DK175331B1 - Ekspressionskontrol-DNA-sekvenser, ekspressionsvektorer, som indeholder disse DNA-sekvenser, transformanter som bærer disse ekspressionsvektorer, og fremgangsmåder til fremstilling af pro- og eukaryote proteiner under anvendelse af de - Google Patents

Description

i DK 175331 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte ekspressionskontrol-DNA-sekvenser, ekspressionsvektorer, som indeholder disse DNA-sekvenser, værtsceller, som transformeres med disse ekspressionsvektorer, samt fremgangsmåder til fremstilling af pro- og eukaryote proteiner under anvendelse af de hidtil ukendte 5 ekspressionskontrol-DNA-sekvenser, vektorer og transformanter.

' Niveauet af dannelse af et protein i en værtscelle bestemmes af tre hovedfaktorer:

antallet af kopier af dets gen i cellen, den effektivitet, hvormed disse genkopierer ' transkriberes, og den effektivitet, hvormed det resulterende messenger-RNA

10 ("mRNA") translateres. Transkriptions- og translationseffektivitet afhænger på sin side af de nucleotidsekvenser, der normalt er anbragt foran den ønskede kodende sekvens eller gen. Disse nucleotidsekvenser (ekspressionskontrol-DNA-sekvenser) definerer blandt andet det sted, hvor RNA-polymerase indvirker (promotorsekvensen), hvorved transkriptionen indledes, og hvor ribosomerne binder og samvirker med mRNA’et 15 (transkriptionsproduktet), hvorved translationen indledes.

Ikke alle sådanne ekspressionskontrol-DNA-sekvenser fungerer lige effektivt. Det er således ofte en fordel at adskille den specifikke kodende sekvens eller gen for et ønsket protein fra dens eller dets tilstødende nucleotidsekvenser og fusionere den 20 eller det med andre ekspressionskontrol-DNA-sekvenser, således at man fremmer højere ekspressionsniveauer. Nar dette er blevet opnået, kan det nyligt manipulerede DNA-fragment indsættes i et plasmid- eller bacteriophagderivat med højere kopital for at forøge antallet af genkopier i cellen, hvorved udbyttet af det ønskede protein forbedres.

25

Da overproduktion af selv normalt ikke-toxiske genprodukter kan skade værtscellerne og føre til nedsat stabilitet af bestemte værts-vektorsystemer, bør en ekspressionskontrol-DNA-sekvens ud over at forbedre effektiviteten af transkription og translation af klonede gener være gjort kontrollerbar for at muliggøre modulering 30 af ekspressionen under bakteriens vækst. Fx er kontrollerbare ekspressionskontrol-DNA-sekvenser sådanne, der kan slukkes for at gøre værtscellerne i stand til at formere sig, uden at der er en for stor ophobning af genprodukter, og senere tændes for at fremme ekspressionen af store mængder af de ønskede proteinprodukter, der er under kontrol af disse ekspressionskontrol-DNA-sekvenser.

35

Der er blevet anvendt adskillige ekspressionskontrol-DNA-sekvenser, der tilfredsstiller nogle af de ovennævnte kriterier, til udtrykkelse af DNA-sekvenser og gener, som koder for proteiner og polypeptider, i bakterieværter. Disse omfatter fx operatoren, promotoren og ribosombindings- og interaktionssekvenserne fra E. coii’s lactose-40 operon (fx K. Itakura et al., "Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin", Science 198, 1977, s. 1056-1063; D.V. Goeddel et al., "Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human I DK 175331 B1

I I

I insulin", PNAS USA 76, 1979, s. 106-110), de tilsvarende sekvenser fra I

tryptophansyntetasesystemet i E. coli (J.S. Emtage et al., "Influenza antigenic I

I determinants are expressed from Haemagglutinin genes cloned in Escherichia coli", I

I Nature 283, 1980, s. 171-174; J.A. Martial et al., "Human growth hormone: I

I 5 Complementary DNA cloning and expression in bacteria", Science 205, 1979, s. 602- I

607) og hovedoperator- og promotorområderne fra phag λ (Η. Bernard et al., I

I "Construction of plasmid cloning vehicles that promote gene expression from the · I

I bacteriophage lambda PL promoter", Gene 5, 1979, s. 59-76; europæisk I

offentliggørelsesskrift nr. 41767). I

I 10

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en hidtil ukendt og forbedret I

ekspressionskontrol-DNA-sekvens, som omfatter en coliphag T5-promotor kombineret I

med en lac-operator eller en funktionel del deraf, som muliggør kontrol af promotor- I

I aktivitet (regulerende sekvens). I

I 15

I Det er kendt fra Bujard et al., "Integration of efficient promotors of the E. coli system I

I into plasmid vectors", Gene Amplif Anal (1983), vol 3:65-87, som beskriver et plasmid I

I der ikke omfatter et /ac-operon, at effektive T5-promotorer indeholder store I

I homologier nedstrøms fra transskriptions-indledningsstedet. Denne nedstrømsregion I

I 20 bidrager stærkt til promotorstyrken af T5-promotorer eftersom erstatning af denne I

