチドをコードで
各種ＤＮＡ配列から選ぶことができる。例えば、配列は
酵素、ホルモン、免疫調節活性、抗ウイルス活性又は抗
癌活性を有するポリペチド、抗体、抗原、ワクチンおよ
び原核性または真核性の有用なポリペプチドをコードし
ているものである。
されるＤＮＡ配列はｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔ
ｒｏで原核細胞或いは真核細胞ポリペプチドをコードで
各種ＤＮＡ配列から選ぶことができる。例えば、配列は
酵素、ホルモン、免疫調節活性、抗ウイルス活性又は抗
癌活性を有するポリペチド、抗体、抗原、ワクチンおよ
び原核性または真核性の有用なポリペプチドをコードし
ているものである。
【００１９】本発明により改良発現調節システムを用い
て発現できるたん白質の例としては、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ、マラリア表層抗原、インタリユキン２、インタ
フェロンα，βおよびγのようなリンホカイン類、イン
シュリンおよびインシュリン前駆体、生長ホルモン、テ
ィッシュプラスミノーゲンアクチベーター或いはヒトレ
ニンがある。
て発現できるたん白質の例としては、ジヒドロ葉酸レダ
クターゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェ
ラーゼ、マラリア表層抗原、インタリユキン２、インタ
フェロンα，βおよびγのようなリンホカイン類、イン
シュリンおよびインシュリン前駆体、生長ホルモン、テ
ィッシュプラスミノーゲンアクチベーター或いはヒトレ
ニンがある。
【００２０】本発明に従って発現ベクターを用いて原核
および真核たん白をコードするＤＮＡ配列を発現する方
法には、よく知られている一般的方法が適用できる（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、前述）。それは目的のＤＮＡ配列を
ベクターの発現調節配列に有効に結合した発現ベクター
で適当な宿主を形質転換し、その宿主細胞を生育に適当
な条件下で培養し、培養物より目的のポリペチドを単離
するものである。この分野に精通している者は、本発明
の範囲内に於いて、これらの知られた方法より個々の遺
伝子発現に最も効果のあるものを選べる。
および真核たん白をコードするＤＮＡ配列を発現する方
法には、よく知られている一般的方法が適用できる（Ｍ
ａｎｉａｔｉｓら、前述）。それは目的のＤＮＡ配列を
ベクターの発現調節配列に有効に結合した発現ベクター
で適当な宿主を形質転換し、その宿主細胞を生育に適当
な条件下で培養し、培養物より目的のポリペチドを単離
するものである。この分野に精通している者は、本発明
の範囲内に於いて、これらの知られた方法より個々の遺
伝子発現に最も効果のあるものを選べる。
【００２１】本発明に於いて特別の宿主を選択するには
この分野で認められている多くの要因に依存する。例え
ば選んだ発現ベクターとの共存性、組換えプラスミドで
コードされるたん白の毒性、目的たん白の回収の容易
さ、発現の特質、生物安全性およびコストなどがある。
これらの一般的な指針内で有用なバクテリア宿主はグラ
ム陰性およびグラム陽性バクテリア、特にＥ．ｃｏｌｉ
およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの菌株である。本発明にお
いて最も好ましい宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５
（Ｍ．Ｒ．Ｖｉｌｌａｒｅｊｏら、“β−Ｇａｌａｃｔ
ｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉ
ｎｓ”，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２０巻，４６６〜
４７４頁〔１９７４年〕中でＤＺ２９１と記載されてい
る。）である。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３１４４６）およびＥ．ｃｏｌｉＲＲ１（ＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．３１３４３）のような他のＥ．ｃｏｌｉ菌
株も使用することができる。
この分野で認められている多くの要因に依存する。例え
ば選んだ発現ベクターとの共存性、組換えプラスミドで
コードされるたん白の毒性、目的たん白の回収の容易
さ、発現の特質、生物安全性およびコストなどがある。
これらの一般的な指針内で有用なバクテリア宿主はグラ
ム陰性およびグラム陽性バクテリア、特にＥ．ｃｏｌｉ
およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓの菌株である。本発明にお
いて最も好ましい宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５
（Ｍ．Ｒ．Ｖｉｌｌａｒｅｊｏら、“β−Ｇａｌａｃｔ
ｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉ
ｎｓ”，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１２０巻，４６６〜
４７４頁〔１９７４年〕中でＤＺ２９１と記載されてい
る。）である。しかし、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ
Ｎｏ．３１４４６）およびＥ．ｃｏｌｉＲＲ１（ＡＴ
ＣＣ Ｎｏ．３１３４３）のような他のＥ．ｃｏｌｉ菌
株も使用することができる。
【００２２】
【実施例】本発明は後に示す図と合わせて以下の実施例
でよりよく理解できる。本発明のプロモーター／オペレ
ーター融合体ＰＮN25 Ｘ/Oの構築は次の実施例により詳
細に説明される。
でよりよく理解できる。本発明のプロモーター／オペレ
ーター融合体ＰＮN25 Ｘ/Oの構築は次の実施例により詳
細に説明される。
【００２３】実施例１ プロモーターＰN25 ｘ/Oの構築に使用したプラスミド Ａ．原理 ｐＤＳ１，ｔ0 １+ （図１）およびｐＤＳ１，ｔ0 ２+
（図４）はプロモーターＰN25 の挿入およびプロモータ
ーＰN25 とｌａｃオペレーターの融合に使用しただけで
なく、得られたプロモーター／オペレーター融合体Ｐ
N25 ｘ/Oの機能を示すためにも使用した。
（図４）はプロモーターＰN25 の挿入およびプロモータ
ーＰN25 とｌａｃオペレーターの融合に使用しただけで
なく、得られたプロモーター／オペレーター融合体Ｐ
N25 ｘ/Oの機能を示すためにも使用した。
【００２４】ＰN25 プロモーターの材料としてよく記載
されているものがいくつかあるが、ＰN25 をＥｃｏＲＩ
断片上に保有するｐＤＳ１／ＰN25 ，ｔ0 １+ （図２）
プラスミドをその材料とし、ｌａｃオペレーターの２１
塩基対を含むｐＥＸＯ７ｌａｃ ｏｐ２（図３）；Ｈ．
Ｗｅｉｈｅｒ，“Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ ｚｕ
ｒ Ｓｔｒｕｋｔｕｒ ｕｎｄ Ｆｕｎｋｔｉｏｎ ｖ
ｏｎ Ｅ． ｃｏｌｉＰｒｏｍｏｔｏｒｅｎ：Ｖａｒｉ
ａｔｉｏｎ ｄｅｓ Ｌａｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｄ
ｕｒｃｈ ｇｅｚｉｅｌｔｅ Ｎｅｕ−ｋｏｎｓｔｒｕ
ｋｔｉｏｎｖｏｎ Ｔｅｉｌｓｅｑｕｅｎｚｅｎ ｕｎ
ｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｅ”，西独ハイデルベルグ大学
博士論文〔１９８０年〕）をプロモーター／オペレータ
ー融合のオペレーター部分の材料として選んだ。ｌａｃ
レプレッサーはｌａｃ Ｉ遺伝子でコードされる。プロ
モーターはレプレッサー分子が十分量存在する時のみレ
プレッサーがオペレーターに結合することにより効率よ
く抑制されるのでｌａｃ Ｉq 配列をプロモーター変異
と共に用い、レプレッサー分子が十分量供給されるよう
に遺伝子の転写を増強するようにした。このｌａｃ Ｉ
遺伝子変異の材料としてプラスミドｐＩＸ，１を用いた
（図５）。
されているものがいくつかあるが、ＰN25 をＥｃｏＲＩ
断片上に保有するｐＤＳ１／ＰN25 ，ｔ0 １+ （図２）
プラスミドをその材料とし、ｌａｃオペレーターの２１
塩基対を含むｐＥＸＯ７ｌａｃ ｏｐ２（図３）；Ｈ．
Ｗｅｉｈｅｒ，“Ｕｎｔｅｒｓｕｃｈｕｎｇｅｎ ｚｕ
ｒ Ｓｔｒｕｋｔｕｒ ｕｎｄ Ｆｕｎｋｔｉｏｎ ｖ
ｏｎ Ｅ． ｃｏｌｉＰｒｏｍｏｔｏｒｅｎ：Ｖａｒｉ
ａｔｉｏｎ ｄｅｓ Ｌａｃ Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｄ
ｕｒｃｈ ｇｅｚｉｅｌｔｅ Ｎｅｕ−ｋｏｎｓｔｒｕ
ｋｔｉｏｎｖｏｎ Ｔｅｉｌｓｅｑｕｅｎｚｅｎ ｕｎ
ｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｅ”，西独ハイデルベルグ大学
博士論文〔１９８０年〕）をプロモーター／オペレータ
ー融合のオペレーター部分の材料として選んだ。ｌａｃ
レプレッサーはｌａｃ Ｉ遺伝子でコードされる。プロ
モーターはレプレッサー分子が十分量存在する時のみレ
プレッサーがオペレーターに結合することにより効率よ
く抑制されるのでｌａｃ Ｉq 配列をプロモーター変異
と共に用い、レプレッサー分子が十分量供給されるよう
に遺伝子の転写を増強するようにした。このｌａｃ Ｉ
遺伝子変異の材料としてプラスミドｐＩＸ，１を用いた
（図５）。
【００２５】Ｂ．プラスミドｐＤＳ１，ｔ0 １+ ｐＤＳ１，ｔ0 １+ （図１；Ｄ．Ｓｔｕｂｅｒおよび
Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ，前述）の中で宿主中でプラスミドの
ＤＮＡ複製および保持に必要な領域を含むＸｂａＩとＥ
ｃｏＲＩ部位の間並びにアンピシリン耐性を示すβ−ラ
クタマーゼの全遺伝子部分はｐＢＲ３２２由来である
（Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒら、“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｎｅｗ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｈｉｃｌｅｓ II．Ａ
ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔ
ｅｍ．”Ｇｅｎｅ，第２巻、９５〜１１３頁〔１９７
