JPH0686678A - 改良型バクテリオファージλｐＬプロモーター - Google Patents
改良型バクテリオファージλｐＬプロモーターInfo
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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-
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【構成】 本発明は、転写活性化配列として機能する新
規なＤＮＡ化合物に関する。また、該転写活性化配列を
含有する組換えＤＮＡ発現ベクターおよびその発現ベク
ターによって形質転換された宿主細胞に関する。 【効果】 本発明の新規な転写活性化配列を発現ベクタ
ー内に適切に配置した場合、機能的に連結された遺伝子
の発現を調節でき、また該発現ベクターの構造上の安定
性を増大させることができる。
規なＤＮＡ化合物に関する。また、該転写活性化配列を
含有する組換えＤＮＡ発現ベクターおよびその発現ベク
ターによって形質転換された宿主細胞に関する。 【効果】 本発明の新規な転写活性化配列を発現ベクタ
ー内に適切に配置した場合、機能的に連結された遺伝子
の発現を調節でき、また該発現ベクターの構造上の安定
性を増大させることができる。
Description
【０００１】組換えＤＮＡ発現ベクターの構造的な不安
定性は、ベクターの構造を改変するＤＮＡ欠損や再配列
を招く。このことは、これら発現ベクターによってコー
ドされているポリペプチドを生産するために大量培養す
る場合には重要な関心事である。これらベクターはコー
ド化ポリペプチドの発現を妨げるように改変されること
もある。従って、ポリペプチドが発現するように培養物
を誘導する場合、負の選択圧をポリペプチド発現の喪失
に向かって負荷すれば、改変された発現ベクターが蓄積
される場合が多い。
定性は、ベクターの構造を改変するＤＮＡ欠損や再配列
を招く。このことは、これら発現ベクターによってコー
ドされているポリペプチドを生産するために大量培養す
る場合には重要な関心事である。これらベクターはコー
ド化ポリペプチドの発現を妨げるように改変されること
もある。従って、ポリペプチドが発現するように培養物
を誘導する場合、負の選択圧をポリペプチド発現の喪失
に向かって負荷すれば、改変された発現ベクターが蓄積
される場合が多い。
【０００２】このような観点から、食品医薬品局などの
管理機関は、ヘテロローガスなタンパク質を生産するた
めに利用されるあらゆる組換えＤＮＡ発現ベクターの完
全な特性化を要求する。組換えＤＮＡ発現ベクターが発
酵の終了時点で初代接種物から得られる発現ベクターと
同じであることを証明する証拠を提出しなければならな
い。証明データには、発現物の構造とサイズ分析、およ
び所望の産物をコードしているヌクレオチド配列の証
明、およびそのコード化配列を画する(フランキングす
る)領域、特にプロモーターなどの重要な機能を果すフ
ランキング配列の証明などがある。
管理機関は、ヘテロローガスなタンパク質を生産するた
めに利用されるあらゆる組換えＤＮＡ発現ベクターの完
全な特性化を要求する。組換えＤＮＡ発現ベクターが発
酵の終了時点で初代接種物から得られる発現ベクターと
同じであることを証明する証拠を提出しなければならな
い。証明データには、発現物の構造とサイズ分析、およ
び所望の産物をコードしているヌクレオチド配列の証
明、およびそのコード化配列を画する(フランキングす
る)領域、特にプロモーターなどの重要な機能を果すフ
ランキング配列の証明などがある。
【０００３】エシェリヒア・コリ(大腸菌)バクテリオフ
ァージλpＬプロモーター-オペレーター領域を利用し、
機能的に連結された遺伝子を転写させることのできる組
換えＤＮＡベクターは構造的に不安定であることが多
い。このようなベクターを発酵工程の終了時点に調査し
た場合、そのベクターの構造が改変されていることがし
ばしばである。本発明の目的は、発現ベクターの安定性
を増大させると同時に、機能的に連結された遺伝子の転
写を調節できる転写活性化配列を提供することにある。
ァージλpＬプロモーター-オペレーター領域を利用し、
機能的に連結された遺伝子を転写させることのできる組
換えＤＮＡベクターは構造的に不安定であることが多
い。このようなベクターを発酵工程の終了時点に調査し
た場合、そのベクターの構造が改変されていることがし
ばしばである。本発明の目的は、発現ベクターの安定性
を増大させると同時に、機能的に連結された遺伝子の転
写を調節できる転写活性化配列を提供することにある。
【０００４】本発明の目的に沿って、本明細書に使用す
る用語を次のように定義する。 ＡpＲ−アンピシリン耐性表現型またはそれを付与す
る遺伝子。 cＩ８５７−バクテリオファージcＩリプレッサーの温
度感受性の型をコード している遺伝子。 ＥＫ-ウシ成長ホルモン−アミノ末端アミノ酸配列フ
ェニルアラニル-(アスパルチル)4-リシニルがエンテロ
キナーゼ開裂部位を特定していると示されているメチオ
ニル-フェニルアラニル-(アスパルチル)4-リシニル-ウ
シ成長ホルモン。 ＥＫ-ＢＧＨ−ＥＫ-ウシ成長ホルモン。
る用語を次のように定義する。 ＡpＲ−アンピシリン耐性表現型またはそれを付与す
る遺伝子。 cＩ８５７−バクテリオファージcＩリプレッサーの温
度感受性の型をコード している遺伝子。 ＥＫ-ウシ成長ホルモン−アミノ末端アミノ酸配列フ
ェニルアラニル-(アスパルチル)4-リシニルがエンテロ
キナーゼ開裂部位を特定していると示されているメチオ
ニル-フェニルアラニル-(アスパルチル)4-リシニル-ウ
シ成長ホルモン。 ＥＫ-ＢＧＨ−ＥＫ-ウシ成長ホルモン。
【０００５】機能的なポリペプチド−回収可能である
生物学的に活性なヘテロローガスもしくはホモローガス
なポリペプチドまたは前駆体、ヘテロローガスなポリペ
プチドとホモローガスなポリペプチドの一部もしくは全
部とからなる回収可能な生物活性ポリペプチド、または
特異的に開裂することのできる生物学的に不活性なポリ
ペプチドもしくは再折り畳みもしくは当業界に周知の他
の化学的処理によって生物活性ポリペプチドに変換する
ことのできる生物学的に不活性なポリペプチドとヘテロ
ローガスなポリペプチドとを含有する回収可能である生
物学的に不活性なポリペプチド。 pＬ−バクテリオファージλの左まわりプロモータ
ー。 プロモーター−ＤＮＡをＲＮＡに転写させるＤＮＡ配
列。
生物学的に活性なヘテロローガスもしくはホモローガス
なポリペプチドまたは前駆体、ヘテロローガスなポリペ
プチドとホモローガスなポリペプチドの一部もしくは全
部とからなる回収可能な生物活性ポリペプチド、または
特異的に開裂することのできる生物学的に不活性なポリ
ペプチドもしくは再折り畳みもしくは当業界に周知の他
の化学的処理によって生物活性ポリペプチドに変換する
ことのできる生物学的に不活性なポリペプチドとヘテロ
ローガスなポリペプチドとを含有する回収可能である生
物学的に不活性なポリペプチド。 pＬ−バクテリオファージλの左まわりプロモータ
ー。 プロモーター−ＤＮＡをＲＮＡに転写させるＤＮＡ配
列。
【０００６】組換えＤＮＡ発現ベクター−プロモータ
ーが組み込まれている組換えＤＮＡクローニングベクタ
ー。 組換えＤＮＡクローニングベクター−１つまたはそれ
以上の付加的なＤＮＡセグメントを加えることができる
かまたは既に加えられているＤＮＡ分子から構成される
物質であり、例えば組換えプラスミド、バクテリオファ
ージおよびウイルスがあるが、これらに限定されない。 構造遺伝子−機能的なポリペプチドをその開始および
終止コドンと共にコードしているＤＮＡ配列。 ＴetＲ−テトラサイクリン耐性表現型またはそれを付
与する遺伝子。
ーが組み込まれている組換えＤＮＡクローニングベクタ
ー。 組換えＤＮＡクローニングベクター−１つまたはそれ
以上の付加的なＤＮＡセグメントを加えることができる
かまたは既に加えられているＤＮＡ分子から構成される
物質であり、例えば組換えプラスミド、バクテリオファ
ージおよびウイルスがあるが、これらに限定されない。 構造遺伝子−機能的なポリペプチドをその開始および
終止コドンと共にコードしているＤＮＡ配列。 ＴetＲ−テトラサイクリン耐性表現型またはそれを付
与する遺伝子。
【０００７】転写活性化配列−ＤＮＡの転写を調節的
に行わしめるＤＮＡ配列。 翻訳活性化配列−mＲＮＡ転写物のペプチドまたはポ
リペプチドへの翻訳を開始させるＤＮＡ配列であって、
リボゾーム結合部位および翻訳開始コドン、例えば５'-
ＡＴＧ-３'は含有するが、その開始コドンの下流の配列
はまったく含まない配列。
に行わしめるＤＮＡ配列。 翻訳活性化配列−mＲＮＡ転写物のペプチドまたはポ
リペプチドへの翻訳を開始させるＤＮＡ配列であって、
リボゾーム結合部位および翻訳開始コドン、例えば５'-
ＡＴＧ-３'は含有するが、その開始コドンの下流の配列
はまったく含まない配列。
【０００８】本発明は、新規な転写活性化配列、その新
規な転写活性化配列を含有する組換えＤＮＡ発現ベクタ
ー、および本発明の発現ベクターによって形質転換され
ている宿主細胞に関する。本発明の転写活性化配列は、
リプレッサー結合領域の５'位に配置するＤＮＡ配列が
欠失されている修飾バクテリオファージλ転写活性化配
列である。この修飾された転写活性化配列は、機能的に
連結された遺伝子の発現を調節することができ、またそ
れがクローンされた組換えＤＮＡベクターに構造上の安
定性を付与できる。
規な転写活性化配列を含有する組換えＤＮＡ発現ベクタ
ー、および本発明の発現ベクターによって形質転換され
ている宿主細胞に関する。本発明の転写活性化配列は、
リプレッサー結合領域の５'位に配置するＤＮＡ配列が
欠失されている修飾バクテリオファージλ転写活性化配
列である。この修飾された転写活性化配列は、機能的に
連結された遺伝子の発現を調節することができ、またそ
れがクローンされた組換えＤＮＡベクターに構造上の安
定性を付与できる。
【０００９】好ましい本発明の転写活性化配列は以下の
構造を有するものである：
構造を有するものである：
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】 および
【化１３】 [式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルである]。
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルである]。
【００１０】転写活性化配列の両鎖をコードしている１
本鎖デオキシオリゴヌクレオチドは、アプライド・バイ
オシステムズ[Applied Biosystems,カリホルニア94404,
ホスター・シティー,リンカーン・センター・ドライブ850
番]から販売されているβ-シアノエチルホスホルアミダ
イトの化学を利用する３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置などの
市販の装置によって合成することができる。ＤＮＡの他
の合成方法も当業界に周知である。１本鎖ＤＮＡを合成
するための通常のホスホトリエステル変法は、イタクラ
(Itakura)らのScience 198:1056(1977)およびクレア(Cr
ea)らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.75:5765(1978)に記
載されており、それらも本発明の転写活性化配列をコー
ドしているＤＮＡを合成するために使用することができ
る。
本鎖デオキシオリゴヌクレオチドは、アプライド・バイ
オシステムズ[Applied Biosystems,カリホルニア94404,
ホスター・シティー,リンカーン・センター・ドライブ850
番]から販売されているβ-シアノエチルホスホルアミダ
イトの化学を利用する３８０Ｂ ＤＮＡ合成装置などの
市販の装置によって合成することができる。ＤＮＡの他
の合成方法も当業界に周知である。１本鎖ＤＮＡを合成
するための通常のホスホトリエステル変法は、イタクラ
(Itakura)らのScience 198:1056(1977)およびクレア(Cr
ea)らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.75:5765(1978)に記
載されており、それらも本発明の転写活性化配列をコー