I region med andre nucleotider resulterer i en mere end ottefoldig reduktion af I

promotorstyrken som vist i Bujard et al. -skriftet i "Sequence Specificity in I

I Transcription and Translation”, side 21 til 29 (Alan R. Liss, Inc., 1985). Denne I

nedstrømsregion mangler i T5-promotorsekvenserne fra T5-promotor//ac- I

I 25 operatorfusionerne i den nærværende opfindelse. I

Navnlig gør den foreliggende opfindelse det muligt at kombinere en lac-operator eller I

en funktionel del deraf, der muliggør kontrol af promotoraktivitet fra en coliphag T5- I

promotor, medens coliphag T5-promotorens særdeles effektive promotorfunktion I

I 30 samtidig opretholdes. I

I I nærværende sammenhæng er T5-promotorer defineret som promotor- I

I funktionsmedierende DNA-sekvenser, der optræder i genomer fra coliphag T5- - I

familien, og funktionelle kombinationer, som stammer fra sådanne sekvenser. I

I 35 I

Naturligt forekommende T5-promotorer vides at være effektive tran- I

skriptionsindledningssignaler (A. von Gabain og H. Bujard, "Interaction of E. coli RNA I

I polymerase with promoters of coliphage T5", Molec. gen. Genet. 157, 1977, s. 301- I

311) med følgende hovedegenskaber: I

I 40

I i) de udviser en høj aktiv ("forward") hyppighedskonstant i complexdannelsen I

I mellem promotorsekvensen og E. coli RNA-polymerase (A. von Gabain og Η. I

3 DK 175331 B1

Bujard, "Interaction of Escherichia coli RNA polymerase with promoters of several coliphage and plasmid DNAs", PNAS 76, 1979, s. 189-193); ii) de indleder RNA-syntese in vivo og in vitro med usædvanlig høj hyppighed; 5 iii) de indeholder konserverede sekvenser i 5 områder af RNA-po-lymerasebindingsstedet (H. Bujard et al., "Integration of efficient promoters of the E. coli system into plasmid vectors", i Gene Amplification and Analysis, bind 3: Expression of clonedgenes in prokaryotic and eukaryotic cells, red.

10 T.S. Papas, M. Rosenberg og J.G. Chirikjian, Elsevier, New York-Amsterdam-

Oxford, 1983, s. 65-87); og iv) klonede i ekspressionsvektorer er disse promotorer ikke regulerbare.

15 T5-Promotorer, som kan anvendes i den foreliggende opfindelse, er sådanne fra den "førtidlige", "tidlige" og "sene" ekspressionsklasse af phagen, især de sekvenser, som er beskrevet i R. Gentz's afhandling (Universitéat Heidelberg 1984): P207> P2S I

(benævnt PN2s i nærværende beskrivelse), P26, G30, P28a (benævnt P28 i Bujard et al., supra), P28b, G22, Gs, G2s, G2e, G2o.

20 DNA-Sekvensen for nogle af de foretrukne ovennævnte T5-promotorer er vist i tabel I nedenfor:

Tabel I 25 *50 -A0 -30 -20 *10 *1 »10 »20 30 TCAT/p^mAi|nroricffly^rrma(pfAAb anpi; ^ϊμ^οώαπτιαααϊα P26 ATIfff2pt«jn(£ra«1COACMncn6(|ATAAl( ΠΟΙΛΙ/ ϊ|1&|Λ«αΑΠαβΓΠΑ P2a TA^r^^^^^-|^iC/TlA^IACn(j(|IAIAAl< ΓΠΛΑΤί V^nfrlASOAWAAinCAl 35 -—------

Tabel I viser nucleotidsekvensen af disse fire T5-promotorer, der hurtigt reagerer med E. coli RNA-polymerase. Områder med stor homologi er indrammet. Det mest slående 40 er homologierne i -10-, -33-, -43- og +7-områderne samt den præcise afstand (18 bp) mellem -10- og -33- homologierne. De understregede sekvenser, der er centreret omkring -43, viser områder, hvor der er en stærk selektion mod GC-base par.

I DK 175331 B1

I DNA-Sekvenser, der muliggør kontrol af promotoraktiviteten, er kendte. De optræder i I

I operoner (regulerbar ekspressionsenhed) af forskellig type (J.H. Miller og W.S. I

I Reznikoff, The Operon, Cold Spring Harbor Laboratory, 1980). Én sådan type er en I

I 5 negativt kontrolleret ekspressionsenhed, hvis essentielle element er en I

I operatorsekvens, som samvirker med et repressorprotein. Den kodende sekvens for I

repressorproteinet kan være anbragt på et plasmid, som bærer operatoren, eller på * I

I en separat vektor eller i værtschromosomet. I

I 10 I den foreliggende opfindelse anvendes /ac-operonsystemet, som består af den I

H naturlige /ac-operator eller funktionelle sekvenser, som stammer derfra, og en I

repressor, som indkoder DNA-sekvenser, der frembringer naturlige eller modificerede I

I repressormolekyler (J.H. Miller og W.S. Reznikoff, supra). I

15 Ekspressionskontrol-DNA-sekvenserne ifølge den foreliggende opfindelse kan fås som I

følger: I

H En coliphag T5-promotorsekvens kan kombineres på velkendt måde med én eller flere I

sekvenser, som muliggør kontrol af promotoraktiviteten (regulerende sekvens), til en I

20 funktionel enhed, hvorhos positionen af de regulerende sekvenser, fx en operator, kan I

I variere. I sådanne kombinationer kan den regulerende sekvens være anbragt inden I

for eller uden for T5-promotorsekvensen. En regulerende sekvens kan således være I

integreret i promotoren, være delvis overlappende med promotoren eller gå forud for I

eller efterfølge promotoren i forskellig afstand uden nogen overlapning. Den I

I 25 regulerende sekvens overlapper fortrinsvis promotorsekvensen mellem stilling +1 og I