７〕；Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，前述）。プラスミ
ドの残りの部分にはＸｈｏＩ，ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩ制限酵素部位と続いてマウスＡＴ−３０００細胞株
のジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする領域（Ａ．
Ｃ．Ｙ．Ｃｈａｎｇら、“Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｆ ａＤＮ
Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｍｏｕ
ｓｅ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓ
ｅ”，Ｎａｔｕｒｅ，２７５巻，６１７〜６２４頁〔１
９７８年〕；Ｊ．Ｎ．ＭａｓｔｅｒｓおよびＧ．Ａｔｔ
ａｒｄｉ，“Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡｃｏｄｉｎｇ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌｉｃ
ａｃｉｄ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ”，Ｇｅｎｅ，２１巻，
５９〜６３頁〔１９８３年〕）、ラムダファージのター
ミネーターｔ0 （Ｅ．Ｓｃｈｗａｒｚら、“Ｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｒｏ，ｃII
ａｎｄ ｐａｒｔ ｏｆ Ｏ ｇｅｎｅ ｉｎ ｐｈａ
ｇｅ λＤＮＡ”，Ｎａｔｕｒｅ，２７２巻、４１０〜
４１４頁〔１９７８年〕；Ｄ．ＳｔｕｂｅｒおよびＨ．
Ｂｕｊａｒｄ，前述）、およびプロモーターを除去した
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（Ｒ．Ｍａｒｃｏｌｉら、“Ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ＩＳ１−ｆｌａｎｋｅｄ ｔｒ
ａｎｓｐｏｓｏｎ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓ
ｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｈｌｏｒａｗｐｈｅｎｉｃｏｌ
ａｎｄｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ”，ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ，１１０巻、１１〜１４頁〔１９８０年〕を含
んでいる。
Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ，前述）の中で宿主中でプラスミドの
ＤＮＡ複製および保持に必要な領域を含むＸｂａＩとＥ
ｃｏＲＩ部位の間並びにアンピシリン耐性を示すβ−ラ
クタマーゼの全遺伝子部分はｐＢＲ３２２由来である
（Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒら、“Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｎｅｗ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｈｉｃｌｅｓ II．Ａ
ｍｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｓｙｓｔ
ｅｍ．”Ｇｅｎｅ，第２巻、９５〜１１３頁〔１９７
７〕；Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，前述）。プラスミ
ドの残りの部分にはＸｈｏＩ，ＥｃｏＲＩおよびＢａｍ
ＨＩ制限酵素部位と続いてマウスＡＴ−３０００細胞株
のジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする領域（Ａ．
Ｃ．Ｙ．Ｃｈａｎｇら、“Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｅｘ
ｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｆ ａＤＮ
Ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｍｏｕ
ｓｅ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓ
ｅ”，Ｎａｔｕｒｅ，２７５巻，６１７〜６２４頁〔１
９７８年〕；Ｊ．Ｎ．ＭａｓｔｅｒｓおよびＧ．Ａｔｔ
ａｒｄｉ，“Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡｃｏｄｉｎｇ ｆｏ
ｒ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌｉｃ
ａｃｉｄ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ”，Ｇｅｎｅ，２１巻，
５９〜６３頁〔１９８３年〕）、ラムダファージのター
ミネーターｔ0 （Ｅ．Ｓｃｈｗａｒｚら、“Ｎｕｃｌｅ
ｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｃｒｏ，ｃII
ａｎｄ ｐａｒｔ ｏｆ Ｏ ｇｅｎｅ ｉｎ ｐｈａ
ｇｅ λＤＮＡ”，Ｎａｔｕｒｅ，２７２巻、４１０〜
４１４頁〔１９７８年〕；Ｄ．ＳｔｕｂｅｒおよびＨ．
Ｂｕｊａｒｄ，前述）、およびプロモーターを除去した
クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（Ｒ．Ｍａｒｃｏｌｉら、“Ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕ
ｅｎｃｅ ｏｆ ａｎ ＩＳ１−ｆｌａｎｋｅｄ ｔｒ
ａｎｓｐｏｓｏｎ ｃｏｄｉｎｇ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓ
ｔａｎｃｅ ｔｏ ｃｈｌｏｒａｗｐｈｅｎｉｃｏｌ
ａｎｄｆｕｓｉｄｉｃ ａｃｉｄ”，ＦＥＢＳ Ｌｅｔ
ｔｅｒｓ，１１０巻、１１〜１４頁〔１９８０年〕を含
んでいる。
【００２６】Ｃ．プラスミドｐＤＳ１／ＰN25 ，ｔ0 １
+ プラスミドｐＤＳ１／ＰN25 ，ｔ0 １+ （図２）はｐＤ
Ｓ１，ｔ0 １+ （図１）と同じであるが唯、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｔ５ファージのＸｈｏＩ断片プロモーター（Ａ．ｖ
ｏｎ ＧａｂａｉｎおよびＨ．Ｂｕｊａｒｄ，上記；
Ｄ．Ｓｔｕｂｅｒら，“Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏ
ｓｃｏｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ
ｅｓ；ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ ｃｏｌｉｐｈａｇｅＴ５ ｇｅｎｏｍ
ｅ”，Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎ．，１６６巻，１４
１〜１４９頁〔１９７８年〕；Ｈ．Ｂｕｊａｒｄら、前
述）を含んでいる。
+ プラスミドｐＤＳ１／ＰN25 ，ｔ0 １+ （図２）はｐＤ
Ｓ１，ｔ0 １+ （図１）と同じであるが唯、Ｅ．ｃｏｌ
ｉ Ｔ５ファージのＸｈｏＩ断片プロモーター（Ａ．ｖ
ｏｎ ＧａｂａｉｎおよびＨ．Ｂｕｊａｒｄ，上記；
Ｄ．Ｓｔｕｂｅｒら，“Ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏ
ｓｃｏｐｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆｉｎ ｖｉｔｒ
ｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｍｐｌｅｘ
ｅｓ；ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｏ
ｆ ｔｈｅ ｃｏｌｉｐｈａｇｅＴ５ ｇｅｎｏｍ
ｅ”，Ｍｏｌｅｃ．ｇｅｎ．Ｇｅｎ．，１６６巻，１４
１〜１４９頁〔１９７８年〕；Ｈ．Ｂｕｊａｒｄら、前
述）を含んでいる。
【００２７】Ｄ．プラスミドｐＥＸＯ７ｌａｃ ｏｐ２ プラスミドｐＥＸＯ７ｌａｃ ｏｐ２（図３）、Ｈ．Ｗ
ｅｉｈｅｒ，前述）はｐＢＲ３２２の誘導体であり、
（Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒら，上記；Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉ
ｆｆｅ，前述），ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片がｌａｃオペレーター配列の２１塩基対を含
むＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌ
ｅｒおよびＷ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，上記）と置換
している。
ｅｉｈｅｒ，前述）はｐＢＲ３２２の誘導体であり、
（Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒら，上記；Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉ
ｆｆｅ，前述），ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ／Ｈｉｎｄ
ＩＩＩ断片がｌａｃオペレーター配列の２１塩基対を含
むＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ断片（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌ
ｅｒおよびＷ．Ｓ．Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，上記）と置換
している。
【００２８】Ｅ．プラスミドｐＤＳ１，ｔ0 ２+ ｐＤＳ１，ｔ0 ２+ （図４，Ｄ．Ｓｔｕｂｅｒおよび
Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ，前述）の宿主内に於けるＤＮＡ複製