ドしているＤＮＡを合成するために使用することができ
る。
【００１１】本発明の転写活性化配列はバクテリオファ
ージλpＬプロモーター-オペレーター領域(pＬプロモー
ター)から誘導される。この活性化配列はpＬプロモータ
ーの非常に望ましい特性を保持しており、λcＩリプレ
ッサータンパク質によって抑制される。温度感受性のc
Ｉリプレッサータンパク質(cＩ８５７)を本発明の新規
な転写活性化配列と共に使用する場合、この新規な配列
からの転写は、cＩリプレッサータンパク質が本発明の
新規な配列のオペレーター領域と結合して転写を阻害す
る温度である低温(３０℃−３５℃)にて抑制される。そ
れよりも高温(３７℃−４２℃)では、温度感受性cＩリ
プレッサータンパク質が分裂し、転写活性化配列からの
転写を妨害することができなくなる。従って、本発明の
新規な配列は大腸菌内での調節可能な利点、すなわち大
規模な微生物発酵に関する場合には非常に望ましい特性
を保持している。
ージλpＬプロモーター-オペレーター領域(pＬプロモー
ター)から誘導される。この活性化配列はpＬプロモータ
ーの非常に望ましい特性を保持しており、λcＩリプレ
ッサータンパク質によって抑制される。温度感受性のc
Ｉリプレッサータンパク質(cＩ８５７)を本発明の新規
な転写活性化配列と共に使用する場合、この新規な配列
からの転写は、cＩリプレッサータンパク質が本発明の
新規な配列のオペレーター領域と結合して転写を阻害す
る温度である低温(３０℃−３５℃)にて抑制される。そ
れよりも高温(３７℃−４２℃)では、温度感受性cＩリ
プレッサータンパク質が分裂し、転写活性化配列からの
転写を妨害することができなくなる。従って、本発明の
新規な配列は大腸菌内での調節可能な利点、すなわち大
規模な微生物発酵に関する場合には非常に望ましい特性
を保持している。
【００１２】大規模発酵培養の場合、本発明の発現ベク
ターは、野生型のλpＬプロモーター-オペレーター領域
を含有する発現ベクターよりも安定であるという利点を
有している。この構造安定性の増大は、野生型バクテリ
オファージλpＬプロモーターの短型である本発明の転
写活性化配列のおかげである。従って、本発明によっ
て、不安定性の原因であるＤＮＡ配列を削除することに
よりベクターの不安定性が顕著に減少される。同時に、
本発明の転写活性化配列は機能的に連結された遺伝子の
発現を調節できる能力を保持している。
ターは、野生型のλpＬプロモーター-オペレーター領域
を含有する発現ベクターよりも安定であるという利点を
有している。この構造安定性の増大は、野生型バクテリ
オファージλpＬプロモーターの短型である本発明の転
写活性化配列のおかげである。従って、本発明によっ
て、不安定性の原因であるＤＮＡ配列を削除することに
よりベクターの不安定性が顕著に減少される。同時に、
本発明の転写活性化配列は機能的に連結された遺伝子の
発現を調節できる能力を保持している。
【００１３】本発明の好ましい発現ベクターは、(a)上
記の新規な転写活性化配列の１つ、(b)翻訳活性化配
列、および(c)機能的なポリペプチドをコードしている
ＤＮＡ配列から実質的に構成され、(a)および(b)が(c)
を発現するように配置されているものである。
記の新規な転写活性化配列の１つ、(b)翻訳活性化配
列、および(c)機能的なポリペプチドをコードしている
ＤＮＡ配列から実質的に構成され、(a)および(b)が(c)
を発現するように配置されているものである。
【００１４】本明細書に例示している発現ベクターで
は、転写活性化配列を大腸菌lpp遺伝子の翻訳活性化配
列と連結する。類似の構築物が１９８９年１０月７日発
行の米国特許第4,874,703号に開示され、特許請求され
ている。この特許は、大腸菌lpp遺伝子翻訳活性化配列
に連結された野生型λpＬプロモーター-オペレーター領
域を含有するプラスミドpＬ１１０を開示し、特許請求
している。pＬ１１０では、これら活性化配列がＥＫ-Ｂ
ＧＨコード化ＤＮＡと機能的に連結されている。本明細
書に記載するプラスミドは、pＬ１１０の野生型pＬプロ
モーター-オペレーター領域を本発明の新規な転写活性
化配列と置き換えている。
は、転写活性化配列を大腸菌lpp遺伝子の翻訳活性化配
列と連結する。類似の構築物が１９８９年１０月７日発
行の米国特許第4,874,703号に開示され、特許請求され
ている。この特許は、大腸菌lpp遺伝子翻訳活性化配列
に連結された野生型λpＬプロモーター-オペレーター領
域を含有するプラスミドpＬ１１０を開示し、特許請求
している。pＬ１１０では、これら活性化配列がＥＫ-Ｂ
ＧＨコード化ＤＮＡと機能的に連結されている。本明細
書に記載するプラスミドは、pＬ１１０の野生型pＬプロ
モーター-オペレーター領域を本発明の新規な転写活性
化配列と置き換えている。
【００１５】本発明の好ましいベクターはさらに選択マ
ーカー、該ベクターの染色体外維持を可能とするレプリ
コンおよび温度感受性cＩ８５７λリプレッサー遺伝子
を含有している。
ーカー、該ベクターの染色体外維持を可能とするレプリ
コンおよび温度感受性cＩ８５７λリプレッサー遺伝子
を含有している。
【００１６】本発明の組換えＤＮＡベクターを構築する
ために使用される出発組換えＤＮＡベクターはプラスミ
ドpＣＺＲ１２５である。このプラスミドはプラスミドp
Ｌ１１０を出発物質として使用して構築した。プラスミ
ドpＣＺＲ１２５はpＬ１１０の５．８kb ＸbaＩ-ＢamＨ
Ｉフラグメントを実施例１に記載している２つの合成Ｄ
ＮＡフラグメントと連結することにより構築した。これ
ら合成ＤＮＡフラグメントは無傷の第１シストロンおよ
びＥＫ-ＢＧＨ遺伝子をコードしている。プラスミドpＣ
ＺＲ１２５によりＥＫ-ＢＧＨの２シストロン産生を行
うことができる。２-シストロン発現系はショーナー[Sc
honer]らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.83:8506(1986)
に記載されている。
ために使用される出発組換えＤＮＡベクターはプラスミ
ドpＣＺＲ１２５である。このプラスミドはプラスミドp
Ｌ１１０を出発物質として使用して構築した。プラスミ
ドpＣＺＲ１２５はpＬ１１０の５．８kb ＸbaＩ-ＢamＨ
Ｉフラグメントを実施例１に記載している２つの合成Ｄ
ＮＡフラグメントと連結することにより構築した。これ
ら合成ＤＮＡフラグメントは無傷の第１シストロンおよ
びＥＫ-ＢＧＨ遺伝子をコードしている。プラスミドpＣ
ＺＲ１２５によりＥＫ-ＢＧＨの２シストロン産生を行
うことができる。２-シストロン発現系はショーナー[Sc
honer]らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.83:8506(1986)
に記載されている。
【００１７】プラスミドpＣＺＲ１２５を含有する細胞
を大量培養し、次いでその培養物から得られるプラスミ
ドＤＮＡを分析した際、pＣＺＲ１２５が何らかの構造
上の不安定性を示すことに気付いた。ベクター安定性の
分析は、実施例８に記載している方法によって行われ
る。プラスミドpＣＺＲ１２５の制限部位および機能地
図を添付の図１に示す。
を大量培養し、次いでその培養物から得られるプラスミ
ドＤＮＡを分析した際、pＣＺＲ１２５が何らかの構造
上の不安定性を示すことに気付いた。ベクター安定性の
分析は、実施例８に記載している方法によって行われ
る。プラスミドpＣＺＲ１２５の制限部位および機能地
図を添付の図１に示す。
【００１８】プラスミドpＣＺＲ１２５の不安定性に対
処するため、プラスミドpＨＰＲ９７を構築した。プラ
スミドpＨＰＲ９７は、プラスミドpＣＺＲ１２５から４
１８塩基対のＥcoＲＩ-ＢglII制限フラグメントを削除
し、その位置にバクテリオファージλpＬプロモーター
をコードしている合成ＤＮＡ配列を連結することで構築
した。本発明の要素でもあるこのプロモーターは、クロ
ーニングを簡便に行えるようにするためＥcoＲＩおよび
ＢglIIの粘着末端を含有するよう合成した。このＤＮＡ
フラグメントの配列は以下のとおりである：
処するため、プラスミドpＨＰＲ９７を構築した。プラ
スミドpＨＰＲ９７は、プラスミドpＣＺＲ１２５から４
１８塩基対のＥcoＲＩ-ＢglII制限フラグメントを削除
し、その位置にバクテリオファージλpＬプロモーター
をコードしている合成ＤＮＡ配列を連結することで構築
した。本発明の要素でもあるこのプロモーターは、クロ
ーニングを簡便に行えるようにするためＥcoＲＩおよび
ＢglIIの粘着末端を含有するよう合成した。このＤＮＡ
フラグメントの配列は以下のとおりである：
【化１４】
【００１９】従って、プラスミドpＨＰＲ９７ではＥＫ-
ＢＧＨ遺伝子が上記プロモーター配列と機能的に連結さ
れている。さらに、pＨＰＲ９７は、野生型バクテリオ
ファージλpＬプロモーター-オペレーター配列の５'側
に位置するプラスミドpＣＺＲ１２５に元来存在してい
る領域から２８２塩基対が欠失している。このＤＮＡセ
グメントを除去するとプラスミドの安定性にポジティブ
な効果をもたらすことが見いだされた。従って、プラス
ミドpＣＺＲ１２５およびプラスミドpＬ１１０からこの
領域を欠失させることもさらなる本発明の態様である。
プラスミドpＨＰＲ９７の制限部位および機能地図を添
付の図２に示す。
ＢＧＨ遺伝子が上記プロモーター配列と機能的に連結さ
れている。さらに、pＨＰＲ９７は、野生型バクテリオ
ファージλpＬプロモーター-オペレーター配列の５'側
に位置するプラスミドpＣＺＲ１２５に元来存在してい
る領域から２８２塩基対が欠失している。このＤＮＡセ
グメントを除去するとプラスミドの安定性にポジティブ
な効果をもたらすことが見いだされた。従って、プラス
ミドpＣＺＲ１２５およびプラスミドpＬ１１０からこの
領域を欠失させることもさらなる本発明の態様である。
プラスミドpＨＰＲ９７の制限部位および機能地図を添
付の図２に示す。
【００２０】野生型λプロモーター-オペレーター領域
を含有するベクターのプラスミド不安定性に対処するた
め、プラスミドpＨＰＲ１０４を構築した。プラスミドp
ＨＰＲ１０４はプラスミドpＨＰＲ９７の場合と同様に
して構築した。プラスミドpＣＺＲ１２５の６．０kb Ｅ
coＲＩ-ＢglIIフラグメントを、ＥcoＲＩとＢglIIとの
粘着末端を有するバクテリオファージλpＬプロモータ
ーの短くした誘導体をコードしている合成ＤＮＡセグメ
ントと連結した。このＤＮＡフラグメントの配列は以下
のとおりである：
を含有するベクターのプラスミド不安定性に対処するた
め、プラスミドpＨＰＲ１０４を構築した。プラスミドp
ＨＰＲ１０４はプラスミドpＨＰＲ９７の場合と同様に
して構築した。プラスミドpＣＺＲ１２５の６．０kb Ｅ
coＲＩ-ＢglIIフラグメントを、ＥcoＲＩとＢglIIとの
粘着末端を有するバクテリオファージλpＬプロモータ
ーの短くした誘導体をコードしている合成ＤＮＡセグメ
ントと連結した。このＤＮＡフラグメントの配列は以下
のとおりである：
【化１５】 この転写活性化配列はプラスミドpＨＰＲ９７に存在す
るλpＬプロモーター-オペレーター領域の５'領域から
６０塩基対が欠失している。プラスミドpＨＰＲ１０４
の制限部位および機能地図を添付の図３に示す。
るλpＬプロモーター-オペレーター領域の５'領域から
６０塩基対が欠失している。プラスミドpＨＰＲ１０４
の制限部位および機能地図を添付の図３に示す。
【００２１】プラスミドpＨＤＭ１５９はプラスミドpＨ
ＰＲ１０４の場合と同様にして構築される。プラスミド
pＣＺＲ１２５の６．０kb ＥcoＲＩ-ＢglIIフラグメン
トを、ＥcoＲＩとＢglIIとの粘着末端を有するバクテリ
オファージλpＬプロモーターの誘導体をコードしてい
る合成ＤＮＡフラグメントと連結する。このＤＮＡフラ
グメントの配列は以下のとおりである：
ＰＲ１０４の場合と同様にして構築される。プラスミド
pＣＺＲ１２５の６．０kb ＥcoＲＩ-ＢglIIフラグメン
トを、ＥcoＲＩとＢglIIとの粘着末端を有するバクテリ
オファージλpＬプロモーターの誘導体をコードしてい
る合成ＤＮＡフラグメントと連結する。このＤＮＡフラ
グメントの配列は以下のとおりである：
【化１６】
【００２２】この転写活性化配列はプラスミドpＨＰＲ
１０４に存在するものと同じであるが、そのＤＮＡ配列
の５'末端から７２塩基に位置しているＡがＧに置き換
わっている。この変化は、Sarai & TukedaのProc.Natl.