I +20, -13 og -30 og/eller -34 og -50 (nomenklatur som i tabel I). Yderligere foretrukne I

I positioner er områder "nedstrøms" for stilling +20 op til +200. Særligt foretrukne I

I steder er sådanne, hvor den regulerende sekvens, fx /ac-operatorsekvensen, I

I overlapper T5-promotorsekvensen Indtil stilling +2 analogt med /ac-operonet i-f. coli I

I 30 som vist i fig. 7. I

I Ekspressionskontrol-DNA-sekvensen ifølge den foreliggende opfindelse kan fås i I

I henhold til metoder, der er velkendte inden for DNA-kemi, herunder fuldstændig I

kemisk syntese af de respektive DNA-sekvenser. I

I 35 i

I I den foretrukne udførelsesform for opfindelsen kan /ac-operatoren være negativt I

I reguleret af/ac-repressorproteinet, som indkodes af lacl-genet. Til opnåelse af I

I relevante mængder af repressormolekyler inde i cellen kan det tilsvarende gen være I

I overudtrykt ved sædvanlige metoder, fx ved at integrere lacF-genet (J.H. Miller og I

I 40 W.S. Reznikoff, supra·, M.P. Calos, "DNA sequence of a low-level promoter of the lac I

repressor gene and an "up" promoter mutation", Nature274, 1978, s. 762-765) i en I

I vektor, som omfatter den ovennævnte ekspressionskontrolsekvens. I

5 DK 175331 B1

Ekspressionssekvensen ifølge opfindelsen kan indføres i en hvilken som helst sædvanlig ekspressionsvektor af plasmid- eller phag-oprindelse på i og for sig kendt måde. Hensigtsmæssige ekspressionsvektorer af plasmid- eller phag-oprindelse er fx 5 nævnt i laboratoriemanualen Molecular Cloning af Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.

Medlemmer af pDSl-familien af plasmider har vist sig at være hensigtsmæssige til stabil integrering af transkriptionssignaler med usædvanlig styrke (D. Stéuber og H.

10 Bujard, "Transcription from efficient promoters can interfere with plasmid replication and diminish expression of plasmid specified genes", The EMBO Journal 1, 1982, s. 1399-1404).

De foretrukne vektorer, der anvendes ifølge den foreliggende opfindelse, er derfor fra 15 pDSl-familien. Disse plasmider stammer fra plasmidet pBR322 og omfatter fx pDSl,t0l+ og pDSl,to2+, hvilket medfører plasmidkonstruktioner som pDS2/PN25X/o,to2+ og pDS3/PN25X/o,to2+.

E. coli-stammer, som indeholder plasmider, der er nyttige til sådanne konstruktioner 20 (E. coli M15 transformeret med pDSl,tol+; pDSl,t,>2+; pDSIX,l), blev deponeret i Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM) i Géottingen den 11. december 1984 under deponeringsnumrene DSM 3135, DSM 3136 og DSM 3137.

De DNA-sekvenser, der kan udtrykkes ved hjælp af ekspressionsvektorerne ifølge 25 opfindelsen, kan vælges blandt en lang række DNA-sekvenser, der indkoder prokaryote eller eukaryote polypeptider in vivo eller in vitro. Fx kan sådanne sekvenser indkode enzymer, hormoner, polypeptider med immunmodulerende, antivirale eller anticanceregenskaber, antistoffer, antigener, vacciner og andre nyttige polypeptider af prokaryot eller eukaryot oprindelse.

30

Eksempler på proteiner, som kan udtrykkes under anvendelse af det forbedrede ekspressionskontrolsystem ifølge opfindelsen, er dihydrofolatreduktase, chloramphenicolacetyltransferase, malariaoverfladeantigener, lymphokiner såsom IL-2, pap-, pbp- og pqp-interferon, insulin og insulinprecursorer, væksthormoner, 35 vævsplasminogenaktivator eller humant renin.

Fremgangsmåder til udtrykkelse af DNA-sekvenser, som koder for prokaryote eller eukaryote proteiner, under anvendelse af ekspressionsvektorerne ifølge opfindelsen er velkendte (Maniatis et al., supra). De omfatter transformation af en hensigtsmæssig 40 vært med ekspressionsvektoren med den ønskede DNA-sekvens operativt forbundet med vektorens ekspressionskontrolsekvens, dyrkning af værten under hensigtsmæssige vækstbetingelser og isolering af det ønskede polypeptid fra kulturen.

I DK 175331 B1

I I

Fagfolk kan blandt disse kendte metoder udvælge dem, som er mest effektive til en I

bestemt genekspression, uden at afvige fra opfindelsens omfang. I

Selektionen af en bestemt vært til anvendelse ifølge opfindelsen afhænger af flere I

5 faktorer, som er kendte inden for området. Disse omfatter fx kompatibilitet med den I

valgte ekspressionsvektor, toxiciteten af de proteiner, som indkodes af det hybride I

plasmid, den lethed, hvormed det ønskede protein kan isoleres, I

ekspressionskarakteristika, biosikkerhed og omkostninger. Inden for disse generelle I

retningslinjer er eksempler på anvendelige bakterieværter gramnegative og grampo- I

10 sitive bakterier, især stammer af E. coli og B. subtilis. Den mest foretrukne værtscelle I

ifølge opfindelsen er E coli M15 (beskrevet som DZ291 i M.R. Villarejo et al., "pbp- I