およびプラスミド保持に必要な領域を含むＸｂａＩおよ
びＸｈｏＩの制限部位の間の部分とアンピシリン耐性を
示すβ−ラクタマーゼの全遺伝子はｐＢＲ３２２由来で
ある（Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒら，前述；Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃ
ｌｉｆｆｅ，前述）。プラスミドの残りの部分はＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位、さらにマウスＡＴ−３
０００細胞株のジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする
領域、続いてプロモーターを除いたクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｒ．Ｍａｒｃｏ
ｌｉら，前述）およびファージラムダのターミネーター
ｔ0 （Ｅ．Ｓｃｈｗａｒｚら，前述）を有している。
Ｈ．Ｂｕｊａｒｄ，前述）の宿主内に於けるＤＮＡ複製
およびプラスミド保持に必要な領域を含むＸｂａＩおよ
びＸｈｏＩの制限部位の間の部分とアンピシリン耐性を
示すβ−ラクタマーゼの全遺伝子はｐＢＲ３２２由来で
ある（Ｆ．Ｂｏｌｉｖａｒら，前述；Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃ
ｌｉｆｆｅ，前述）。プラスミドの残りの部分はＥｃｏ
ＲＩおよびＢａｍＨＩ制限部位、さらにマウスＡＴ−３
０００細胞株のジヒドロ葉酸レダクターゼをコードする
領域、続いてプロモーターを除いたクロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｒ．Ｍａｒｃｏ
ｌｉら，前述）およびファージラムダのターミネーター
ｔ0 （Ｅ．Ｓｃｈｗａｒｚら，前述）を有している。
【００２９】Ｆ．プラスミドｐＤＳＩＸ，１ プラスミドｐＤＳＩＸ，１（図５）はｐＤＳ１，ｔ0 １
+ （図１）と同じｐＢＲ３２２領域を保有している。そ
れに加えて、ｌａｃレプレッサーの全遺伝子（Ｐ．Ｊ．
Ｆａｒａｂａｕｇｈ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈ
ｅ ｌａｃ Ｉｇｅｎｅ”，Ｎａｔｕｒｅ，２７４巻，
７６５〜７６５頁〔１９７８年〕）のプロモーター変異
Ｉq （Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，前述）、続いてＥｃｏＲＩ
およびＸｈｏＩ制限酵素部位、さらにβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子の調節領域とコード領域の一部（Ｋ．Ｋａｌ
ｎｉｎｓら，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌａ
ｃ Ｚ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ”，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，２巻，５９３〜５
９７頁〔１９８３年〕；Ｒ．Ｇｅｎｔｚら，“Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｒｏｎ
ｇ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｓ ｍａｄｅ ｐｏｓｓｉ
ｂｌｅ ｂｙ ｔｈｅ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｌａ
ｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＲＮＡ ｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｏｎ ｓｉｇｎａｌ”，ＰＮＡＳ，７８巻，４９３６〜
４９４０頁〔１９８１年〕）およびプロモーターを除い
たクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子（Ｒ．Ｍａｒｃｏｌｉら，前述）を含んでいる。
+ （図１）と同じｐＢＲ３２２領域を保有している。そ
れに加えて、ｌａｃレプレッサーの全遺伝子（Ｐ．Ｊ．
Ｆａｒａｂａｕｇｈ，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈ
ｅ ｌａｃ Ｉｇｅｎｅ”，Ｎａｔｕｒｅ，２７４巻，
７６５〜７６５頁〔１９７８年〕）のプロモーター変異
Ｉq （Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，前述）、続いてＥｃｏＲＩ
およびＸｈｏＩ制限酵素部位、さらにβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子の調節領域とコード領域の一部（Ｋ．Ｋａｌ
ｎｉｎｓら，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌａ
ｃ Ｚ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃ
ｏｌｉ”，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊ．，２巻，５９３〜５
９７頁〔１９８３年〕；Ｒ．Ｇｅｎｔｚら，“Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｔｒｏｎ
ｇ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｉｓ ｍａｄｅ ｐｏｓｓｉ
ｂｌｅ ｂｙ ｔｈｅ ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ ｐｌａ
ｃｅｍｅｎｔ ｏｆ ａ ＲＮＡ ｔｅｒｍｉｎａｔｉ
ｏｎ ｓｉｇｎａｌ”，ＰＮＡＳ，７８巻，４９３６〜
４９４０頁〔１９８１年〕）およびプロモーターを除い
たクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺
伝子（Ｒ．Ｍａｒｃｏｌｉら，前述）を含んでいる。
【００３０】実施例２ プロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/Oを有する
プラスミドｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ の構築 プロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/Oを調製
し、ｐＤＳ１，ｔ0 ２+に挿入してｐＤＳ２／ＰN25 ｘ
/O' ｔ0 ２+ を得た。手順は図６に示し、以下に詳細に
説明する。
プラスミドｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ の構築 プロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/Oを調製
し、ｐＤＳ１，ｔ0 ２+に挿入してｐＤＳ２／ＰN25 ｘ
/O' ｔ0 ２+ を得た。手順は図６に示し、以下に詳細に
説明する。
【００３１】Ａ．プロモーター／オペレーター融合体の
プロモーター部分の調製 ａ）ＰN25 を含むＥｃｏＲＩ断片の単離 プロモーターＰN25 を含むＥｃｏＲＩ断片を単離するた
め、プラスミドｐＤＳ１／ＰN25 ，ｔ0 １+ ３２．５μ
ｇをＥｃｏＲＩで消化し（図６Ａ）、フェノール抽出後
エーテル処理し、エタノール沈澱してＤＮＡ断片を６％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。臭化エチ
ジウムで、ＤＮＡを染色して検出後、ＰN25 を含む断片
をゲルから切り出し、２．５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．
６）と０．２５ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中１０時間
振とうしてゲルから溶出した。遠心分離によりゲル切片
を除去した後、得られた上澄液をフェノールで抽出、エ
ーテルで処理してＤＮＡ断片をエタノール沈でんにより
集めた。このようにして、１．３μｇのプロモーター断
片を単離した。
プロモーター部分の調製 ａ）ＰN25 を含むＥｃｏＲＩ断片の単離 プロモーターＰN25 を含むＥｃｏＲＩ断片を単離するた
め、プラスミドｐＤＳ１／ＰN25 ，ｔ0 １+ ３２．５μ
ｇをＥｃｏＲＩで消化し（図６Ａ）、フェノール抽出後
エーテル処理し、エタノール沈澱してＤＮＡ断片を６％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した。臭化エチ
ジウムで、ＤＮＡを染色して検出後、ＰN25 を含む断片
をゲルから切り出し、２．５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．
６）と０．２５ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中１０時間
振とうしてゲルから溶出した。遠心分離によりゲル切片
を除去した後、得られた上澄液をフェノールで抽出、エ
ーテルで処理してＤＮＡ断片をエタノール沈でんにより
集めた。このようにして、１．３μｇのプロモーター断
片を単離した。
【００３２】ｂ）ＥｃｏＲＩ断片のＨｉｎｆＩによる部
分消化 １μｇのＥｃｏＲＩ断片を１００ｍＭ食塩を含む緩衝液
１２０μｌ中で２１単位のＨｉｎｆＩで３７℃９分間反
応させた。酵素を６５℃７分間処理して失活させ、フェ
ノールで３回抽出して除去した。エーテル抽出により残
留フェノールを除去した後、ＤＮＡをエタノールで沈で
んし、５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ食塩を含む緩衝液中で保存し
た。６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によるＤＮ
Ａ分析でＥｃｏＲＩ断片分子のおよそ６０％がＨｉｎｆ
Ｉで切断されたことがわかった。
分消化 １μｇのＥｃｏＲＩ断片を１００ｍＭ食塩を含む緩衝液
１２０μｌ中で２１単位のＨｉｎｆＩで３７℃９分間反
応させた。酵素を６５℃７分間処理して失活させ、フェ
ノールで３回抽出して除去した。エーテル抽出により残
留フェノールを除去した後、ＤＮＡをエタノールで沈で