Acad.Sci.,U.S.A.86:6513(1989)の知見に基づいて施し
た。Sarai および Tukedaに記載されているように、ＯR
１リプレッサー結合部位に相当する塩基置換を施すと、
野生型のλプロモーターよりも確実に調節されるプロモ
ーター-オペレーター領域が得られることになる。ＯL１
における相当する変化はこれと同じ効果を有すると期待
された。プラスミドpＨＤＭ１５９の制限部位および機
能地図を添付の図４に示す。
１０４に存在するものと同じであるが、そのＤＮＡ配列
の５'末端から７２塩基に位置しているＡがＧに置き換
わっている。この変化は、Sarai & TukedaのProc.Natl.
Acad.Sci.,U.S.A.86:6513(1989)の知見に基づいて施し
た。Sarai および Tukedaに記載されているように、ＯR
１リプレッサー結合部位に相当する塩基置換を施すと、
野生型のλプロモーターよりも確実に調節されるプロモ
ーター-オペレーター領域が得られることになる。ＯL１
における相当する変化はこれと同じ効果を有すると期待
された。プラスミドpＨＤＭ１５９の制限部位および機
能地図を添付の図４に示す。
【００２３】上記のプラスミドの場合と同様にしてプラ
スミドpＨＰＲ１０６を構築した。pＣＺＲ１２５の６．
０kb ＥcoＲＩ-ＢglIIフラグメントをＥcoＲＩおよびＢ
glII粘着末端を有するバクテリオファージλpＬプロモ
ーターの誘導体をコードしている合成ＤＮＡフラグメン
トに連結した。このＤＮＡフラグメントの配列は以下の
とおりである：
スミドpＨＰＲ１０６を構築した。pＣＺＲ１２５の６．
０kb ＥcoＲＩ-ＢglIIフラグメントをＥcoＲＩおよびＢ
glII粘着末端を有するバクテリオファージλpＬプロモ
ーターの誘導体をコードしている合成ＤＮＡフラグメン
トに連結した。このＤＮＡフラグメントの配列は以下の
とおりである：
【化１７】
【００２４】この転写活性化配列は、−１０共通配列を
含有するよう構築されている以外はプラスミドpＨＰＲ
１０４のそれと同一である。野生型のλプロモーター-
オペレーター領域は−１０共通配列を含有していない。
−１０共通配列は機能的に連結された遺伝子の発現を増
強することができると広く知られているので、この配列
をプラスミドpＨＰＲ１０６の転写活性化配列に付加し
た。この転写活性化配列の驚くべき局面は、この改変−
１０配列がλリプレッサータンパク質を結合する領域内
に存在するにもかかわらず、プロモーターの調節が保持
されていることである。pＨＰＲ１０６の制限部位およ
び機能地図を添付の図５に示す。プラスミドpＨＰＲ１
０６ＡはプラスミドpＨＰＲ１０６について記載したよ
うにして構築した。しかし、バクテリオファージλpＬ
プロモーターの誘導体をコードしている合成ＤＮＡフラ
グメントの配列は以下のとおりである：
含有するよう構築されている以外はプラスミドpＨＰＲ
１０４のそれと同一である。野生型のλプロモーター-
オペレーター領域は−１０共通配列を含有していない。
−１０共通配列は機能的に連結された遺伝子の発現を増
強することができると広く知られているので、この配列
をプラスミドpＨＰＲ１０６の転写活性化配列に付加し
た。この転写活性化配列の驚くべき局面は、この改変−
１０配列がλリプレッサータンパク質を結合する領域内
に存在するにもかかわらず、プロモーターの調節が保持
されていることである。pＨＰＲ１０６の制限部位およ
び機能地図を添付の図５に示す。プラスミドpＨＰＲ１
０６ＡはプラスミドpＨＰＲ１０６について記載したよ
うにして構築した。しかし、バクテリオファージλpＬ
プロモーターの誘導体をコードしている合成ＤＮＡフラ
グメントの配列は以下のとおりである：
【化１８】
【００２５】実施例６に記載する方法によってプラスミ
ドpsyn３を構築した。プラスミドpＬ１１０の６．３kb
ＥcoＲＩ-ＢglIIフラグメントをＥcoＲＩおよびＢglII
粘着末端を有するバクテリオファージλpＬプロモータ
ーの誘導体をコードしている合成ＤＮＡフラグメントと
連結した。このＤＮＡフラグメントの配列は以下のとお
りである：
ドpsyn３を構築した。プラスミドpＬ１１０の６．３kb
ＥcoＲＩ-ＢglIIフラグメントをＥcoＲＩおよびＢglII
粘着末端を有するバクテリオファージλpＬプロモータ
ーの誘導体をコードしている合成ＤＮＡフラグメントと
連結した。このＤＮＡフラグメントの配列は以下のとお
りである：
【化１９】
【００２６】好ましくは、psyn３の合成ＤＮＡフラグメ
ントをプラスミドpＣＺＲ１２５の６．０kb ＥcoＲＩ-
ＢglIIフラグメントに連結し、プラスミドpsynＣを作成
する。このプラスミドpsynＣの制限部位および機能地図
を添付の図６に示す。
ントをプラスミドpＣＺＲ１２５の６．０kb ＥcoＲＩ-
ＢglIIフラグメントに連結し、プラスミドpsynＣを作成
する。このプラスミドpsynＣの制限部位および機能地図
を添付の図６に示す。
【００２７】実施例７に記載する方法によってプラスミ
ドpsyn４を構築した。このプラスミドを構築した目的
は、プラスミドpsyn３の転写活性化配列からＯL３オペ
レーター領域を削除するためである。psyn４と同一の転
写活性化配列を提供する好ましいベクターはプラスミド
psynＤである。プラスミドpsynＤを構築するため、プラ
スミドpＣＺＲ１２５の６．０kb ＥcoＲＩ-ＢglIIフラ
グメントを、psyn４内に存在するバクテリオファージλ
pＬプロモーターの誘導体をコードしている合成ＤＮＡ
フラグメントと連結する。このＤＮＡフラグメントの配
列は以下のとおりである：
ドpsyn４を構築した。このプラスミドを構築した目的
は、プラスミドpsyn３の転写活性化配列からＯL３オペ
レーター領域を削除するためである。psyn４と同一の転
写活性化配列を提供する好ましいベクターはプラスミド
psynＤである。プラスミドpsynＤを構築するため、プラ
スミドpＣＺＲ１２５の６．０kb ＥcoＲＩ-ＢglIIフラ
グメントを、psyn４内に存在するバクテリオファージλ
pＬプロモーターの誘導体をコードしている合成ＤＮＡ
フラグメントと連結する。このＤＮＡフラグメントの配
列は以下のとおりである：
【化２０】 プラスミドpsynＤの制限部位および機能地図を添付の図
７に示す。
７に示す。
【００２８】プラスミドpＨＰＲ９７、pＨＰＲ１０４、
pＨＤＭ１５９、pＨＰＲ１０６、pＨＰＲ１０６Ａ、psy
n３、psynＣ、psyn４およびpsynＤは有用かつ調節可能
な発現ベクターである。機能的なポリペプチドをコード
している種々のＤＮＡフラグメントがこれらのプラスミ
ドに導入でき、また発現させることができる。機能的な
ポリペプチドをコードしているＤＮＡをこれらプラスミ
ドに導入するには、これらプラスミドのＥＫ-ＢＧＨコ
ード化ＤＮＡを含有するＸbaＩ-ＢamＨＩまたはＮdeＩ-
ＢamＨＩフラグメントを、発現させようとする機能的な
ポリペプチドコード化ＤＮＡと置換させる反応を行い、
ＸbaＩ-ＢamＨＩまたはＮdeＩ-ＢamＨＩ制限フラグメン
トとして行えばよい。機能的なポリペプチドをコードし
ているＤＮＡを必要なＸbaＩ-ＢamＨＩまたはＮdeＩ-Ｂ
amＨＩ制限フラグメントに変換するために要求される修
飾法は、当業者に可能な反応を利用するものである。本
発明の発現ベクターに導入することのできる他のポリペ
プチドコード化ＤＮＡには例えば、β-ガラクトシダー
ゼ、ヒトプレプロインスリン、ヒトプロインスリン、ヒ
トインスリンＡ鎖、ヒトインスリンＢ鎖、非ヒトインス
リン、ヒト成長ホルモン、インスリン様成長因子、ヒト
インターフェロン、ウイルス抗原、ウロキナーゼ、組織
型プラスミノーゲンアクチベーター、インターロイキン
１−６、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、ヒトト
ランスフェリンなどをコードしているＤＮＡがある。
pＨＤＭ１５９、pＨＰＲ１０６、pＨＰＲ１０６Ａ、psy
n３、psynＣ、psyn４およびpsynＤは有用かつ調節可能
な発現ベクターである。機能的なポリペプチドをコード
している種々のＤＮＡフラグメントがこれらのプラスミ
ドに導入でき、また発現させることができる。機能的な
ポリペプチドをコードしているＤＮＡをこれらプラスミ
ドに導入するには、これらプラスミドのＥＫ-ＢＧＨコ
ード化ＤＮＡを含有するＸbaＩ-ＢamＨＩまたはＮdeＩ-
ＢamＨＩフラグメントを、発現させようとする機能的な
ポリペプチドコード化ＤＮＡと置換させる反応を行い、
ＸbaＩ-ＢamＨＩまたはＮdeＩ-ＢamＨＩ制限フラグメン
トとして行えばよい。機能的なポリペプチドをコードし
ているＤＮＡを必要なＸbaＩ-ＢamＨＩまたはＮdeＩ-Ｂ
amＨＩ制限フラグメントに変換するために要求される修
飾法は、当業者に可能な反応を利用するものである。本
発明の発現ベクターに導入することのできる他のポリペ
プチドコード化ＤＮＡには例えば、β-ガラクトシダー
ゼ、ヒトプレプロインスリン、ヒトプロインスリン、ヒ
トインスリンＡ鎖、ヒトインスリンＢ鎖、非ヒトインス
リン、ヒト成長ホルモン、インスリン様成長因子、ヒト
インターフェロン、ウイルス抗原、ウロキナーゼ、組織
型プラスミノーゲンアクチベーター、インターロイキン
１−６、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、ヒトト
ランスフェリンなどをコードしているＤＮＡがある。
【００２９】さらに、本発明の発現ベクターは翻訳活性
化配列を含有しているのが好ましい。翻訳活性化配列は
シャイン(Shine)およびダルガーノ(Dalgarno)のNature
254:34(1975)、およびステイツ(Steitz,J.A.)のBiologi
cal Regulation and Development: Gene Expression 1:
349(R.F.Goldberg 編,1979)によって議論されている。
翻訳活性化配列をクローニングする方法は、マニアチス
(Maniatis)らのMolecular Cloning: A Laboratory Manu
al,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨー
ク(2編,1989)に記載されている。
化配列を含有しているのが好ましい。翻訳活性化配列は
シャイン(Shine)およびダルガーノ(Dalgarno)のNature
254:34(1975)、およびステイツ(Steitz,J.A.)のBiologi
cal Regulation and Development: Gene Expression 1:
349(R.F.Goldberg 編,1979)によって議論されている。
翻訳活性化配列をクローニングする方法は、マニアチス
(Maniatis)らのMolecular Cloning: A Laboratory Manu
al,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・
プレス，コールド・スプリング・ハーバー，ニューヨー
ク(2編,1989)に記載されている。
【００３０】本発明の転写活性化配列は、本分子の末端
に位置するＥcoＲＩおよびＢglII粘着末端を有してい
る。この粘着末端を使用し、本明細書に記載するクロー
ニングベクターにこの転写活性化配列をクローニングし
た。これらの粘着末端は連結を可能とするが、配列の活
性には寄与しない。これらの末端を改変でき、またはＥ
coＲＩまたはＢglII以外の制限酵素認識部位に連結でき
るように全転写活性化配列を構築することができること
は、当業者ならば理解されよう。従って、本発明はいか
なる意味においても本明細書に具体的に例示した正確な
ＤＮＡ配列に制限されるものではない。
に位置するＥcoＲＩおよびＢglII粘着末端を有してい
る。この粘着末端を使用し、本明細書に記載するクロー
ニングベクターにこの転写活性化配列をクローニングし
た。これらの粘着末端は連結を可能とするが、配列の活
性には寄与しない。これらの末端を改変でき、またはＥ
coＲＩまたはＢglII以外の制限酵素認識部位に連結でき
るように全転写活性化配列を構築することができること
は、当業者ならば理解されよう。従って、本発明はいか
なる意味においても本明細書に具体的に例示した正確な
ＤＮＡ配列に制限されるものではない。
【００３１】プラスミドpsyn３、psynＣ、psyn４、psyn
Ｄ、pＨＰＲ１０６、pＨＰＲ１０６ＡおよびpＨＤＭ１