Galactosidase from termination and deletion mutant strains", J. Bacteriol. 120, 1974, I

I s. 466-474). Imidlertid kan andre E. coli-stammer såsom E. coli 294 (ATCC nr. 31446) I

og E. coli RR1 (ATCC nr. 31343) også anvendes. I

I 15 I

Den foreliggende opfindelse forklares nærmere under henvisning til eksemplerne og I

tegningen, hvor der anvendes følgende forkortelser og symboler: I

B, E, Η, P, X og Xb, der betegner steder for restriktionsendonucleaserne BamHl, I

I 20 fcoRI, Hindlll, Pstl, Xhol og Xbal; I

I*//.vi betegner promotorer; I

betegner ribosombindingssteder; I

fjlllljint betegner terminatoren t^; I

betegner lac operatoren (O) eller dele deraf; I

25 I I betegner promotoren Pn25 (Pn2s)/ I

I i betegner områder, som er nødvendige for DNA-replikation (repl.); I

betegner et kodende område for enten dihydrofolatreduktase (dhfr), I

chloramphenicolacetyltransferase (cat), pbp-lactamase (bla) og /ac-repressor I

I (lad) eller dele af det kodende område for chloramphenicolacetyltransferase I

30 (cat’);

I ·Η·Ε betegner dele af det kodende område for pbp-galactosidase (lacZ'). I

I Fig. la) viser skematisk plasmidet pDSl,t0l+. Nudeotidsekvensen af EcoRl/Xbal I

I -fragmentet, som indeholder dhfr-genet, terminatoren to og cat-genet I

I 35 er vist i fig. Ib). Her er der sat en linje over de i fig. la) viste I

restriktionsendonudeasesteder. Desuden er pBR322-delen af pDSl,t<,l+ I

vist skematisk, hvor de anførte tal betegner nudeotidsekvensen af I

I pBR322 (J.G. Sutcliffe, "Complete nucleotide sequence of the I

I Escherichia coli plasmid pBR322”, Cold Spring Harbor Symp. Quant I

I 40 Biol. 43, 1979, s. 77-90.

DK 175331 B1 7

Fig. 2 viser skematisk plasmidet pDSl/P^sjtol*. Nudeotidsekvensen af Xhol- fragmentet, der bærer promotoren PN2s, er vist. Initieringsstedet og transkriptionsretningen er vist med pilen.

5 Fig. 3 viser skematisk plasmidet pEX07 lac op 2. Nudeotidsekvensen af fcoRI/W/'ndlll-fragmentet, som bærer /ac-operatoren, er vist.

Fig. 4a) viser skematisk plasmidet pDSl,to2+. Nudeotidsekvensen af Xhol/Xbal-fragmentet, som indeholder dhfr-genet, cat-genet og terminatoren to, er 10 vist i fig. 4b). Her er der sat en streg over de restriktionsendonudeasesteder, som er vist i fig. 4a). Desuden er pBR322-delen af pDSl,to2+ vist skematisk, hvor de anførte tal betegner nudeotidsekvensen af pBR322 (J.G. Sutcliffe, supra).

15 Fig. 5a) viser skematisk plasmidet pDSIX,l. Nudeotidsekvensen af £coRI/XbaI-fragmentet, som indeholder /acJ-genet, dele af/acZ-genet (lacZ') og cat-genet er vist i fig. 5b) og 5c). Her er der sat en streg over de i fig.

5a) viste restriktionsendonudeasesteder. Desuden er pBR322-delen af pDSIX,l vist skematisk, idet de anførte tal henviser til nudeotid-20 sekvensen af pBR322 (J.G. Sutcliffe, supra).

Fig. 6a, b og c viser skematisk konstruktionen af promotor/operatorfusionen PN25X/o, som er indlejret i plasmidet pDS2/PN25X/o,t02+.

25 Fig. 7 viser nudeotidsekvensen af det X/7oI/£coRI-fragment, som indeholder promotor/operatorfusionen PN2sX/o· Initieringsstedet og transkriptionsretningen er vist med pilen.

Fig. 8a, b og c viser skematisk konstruktionen af plasmiderne 30 pDSXII,3, pDS3/PN25X/o,t02+ og pDSXIII,l.

Fig. 9 viser et elektroferogram, der overvåger proteinsyntese i nærværelse eller fraværelse af IPTG i £. coli M15, som indeholder plasmiderne pDSXII,3 (bånd l),pDS2/PN25X/o,to2+ (bånd 2 og 3) eller 35 pDS3/Pm2sX/o,to2+ (band 4-7).

Konstruktionen af promotor/operatorfusionen PrøsX/o ifølge opfindelsen er nærmere beskrevet i nedenstående eksempler: 40 I DK 175331 B1 I EKSEMPEL 1

Beskrivelse af plasmider, der anvendes til konstruktion af promotoren PN2sX/o 5 A. Principper I pDSl,t0l+ (fig. 1) og pDSl,t02+ (fig. 4) blev udvalgt som vektorer ikke blot til integrering af promotoren PN25 og konstruktion af fusionen mellem promotoren PN25 og /ac-operatoren, men også til påvisning af funktionen af den resulterende 10 promotor/operatorfusion PN2SX/o·