んし、５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）、０．５ｍＭ
ＥＤＴＡおよび１００ｍＭ食塩を含む緩衝液中で保存し
た。６％ポリアクリルアミドゲルの電気泳動によるＤＮ
Ａ分析でＥｃｏＲＩ断片分子のおよそ６０％がＨｉｎｆ
Ｉで切断されたことがわかった。
【００３３】ｃ）３′−末端のＤＮＡポリメラーゼＩに
よる伸長ＨｉｎｆＩ消化ＤＮＡ０．１７μｇを１００ｍ
Ｍりん酸カリ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化カリ、７
ｍＭ塩化マグネシウム、４種のデオキシヌクレオシド三
りん酸各２５μＭおよび５単位のＤＮＡポリメラーゼＩ
を含む緩衝液２５μｌ中、２０℃４０分間反応させた。
フェノール抽出により酵素を除去した後、溶液を２．５
ｍＭトリス、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ酢
酸カリより成る緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ７５を通してクロマトグラフにかけた。Ｄ
ＮＡを含む分画を合わせてからＤＮＡをエタノールで沈
でんし、５０ｍＭ食塩を添加したライゲーション緩衝液
中で保存した。得られた０．０８μｇＤＮＡ含有溶液は
断片１（図６Ａ）を有した。
よる伸長ＨｉｎｆＩ消化ＤＮＡ０．１７μｇを１００ｍ
Ｍりん酸カリ（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ塩化カリ、７
ｍＭ塩化マグネシウム、４種のデオキシヌクレオシド三
りん酸各２５μＭおよび５単位のＤＮＡポリメラーゼＩ
を含む緩衝液２５μｌ中、２０℃４０分間反応させた。
フェノール抽出により酵素を除去した後、溶液を２．５
ｍＭトリス、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡおよび５０ｍＭ酢
酸カリより成る緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したセフ
ァデックスＧ７５を通してクロマトグラフにかけた。Ｄ
ＮＡを含む分画を合わせてからＤＮＡをエタノールで沈
でんし、５０ｍＭ食塩を添加したライゲーション緩衝液
中で保存した。得られた０．０８μｇＤＮＡ含有溶液は
断片１（図６Ａ）を有した。
【００３４】Ｂ．プロモーター／オペレーター融合体の
オペレーター部分の調製
オペレーター部分の調製
【００３５】ａ）ｐＥＸＯ７１ａｃ ｏｐ２の部分消化 プラスミドｐＥＸ０７ｌａｃ ｏｐ２（図６Ａ）１４．
５μｇを１．５単位のＥｃｏＲＩを含む２５０μｌ溶液
中で３７℃５０分インキュベートした。反応後、酵素を
６５℃７分処理により不活化し、フェノール抽出により
除去した。残留フェノールをエーテルで除いた後、ＤＮ
Ａをエタノールで沈でんし、２．５ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．６）および０．２５ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液
中で保存した。６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
ＤＮＡを分析した結果、プラスミド分子のおよそ５０％
が線状化したことがわかった。ｂ）５′接着末端のＳ１
ヌクレアーゼによる処理５′突出末端を除くために、Ｅ
ｃｏＲＩ消化ＤＮＡを一本鎖に特異的なヌクレアーゼＳ
１で処理した（図６Ｂ）。三つの別の実験で１．７μｇ
のＤＮＡを２８０ｍＭの食塩、３０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．４）、４．５ｍＭ酢酸亜鉛および２０μｇ／
ｍｌのファージｆｄの一本鎖ＤＮＡを含む５０μｌの緩
衝液中で、それぞれ１６０単位、８００単位および４０
００単位のＳ１ヌクレアーゼ（西独、マンハイム、ベー
リンガー社）と２０℃３０分間インキュベートした。反
応は酢酸アンモニウムおよびＥＤＴＡを最終濃度が夫々
０．５Ｍ、１０ｍＭとなるよう加えて６５℃７分間イン
キュベートして停止した。たん白をフェノール抽出およ
びエーテル処理により除去し、三つの反応液を合わせて
２．５ｍＭトリス塩酸、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡおよび
５０ｍＭ酢酸カリより成るｐＨ７．０の緩衝液で平衡化
したセファデックスＧ７５を通してクロマトグラフィに
かけた。ＤＮＡを含む分画を集め、ＤＮＡをエタノール
で沈でんし、ライゲーション緩衝液中で保存した。得ら
れた４．３μｇＤＮＡを含む溶液は断片２を含有してい
た（図６Ｂ）。
５μｇを１．５単位のＥｃｏＲＩを含む２５０μｌ溶液
中で３７℃５０分インキュベートした。反応後、酵素を
６５℃７分処理により不活化し、フェノール抽出により
除去した。残留フェノールをエーテルで除いた後、ＤＮ
Ａをエタノールで沈でんし、２．５ｍＭトリス塩酸（ｐ
Ｈ７．６）および０．２５ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液
中で保存した。６％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
ＤＮＡを分析した結果、プラスミド分子のおよそ５０％
が線状化したことがわかった。ｂ）５′接着末端のＳ１
ヌクレアーゼによる処理５′突出末端を除くために、Ｅ
ｃｏＲＩ消化ＤＮＡを一本鎖に特異的なヌクレアーゼＳ
１で処理した（図６Ｂ）。三つの別の実験で１．７μｇ
のＤＮＡを２８０ｍＭの食塩、３０ｍＭ酢酸ナトリウム
（ｐＨ４．４）、４．５ｍＭ酢酸亜鉛および２０μｇ／
ｍｌのファージｆｄの一本鎖ＤＮＡを含む５０μｌの緩
衝液中で、それぞれ１６０単位、８００単位および４０
００単位のＳ１ヌクレアーゼ（西独、マンハイム、ベー
リンガー社）と２０℃３０分間インキュベートした。反
応は酢酸アンモニウムおよびＥＤＴＡを最終濃度が夫々
０．５Ｍ、１０ｍＭとなるよう加えて６５℃７分間イン
キュベートして停止した。たん白をフェノール抽出およ
びエーテル処理により除去し、三つの反応液を合わせて
２．５ｍＭトリス塩酸、０．２５ｍＭ ＥＤＴＡおよび
５０ｍＭ酢酸カリより成るｐＨ７．０の緩衝液で平衡化
したセファデックスＧ７５を通してクロマトグラフィに
かけた。ＤＮＡを含む分画を集め、ＤＮＡをエタノール
で沈でんし、ライゲーション緩衝液中で保存した。得ら
れた４．３μｇＤＮＡを含む溶液は断片２を含有してい
た（図６Ｂ）。
【００３６】Ｃ．プロモーター／オペレーター融合体を
挿入したプラスミドｐＤＳ１，ｔ0２+ の調製 プロモーター／オペレーター融合体を挿入するベクター
としてＰＤＳ１，ｔ0２+ （図４）を選択した。そこで
本プラスミドのＤＮＡ５．１μｇをＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＸｈｏＩで完全消化した（図６Ｃ）。反応後酵素を６
５℃７分間処理して失活させ、たん白をフェノール抽出
してエーテル処理により除去した後、ＤＮＡをエタノー
ルで沈でんさせ、２．５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）
および０．２５ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中で保存し
た。
挿入したプラスミドｐＤＳ１，ｔ0２+ の調製 プロモーター／オペレーター融合体を挿入するベクター
としてＰＤＳ１，ｔ0２+ （図４）を選択した。そこで
本プラスミドのＤＮＡ５．１μｇをＨｉｎｄＩＩＩおよ
びＸｈｏＩで完全消化した（図６Ｃ）。反応後酵素を６
５℃７分間処理して失活させ、たん白をフェノール抽出
してエーテル処理により除去した後、ＤＮＡをエタノー
ルで沈でんさせ、２．５ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．６）
および０．２５ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中で保存し
た。
【００３７】Ｄ．ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ を構築するためにＰ
N25 ｘ/Oのプロモーター部分（断片１）とオペレーター
部分（断片２）を併せて連結し、得られた融合体を次い
でｐＤＳ１，ｔ0 ２+ に（図６Ｃ）挿入した。プロモー
ターとオペレーターの融合には断片１を含むＤＮＡ混合
物０．０５μｇと断片２を含むＤＮＡ混合物３．５μｇ
とを２５ｍＭ食塩を含むライゲーション緩衝液中で５単
位のＴ４−ＤＮＡライゲースと１５℃７時間反応させ
た。酵素を６５℃７分処理して失活させた後、反応液を
２０単位のＨｉｎｄＩＩＩおよび１５単位のＸｈｏＩと
３７℃１時間インキュベートしてＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片としてプロモーター／オペレーター融合体を得
た。制限酵素を６５℃で失活させ、フェノール抽出、エ
ーテル処理で除去した後、ＤＮＡをエタノールで沈でん
させ、２５ｍＭ塩化カリを加えたライゲーション緩衝液
に溶解した。ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化したプラ
スミドｐＤＳ１，ｔ0 ２+ ０．２５μｇと１．３単位の
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを添加し、反応液を１５℃に４時
間インキュベートした後、酵素を６５℃７分処理して失
活させた。
N25 ｘ/Oのプロモーター部分（断片１）とオペレーター
部分（断片２）を併せて連結し、得られた融合体を次い
でｐＤＳ１，ｔ0 ２+ に（図６Ｃ）挿入した。プロモー
ターとオペレーターの融合には断片１を含むＤＮＡ混合
物０．０５μｇと断片２を含むＤＮＡ混合物３．５μｇ
とを２５ｍＭ食塩を含むライゲーション緩衝液中で５単
位のＴ４−ＤＮＡライゲースと１５℃７時間反応させ
た。酵素を６５℃７分処理して失活させた後、反応液を
２０単位のＨｉｎｄＩＩＩおよび１５単位のＸｈｏＩと
３７℃１時間インキュベートしてＸｈｏＩ／ＨｉｎｄＩ
ＩＩ断片としてプロモーター／オペレーター融合体を得
た。制限酵素を６５℃で失活させ、フェノール抽出、エ
ーテル処理で除去した後、ＤＮＡをエタノールで沈でん
させ、２５ｍＭ塩化カリを加えたライゲーション緩衝液
に溶解した。ＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩで消化したプラ