５９は、そのＤＮＡ配列が既に有意に改変されている転
写活性化配列を含有している。プラスミドpsynＣおよび
psyn３の転写活性化配列は最初のリプレッサー結合領域
内の変動および−１０共通配列を含有している。プラス
ミドpsynＤおよびpsyn３の転写活性化配列を改変してＯ
L３オペレーター領域を削除した。プラスミドpＨＰＲ１
０６の転写活性化配列は、ＯL１リプレッサー結合領域
内に１塩基の変化を有している−１０共通配列を含有し
ている。この変化により、リプレッサー結合性および抑
制性に対する影響は最小限に抑えられて転写活性化の活
性が増大される。プラスミドpＨＤＭ１５９は、cＩ８５
７リプレッサーへの結合親和性を増大させる変化を有し
ている。プラスミドpＨＤＭ１５９は、転写活性化の活
性には最小限の影響しか与えないように−１０領域の１
つの塩基を変化させて構築した。従って、本発明は、ベ
クター安定性を増大させると共に、機能的に連結された
遺伝子の発現を調節することのできる種々の修飾型バク
テリオファージλpＬプロモーター-オペレーター領域を
包含している。
Ｄ、pＨＰＲ１０６、pＨＰＲ１０６ＡおよびpＨＤＭ１
５９は、そのＤＮＡ配列が既に有意に改変されている転
写活性化配列を含有している。プラスミドpsynＣおよび
psyn３の転写活性化配列は最初のリプレッサー結合領域
内の変動および−１０共通配列を含有している。プラス
ミドpsynＤおよびpsyn３の転写活性化配列を改変してＯ
L３オペレーター領域を削除した。プラスミドpＨＰＲ１
０６の転写活性化配列は、ＯL１リプレッサー結合領域
内に１塩基の変化を有している−１０共通配列を含有し
ている。この変化により、リプレッサー結合性および抑
制性に対する影響は最小限に抑えられて転写活性化の活
性が増大される。プラスミドpＨＤＭ１５９は、cＩ８５
７リプレッサーへの結合親和性を増大させる変化を有し
ている。プラスミドpＨＤＭ１５９は、転写活性化の活
性には最小限の影響しか与えないように−１０領域の１
つの塩基を変化させて構築した。従って、本発明は、ベ
クター安定性を増大させると共に、機能的に連結された
遺伝子の発現を調節することのできる種々の修飾型バク
テリオファージλpＬプロモーター-オペレーター領域を
包含している。
【００３２】適当な発酵条件下において本発明によって
提供される組換えＤＮＡ発現ベクターを含有する宿主細
胞から機能的なポリペプチド産物を発現させる方法も本
発明によって提供されることは、当業者ならば理解され
よう。発酵が終了したなら、ヘテロローガスなポリペプ
チド産物を当業界周知の種々の方法によってその宿主細
胞または得られた発酵ブロスから単離する。本発明は、
規定された培地組成物および複合培地組成物の両者にお
いて実施することができる。当業者には、発酵工程で使
用される培地が産物を最大限に発現させるうえで重要で
あることは理解されよう。例えば、マニアチスら(1982)
により議論されているような種々の培地は、本発明を実
施するのに使用する特定の発現系のための培地として最
適であるか否かを評価すべきである。例えば、Domachら
のBiotechnology and Bioengineering,XXVI巻:203-206
(1984)に記載されているような培地組成物は、本発明の
形質転換細胞を発育させるための発酵培地として使用す
ることができる。得られた形質転換体を発育に適する条
件下で培養し、最適な発現が得られるに充分な数にす
る。この時点で、温度感受性cＩ８５７リプレッサー遺
伝子産物を不活化させるレベルにまで培養温度を上昇さ
せ、それにより本発明の新規な転写活性化配列から発現
を起こさせることができる。
提供される組換えＤＮＡ発現ベクターを含有する宿主細
胞から機能的なポリペプチド産物を発現させる方法も本
発明によって提供されることは、当業者ならば理解され
よう。発酵が終了したなら、ヘテロローガスなポリペプ
チド産物を当業界周知の種々の方法によってその宿主細
胞または得られた発酵ブロスから単離する。本発明は、
規定された培地組成物および複合培地組成物の両者にお
いて実施することができる。当業者には、発酵工程で使
用される培地が産物を最大限に発現させるうえで重要で
あることは理解されよう。例えば、マニアチスら(1982)
により議論されているような種々の培地は、本発明を実
施するのに使用する特定の発現系のための培地として最
適であるか否かを評価すべきである。例えば、Domachら
のBiotechnology and Bioengineering,XXVI巻:203-206
(1984)に記載されているような培地組成物は、本発明の
形質転換細胞を発育させるための発酵培地として使用す
ることができる。得られた形質転換体を発育に適する条
件下で培養し、最適な発現が得られるに充分な数にす
る。この時点で、温度感受性cＩ８５７リプレッサー遺
伝子産物を不活化させるレベルにまで培養温度を上昇さ
せ、それにより本発明の新規な転写活性化配列から発現
を起こさせることができる。
【００３３】以下の実施例は本発明のさらなる理解を助
けるためのものである。使用する個々の材料、菌株およ
び条件は本発明をさらに例示するためのものであり、本
発明の妥当な範囲を限定するものではない。本実施例で
引用するすべての酵素は特に明記しない限り、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ(ＢＲＬ)[ＭＤ ２０８７
７，ゲイセルスバーグ]、またはニュー・イングランド
・バイオラボス・インコーポレイデッド(ＮＥＢ)[ＭＡ
０１９１５，ビバリー]、またはベーリンガー-マンハイ
ム・バイオケミカルズ(インディアナ４６２５０，イン
ディアナポリス，Ｐ．Ｏ．ボックス５０８１６，キャス
トルウェイ・ドライブ７９４１)から市販されており、
それら製造元の教示に実質的に従って使用している。
けるためのものである。使用する個々の材料、菌株およ
び条件は本発明をさらに例示するためのものであり、本
発明の妥当な範囲を限定するものではない。本実施例で
引用するすべての酵素は特に明記しない限り、ベセスダ
・リサーチ・ラボラトリーズ(ＢＲＬ)[ＭＤ ２０８７
７，ゲイセルスバーグ]、またはニュー・イングランド
・バイオラボス・インコーポレイデッド(ＮＥＢ)[ＭＡ
０１９１５，ビバリー]、またはベーリンガー-マンハイ
ム・バイオケミカルズ(インディアナ４６２５０，イン
ディアナポリス，Ｐ．Ｏ．ボックス５０８１６，キャス
トルウェイ・ドライブ７９４１)から市販されており、
それら製造元の教示に実質的に従って使用している。
【００３４】実施例１ pＣＺＲ１２５の構築 Ａ．プラスミドpＬ１１０の５．８kb ＸbaＩ-ＢamＨＩ
制限フラグメントの調製 ６０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．５[トリスとはトリス(ヒ
ドロキシメチル)アミノメタンである]、１０mＭ ＭgＣl
2、１００mＭ ＮaＣl および１mＭ β-メルカプトエタ
ノールを含有する反応容量５００μl 中、プラスミドp
Ｌ１１０(２５μg)をＸbaＩ(１５μl、１５０単位)で完
全消化した。この混合物を３７℃で１時間インキュベー
トした。消化されたＤＮＡをフェノールとクロロホルム
の５０：５０混液で２回抽出し、水層を回収した。水層
に無水エタノール２．５容量および３Ｍ 酢酸ナトリウ
ム０．１容量を添加し、その水層からＤＮＡを回収し
た。得られたＤＮＡを遠心によって採取し、水５０μl
に再懸濁した。
制限フラグメントの調製 ６０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．５[トリスとはトリス(ヒ
ドロキシメチル)アミノメタンである]、１０mＭ ＭgＣl
2、１００mＭ ＮaＣl および１mＭ β-メルカプトエタ
ノールを含有する反応容量５００μl 中、プラスミドp
Ｌ１１０(２５μg)をＸbaＩ(１５μl、１５０単位)で完
全消化した。この混合物を３７℃で１時間インキュベー
トした。消化されたＤＮＡをフェノールとクロロホルム
の５０：５０混液で２回抽出し、水層を回収した。水層
に無水エタノール２．５容量および３Ｍ 酢酸ナトリウ
ム０．１容量を添加し、その水層からＤＮＡを回収し
た。得られたＤＮＡを遠心によって採取し、水５０μl
に再懸濁した。
【００３５】上記のＤＮＡを以下のようにしてＢamＨＩ
で部分的に消化した。１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．
８、７mＭ ＭgＣl2、１５０mＭ 塩化ナトリウムおよび
６mＭβ−メルカプトエタノールからなる反応容量１５
０μl 中、ＸbaＩ消化ＤＮＡ５０μl をＢamＨＩ(０．
２μl、２単位)と混合した。この混合物を３７℃で５分
間インキュベートした。得られた試料を上記のようにし
て精製し回収し、ＴＥ(ＴＥとは１０mＭ トリス-ＨＣl
pＨ７．４および１mＭ エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴ
Ａ)である)５０μl 中に再懸濁した。補充緩衝液(２５
％v/vグリセリン、０．０５％w/vブロムフェノールブル
ーおよび０．５％w/vキシレンシアノール)５μl をこの
試料に加え、次いでManiatisらのMolecular Cloning: A
Laboratory Manual(1982),コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー，コールド・スプリング・ハーバ
ー，ニューヨークの１５０-１７２頁に記載されている
ようにして、消化されたＤＮＡをゲル電気泳動によって
１％アガロースゲルの分画化にかけた。このアガロース
ゲルを臭化エチジウムの希薄溶液で染色し、３００nmＵ
Ｖ光の下で５．８kb ＸbaＩ-ＢamＨＩ制限フラグメント
を視覚化した。この制限フラグメントを含有するゲル部
分を回収した。このゲル切片を切除し、上記のようにフ
ェノール：クロロホルム(５０：５０)で２回抽出し、そ
してエタノール沈殿することで、ＤＮＡを精製した。
で部分的に消化した。１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．
８、７mＭ ＭgＣl2、１５０mＭ 塩化ナトリウムおよび
６mＭβ−メルカプトエタノールからなる反応容量１５
０μl 中、ＸbaＩ消化ＤＮＡ５０μl をＢamＨＩ(０．
２μl、２単位)と混合した。この混合物を３７℃で５分
間インキュベートした。得られた試料を上記のようにし
て精製し回収し、ＴＥ(ＴＥとは１０mＭ トリス-ＨＣl
pＨ７．４および１mＭ エチレンジアミン四酢酸(ＥＤＴ
Ａ)である)５０μl 中に再懸濁した。補充緩衝液(２５
％v/vグリセリン、０．０５％w/vブロムフェノールブル
ーおよび０．５％w/vキシレンシアノール)５μl をこの
試料に加え、次いでManiatisらのMolecular Cloning: A
Laboratory Manual(1982),コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー，コールド・スプリング・ハーバ
ー，ニューヨークの１５０-１７２頁に記載されている
ようにして、消化されたＤＮＡをゲル電気泳動によって
１％アガロースゲルの分画化にかけた。このアガロース
ゲルを臭化エチジウムの希薄溶液で染色し、３００nmＵ
Ｖ光の下で５．８kb ＸbaＩ-ＢamＨＩ制限フラグメント
を視覚化した。この制限フラグメントを含有するゲル部
分を回収した。このゲル切片を切除し、上記のようにフ
ェノール：クロロホルム(５０：５０)で２回抽出し、そ
してエタノール沈殿することで、ＤＮＡを精製した。
【００３６】Ｂ．ＸbaＩ-ＮdeＩリンカーの調製 以下の相補的なＤＮＡセグメントを自動ＤＮＡ合成装置
(Applied Biosystem 380B)によってβ-シアノエチルホ
スホルアミダイトの化学を使用して合成した：
(Applied Biosystem 380B)によってβ-シアノエチルホ
スホルアミダイトの化学を使用して合成した：
【化２１】 これらの１本鎖ＤＮＡセグメントを常法により精製し、
水に再懸濁した。各１本鎖ＤＮＡセグメント５μgを混
合し、７０℃に５分間加熱した。得られた混合物を室温
にまで３０分で冷却し、ＤＮＡセグメントをアニーリン
グさせた。０．２mＭ デオキシアデニン５'-三リン酸を
含有する５mＭ ＤＴＴ、１０mＭＭgＣl2、０．１Ｍ Ｋ