Selv om der findes adskillige veldefinerede kilder til promotoren PN2S, blev plasmidet pDSl/Pp,25,tol+(fig. 2), der bar dette element på et fcoRI-fragment, udvalgt som kilde til promotoren PN25, hvorimod pEX07 lac op 2 (fig. 3; H. Weiher, "Untersuchungen zur 15 Struktur und Funktion von E. coli Promotoren: Variation des Lac Promoters durch gezielte Neukonstruktion von Teilsequenzen und Mutagenese", licentiatafhandling,

Heidelberg Universitet, Forbundsrepublikken Tyskland, 1980), der omfattede 21 basepar fra lac-operatoren, blev udvalgt som kilde til operatordelen i promotor/operatorfusionen. Lac-repressoren inkodes af /ac/-genet. Oa en promotor 20 kun undertrykkes effektivt ved binding af en repressor til operatoren, hvis der er H tilstrækkelige mængder repressormolekyler til stede, blev /acF-allellen anvendt med en mutantpromotor, hvilket medførte forøget transkription af genet, således at der tilvejebragtes tilstrækkeligt mange repressormolekyler. Som kilde til dette muterede lacl-gen blev plasmidet ρΙΧ,Ι (fig. 5) anvendt.

I B. Plasmidet pDSl,tol+

Den del af pDSl,tol+ (fig. 1; D. Stéuber og H. Bujard, supra) mellem stederne for I restriktionsendonucleaserne Xbal og EcoRl, der indeholder det område, som er I 30 nødvendigt for DNA-replikation og bevaring af plasmidet i cellen, og hele genet for β- I lactamase, der meddeler ampicillinresistens, stammer fra pBR322 (F. Bolivar et al., I "Construction and characterization of new cloning vehicles II. A multi-purpose cloning I system", Gene 2, 1977, s. 95-113; J.G. Sutcliffe, supra). Den resterende del af

I plasmidet bærer steder for restriktionsendonucleaserne Xhol, EcoRl og SamHI

35 efterfulgt af det kodende område for dihydrofolatreduktase fra musecellelinjen ΑΤΙ 3000 (A.C.Y. Chang et al., "Phenotypic expression in E. coli of a DNA sequence coding I for mouse dihydrofolate reductase", Nature 275, 1978, s. 617-624; 3.N. Masters og G.

I Attardi, "The nucleotide sequence of the cDNA coding for the human dihydrofolic acid I reductase", Gene 21, 1983, s. 59-63), terminatoren t„ fra phag λ (E. Schwarz et al., I 40 "Nucleotide sequence of cro, ell and part of the O gene in phage λ DNA", Nature 272, I 1978, s. 410-414; D. Stéuber og H. Bujard, supra) og det promotorfri gen for I chloramphenicolacetyltransferase (R. Marcoli et al., "The DNA sequence of an IS1- 9 DK 175331 B1 flanked transposon coding for resistance to chloramphenicol and fusidic acid", FEBS Letters 110, 1980, s. 11-14).

C. Plasmidet pDSl/PN2S,t0l + 5

Plasmidet pDSl/PN25,tol+ (fig. 2) svarer til pDSl,tol+ (fig. 1), men indeholder på et ΧΛοΙ-fragment promotoren PN25 fra E. co//-phagen T5 (A. von Gabain og H. Bujard, supra·, D. Stéuber et al., "Electron microscopic analysis of in vitro transcriptional complexes: Mapping of promoters of the coliphage T5 genome", Molec. gen. Gen. 166, 10 1978, s. 141-149; H. Bujard et al., supra).

D. Plasmidet pEX07 lac op 2

Plasmidet pEX07 lac op 2 (fig. 3; H. Weiher, supra) er et derivat af pBR322 (F. Bolivar 15 et al., supra; J.G. Sutcliffe, supra), hvor EcoRI/Hind IH-fraomentet fra pBR322 er erstattet med et £coRI/Hind Ill-fragment indeholdende 21 basepar af lac-operatorsekvensen (J.H. Miller og W.S. Reznikoff, supra).

E. Plasmidet pDSl,to2+ 20

Den del af pDSl,t<>2+ (fig. 4; D. Stéuber og H. Bujard, supra) mellem stederne for restriktionsendonucleaserne Xbal og Xhol, der indeholder det område, som er nødvendigt for DNA-replikation og bevaring af plasmidet i cellen, og hele genet for β-lactamase, der meddeler ampicillinresistens, stammer fra pBR322 (F. Bolivar et al., 25 supra; J.G. Sutcliffe, supra). Den resterende del af plasmidet bærer steder for restriktionsendonucleaserne EcoRI og BamHl efterfulgt af det kodende område for dihydrofolatreduktase fra musecellelinjen AT-3000 (A.C.Y. Chang et al., supra; J.N.

Masters og G. Attardi, supra), det promotorfri gen for chloramphenicolacetyltransferase (R. Marcoli et al., supra) og terminatoren t0 fra phag 30 λ (E. Schwarz et al., supra).

F. Plasmidet pDSIX,l

Plasmidet pDSIX,l (fig. 5) bærer den samme del af pBR322 som plasmidet pDSl,tol+ 35 (fig. 1). Herudover indeholder det hele genet for /ac-repressoren (PJ. Farabaugh, "Sequence of the /acl-gene", Nature274, 1978, s. 765-769) med promotormutationen Iq (M.P. Calos, supra) efterfulgt af steder for restriktionsendonucleaserne EcoRI og Xhol, det regulerende område og en del af det kodende område af genet for β-galactosidase (A. Kalnins et al., "Sequence of the lac 2 gene of Escherichia coli", 40 The EMBOJ. 2, 1983, s. 593-597; R. Gentz et al., "Cloning and analysis of strong promoters is made possible by the downstream placement of a RNA termination I DK 175331 B1 I 10 I signal", PNAS 78, 1981, s. 4936-4940) og det promotorfri gen for chloramphenicolacetyltransferase (R. Marcoli et al., supra).