スミドｐＤＳ１，ｔ0 ２+ ０．２５μｇと１．３単位の
Ｔ４−ＤＮＡリガーゼを添加し、反応液を１５℃に４時
間インキュベートした後、酵素を６５℃７分処理して失
活させた。
【００３８】Ｅ．ｃｏｌｉ Ｃ６００（塩化カルシウム
コンピーテント）を上述のライゲーション液の半量を用
い、適当な条件下で形質転換した。形質転換株は、０．
２％グルコース、０．５％カゼイン加水分解物、１０ｍ
ｇ／ＬのビタミンＢ１、４０ｍｇ／ＬのＸ−ｇａｌ（５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシド）および１０〜２００μｇ／ｍｌのクロラムフ
ェニコールを添加したＭ９−培地（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅ
ｒ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，４３１〜４３２頁
〔１９７２年〕）基本の最少寒天培地上３７℃選択し
た。
コンピーテント）を上述のライゲーション液の半量を用
い、適当な条件下で形質転換した。形質転換株は、０．
２％グルコース、０．５％カゼイン加水分解物、１０ｍ
ｇ／ＬのビタミンＢ１、４０ｍｇ／ＬのＸ−ｇａｌ（５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラ
クトシド）および１０〜２００μｇ／ｍｌのクロラムフ
ェニコールを添加したＭ９−培地（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅ
ｒ，“Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，４３１〜４３２頁
〔１９７２年〕）基本の最少寒天培地上３７℃選択し
た。
【００３９】プロモーターがクロラムフェニコールアセ
チルトランスフェラーゼのプロモーターを持たない遺伝
子の前に挿入したプラスミドｐＤＳ１，ｔ0 ２+ を含む
形質転換株のみ１０μｇ／ｍｌ以上の濃度のクロラムフ
ェニコールを含む平板上に生育する筈である。さらに、
このマーカー遺伝子の前にＰN25 ｘ/Oが挿入したｐＤＳ
１，ｔ0 ２+ を含む形質転換株はこの平板上で青色にな
る筈である。それは宿主のｌａｃ系がｌａｃレプレッサ
ー分子がプラスミド上に存在するオペレーター配列と結
合することにより誘導され、その結果、無色のＸ−ｇａ
ｌが分解して青色の誘導体となるからである。このよう
にして５０μｇ／ｍｌ以上の濃度のクロラムフェニコー
ルを含む平板から１８個の青色形質転換株を選択し、そ
れらを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−培
地中３７℃で生育させた。得られた培養物から常法によ
りＤＮＡを単離し、その大きさおよびＥｃｏＲＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩおよびＸｈｏＩの制限酵素部位
の存在を確認した。６％ポリアクリルアミドゲルを用い
た消化断片の電気泳動で予想通りのパターンを示した一
つのプラスミドをｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ と命
名した（図６Ｃ）。このプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−
ＸｈｏＩ断片の配列分析により図７に示すようなプロモ
ーターＰN25 ｘ/Oの配列であることを確認した。
チルトランスフェラーゼのプロモーターを持たない遺伝
子の前に挿入したプラスミドｐＤＳ１，ｔ0 ２+ を含む
形質転換株のみ１０μｇ／ｍｌ以上の濃度のクロラムフ
ェニコールを含む平板上に生育する筈である。さらに、
このマーカー遺伝子の前にＰN25 ｘ/Oが挿入したｐＤＳ
１，ｔ0 ２+ を含む形質転換株はこの平板上で青色にな
る筈である。それは宿主のｌａｃ系がｌａｃレプレッサ
ー分子がプラスミド上に存在するオペレーター配列と結
合することにより誘導され、その結果、無色のＸ−ｇａ
ｌが分解して青色の誘導体となるからである。このよう
にして５０μｇ／ｍｌ以上の濃度のクロラムフェニコー
ルを含む平板から１８個の青色形質転換株を選択し、そ
れらを１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−培
地中３７℃で生育させた。得られた培養物から常法によ
りＤＮＡを単離し、その大きさおよびＥｃｏＲＩ、Ｈｉ
ｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩおよびＸｈｏＩの制限酵素部位
の存在を確認した。６％ポリアクリルアミドゲルを用い
た消化断片の電気泳動で予想通りのパターンを示した一
つのプラスミドをｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ と命
名した（図６Ｃ）。このプラスミドのＨｉｎｄＩＩＩ−
ＸｈｏＩ断片の配列分析により図７に示すようなプロモ
ーターＰN25 ｘ/Oの配列であることを確認した。
【００４０】実施例３ プロモーターＰN25 ｘ/Oを含むプラスミドｐＤＳＸＩ
Ｉ，３，ｐＤＳ３，ＰN25ｘ/O' ｔ0 ２+ およびｐＤＳ
ＸＩＩＩ，１の構築 ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ （レプレッサー遺伝子
を欠いている）に加えて、さらに３つのプロモーター／
オペレーター融合体ＰN25 ｘ/O' を含むプラスミド、即
ち、ｐＤＳＸＩＩ，３（ｐＤＳＩＩＩ，１構築のための
中間体）、ｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ （本発明に
係るプラスミドの例として）およびｐＤＳＩＩＩ，１
（ＲＢＳを欠いていてｃａｔ遺伝子の一部を削除したも
の；比較の目的で陰性対照として）、をＰN25 ｘ/Oの機
能を示すためデザインした。これらのプラスミドの構築
は図８に示し、以下に詳細に記す。
Ｉ，３，ｐＤＳ３，ＰN25ｘ/O' ｔ0 ２+ およびｐＤＳ
ＸＩＩＩ，１の構築 ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ （レプレッサー遺伝子
を欠いている）に加えて、さらに３つのプロモーター／
オペレーター融合体ＰN25 ｘ/O' を含むプラスミド、即
ち、ｐＤＳＸＩＩ，３（ｐＤＳＩＩＩ，１構築のための
中間体）、ｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ （本発明に
係るプラスミドの例として）およびｐＤＳＩＩＩ，１
（ＲＢＳを欠いていてｃａｔ遺伝子の一部を削除したも
の；比較の目的で陰性対照として）、をＰN25 ｘ/Oの機
能を示すためデザインした。これらのプラスミドの構築
は図８に示し、以下に詳細に記す。
【００４１】Ａ．プラスミドｐＤＳＸＩＩ，３の構築 プラスミドｐＤＳＸＩＩ，３はｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O'
ｔ0 ２+ に由来し、このプラスミドからＨｉｎｄＩＩＩ
制限酵素部位とクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ遺伝子の一部を含むＥｃｏＲＩ−断片を削除
したものである（図８Ａ）。このために０．４５μｇの
ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ をＥｃｏＲＩ制限酵素
で完全消化した。酵素をフェノール抽出により除去した
後、溶液を２．５ｍＭトリス／塩酸および０．２５ｍＭ
ＥＤＴＡより成る緩衝液、ｐＨ７．６で平衡化したセ
ファデックスＧ７５を通してクロマトグラフィーにかけ
た。ＤＮＡを含む分画を集めて凍結乾燥により濃縮し
た。ＥｃｏＲＩ消化したプラスミド０．１３μｇを１０
０μｌのライゲーション緩衝液中で１．３単位のＴ４−
ＤＮＡリガーゼと１５℃で５時間反応した後、酵素を６
５℃７分間処理して失活させた。
ｔ0 ２+ に由来し、このプラスミドからＨｉｎｄＩＩＩ
制限酵素部位とクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼ遺伝子の一部を含むＥｃｏＲＩ−断片を削除
したものである（図８Ａ）。このために０．４５μｇの
ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ をＥｃｏＲＩ制限酵素
で完全消化した。酵素をフェノール抽出により除去した
後、溶液を２．５ｍＭトリス／塩酸および０．２５ｍＭ
ＥＤＴＡより成る緩衝液、ｐＨ７．６で平衡化したセ
ファデックスＧ７５を通してクロマトグラフィーにかけ
た。ＤＮＡを含む分画を集めて凍結乾燥により濃縮し
た。ＥｃｏＲＩ消化したプラスミド０．１３μｇを１０
０μｌのライゲーション緩衝液中で１．３単位のＴ４−
ＤＮＡリガーゼと１５℃で５時間反応した後、酵素を６
５℃７分間処理して失活させた。
【００４２】Ｅ．ｃｏｌｉ Ｍ１５（塩化カルシウムコ
ンピーテント）で適当な条件下でリガーゼ処理した０．
０７μｇのＤＮＡで形質転換した。形質転換株は０．２
％グルコース、０．５％カゼイン加水分解物、１０ｍｇ
／ＬビタミンＢ１、４０ｍｇ／ＬのＸ−ｇａｌおよび１
ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を添
加したＭ９−培地（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，前述）を基
にし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは５０μｇ
／ｍｌのクロラムフェニコールを含む最少寒天平板上３
７℃で選択した。
ンピーテント）で適当な条件下でリガーゼ処理した０．
０７μｇのＤＮＡで形質転換した。形質転換株は０．２
％グルコース、０．５％カゼイン加水分解物、１０ｍｇ
／ＬビタミンＢ１、４０ｍｇ／ＬのＸ−ｇａｌおよび１
ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）を添
加したＭ９−培地（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，前述）を基
にし、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンまたは５０μｇ
／ｍｌのクロラムフェニコールを含む最少寒天平板上３
７℃で選択した。