Ｃl、７０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．６の総容量２０μl
中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μl (１０単位)に
よってアニーリングしたＤＮＡセグメントを処理した。
この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。次
いで、得られた混合物を７０℃で５分間インキュベート
した後、室温にまで冷却した。
水に再懸濁した。各１本鎖ＤＮＡセグメント５μgを混
合し、７０℃に５分間加熱した。得られた混合物を室温
にまで３０分で冷却し、ＤＮＡセグメントをアニーリン
グさせた。０．２mＭ デオキシアデニン５'-三リン酸を
含有する５mＭ ＤＴＴ、１０mＭＭgＣl2、０．１Ｍ Ｋ
Ｃl、７０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．６の総容量２０μl
中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μl (１０単位)に
よってアニーリングしたＤＮＡセグメントを処理した。
この混合物を３７℃で３０分間インキュベートした。次
いで、得られた混合物を７０℃で５分間インキュベート
した後、室温にまで冷却した。
【００３７】Ｃ．合成ＥＫ-ＢＧＨ遺伝子の調製 ＥＫ-ＢＧＨ遺伝子をコードしているＤＮＡフラグメン
トを実施例１Ｂに記載の方法に実質的に従って合成し
た。ＥＫ-ＢＧＨをコードしている遺伝子は、７１から
８３ヌクレオチドの長さの１本鎖ＤＮＡの化学的に合成
した小片であって、それらがアニーリングした場合、Ｎ
deＩ-ＢamＨＩ粘着末端を有するＥＫ-ＢＧＨ遺伝子の両
相補鎖を含有するものから構築した。合成ＥＫ-ＢＧＨ
遺伝子の配列は以下のとおりである：
トを実施例１Ｂに記載の方法に実質的に従って合成し
た。ＥＫ-ＢＧＨをコードしている遺伝子は、７１から
８３ヌクレオチドの長さの１本鎖ＤＮＡの化学的に合成
した小片であって、それらがアニーリングした場合、Ｎ
deＩ-ＢamＨＩ粘着末端を有するＥＫ-ＢＧＨ遺伝子の両
相補鎖を含有するものから構築した。合成ＥＫ-ＢＧＨ
遺伝子の配列は以下のとおりである：
【００３８】
【化２２】 Ｄ．ＤＮＡの連結 Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、５０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．
６、１０mＭ ＭgＣl2、１mＭ ジチオトレイトール、１m
Ｍ アデニン５'-三リン酸および５％(w/v)ポリエチレン
グリコール-８０００を含有する反応物(総容量１０μl)
中で、実施例１Ａで調製したプラスミドpＬ１１０制限
フラグメント２μl (０．２μg)、実施例１Ｂで調製し
たＤＮＡフラグメント２μl (８．７５pmol)、および実
施例１Ｃで調製したＤＮＡフラグメント２μl (０．１
μg)を連結した。この混合物を１６℃で１６時間インキ
ュベートした。この混合物の一部を使用し、以下のよう
にして大腸菌細胞を形質転換した。
６、１０mＭ ＭgＣl2、１mＭ ジチオトレイトール、１m
Ｍ アデニン５'-三リン酸および５％(w/v)ポリエチレン
グリコール-８０００を含有する反応物(総容量１０μl)
中で、実施例１Ａで調製したプラスミドpＬ１１０制限
フラグメント２μl (０．２μg)、実施例１Ｂで調製し
たＤＮＡフラグメント２μl (８．７５pmol)、および実
施例１Ｃで調製したＤＮＡフラグメント２μl (０．１
μg)を連結した。この混合物を１６℃で１６時間インキ
ュベートした。この混合物の一部を使用し、以下のよう
にして大腸菌細胞を形質転換した。
【００３９】Ｅ．形質転換操作 大腸菌(Ｅ.coli)Ｋ１２ ＲＶ３０８細胞はノーザン・リ
ージォナル・リサーチ・ラボラトリー[イリノイ、ペオ
リア]から受託番号ＮＲＲＬ Ｂ-１５６２４のもとで入
手できる。Ｅ.coli Ｋ１２ ＲＶ３０８の５０ml 培養物
をＬ-ブロス[水１Ｌ当たりトリプトン１０ｇ、ＮaＣl
１０ｇおよび酵母エキス５ｇ]中でＯ．Ｄ．590が０．５
吸光度単位になるまで増殖させた。得られた培養物を氷
上で１０分間冷却した後、遠心によって細胞を採取し
た。得られた細胞ペレットを冷えた５０mＭ ＣaＣl2：
１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０(２５ml)に再懸濁し、
氷上で１５分間インキュベートした。細胞を遠心によっ
て採取し、得られた細胞ペレットを冷えた５０mＭ Ｃa
Ｃl2：１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０(２．５ml)に再
懸濁し、試料を４℃で１６時間保持させた。
ージォナル・リサーチ・ラボラトリー[イリノイ、ペオ
リア]から受託番号ＮＲＲＬ Ｂ-１５６２４のもとで入
手できる。Ｅ.coli Ｋ１２ ＲＶ３０８の５０ml 培養物
をＬ-ブロス[水１Ｌ当たりトリプトン１０ｇ、ＮaＣl
１０ｇおよび酵母エキス５ｇ]中でＯ．Ｄ．590が０．５
吸光度単位になるまで増殖させた。得られた培養物を氷
上で１０分間冷却した後、遠心によって細胞を採取し
た。得られた細胞ペレットを冷えた５０mＭ ＣaＣl2：
１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０(２５ml)に再懸濁し、
氷上で１５分間インキュベートした。細胞を遠心によっ
て採取し、得られた細胞ペレットを冷えた５０mＭ Ｃa
Ｃl2：１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０(２．５ml)に再
懸濁し、試料を４℃で１６時間保持させた。
【００４０】この細胞懸濁液２００μl を、上記のよう
にして調製した連結ＤＮＡ５０μlと混合し、次いで氷
上で６０分間インキュベートした。得られた混合物を３
２℃で４５秒間インキュベートした後、氷上に２分間置
いた。ＴＹ培地(１％トリプトン、０．５％酵母エキス
および１％塩化ナトリウム、pＨ７．４)５ml をこの混
合物に加え、３２℃で２時間インキュベートした。この
培養物１００μl を、５μｇ/ml テトラサイクリンを含
有するＴＹ寒天平板(１％トリプトン、０．５％酵母エ
キス、１％塩化ナトリウムおよび１．５％寒天、pＨ
７．４)上に広げた。これらの平板を３２℃で１６時間
インキュベートした。テトラサイクリン耐性コロニーを
個々に取り上げ、それをＴＹ培地２ml に接種した。得
られた培養物を通気しながら３２℃で１６時間インキュ
ベートした。
にして調製した連結ＤＮＡ５０μlと混合し、次いで氷
上で６０分間インキュベートした。得られた混合物を３
２℃で４５秒間インキュベートした後、氷上に２分間置
いた。ＴＹ培地(１％トリプトン、０．５％酵母エキス
および１％塩化ナトリウム、pＨ７．４)５ml をこの混
合物に加え、３２℃で２時間インキュベートした。この
培養物１００μl を、５μｇ/ml テトラサイクリンを含
有するＴＹ寒天平板(１％トリプトン、０．５％酵母エ
キス、１％塩化ナトリウムおよび１．５％寒天、pＨ
７．４)上に広げた。これらの平板を３２℃で１６時間
インキュベートした。テトラサイクリン耐性コロニーを
個々に取り上げ、それをＴＹ培地２ml に接種した。得
られた培養物を通気しながら３２℃で１６時間インキュ
ベートした。
【００４１】Ｆ．ＤＮＡ単離操作 プラスミドＤＮＡを形質転換体の培養物から以下のよう
にして単離した。以下の操作は特に明記しない限り環境
温度で行った。各培養物１．５ml を微小遠心管に移し
た。１分間遠心して細胞を集めた。その上清を微細な先
端を有するアスピレターで除去し、５０mＭ グルコー
ス、１０mＭ ＥＤＴＡおよび２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ
８．０を含有する溶液１００μl 中に得られた細胞ペレ
ットを懸濁した。室温で５分間インキュベートした後、
アルカリ性のドデシル硫酸ナトリウム溶液(０．２Ｎ Ｎ
aＯＨ、１％ＳＤＳ)２００μl を加えた。その遠心管を
穏やかに反転させて混合した後、氷上に５分間静置し
た。次いで、酢酸カリウム溶液(５Ｍ 酢酸カリウムに氷
酢酸１１．５ml および水２８．５ml を加えて調製し
た。得られた溶液はカリウム３Ｍ、酢酸５Ｍ である。)
１５０μl を加え、穏やかにボルテックスし(渦巻か
せ)、遠心管の内容物を混合した。試料を氷上で５分間
維持し、次いで１０分間遠心した。得られた上清を別の
遠心管に移し、そこへ等量のフェノール(０．１Ｍ トリ
ス(pＨ８．０)で飽和させたフェノール)を加えた。その
試料を混合した後、５分間遠心した。上清を採取し、フ
ェノール抽出を繰り返した。氷冷した無水エタノール１
ml を上清に加えた。得られた試料を混合し、固形物が
凍結しないが高い粘性を呈するまでドライアイスに保持
した。次いで、５分間遠心を行い、ＤＮＡを採取した。
吸引によって上清を除去し、７０％エタノール５００μ
l を得られたＤＮＡペレットに加えた。その試料を穏や
かに渦巻かせてペレットを洗浄し、２分間遠心した。得
られた上清を除去し、ＤＮＡペレットを減圧下に乾燥し
た。ＤＮＡをＴＥ(１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０お
よび１mＭ ＥＤＴＡ)５０μl に溶解し、４℃で保存し
た。
にして単離した。以下の操作は特に明記しない限り環境
温度で行った。各培養物１．５ml を微小遠心管に移し
た。１分間遠心して細胞を集めた。その上清を微細な先
端を有するアスピレターで除去し、５０mＭ グルコー
ス、１０mＭ ＥＤＴＡおよび２５mＭ トリス-ＨＣl pＨ
８．０を含有する溶液１００μl 中に得られた細胞ペレ
ットを懸濁した。室温で５分間インキュベートした後、
アルカリ性のドデシル硫酸ナトリウム溶液(０．２Ｎ Ｎ
aＯＨ、１％ＳＤＳ)２００μl を加えた。その遠心管を
穏やかに反転させて混合した後、氷上に５分間静置し
た。次いで、酢酸カリウム溶液(５Ｍ 酢酸カリウムに氷
酢酸１１．５ml および水２８．５ml を加えて調製し
た。得られた溶液はカリウム３Ｍ、酢酸５Ｍ である。)
１５０μl を加え、穏やかにボルテックスし(渦巻か
せ)、遠心管の内容物を混合した。試料を氷上で５分間
維持し、次いで１０分間遠心した。得られた上清を別の
遠心管に移し、そこへ等量のフェノール(０．１Ｍ トリ
ス(pＨ８．０)で飽和させたフェノール)を加えた。その
試料を混合した後、５分間遠心した。上清を採取し、フ
ェノール抽出を繰り返した。氷冷した無水エタノール１
ml を上清に加えた。得られた試料を混合し、固形物が
凍結しないが高い粘性を呈するまでドライアイスに保持
した。次いで、５分間遠心を行い、ＤＮＡを採取した。
吸引によって上清を除去し、７０％エタノール５００μ
l を得られたＤＮＡペレットに加えた。その試料を穏や
かに渦巻かせてペレットを洗浄し、２分間遠心した。得
られた上清を除去し、ＤＮＡペレットを減圧下に乾燥し
た。ＤＮＡをＴＥ(１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ８．０お
よび１mＭ ＥＤＴＡ)５０μl に溶解し、４℃で保存し
た。
【００４２】Ｇ．ＤＮＡの大規模な単離 大量のpＣＺＲ１２５のプラスミドＤＮＡを以下のよう
にして単離した。５μｇ/ml テトラサイクリンを含有す
るＬブロス１リットルに大腸菌ＲＶ３０８／pＣＺＲ１
２５のコロニーを接種した。この培養物を３２℃で１６
時間発育させた。得られた培養物をＧＳＡローター[Sor
vall]を用いて６０００rpmで５分間４℃において遠心し
た。得られた上清を廃棄し、細胞ペレットをＴＥＳ緩衝
液(１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．５、１０mＭ ＮaＣ
l、および１mＭ ＥＤＴＡ)４０mlで洗浄し、次いで遠心
によって採取した。上清を捨て、得られた細胞ペレット
をドライアイス-エタノール浴中で凍結させ、解凍し
た。その解凍した細胞ペレットを２５％ショ糖および５
０mＭ ＥＤＴＡの溶液１０ml 中に再懸濁した。５mｇ/m
l リゾチーム溶液１ml、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ(pＨ８．
０)３ml、および１０mｇ/ml 煮沸ＲＮアーゼＡ[シグマ