I 5 EKSEMPEL 2

Konstruktion af plasmidet pDS2/PN25x/o/t02+, der bærer promotor/operatorfusionen

Pn25x/0 10 Promotor/operatorfusionen PN25x/0 blev fremstillet og inkorporeret i pDSl,to2+, hvilket efter en række trin gav pDS2/PN25X/o,t02+. Disse fremstillingstrin er vist i fig. 6 og er nærmere beskrevet nedenfor.

A. Fremstilling af promotordelen af promotor/operatorfusionen I 15 a) Isolering af fcoRI-fragmentet indeholdende PN2s

Til isolering af det EcoRl-fragment, der bærer promotoren PN25, blev 32,5 pg af plasmidet pDSl/PN2s,t0l+ spaltet med EcoRI (fig. 6a), og efter ekstraktion med 20 phenol efterfulgt af behandling med ether og efterfølgende udfældning med H ethanol blev DNA-fragmenterne adskilt ved elektroforese i en 6%'s polyacrylamidgel. Efter visualisering af DNA'et ved farvning med ethidiumbromid blev det fragment, der bar PN25, skåret ud af gelen og elueret ved at ryste den H knuste gelskive i 10 timer i en puffer, der indeholdt 2,5 mM Tris-HCI (pH 7,6) og 25 0,25 mM EDTA. Efter fjernelse af gelstykkerne ved centrifugering blev den resulterende supernatant ekstraheret med phenol og behandlet med ether, og DNA-fragmentet blev indsamlet ved udfældning med ethanol. Herved blev 1,3 pg af promotorfragmentet isoleret.

I 30 b) Begrænset spaltning af EcoRI-fragmentet med Hinfl 1 pg af EcoRI-fragmentet blev inkuberet i et volumen på 120 μΙ i en puffer, som indeholdt 100 mM natriumchlorid, med 21 enheder Hinfl i 9 minutter ved 37°C.

I Enzymet blev inaktiveret ved inkubation af blandingen i 7 minutter ved 65°C og 35 fjernet ved tre ekstraktioner med phenol. Efter fjernelse af det resterende phenol I ved ekstraktion med ether blev DNA’et udfældet med ethanol og opbevaret i en

I puffer, der indeholdt 5 mM Tris-HCI (pH 7,6), 0,5 mM EDTA og 100 mM

I natriumchlorid. Analyse af DNA’et ved elektroforese i en 6%'s polyacrylamidgel I viste, at ca. 60% af EcoRI-fragmentmolekylerne var blevet spaltet med Hinfl.

I 40

I c) Udfyldning af 3’-hæfteenderne med DNA-polymerase I

— ·* — ·.· -- v ·**. · ·—·_ DK 175331 B1 11 0,17 μς af det med Hinfl spaltede DNA blev inkuberet i et volumen på 25 μΙ i en puffer bestående af 100 mM kaliumphosphat (pH 7,0), 100 mM kaliumchlorid, 7 mM magnesiumchlorid og 25 μΜ af hver af de fire deoxynudeosid-triphosphater med 5 enheder DNA-polymerase I i 40 minutter ved 20°C. Efter fjernelse af 5 enzymet ved ekstraktion med phenol blev opløsningen chromatograferet gennem Sephadexpøp G75 ækvilibreret i en puffer med en pH på 7,7 bestående af 2,5 mM Tris, 0,25 mM EDTA og 50 mM kaliumacetat. DNA-holdige fraktioner blev kombineret, før DNA'et blev udfældet med ethanol, og opbevaret i ligationspuffer beriget med 50 mM natriumchlorid. Den resulterende opløsning med 0,08 pg DNA 10 indeholdt fragment 1 (fig. 6a).

B. Fremstilling af operatordelen af promotor/operatorfusionen a) Begrænset spaltning af pEX07 lac op 2 15 14,5 μg af plasmidet pEX07 lac op 2 (fig. 6b) blev inkuberet i et volumen på 250 μΙ med 1,5 enheder EcoRI i 50 minutter ved 37°C. Enzymet blev inaktiveret ved inkubation i 7 minutter ved 65°C og fjernet ved phenolekstraktion. Efter fjernelse af resterende phenol med ether blev DNA'et udfældet med ethanol og opbevaret i 20 en puffer bestående af 2,5 mM Tris-HCI (pH 7,6) og 0,25 mM EDTA. Analyse af DNA'et ved elektroforese i en 6%'s polyacrylamidgel viste, at ca. 50% af plasmidmolekylerne var blevet lineariseret.