【００４３】クロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼ遺伝子の一部を含むＥｃｏＲＩ断片の欠失によ
りクロラムフェニコールの耐性を失なっているので、ア
ンピシリン含有平板上でクロラムフェニコール含有平板
のおよそ４０倍の転換株が得られた。アンピシリン耐性
の４株の形質転換株を選択し、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ−培地で生育させた。培養物から常
法により単離したＤＮＡにつき大きさおよび制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩ、ＰｓｔＩおよ
びＸｈｏＩの切断部位の存在を分析した。６％ポリアク
リルアミドゲルの電気泳動で予測されるパターンを示し
たプラスミド一つをｐＤＳＸＩＩ，３と命名した（図８
Ａ）。
ェラーゼ遺伝子の一部を含むＥｃｏＲＩ断片の欠失によ
りクロラムフェニコールの耐性を失なっているので、ア
ンピシリン含有平板上でクロラムフェニコール含有平板
のおよそ４０倍の転換株が得られた。アンピシリン耐性
の４株の形質転換株を選択し、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ−培地で生育させた。培養物から常
法により単離したＤＮＡにつき大きさおよび制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩ、ＰｓｔＩおよ
びＸｈｏＩの切断部位の存在を分析した。６％ポリアク
リルアミドゲルの電気泳動で予測されるパターンを示し
たプラスミド一つをｐＤＳＸＩＩ，３と命名した（図８
Ａ）。
【００４４】Ｂ．プラスミドｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O' ｔ
0 ２+ およびｐＤＳＸＩＩＩ，１の構築 プラスミドｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ およびｐＤ
ＳＸＩＩＩ，１はプラスミドｐＤＳＩＸ，１の適当な断
片と、それぞれｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２ + （図８
Ｂ）またはｐＤＳＸＩＩ，３（図８Ｃ）とを結合したも
のである。この目的で、これら３つのプラスミド１．２
５μｇをそれぞれ別に、ＰｓｔＩとＸｈｏＩで完全消化
した。これらの酵素をフェノール抽出で抽出して除いた
後、溶液をそれぞれ、２．５ｍＭトリス−塩酸および
０．２５ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ７．６の緩衝液で平
衡化したセファデックスＧ７５を用いてクロマトグラフ
ィーにかけた。各クロマトのＤＮＡ含有分画を集めて凍
結乾燥にて濃縮した。
0 ２+ およびｐＤＳＸＩＩＩ，１の構築 プラスミドｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ およびｐＤ
ＳＸＩＩＩ，１はプラスミドｐＤＳＩＸ，１の適当な断
片と、それぞれｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２ + （図８
Ｂ）またはｐＤＳＸＩＩ，３（図８Ｃ）とを結合したも
のである。この目的で、これら３つのプラスミド１．２
５μｇをそれぞれ別に、ＰｓｔＩとＸｈｏＩで完全消化
した。これらの酵素をフェノール抽出で抽出して除いた
後、溶液をそれぞれ、２．５ｍＭトリス−塩酸および
０．２５ｍＭ ＥＤＴＡを含むｐＨ７．６の緩衝液で平
衡化したセファデックスＧ７５を用いてクロマトグラフ
ィーにかけた。各クロマトのＤＮＡ含有分画を集めて凍
結乾燥にて濃縮した。
【００４５】二つの別の反応でプラスミドｐＤＳＩＸ，
１とｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２ + 又はｐＤＳＩＸ，
１とｐＤＳＸＩＩ，３の０．１３μｇの消化ＤＮＡを６
０μｌのライゲーション緩衝液中、１．３単位のＴ４−
ＤＮＡリガーゼと１５℃１０時間反応させた後、酵素を
６５℃７分の処理で失活させた。続いて二つの別々の反
応で、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｍ１５（塩化カルシウムコンピー
テント）を０．１２μｇのリガーゼ処理したＤＮＡと適
当な条件化で反応させた。形質転換株は、０．２％グル
コース、０．５％カゼイン加水分解物、１０ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１，４０ｍｇ／Ｌ Ｘ−ｇａｌおよび１ｍＭ
ＩＰＴＧを添加し、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むＭ９−培地（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，前述）を基
本にした最少寒天平板上３７℃で選択した。各形質転換
から６個の白色転換株を選び、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ−培地で培養した。培養物からＤＮ
Ａを常法に従って単離し、その大きさおよび制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩ，ＰｓｔＩおよ
びＸｈｏＩの切断部位の存在を分析した。６％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で予想通りのパターンを示した
ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ /O' ｔ0 ２+ およびｐＤＳＸＩＩ，
３由来の２つのプラスミドをそれぞれｐＤＳ３／ＰN25
ｘ/O' ｔ0 ２+ （図８Ａ）およびｐＤＳＸＩＩＩ，１
（図８Ｃ）と命名した。
１とｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２ + 又はｐＤＳＩＸ，
１とｐＤＳＸＩＩ，３の０．１３μｇの消化ＤＮＡを６
０μｌのライゲーション緩衝液中、１．３単位のＴ４−
ＤＮＡリガーゼと１５℃１０時間反応させた後、酵素を
６５℃７分の処理で失活させた。続いて二つの別々の反
応で、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｍ１５（塩化カルシウムコンピー
テント）を０．１２μｇのリガーゼ処理したＤＮＡと適
当な条件化で反応させた。形質転換株は、０．２％グル
コース、０．５％カゼイン加水分解物、１０ｍｇ／Ｌ
ビタミンＢ１，４０ｍｇ／Ｌ Ｘ−ｇａｌおよび１ｍＭ
ＩＰＴＧを添加し、１００ｍｇ／ｍｌのアンピシリン
を含むＭ９−培地（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ，前述）を基
本にした最少寒天平板上３７℃で選択した。各形質転換
から６個の白色転換株を選び、１００μｇ／ｍｌのアン
ピシリンを含むＬＢ−培地で培養した。培養物からＤＮ
Ａを常法に従って単離し、その大きさおよび制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＨｉｎｆＩ，ＰｓｔＩおよ
びＸｈｏＩの切断部位の存在を分析した。６％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動で予想通りのパターンを示した
ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ /O' ｔ0 ２+ およびｐＤＳＸＩＩ，
３由来の２つのプラスミドをそれぞれｐＤＳ３／ＰN25
ｘ/O' ｔ0 ２+ （図８Ａ）およびｐＤＳＸＩＩＩ，１
（図８Ｃ）と命名した。
【００４６】実施例４ プロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/Oを含むプ
ラスミド中のクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼの発現 プロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/O' の有用
性を示すために、ＰN2 5 ｘ/Oを含むプラスミドを保有す
る細胞中に於けるクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼの合成を追跡した。ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ
/O' ｔ0 ２+ ，ｐＤＳＸＩＩＩ，１又はｐＤＳ３／Ｐ
N25 ｘ/O' ｔ0 ２+ で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１
５細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−
培地中１ｍＭＩＰＴＧの存在或いは非存在下、３７℃で
１．７×１０9 細胞／ｍｌの細胞濃度まで培養した。
１．５×１０8 個の細胞を遠心分離により集菌し、１％
ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノール、１０％グリセ
ロールおよび６２．５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ６．８）
を含む緩衝液に再けん濁した。試料を５分間沸とうし、
氷冷後１２０００ｘｇ３０秒遠心分離してＵ．レムリの
方法（Ｕ．Ｌａｅｍｍｌｉ，“Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ
ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉ
ｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅ
ａｄ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４”，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０〜６８２頁〔１９７０
年〕）に従ってＳＤＳ−含有ポリアクリルアミドゲル
（１２．５％アクリルアミド）で電気泳動にかけた。ク
マシーブリリアントブルーＲ−２５０でたん白質を染色
し、過剰の色素をゲルから除去した。このゲルの写真を
図９に示す。
ラスミド中のクロラムフェニコールアセチルトランスフ