・ケミカル・コーポレーション(Sigma ChemicalCo.),M
o.セントルイス,P.O.ボックス14508から入手]１００μl
をその溶液に加え、次いで氷上で１５分間インキュベ
ートした。細胞溶解用溶液［１０％トリトンＸ-１００
(３ml)、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ(pＨ８．０)７５ml、１Ｍ
トリス-ＨＣl(pＨ８．０)１５ml、および水７ml を混
合して調製する］３ml をリゾチーム処理細胞に加え、
混合し、得られた溶液を氷上でさらに１５分間インキュ
ベートした。細胞溶解した細胞をドライアイス-エタノ
ール浴中で凍結し、次いで解凍した。
にして単離した。５μｇ/ml テトラサイクリンを含有す
るＬブロス１リットルに大腸菌ＲＶ３０８／pＣＺＲ１
２５のコロニーを接種した。この培養物を３２℃で１６
時間発育させた。得られた培養物をＧＳＡローター[Sor
vall]を用いて６０００rpmで５分間４℃において遠心し
た。得られた上清を廃棄し、細胞ペレットをＴＥＳ緩衝
液(１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．５、１０mＭ ＮaＣ
l、および１mＭ ＥＤＴＡ)４０mlで洗浄し、次いで遠心
によって採取した。上清を捨て、得られた細胞ペレット
をドライアイス-エタノール浴中で凍結させ、解凍し
た。その解凍した細胞ペレットを２５％ショ糖および５
０mＭ ＥＤＴＡの溶液１０ml 中に再懸濁した。５mｇ/m
l リゾチーム溶液１ml、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ(pＨ８．
０)３ml、および１０mｇ/ml 煮沸ＲＮアーゼＡ[シグマ
・ケミカル・コーポレーション(Sigma ChemicalCo.),M
o.セントルイス,P.O.ボックス14508から入手]１００μl
をその溶液に加え、次いで氷上で１５分間インキュベ
ートした。細胞溶解用溶液［１０％トリトンＸ-１００
(３ml)、０．２５Ｍ ＥＤＴＡ(pＨ８．０)７５ml、１Ｍ
トリス-ＨＣl(pＨ８．０)１５ml、および水７ml を混
合して調製する］３ml をリゾチーム処理細胞に加え、
混合し、得られた溶液を氷上でさらに１５分間インキュ
ベートした。細胞溶解した細胞をドライアイス-エタノ
ール浴中で凍結し、次いで解凍した。
【００４３】ＳＷ２８．１ローター[Bechman, Scientif
ic Instrument Division,Campus Drive at Jamboree Bl
vd.,Irvine,CA 92713]を用い２５,０００rpmで４０分間
遠心し、緩衝化フェノールで抽出することによって、細
胞残骸を溶液から除去した。ＣsＣl 約３０．４４ｇお
よび５mｇ/ml 臭化エチジウム溶液〜１ml をこの細胞抽
出液に加え、次いでＴＥＳ緩衝液[１０mＭ トリス-ＨＣ
l pＨ７．５、１０mＭＮaＣl および１mＭ ＥＤＴＡ]を
加えて溶液の容量を４０ml とした。この溶液をＶＴi５
０超遠心管[Bechman]中にデカントし、次いで封管し、
ＶＴi５０ローターを用いて４２,０００rpmで約１６時
間遠心した。紫外光で視覚化されたプラスミドのバンド
を単離し、次いでＴｉ７５チューブおよびローター[Bec
hman]に入れ、５０,０００rpmで１６時間遠心した。
０．７６１ｇ／ml ＣsＣlを含有するＴＥＳを用いて必
要量に調節した。プラスミドのバンドを再度単離し、塩
-飽和イソプロパノールで抽出して臭化エチジウムを除
去し、ＴＥＳ緩衝液で１：３に希釈した。次いでこの溶
液に３Ｍ 酢酸ナトリウム１容量および無水エタノール
２容量を加え、−２０℃で１６時間インキュベートし
た。得られた溶液をＳＳ３４ローター[Sorvall]を用い
て１０,０００rpmで１５分間遠心し、プラスミドＤＮＡ
をペレット化した。この操作により得られたプラスミド
ＤＮＡをＴＥ緩衝液に懸濁し、−２０℃で保存した。
ic Instrument Division,Campus Drive at Jamboree Bl
vd.,Irvine,CA 92713]を用い２５,０００rpmで４０分間
遠心し、緩衝化フェノールで抽出することによって、細
胞残骸を溶液から除去した。ＣsＣl 約３０．４４ｇお
よび５mｇ/ml 臭化エチジウム溶液〜１ml をこの細胞抽
出液に加え、次いでＴＥＳ緩衝液[１０mＭ トリス-ＨＣ
l pＨ７．５、１０mＭＮaＣl および１mＭ ＥＤＴＡ]を
加えて溶液の容量を４０ml とした。この溶液をＶＴi５
０超遠心管[Bechman]中にデカントし、次いで封管し、
ＶＴi５０ローターを用いて４２,０００rpmで約１６時
間遠心した。紫外光で視覚化されたプラスミドのバンド
を単離し、次いでＴｉ７５チューブおよびローター[Bec
hman]に入れ、５０,０００rpmで１６時間遠心した。
０．７６１ｇ／ml ＣsＣlを含有するＴＥＳを用いて必
要量に調節した。プラスミドのバンドを再度単離し、塩
-飽和イソプロパノールで抽出して臭化エチジウムを除
去し、ＴＥＳ緩衝液で１：３に希釈した。次いでこの溶
液に３Ｍ 酢酸ナトリウム１容量および無水エタノール
２容量を加え、−２０℃で１６時間インキュベートし
た。得られた溶液をＳＳ３４ローター[Sorvall]を用い
て１０,０００rpmで１５分間遠心し、プラスミドＤＮＡ
をペレット化した。この操作により得られたプラスミド
ＤＮＡをＴＥ緩衝液に懸濁し、−２０℃で保存した。
【００４４】実施例２ プラスミドpＨＰＲ９７の構築 Ａ．ＥcoＲＩ-ＢglII消化プラスミドpＣＺＲ１２５の調
製 １０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．５、１００mＭ ＮaＣl、
１０mＭ ＭgＣl2、および１０mＭ β-メルカプトエタノ
ールを含有する反応容量６０μl 中、プラスミドpＣＺ
Ｒ１２５ＤＮＡ１０μgをＥcoＲＩ(５μl、５５単位)お
よびＢglII(５μl、５５単位)を用いて完全に消化し
た。反応物を３７℃で２時間インキュベートした。消化
されたＤＮＡを精製し、実施例１Ａに記載のようにして
調製用アガロースゲル電気泳動によって６．０kb フラ
グメントを単離した。
製 １０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．５、１００mＭ ＮaＣl、
１０mＭ ＭgＣl2、および１０mＭ β-メルカプトエタノ
ールを含有する反応容量６０μl 中、プラスミドpＣＺ
Ｒ１２５ＤＮＡ１０μgをＥcoＲＩ(５μl、５５単位)お
よびＢglII(５μl、５５単位)を用いて完全に消化し
た。反応物を３７℃で２時間インキュベートした。消化
されたＤＮＡを精製し、実施例１Ａに記載のようにして
調製用アガロースゲル電気泳動によって６．０kb フラ
グメントを単離した。
【００４５】Ｂ．転写活性化配列ＤＮＡの調製 以下に記載の１本鎖ＤＮＡ配列を合成し、転写活性化配
列を調製した：
列を調製した：
【化２３】
【００４６】これら１本鎖ＤＮＡセグメントはβ-シア
ノエチルホスホルアミダイトの化学を使用する自動ＤＮ
Ａ合成装置(Applied Biosysytems 380B)によって合成し
た。得られた合成ＤＮＡセグメントを精製し、次いでＴ
Ｅ緩衝液中に０℃で保存した。各１本鎖ＤＮＡセグメン
ト１０μl (５μg)を混合し、７０℃で５分間加熱し
た。この混合物を室温で３０分間冷却し、ＤＮＡセグメ
ントをアニーリングさせた。総量２０μl の０．２mＭ
アデニン５'-三リン酸を含有する７０mＭ トリス-ＨＣl
pＨ７．６、０．１Ｍ ＫＣl、１０mＭ ＭgＣl2、５mＭ
ＤＴＴ中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μl (１０
単位)を用いて、アニーリングしたＤＮＡフラグメント
を処理した。この混合物を３７℃で３０分間インキュベ
ートした。次いで、得られた混合物を７０℃で５分間イ
ンキュベートし、次いで室温で冷却した。
ノエチルホスホルアミダイトの化学を使用する自動ＤＮ
Ａ合成装置(Applied Biosysytems 380B)によって合成し
た。得られた合成ＤＮＡセグメントを精製し、次いでＴ
Ｅ緩衝液中に０℃で保存した。各１本鎖ＤＮＡセグメン
ト１０μl (５μg)を混合し、７０℃で５分間加熱し
た。この混合物を室温で３０分間冷却し、ＤＮＡセグメ
ントをアニーリングさせた。総量２０μl の０．２mＭ
アデニン５'-三リン酸を含有する７０mＭ トリス-ＨＣl
pＨ７．６、０．１Ｍ ＫＣl、１０mＭ ＭgＣl2、５mＭ
ＤＴＴ中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μl (１０
単位)を用いて、アニーリングしたＤＮＡフラグメント
を処理した。この混合物を３７℃で３０分間インキュベ
ートした。次いで、得られた混合物を７０℃で５分間イ
ンキュベートし、次いで室温で冷却した。
【００４７】Ｃ．プラスミドpＨＰＲ９７の最終的構築 実施例２Ａで調製した制限フラグメント２μgおよび実
施例２Ｂで調製したキナーゼ処理ＤＮＡフラグメント１
μgを連結するに当たり、混合物を室温で１時間インキ
ュベートし、５分間７０℃に加熱した後、室温にまで冷
却すること以外は実施例１Ｄの方法に実質的に従って行
った。得られた連結ＤＮＡの一部を実施例１Ｅの方法に
従ってＥ.coli Ｋ１２ ＭＭ２９４細胞に形質転換し
た。Ｅ.coliＫ１２ ＭＭ２９４細胞はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション[メリーランド２０８５
２，ロックビレ]から受託番号ＡＴＣＣ ３１４４６のも
とに入手可能である。テトラサイクリン耐性の形質転換
体を選択し、実施例１Ｆに記載のアルカリ性細胞溶解法
に従ってそれらのプラスミドＤＮＡを単離した。制限分
析を行い、pＨＰＲ９７の構造を確かめた。pＨＰＲ９７
の制限部位および機能地図を添付の図２に示す。
施例２Ｂで調製したキナーゼ処理ＤＮＡフラグメント１
μgを連結するに当たり、混合物を室温で１時間インキ
ュベートし、５分間７０℃に加熱した後、室温にまで冷
却すること以外は実施例１Ｄの方法に実質的に従って行
った。得られた連結ＤＮＡの一部を実施例１Ｅの方法に
従ってＥ.coli Ｋ１２ ＭＭ２９４細胞に形質転換し
た。Ｅ.coliＫ１２ ＭＭ２９４細胞はアメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション[メリーランド２０８５
２，ロックビレ]から受託番号ＡＴＣＣ ３１４４６のも
とに入手可能である。テトラサイクリン耐性の形質転換
体を選択し、実施例１Ｆに記載のアルカリ性細胞溶解法
に従ってそれらのプラスミドＤＮＡを単離した。制限分
析を行い、pＨＰＲ９７の構造を確かめた。pＨＰＲ９７
の制限部位および機能地図を添付の図２に示す。
【００４８】実施例３ プラスミドpＨＰＲ１０４の構築 実施例２の記載に実質的に従ってプラスミドpＨＰＲ１
０４を構築した。しかし、合成転写活性化配列は以下に
示す１本鎖ＤＮＡセグメントから構築した：
０４を構築した。しかし、合成転写活性化配列は以下に
示す１本鎖ＤＮＡセグメントから構築した：
【化２４】 プラスミドpＨＰＲ１０４の制限部位および機能地図を
図３に示す。
図３に示す。
【００４９】実施例４ プラスミドpＨＤＭ１５９の構築 実施例２の記載に実質的に従ってプラスミドpＨＤＭ１
５９を構築した。しかし、合成転写活性化配列は以下に
示す１本鎖ＤＮＡセグメントから構築した：
５９を構築した。しかし、合成転写活性化配列は以下に
示す１本鎖ＤＮＡセグメントから構築した：
【化２５】 プラスミドpＨＤＭ１５９の制限部位および機能地図を
図４に示す。
図４に示す。
【００５０】実施例５ プラスミドpＨＰＲ１０６の構築 実施例２の記載に実質的に従ってプラスミドpＨＰＲ１
０６を構築した。しかし、合成転写活性化配列は以下に
示す１本鎖ＤＮＡセグメントから構築した：
０６を構築した。しかし、合成転写活性化配列は以下に
示す１本鎖ＤＮＡセグメントから構築した：
【化２６】 プラスミドpＨＰＲ１０６の制限部位および機能地図を
図５に示す。
図５に示す。
【００５１】実施例６ pＨＰＲ１０６Ａの構築 実施例２の記載に実質的に従ってプラスミドpＨＰＲ１
０６Ａを構築した。しかし、合成転写活性化配列は以下
に示す１本鎖ＤＮＡセグメントから構築した：
０６Ａを構築した。しかし、合成転写活性化配列は以下