b) Fjernelse af de 5-udragende ender med SI nuclease 25

Til fjernelse af de udragende 5’-ender blev det med FcoRI spaltede DNA behandlet med den enkeltstrengsspecifikke nuclease SI (fig. 6b). I tre separate forsøg blev 1,7 pg DNA inkuberet i et volumen på 50 μΙ i en puffer indeholdende 280 mM natriumchlorid, 30 mM natriumacetat (pH 4,4), 4,5 mM zinkacetat og 20 30 pg/ml enkeltstrenget DNA fra phag fd med 160 enheder, 800 enheder og 4000 enheder Sl-nuclease (Boehringer, Mannheim, Forbundsrepublikken Tyskland) i 30 minutter ved 20°C. Reaktionerne blev standset ved tilsætning af ammoniumacetat og EDTA til en slutkoncentration på henholdsvis 0,5 M og 10 mM og inkubation i 7 minutter ved 65°C. Efter fjernelse af proteinet ved 35 phenolekstraktion efterfulgt af behandling med ether blev de tre blandinger kombineret, og den resulterende opløsning blev chromatograferet gennem Sephadex® G75 ækvilibreret i en puffer med en pH på 7,0 bestående af 2,5 mM Tris-HCI, 0,25 mM EDTA og 50 mM kaliumacetat. DNA-holdige fraktioner blev kombineret, før DNA'et blev udfældet med ethanol og opbevaret i ligationspuffer.

40 Den resulterende opløsning med 4,3 pg DNA indeholdt fragment 2 (fig. 6b).

C. Fremstilling af plasmidet pDSl,t„2+, der modtager promotor/operatorfusionen I DK 175331 B1 pDSl,to2+ (fig. 4) blev valgt som vektor til modtagelse af promo- tor/operatorfusionen. Derfor blev 5,1 μg DNA fra dette plasmid spaltet fuldstændigt med restriktionsendonucleaserne HindlU og XhoI (fig. 6c). Efter 5 inaktivering af enzymerne ved inkubation i 7 minutter ved 65°C og fjernelse af proteinerne ved ekstraktion med phenol efterfulgt af behandling med ether blev DNA’et udfældet med ethanol og opbevaret i en puffer bestående af 2,5 mM Tris- HCI (pH 7,6) og 0,25 mM EDTA.

10 D. Konstruktion af pDS2/PN2sX/o,to2+

Til konstruktion af pDS2/PN25X/o,to2+ blev promotordelen (fragment 1) og operatordelen (fragment 2) af PN2sX/o ligeret sammen, og den resulterende fusion H blev derefter inkorporeret i pDSl,t02+(fig. 6c). Til fusion af promotoren og 15 operatoren blev 0,05 ug af den DNA-blanding, der indeholdt fragment 1, og 3,5 pg af den DNA-blanding, der indeholdt fragment 2, inkuberet i ligationspuffer H beriget med 25 mM natriumchlorid med 5 enheder T4-DNA-ligase i 7 timer ved 15°C. Efter inaktivering af enzymet ved inkubation i 7 minutter ved 65°C blev ligationsblandingen inkuberet i et volumen på 100 μΙ med 20 enheder HindlU. og 20 15 enheder Xhol i 1 time ved 37°C for at opnå promotor/operatorfusionen som et

Xhol/HindlU-fragment. Efter inaktivering af restriktionsendonucleaserne ved 65°C og fjernelse deraf ved ekstraktion med phenol efterfulgt af behandling med ether blev DNA'et udfældet med ethanol og på ny opløst i ligationspuffer beriget med 25 mM kaliumchlorid. Der tilsattes 0,25 Mg plasmid pDSl,to2+ spaltet med 25 såvel HindlU som Xhol samt 1,3 enheder T4-DNA-ligase, og blandingen blev inkuberet i 4 timer ved 15°C, før enzymet blev inaktiveret ved inkubation i 7 minutter ved 65°C.

Η E. coii C600 (CaCl2-kompetent) blev transformeret med halvdelen af den ovenfor 30 fremstillede ligationsblanding under hensigtsmæssige betingelser. Transformanter blev udvalgt ved 37°C på minimalagarplader baseret på M9-medium (J.H. Miller,

Experiments InMolecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972, s. 431- I 432) beriget med 0,2% glucose, 0,5% caseinhydrolysat, 10 mg/l vitamin Bl, 40 mg/l X-gal (5-brom-4-chlor-3-indolyl-pbp-D-galactosid) og 10-200 pg/ml 35 chloramphenicol.

I Kun transformanter, der indeholdt plasmidet pDSl,tø2+ med en promotor I integreret foran det promotorfri gen for chloramphenicolacetyltransferase, I forventedes at vokse på plader med chloramphenicolkoncentrationer på over 10 40 Mg/ml. Endvidere forventedes transformanter, der indeholdt pDSl,to2+med I Pn2sX/o integreret foran dette indikatorgen, at blive blå på disse plader som følge I af induktion af værtens lac-system ved binding af /ac-repressormolekylerne til 13 DK 175331 B1 operatorsekvensen i plasmiderne og efterfølgende spaltning af det farveløse X-gal til et blåt derivat. Derfor blev 18 blå transformanter fra plader med 50 ng/ml eller højere koncentrationer af chloramphenicol udvalgt, og kulturerne blev dyrket ved 37°C i LB-medium indeholdende 100 pg/ml ampicillin. DNA fra disse kulturer blev 5 isoleret under anvendelse af standardmetoder og analyseret for dets størrelse og tilstedeværelsen af steder for restriktionsendonucleaserne EcoRI, Hindlll, Hinfl og Xhol. Et plasmid, der udviste de forventede mønstre efter elektroforese af restriktionsfragmenter i 6%’s polyacrylamidgeler, blev betegnet pDS2/PN2sX/o,to2+ (fig. 6c). Sekvensanalyse af AV/ncflll-X/ioI-fragmentet fra dette plasmid 10 bekræftede den forventede sekvens for promotoren PN2sX/o som vist i fig.. 7.