ェラーゼの発現 プロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/O' の有用
性を示すために、ＰN2 5 ｘ/Oを含むプラスミドを保有す
る細胞中に於けるクロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼの合成を追跡した。ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ
/O' ｔ0 ２+ ，ｐＤＳＸＩＩＩ，１又はｐＤＳ３／Ｐ
N25 ｘ/O' ｔ0 ２+ で形質転換したＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１
５細胞を１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ−
培地中１ｍＭＩＰＴＧの存在或いは非存在下、３７℃で
１．７×１０9 細胞／ｍｌの細胞濃度まで培養した。
１．５×１０8 個の細胞を遠心分離により集菌し、１％
ＳＤＳ、１％β−メルカプトエタノール、１０％グリセ
ロールおよび６２．５ｍＭのトリス塩酸（ｐＨ６．８）
を含む緩衝液に再けん濁した。試料を５分間沸とうし、
氷冷後１２０００ｘｇ３０秒遠心分離してＵ．レムリの
方法（Ｕ．Ｌａｅｍｍｌｉ，“Ｃｌｅａｖａｇｅ ｏｆ
ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｄｕｒｉ
ｎｇ ｔｈｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ｔｈｅ ｈｅ
ａｄ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔ４”，Ｎ
ａｔｕｒｅ，２２７巻，６８０〜６８２頁〔１９７０
年〕）に従ってＳＤＳ−含有ポリアクリルアミドゲル
（１２．５％アクリルアミド）で電気泳動にかけた。ク
マシーブリリアントブルーＲ−２５０でたん白質を染色
し、過剰の色素をゲルから除去した。このゲルの写真を
図９に示す。
【００４７】図９の１，２および３を比較すると、予想
される通り、ｐＤＳＸＩＩＩ，１（サンプル１）はｌａ
ｃレプレッサー（Ｒ）をコードしているがクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）はコー
ドしていない。一方ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ で
形質転換した細胞（サンプル２および３）ではレプレッ
サーは存在せず、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼは培地中のＩＰＴＧの存在に関係なく多量
に生産されている。ｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O' ｔ 0 ２+ は
ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ とｌａｃレプレッサー
遺伝子を含む点でのみ異なってるが（図８Ｂ）、ｐＤＳ
３／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ で形質転換した細胞ではＩＰ
ＴＧ非存在下でクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼは検出できない量でしか生産されていない
（サンプル４と５を１，２および３と比較）。しかし、
ｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ を保有する細胞でＩＰ
ＴＧ存在下で生育させると、ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ
0 ２+ を含む細胞と同じぐらいの量のクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼが生成している（サン
プル６および７を２および３と比較）。
される通り、ｐＤＳＸＩＩＩ，１（サンプル１）はｌａ
ｃレプレッサー（Ｒ）をコードしているがクロラムフェ
ニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）はコー
ドしていない。一方ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ で
形質転換した細胞（サンプル２および３）ではレプレッ
サーは存在せず、クロラムフェニコールアセチルトラン
スフェラーゼは培地中のＩＰＴＧの存在に関係なく多量
に生産されている。ｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O' ｔ 0 ２+ は
ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ とｌａｃレプレッサー
遺伝子を含む点でのみ異なってるが（図８Ｂ）、ｐＤＳ
３／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ で形質転換した細胞ではＩＰ
ＴＧ非存在下でクロラムフェニコールアセチルトランス
フェラーゼは検出できない量でしか生産されていない
（サンプル４と５を１，２および３と比較）。しかし、
ｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ を保有する細胞でＩＰ
ＴＧ存在下で生育させると、ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ
0 ２+ を含む細胞と同じぐらいの量のクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼが生成している（サン
プル６および７を２および３と比較）。
【００４８】上述の結果は、プロモーターＰN25 ｘ/Oは
ｌａｃレプレッサーの存在下で抑制され、誘導剤ＩＰＴ
Ｇの添加によりほぼ完全に活性が誘導されることを示し
ている。
ｌａｃレプレッサーの存在下で抑制され、誘導剤ＩＰＴ
Ｇの添加によりほぼ完全に活性が誘導されることを示し
ている。
【図１Ａ】プラスミドＰＤＳ１，ｔ0 １+ を図示したも
のである。ｄｈｆｒ遺伝子、ターミネーターｔ0 および
ｃａｔ遺伝子の塩基配列を図１Ｂに示す。
のである。ｄｈｆｒ遺伝子、ターミネーターｔ0 および
ｃａｔ遺伝子の塩基配列を図１Ｂに示す。
【図１Ｂ】図１Ａに示す制限酵素部位は図１Ｂで上線で
示し、さらにｐＤＳ１，ｔ0 １+のｐＢＲ３２２部を図
示した。数字はｐＢＲ３２２の塩基配列に依る（Ｊ．
Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌａｓｍｉｄｐＢ
Ｒ３２２”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｓｙｗｐ Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４３巻，７０〜９
０頁〔１９７９年〕）。
示し、さらにｐＤＳ１，ｔ0 １+のｐＢＲ３２２部を図
示した。数字はｐＢＲ３２２の塩基配列に依る（Ｊ．
Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，“Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃ
ｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｌａｓｍｉｄｐＢ
Ｒ３２２”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｓｙｗｐ Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４３巻，７０〜９
０頁〔１９７９年〕）。
【図２】プラスミドｐＤＳ１／ＰN25 ，ｔ0 １+ を図示
したものである。プロモーターＰN25 を保有するＸｈｏ
Ｉ−断片の塩基配列も示す。転写の開始部位並びに方向
を矢印で示す。
したものである。プロモーターＰN25 を保有するＸｈｏ
Ｉ−断片の塩基配列も示す。転写の開始部位並びに方向
を矢印で示す。
【図３】プラスミドｐＥＸＯ７ ｌａｃ ｏｐ２を図示
したものである。ｌａｃオペレーターを保有するＥｃｏ
ＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の塩基配列も示す。
したものである。ｌａｃオペレーターを保有するＥｃｏ
ＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の塩基配列も示す。
【図４Ａ】プラスミドｐＤＳ１，ｔ0 ２+ を図示したも
のである。図４Ａはｄｈｆｒ−遺伝子、ｃａｔ−遺伝子
およびターミネーターｔ0 を含むＸｈｏＩ／ＸｂａＩ断
片の塩基配列を示す。
のである。図４Ａはｄｈｆｒ−遺伝子、ｃａｔ−遺伝子
およびターミネーターｔ0 を含むＸｈｏＩ／ＸｂａＩ断
片の塩基配列を示す。
【図４Ｂ】図４Ａに示す制限酵素部位を図４Ｂでは上線
で示す。さらにｐＤＳ１，ｔ0 ２ + のｐＢＲ３２２挿入
部分も図示し、数字はｐＢＲ３２２の塩基配列（Ｊ．
Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，前述）による。
で示す。さらにｐＤＳ１，ｔ0 ２ + のｐＢＲ３２２挿入
部分も図示し、数字はｐＢＲ３２２の塩基配列（Ｊ．
Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，前述）による。
【図５Ａ】プラスミドｐＤＳＩＸ，１を図示したもので
ある。
ある。
【図５Ｂ】ｌａｃＩ−遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子の一部分
（ｌａｃＺ′）およびｃａｔ遺伝子の塩基配列を示す。
図５Ａに示した制限酵素部位は上線で示す。さらにｐＤ
Ｓ１Ｘ，１のｐＢＲ３２２領域を図示する。数字はｐＢ
Ｒ３２２の塩基配列（Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，前
述）による。
（ｌａｃＺ′）およびｃａｔ遺伝子の塩基配列を示す。
図５Ａに示した制限酵素部位は上線で示す。さらにｐＤ
Ｓ１Ｘ，１のｐＢＲ３２２領域を図示する。数字はｐＢ
Ｒ３２２の塩基配列（Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，前
述）による。
【図５Ｃ】ｌａｃＩ−遺伝子、ｌａｃＺ遺伝子の一部分
（ｌａｃＺ′）およびｃａｔ遺伝子の塩基配列を示す。