に示す１本鎖ＤＮＡセグメントから構築した：
【化２７】 プラスミドpＨＰＲ１０６Ａの制限部位および機能地図
は図５に示すものと同一である。
は図５に示すものと同一である。
【００５２】実施例７ プラスミドpsyn３およびpsynＣの構築 Ａ．ＥcoＲＩ-ＢglII消化プラスミドpＬ１１０の調製 プラスミドpＣＺＲ１２５ＤＮＡをプラスミドpＬ１１０
ＤＮＡに変更し、実質的に実施例２Ａに従って、プラス
ミドpＬ１１０の６．０kb ＥcoＲＩ-ＢglII制限フラグ
メントを調製した。プラスミドpＬ１１０は、１９８９
年１０月１７日に発行された米国特許第4,874,703号に
おいて特許請求され、その構築のための方法および出発
物質がその特許公報に記載されたものである。この特許
を引用によって本明細書に包含させる。 Ｂ．転写活性化配列ＤＮＡの調製 転写活性化配列を以下に記載の１本鎖ＤＮＡセグメント
から構築した：
ＤＮＡに変更し、実質的に実施例２Ａに従って、プラス
ミドpＬ１１０の６．０kb ＥcoＲＩ-ＢglII制限フラグ
メントを調製した。プラスミドpＬ１１０は、１９８９
年１０月１７日に発行された米国特許第4,874,703号に
おいて特許請求され、その構築のための方法および出発
物質がその特許公報に記載されたものである。この特許
を引用によって本明細書に包含させる。 Ｂ．転写活性化配列ＤＮＡの調製 転写活性化配列を以下に記載の１本鎖ＤＮＡセグメント
から構築した：
【化２８】
【００５３】これらのオリゴヌクレオチドは、実施例２
Ｂに記載の方法によって自動ＤＮＡ合成装置により合成
した[Applied Biosystems，ＣＡ９４４０４，フォスタ
ー・シティー，リンカーン・センター・ドライブ８５０
番]。あるいは、これらオリゴヌクレオチドは、イタク
ラらのScience 198:1058(1977)およびCreaらのProc.Nat
l.Acad.Sci.,U.S.A.75:5765(1978)の方法に実質的に従
った、完全保護トリデオキシヌクレオチド作成ブロック
を利用する改変ホスホトリエステル法によって合成する
こともできる。得られた合成ＤＮＡセグメントをＴＥ緩
衝液に溶解し、０℃で保存した。
Ｂに記載の方法によって自動ＤＮＡ合成装置により合成
した[Applied Biosystems，ＣＡ９４４０４，フォスタ
ー・シティー，リンカーン・センター・ドライブ８５０
番]。あるいは、これらオリゴヌクレオチドは、イタク
ラらのScience 198:1058(1977)およびCreaらのProc.Nat
l.Acad.Sci.,U.S.A.75:5765(1978)の方法に実質的に従
った、完全保護トリデオキシヌクレオチド作成ブロック
を利用する改変ホスホトリエステル法によって合成する
こともできる。得られた合成ＤＮＡセグメントをＴＥ緩
衝液に溶解し、０℃で保存した。
【００５４】総容量１００μl の５０mＭ トリス-ＨＣl
pＨ７．６、１０mＭ ＭgＣl2、１０mＭ ジチオトレイ
トール(ＤＴＴ)および０．３mＭ アデノシン５'-三リン
酸(ＡＴＰ)中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μl(〜
１０単位)を用いて３７℃で３０分間処理することによ
り、各合成オリゴヌクレオチド２−６の１nmolをリン酸
化した。このインキュベートの後、６５℃で１０分間イ
ンキュベートし、次いで凍結した。５０mＭ トリス-Ｈ
Ｃl pＨ７．６、１０mＭ ＭgＣl2、１０mＭ ＤＴＴおよ
び０．５mＭ ＡＴＰおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１０単
位を含有する反応緩衝液中、リン酸化オリゴヌクレオチ
ド各１nmol を非リン酸オリゴヌクレオチド１および７
(１．２nmol)と混合した。この反応物を４℃で一晩イン
キュベートした。インキュベートした後、連結された１
１３塩基対の２本鎖ＤＮＡフラグメントを１５％ポリア
クリルアミドゲルのゲル電気泳動によって精製した。ブ
ラウン(Brown)らの[Brown,EらのMethods in Enzymology
68:101]に記載されているように、２Ｍ 炭酸水素トリ
エチルアンモニウム(pＨ７．９)で抽出した後、ＤＥ-５
２カラムで脱塩することで、ＤＮＡフラグメントをその
ゲルから切除し、回収した。単離した後、既述のように
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによってＤＮＡフラグメ
ントをリン酸化した。キナーゼ反応の後、得られたＤＮ
ＡをセファデックスＧ-５０カラム(ファルマシア,Ｐ-Ｌ
バイオケニカルズ,Ｉnc．ＮＪ０８８５４，ピスカッタ
ウェイ，センテンシャル・アベニュー８００番)に通
し、単離されたＤＮＡを１０mＭ トリス-ＨＣl(pＨ８．
０)５０μl 中に保存した。
pＨ７．６、１０mＭ ＭgＣl2、１０mＭ ジチオトレイ
トール(ＤＴＴ)および０．３mＭ アデノシン５'-三リン
酸(ＡＴＰ)中、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ１μl(〜
１０単位)を用いて３７℃で３０分間処理することによ
り、各合成オリゴヌクレオチド２−６の１nmolをリン酸
化した。このインキュベートの後、６５℃で１０分間イ
ンキュベートし、次いで凍結した。５０mＭ トリス-Ｈ
Ｃl pＨ７．６、１０mＭ ＭgＣl2、１０mＭ ＤＴＴおよ
び０．５mＭ ＡＴＰおよびＴ４ ＤＮＡリガーゼ１０単
位を含有する反応緩衝液中、リン酸化オリゴヌクレオチ
ド各１nmol を非リン酸オリゴヌクレオチド１および７
(１．２nmol)と混合した。この反応物を４℃で一晩イン
キュベートした。インキュベートした後、連結された１
１３塩基対の２本鎖ＤＮＡフラグメントを１５％ポリア
クリルアミドゲルのゲル電気泳動によって精製した。ブ
ラウン(Brown)らの[Brown,EらのMethods in Enzymology
68:101]に記載されているように、２Ｍ 炭酸水素トリ
エチルアンモニウム(pＨ７．９)で抽出した後、ＤＥ-５
２カラムで脱塩することで、ＤＮＡフラグメントをその
ゲルから切除し、回収した。単離した後、既述のように
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによってＤＮＡフラグメ
ントをリン酸化した。キナーゼ反応の後、得られたＤＮ
ＡをセファデックスＧ-５０カラム(ファルマシア,Ｐ-Ｌ
バイオケニカルズ,Ｉnc．ＮＪ０８８５４，ピスカッタ
ウェイ，センテンシャル・アベニュー８００番)に通
し、単離されたＤＮＡを１０mＭ トリス-ＨＣl(pＨ８．
０)５０μl 中に保存した。
【００５５】このＤＮＡフラグメントは、実施例２の方
法に実質的に従って、以下に示す合成ＤＮＡセグメント
から構築することもできる：
法に実質的に従って、以下に示す合成ＤＮＡセグメント
から構築することもできる：
【化２９】
【００５６】Ｃ．プラスミドpsyn３の最終的構築 実施例６Ａで調製した制限フラグメント２μgおよび実
施例６Ｂで調製したキナーゼ処理ＤＮＡフラグメント１
μgを実施例２Ｃの方法に実質的に従って連結した。実
施例１Ｅの方法に従って、得られた連結ＤＮＡの一部を
Ｅ.coli Ｋ１２ＲＶ３０８細胞に形質転換した。テトラ
サイクリン耐性の形質転換体を選択し、実施例１Ｆの小
規模調製ＤＮＡ単離操作に従ってそれらのプラスミドＤ
ＮＡを単離した。制限酵素分析により、プラスミドpsyn
３の構造を確かめた。
施例６Ｂで調製したキナーゼ処理ＤＮＡフラグメント１
μgを実施例２Ｃの方法に実質的に従って連結した。実
施例１Ｅの方法に従って、得られた連結ＤＮＡの一部を
Ｅ.coli Ｋ１２ＲＶ３０８細胞に形質転換した。テトラ
サイクリン耐性の形質転換体を選択し、実施例１Ｆの小
規模調製ＤＮＡ単離操作に従ってそれらのプラスミドＤ
ＮＡを単離した。制限酵素分析により、プラスミドpsyn
３の構造を確かめた。
【００５７】Ｄ．プラスミドpsynＣの構築 実施例６Ｂで調製した合成ＤＮＡフラグメントは、好ま
しくは実施例２Ｃに記載の方法に実質的に従って実施例
２Ａで調製したＤＮＡと連結し、プラスミドpsynＣを作
成するのがよい。実施例１Ｅの方法に従って、得られた
連結ＤＮＡの一部をＥ.coli Ｋ１２ ＲＶ３０８細胞に
形質転換した。テトラサイクリン耐性の形質転換体を選
択し、実施例１Ｆの小規模調製ＤＮＡ単離操作に従って
それらのプラスミドＤＮＡを単離した。制限酵素分析に
より、プラスミドpsynＣの構造を確かめた。プラスミド
psynＣの制限部位および機能地図を図６に示す。
しくは実施例２Ｃに記載の方法に実質的に従って実施例
２Ａで調製したＤＮＡと連結し、プラスミドpsynＣを作
成するのがよい。実施例１Ｅの方法に従って、得られた
連結ＤＮＡの一部をＥ.coli Ｋ１２ ＲＶ３０８細胞に
形質転換した。テトラサイクリン耐性の形質転換体を選
択し、実施例１Ｆの小規模調製ＤＮＡ単離操作に従って
それらのプラスミドＤＮＡを単離した。制限酵素分析に
より、プラスミドpsynＣの構造を確かめた。プラスミド
psynＣの制限部位および機能地図を図６に示す。
【００５８】実施例８ プラスミドpsyn４およびpsynＤの構築 プラスミドpsyn３の転写活性化配列からＯL３オペレー
ター領域を削除してプラスミドpsyn４を構築した。１０
mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．４、２０mＭ ＫＣl、１０mＭ
ＭgＣl2および１mＭ ＤＴＴを含有する反応容量５０μ
l 中で、プラスミドpsyn３(実施例６)１０μgをＨpaＩ
(１０μl、１００単位)で完全消化した。この混合物を
３７℃で１時間インキュベートした。実施例１Ａに記載
の方法に従って、得られたＤＮＡフラグメント(４１６
８塩基対および１９２４塩基対)を調製用ゲル電気泳動
によって単離した。
ター領域を削除してプラスミドpsyn４を構築した。１０
mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．４、２０mＭ ＫＣl、１０mＭ
ＭgＣl2および１mＭ ＤＴＴを含有する反応容量５０μ
l 中で、プラスミドpsyn３(実施例６)１０μgをＨpaＩ
(１０μl、１００単位)で完全消化した。この混合物を
３７℃で１時間インキュベートした。実施例１Ａに記載
の方法に従って、得られたＤＮＡフラグメント(４１６
８塩基対および１９２４塩基対)を調製用ゲル電気泳動
によって単離した。
【００５９】１０mＭ トリス-ＨＣl pＨ７．４、１００
mＭ ＮaＣl、１０mＭ ＭgＣl2および１０mＭ β-メルカ
プトエタノールを含有する反応容量５０μl 中で、４１
６８塩基対のＨpaＩ消化フラグメントＤＮＡ約５μgを
ＳspＩ(５μl、５０単位)でさらに消化した。この混合
物を３７℃で１時間インキュベートした。得られた４１
４８塩基対のＨpaＩ-ＳspＩ制限フラグメントを実施例
１Ａに記載の調製用ゲル電気泳動法によって単離した。
このＤＮＡフラグメントを先に単離したプラスミドpsyn
３の１９２４塩基対ＨpaＩ消化ＤＮＡフラグメントと、
実施例１Ｃに記載の操作法に実質的に従ってＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結し、プラスミドpsyn４を作成し
た。その連結ＤＮＡの一部を用い、実施例１Ｅの方法に
従ってＥ.coli ＲＶ３０８細胞を形質転換した。実施例
１Ｆの小規模調製用ＤＮＡ単離操作により、テトラサイ
クリン耐性の形質転換体を選択し、そのプラスミドＤＮ
Ａを単離した。制限酵素分析を行い、プラスミドpsyn４
の構造を確認した。
mＭ ＮaＣl、１０mＭ ＭgＣl2および１０mＭ β-メルカ
プトエタノールを含有する反応容量５０μl 中で、４１
６８塩基対のＨpaＩ消化フラグメントＤＮＡ約５μgを
ＳspＩ(５μl、５０単位)でさらに消化した。この混合
物を３７℃で１時間インキュベートした。得られた４１
４８塩基対のＨpaＩ-ＳspＩ制限フラグメントを実施例
１Ａに記載の調製用ゲル電気泳動法によって単離した。
このＤＮＡフラグメントを先に単離したプラスミドpsyn
３の１９２４塩基対ＨpaＩ消化ＤＮＡフラグメントと、
実施例１Ｃに記載の操作法に実質的に従ってＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼを用いて連結し、プラスミドpsyn４を作成し