図５Ａに示した制限酵素部位は上線で示す。さらにｐＤ
Ｓ１Ｘ，１のｐＢＲ３２２領域を図示する。数字はｐＢ
Ｒ３２２の塩基配列（Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，前
述）による。
（ｌａｃＺ′）およびｃａｔ遺伝子の塩基配列を示す。
図５Ａに示した制限酵素部位は上線で示す。さらにｐＤ
Ｓ１Ｘ，１のｐＢＲ３２２領域を図示する。数字はｐＢ
Ｒ３２２の塩基配列（Ｊ．Ｇ．Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，前
述）による。
【図６Ａ】プラスミドｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+
のプロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/0の構築
の概要を図示したものである。
のプロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/0の構築
の概要を図示したものである。
【図６Ｂ】プラスミドｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+
のプロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/0の構築
の概要を図示したものである。
のプロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/0の構築
の概要を図示したものである。
【図６Ｃ】プラスミドｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+
のプロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/0の構築
の概要を図示したものである。
のプロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/0の構築
の概要を図示したものである。
【図７】プロモーター／オペレーター融合体ＰN25 ｘ/O
を含むＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片の塩基配列を示す。転
写の開始点および方向を矢印で示す。
を含むＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ断片の塩基配列を示す。転
写の開始点および方向を矢印で示す。
【図８Ａ】プラスミドｐＤＳＸＩＩ，３，ｐＤＳ３／Ｐ
N25 ｘ/O' ｔ0 ２+ およびｐＤＳＸＩＩＩ，１の構築の
概要を示す。
N25 ｘ/O' ｔ0 ２+ およびｐＤＳＸＩＩＩ，１の構築の
概要を示す。
【図８Ｂ】プラスミドｐＤＳＸＩＩ，３，ｐＤＳ３／Ｐ
N25 ｘ/O' ｔ0 ２+ およびｐＤＳＸＩＩＩ，１の構築の
概要を示す。
N25 ｘ/O' ｔ0 ２+ およびｐＤＳＸＩＩＩ，１の構築の
概要を示す。
【図８Ｃ】プラスミドｐＤＳＸＩＩ，３，ｐＤＳ３／Ｐ
N25 ｘ/O' ｔ0 ２+ およびｐＤＳＸＩＩＩ，１の構築の
概要を示す。
N25 ｘ/O' ｔ0 ２+ およびｐＤＳＸＩＩＩ，１の構築の
概要を示す。
【図９】プラスミドｐＤＳＸＩＩ，３（サンプル１），
ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２ + （サンプル２および
３）、或いはｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ （サンプ
ル４〜７）を保有するＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５中で、ＩＰ
ＴＧ存在、非存在下に於けるたん白合成を電気泳動で示
したものである。
ｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２ + （サンプル２および
３）、或いはｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O' ｔ0 ２+ （サンプ
ル４〜７）を保有するＥ．ｃｏｌｉ Ｍ１５中で、ＩＰ
ＴＧ存在、非存在下に於けるたん白合成を電気泳動で示
したものである。
【記号の説明】使用した略号は：Ｂ，Ｅ，Ｈ，Ｐ，Ｘお
よびＸｂはそれぞれ制限酵素ＢａｍＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ，ＸｈｏＩおよびＸｂａＩの切
断部位を示す。（イ）はプロモーターを、（ロ）はリボ
ゾーム結合部位を、（ハ）はターミネータｔ0 を；
（ニ）はｌａｃオペレータ（Ｏ）またはその部分を、
（ホ）はプロモーターＰN25 （ＰN25 ）を；（ヘ）はＤ
ＮＡ複製に必要な領域（ｒｅｐｌ）；（ト）はジヒドロ
葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）、クロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、β−ラクタマ
ーゼ（ｂｌａ）およびｌａｃレプレッサー（ｌａｃＩ）
のコード領域或いはクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼのコード領域の一部を（ｃａｔ′）、
（チ）はβ−ガラクトシダーゼのコード領域の一部（ｌ
ａｃ Ｚ′）を示す。
よびＸｂはそれぞれ制限酵素ＢａｍＩ，ＥｃｏＲＩ，Ｈ
ｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ，ＸｈｏＩおよびＸｂａＩの切
断部位を示す。（イ）はプロモーターを、（ロ）はリボ
ゾーム結合部位を、（ハ）はターミネータｔ0 を；
（ニ）はｌａｃオペレータ（Ｏ）またはその部分を、
（ホ）はプロモーターＰN25 （ＰN25 ）を；（ヘ）はＤ
ＮＡ複製に必要な領域（ｒｅｐｌ）；（ト）はジヒドロ
葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）、クロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、β−ラクタマ
ーゼ（ｂｌａ）およびｌａｃレプレッサー（ｌａｃＩ）
のコード領域或いはクロラムフェニコールアセチルトラ
ンスフェラーゼのコード領域の一部を（ｃａｔ′）、
（チ）はβ−ガラクトシダーゼのコード領域の一部（ｌ
ａｃ Ｚ′）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 9/10 Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:125） Ｃ１２Ｒ 1:125） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｃ１２Ｒ 1:19） 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
Claims (8)
- 【請求項１】 原核又は真核細胞のポリペプチドをコー
ドするＤＮＡが、本質的に重要な下流領域を欠失した大
腸菌ファージＴ５プロモーターとプロモーター活性の調
節が可能な大腸菌ｌａｃオペレーターまたはその機能性
部分とを結合してなる発現調節ＤＮＡ配列に有効に結合
して保持される発現ベクターで宿主を形質転換し、適当
な条件下で該形質転換株を培養し、培養物より目的のポ
リペプチドを単離することから成るポリペプチドの製造
方法。 - 【請求項２】 ベクターがグラム陰性および／またはグ
ラム陽性細菌中で複製可能なプラスミドである請求項１
に記載の方法。 - 【請求項３】 プラスミドがＥ．ｃｏｌｉ菌株中で複製
可能である請求項２に記載の方法。 - 【請求項４】 プラスミドがＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌株
中で複製可能である請求項２に記載の方法。 - 【請求項５】 プラスミドがｐＤＳ１群の一つである請
求項２または３に記載の方法。 - 【請求項６】 プラスミドがｐＤＳ２／ＰN25 ｘ/O' ｔ
0 ２+ である請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 プラスミドがｐＤＳ３／ＰN25 ｘ/O' ｔ
0 ２+ である請求項５記載の方法。 - 【請求項８】 ポリペプチドがクロラムフェニコールア
セチルトランスフェラーゼである請求項１〜７のいずれ
かに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| GB848431818A GB8431818D0 (en) | 1984-12-17 | 1984-12-17 | Expression control sequence |
| GB8431818 | 1984-12-17 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60282699A Division JP2552650B2 (ja) | 1984-12-17 | 1985-12-16 | 新規な発現調節配列 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0746994A JPH0746994A (ja) | 1995-02-21 |
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Family
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Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60282699A Expired - Lifetime JP2552650B2 (ja) | 1984-12-17 | 1985-12-16 | 新規な発現調節配列 |
| JP6095174A Expired - Lifetime JP2515488B2 (ja) | 1984-12-17 | 1994-05-09 | ポリペプチドの製造方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60282699A Expired - Lifetime JP2552650B2 (ja) | 1984-12-17 | 1985-12-16 | 新規な発現調節配列 |
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