た。その連結ＤＮＡの一部を用い、実施例１Ｅの方法に
従ってＥ.coli ＲＶ３０８細胞を形質転換した。実施例
１Ｆの小規模調製用ＤＮＡ単離操作により、テトラサイ
クリン耐性の形質転換体を選択し、そのプラスミドＤＮ
Ａを単離した。制限酵素分析を行い、プラスミドpsyn４
の構造を確認した。
【００６０】psyn４と同一の転写活性化配列を提供する
より好ましいベクターはプラスミドpsynＤである。この
プラスミドpsynＤは、実施例２に記載の操作に実質的に
従って構築される。しかし、その転写活性化配列は以下
に示す合成１本鎖ＤＮＡセグメントから構築する：
より好ましいベクターはプラスミドpsynＤである。この
プラスミドpsynＤは、実施例２に記載の操作に実質的に
従って構築される。しかし、その転写活性化配列は以下
に示す合成１本鎖ＤＮＡセグメントから構築する：
【化３０】 プラスミドpsyn４およびpsynＤは、ＯL３リプレッサー
結合領域が切除された修飾型バクテリオファージプロモ
ーター-オペレーター領域を含有している。この活性化
配列はさらに−１０共通配列を含有している。psynＤの
制限部位および機能地図を図７に示す。
結合領域が切除された修飾型バクテリオファージプロモ
ーター-オペレーター領域を含有している。この活性化
配列はさらに−１０共通配列を含有している。psynＤの
制限部位および機能地図を図７に示す。
【００６１】実施例９ ベクター安定性の分析 発酵の終了時点に発酵混合物から単離したベクターを制
限分析し、発現ベクターの分析を行った。制限分析を発
現ベクターの特性化に使用することは、当業者に周知で
ある。制限エンドヌクレアーゼマッピングを作成し、解
釈する方法は当業者に周知である。このことはマニアチ
スらの１９８２年版にその概要が示されている。
限分析し、発現ベクターの分析を行った。制限分析を発
現ベクターの特性化に使用することは、当業者に周知で
ある。制限エンドヌクレアーゼマッピングを作成し、解
釈する方法は当業者に周知である。このことはマニアチ
スらの１９８２年版にその概要が示されている。
【００６２】発酵終了時点で発酵混合物中の細胞から本
発明のベクターを単離することにより、ベクターの構造
上の安定性を分析した。実施例１Ｆの方法に実質的に従
って、ＤＮＡ小規模調製法によりこのＤＮＡを単離し
た。単離したベクターＤＮＡを制限酵素ＢamＨＩで消化
することにより制限酵素分析を行った。６mＭ トリス-
ＨＣl pＨ７．９、１５０mＭ ＮaＣl および６mＭＭgＣ
l2を含有する反応容量１０μl 中で、単離したベクター
ＤＮＡ約０．２５μgをＢamＨＩ(１μl、１０単位)で完
全消化した。この混合物を３７℃で１時間インキュベー
トした。消化したＤＮＡをアガロースゲルで分画化し、
実施例１Ａに記載のようにして視覚化した。
発明のベクターを単離することにより、ベクターの構造
上の安定性を分析した。実施例１Ｆの方法に実質的に従
って、ＤＮＡ小規模調製法によりこのＤＮＡを単離し
た。単離したベクターＤＮＡを制限酵素ＢamＨＩで消化
することにより制限酵素分析を行った。６mＭ トリス-
ＨＣl pＨ７．９、１５０mＭ ＮaＣl および６mＭＭgＣ
l2を含有する反応容量１０μl 中で、単離したベクター
ＤＮＡ約０．２５μgをＢamＨＩ(１μl、１０単位)で完
全消化した。この混合物を３７℃で１時間インキュベー
トした。消化したＤＮＡをアガロースゲルで分画化し、
実施例１Ａに記載のようにして視覚化した。
【００６３】本明細書に記載のプラスミドの制限地図に
基づけば、ＢamＨＩ制限消化により、発酵工程の間に安
定性が保持されている上記プラスミドの２つのＤＮＡフ
ラグメントが得られた。プラスミドpＨＰＲ１０４およ
びpＨＰＲ１０６ＡのＢamＨＩ消化により、４２７８お
よび１８０８塩基対の期待されたＤＮＡフラグメントが
生成された。プラスミドpsynＣのＢamＨＩ消化により、
４２７８および１８３３塩基対のＤＮＡフラグメントが
得られ、他方psynＤの消化により、４２７８および１８
１４塩基対のＤＮＡフラグメントが得られる。これらの
結果は、プラスミドpＨＰＲ１０４、pＨＰＲ１０６Ａ、
psynＣおよびpsynＤが発酵工程の間、安定性を保持して
いることを示している。
基づけば、ＢamＨＩ制限消化により、発酵工程の間に安
定性が保持されている上記プラスミドの２つのＤＮＡフ
ラグメントが得られた。プラスミドpＨＰＲ１０４およ
びpＨＰＲ１０６ＡのＢamＨＩ消化により、４２７８お
よび１８０８塩基対の期待されたＤＮＡフラグメントが
生成された。プラスミドpsynＣのＢamＨＩ消化により、
４２７８および１８３３塩基対のＤＮＡフラグメントが
得られ、他方psynＤの消化により、４２７８および１８
１４塩基対のＤＮＡフラグメントが得られる。これらの
結果は、プラスミドpＨＰＲ１０４、pＨＰＲ１０６Ａ、
psynＣおよびpsynＤが発酵工程の間、安定性を保持して
いることを示している。
【図１】 プラスミドpＣＺＲ１２５の制限部位および
機能地図である。
機能地図である。
【図２】 プラスミドpＨＰＲ９７の制限部位および機
能地図である。
能地図である。
【図３】 プラスミドpＨＰＲ１０４の制限部位および
機能地図である。
機能地図である。
【図４】 プラスミドpＨＤＭ１５９の制限部位および
機能地図である。
機能地図である。
【図５】 プラスミドpＨＰＲ１０６の制限部位および
機能地図である。
機能地図である。
【図６】 プラスミドpsynＣの制限部位および機能地図
である。
である。
【図７】 プラスミドpsynＤの制限部位および機能地図
である。
である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 チャールズ・リー・ハーシュバーガー アメリカ合衆国46163インディアナ州ニュ ー・ペイルスタイン、サウス・600・ウエ スト722番 (72)発明者 ハンセン・マックスウェル・シウン アメリカ合衆国46032インディアナ州イン ディアナポリス、コール・ポーター・レイ ン4760番 (72)発明者 ポール・ロバート・ロステック・ジュニア アメリカ合衆国46237インディアナ州イン ディアナポリス、サフロン・ドライブ4247 番 (72)発明者 ジェイン・ラロウ・スターナー アメリカ合衆国46236インディアナ州イン ディアナポリス、ドー・レイン12479番
Claims (10)
- 【請求項１】 リプレッサー結合領域の５'位に位置す
るＤＮＡ配列が欠失されており、そして機能的に連結さ
れた遺伝子の発現を調節し、クローンされた組換えＤＮ
Ａベクターに構造上の安定性を付与する修飾バクテリオ
ファージλ転写活性化配列。 - 【請求項２】 以下の配列： 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】 【化５】 および 【化６】 [式中、Ａはデオキシアデニル、Ｇはデオキシグアニ
ル、Ｃはデオキシシチジル、Ｔはチミジルである]の中
から選ばれる請求項１に記載の転写活性化配列。 - 【請求項３】 (a)請求項１または請求項２に記載の転
写活性化配列、 (b)翻訳活性化配列、および(c)機能的なポリペプチドを
コードしているＤＮＡ配列から実質的に構成され、(a)
および(b)が(c)を発現するように配置されている組換え
ＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項４】 プラスミドpＨＰＲ１０４、pＨＤＭ１５
９、pＨＰＲ１０６、pＨＰＲ１０６Ａ、psynＣ、psyn
Ｄ、psyn３、およびpsyn４の中から選ばれる請求項３に
記載の組換えＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項５】 請求項３または請求項４に記載の組換え
ＤＮＡ発現ベクターによって形質転換されている宿主細
胞。 - 【請求項６】 配列： 【化７】 を含有する転写活性化配列。
- 【請求項７】 (a)請求項６に記載の転写活性化配列、 (b)翻訳活性化配列、および(c)機能的なポリペプチドを
コードしているＤＮＡ配列から実質的に構成され、(a)
および(b)が(c)を発現するように配置されている組換え
ＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項８】 pＨＰＲ９７である請求項７に記載の組
換えＤＮＡ発現ベクター。 - 【請求項９】 請求項７または請求項８に記載の組換え
ＤＮＡ発現ベクターによって形質転換されている宿主細
胞。 - 【請求項１０】 コードされている機能的なポリペプチ
ドを発現できる条件下で請求項５または請求項９に記載
の宿主細胞を培養することを特徴とする機能的なポリペ
プチドを生産するための方法。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US56578390A | 1990-08-13 | 1990-08-13 | |
| US73928091A | 1991-08-01 | 1991-08-01 | |
| US739280 | 1991-08-01 | ||
| US565783 | 1991-08-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0686678A true JPH0686678A (ja) | 1994-03-29 |
Family
ID=27073966
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3201746A Withdrawn JPH0686678A (ja) | 1990-08-13 | 1991-08-12 | 改良型バクテリオファージλｐＬプロモーター |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5576190A (ja) |
| JP (1) | JPH0686678A (ja) |
| IE (1) | IE912853A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19633698A1 (de) * | 1996-08-21 | 1998-02-26 | Lubitz Werner Prof Dr | Neue Systeme zur Regulation der Genexpression |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0058002A3 (en) * | 1981-01-26 | 1983-06-29 | The Upjohn Company | Process for stabilising potential plasmid vectors and novel plasmids |
| US4874703A (en) * | 1985-08-26 | 1989-10-17 | Eli Lilly And Company | Expression vectors for use in E. coli |
| JPH0757193B2 (ja) * | 1987-08-05 | 1995-06-21 | 宇部興産株式会社 | 改良プロモ−タ−、これを有するベクタ−、このベクタ−を有するプラスミド及びこのプラスミドを有する宿主菌 |
-
1991
- 1991-08-12 JP JP3201746A patent/JPH0686678A/ja not_active Withdrawn
- 1991-08-12 IE IE285391A patent/IE912853A1/en unknown
-
1993
- 1993-11-23 US US08/156,325 patent/US5576190A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5576190A (en) | 1996-11-19 |
| IE912853A1 (en) | 1992-02-26 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A300 | Application deemed to be withdrawn because no request for examination was validly filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A300 Effective date: 19981112 |