EKSEMPEL 3 15 Konstruktion af plasmiderne pDSXII,3, pDS3,PN2sX/o#to2+ og pDSXIII,l indeholdende promotoren PN25X/o

Ud over pDS2/PN25x/0,t02+ (som mangler repressorgen) blev der fremstillet yderligere tre plasmider, der indeholdt promotor/operatorfusionen Pn2sX/o, nemlig pDSXII,3 20 (mellemprodukt til fremstilling af pDSXIII,l), pDS3/PN2sX/o»to2+ (som et eksempel på plasmider ifølge opfindelsen) og pDSXIII,! (med et delvis slettet cat-gen, der mangler RBS; som negativ kontrol til sammenligningsformål) for at vise funktionen af dette I element. Konstruktionen af disse plasmider er vist i fig. 8 og er nærmere beskrevet I nedenfor.

I 25 I A. Konstruktion af plasmidet pDSXII,3 I Plasmidet pDSXII,3 blev afledt af pDS2/PN25X/o,to2+ ved eliminering af det EcoRI- I fragment på dette plasmid, som indeholdt det enkelte sted for I 30 restriktionsendonucleasen Hindlll og en del af genet for I chloramphenicolacetyltransferase (fig. 8a). Til dette formål blev 0,45 μg I pDS2/PN25X/o,t02+ spaltet fuldstændigt med restriktionsendonucleasen EcoRI.

I Efter fjernelse af enzymet ved ekstraktion med phenol blev opløsningen

I chromatograferet gennem Sephadex® G75 og ækvilibreret i en puffer med en pH

I 35 på 7,6 bestående af 2,5 mM Tris-HCI og 0,25 mM EDTA. DNA-holdige fraktioner I blev kombineret, og den resulterende opløsning blev koncentreret ved I lyofilisering. 0,13 pg af plasmidet spaltet med EcoRI blev inkuberet i et volumen I på 100 μΙ i ligationspuffer med 1,3 enheder T4-DNA-ligase i 5 timer ved 15°C, før I enzymet blev inaktiveret ved inkubation i 7 minutter ved 65°C.

I 40 I E. coli M15 (CaCI2-kompetent) blev transformeret med 0,07 μg af det ligerede

I DNA under hensigtsmæssige betingelser. Transformanter blev udvalgt ved 37°C

I DK 175331 B1 I 14 på minimalagarplader baseret på M9-medium (J.H. Miller, supra) beriget med 0,2% glucose, 0,5% caseinhydrolysat, 10 mg/l Bl-vitamin, 40 mg/! X-gal og 1 mM IPTG (isopropylthiogalactosid) og indeholdende enten 100 pg/ml ampicillin eller 50 pg/ml chloramphenicol.

Da tab af det £coRI-fragment, der omfatter en del af genet for chloramphenicolacetyltransferase, medfører tab af chloramphenicolresistens, viste plader med ampicillin sig at have ca. 40 gange flere transformanter end plader med chloramphenicol. 4 ampicillinresistente transformanter blev udvalgt, 10 og kulturer blev dyrket i LB-medium indeholdende 100 pg/ml ampicillin. DNA fra disse kulturer blev isoleret under anvendelse af standardmetoder og analyseret for størrelse og tilstedeværelse af steder for restriktionsendonucleaserne EcoRI,

Hindlll, Hinfl, Pstl og Xhol. Et plasmid, der viste de forventede mønstre efter elektroforese i 6%'s polyacrylamidgeler, blev betegnet pDSXII,3 (fig. 8a).

Η B. Konstruktion af plasmiderne pDS3/PN25X/0fto2+ og pDSXIII,l

Plasmiderne pDS3/PN2sX/o,t02+ og pDSXIII,l blev fremstillet ved at kombinere relevante fragmenter af plasmiderne pDSIX,l og pDS2/PN25x/o,t02+ (fig. 8B) eller 20 pDSXII,3 (fig. 8c). Til dette formål blev 1,25 pg af disse tre plasmider spaltet fuldstændigt i tre separate reaktioner med restriktionsendonucleaserne Pstl og

Xhol. Efter fjernelse af disse enzymer ved phenolekstraktion blev de tre I opløsninger chromatograferet gennem Sephadex® G75 ækvilibreret i en puffer med en pH på 7,6 bestående af 2,5 mM Tris-HCI og 0,25 mM EDTA. DNA-holdige 25 fragmenter fra hvert forsøg blev kombineret, og de resulterende opløsninger blev I koncentreret ved lyofilisering.

I I to separate reaktioner blev 0,13 pg spaltet DNA fra hvert af plasmiderne pDSIX,l og pDS2/PN25X/0/to2+ eller pDSIX,l og pDSXII,3 inkuberet i et volumen I 30 på 60 pi i ligationspuffer med 1,3 enheder T4-DNA-ligase i 10 timer ved 15°C, før enzymet blev inaktiveret ved inkubation i 7 minutter ved 65°C. Igen i 2 separate I reaktioner blev E. coli M15 (CaCI2-kompetent) transformeret med 0,12 pg af det I ligerede DNA under hensigtsmæssige betingelser. Transformanter blev udvalgt I ved 37°C på minimalagarplader baseret på M9-medium (J.H. Miller, supra) I 35 beriget med 0,2% glucose, 0,5% caseinhydrolysat, 10 mg/l Bl-vitamin, 40 mg/l X-gal og 1 mM IPTG og indeholdende 100 pg/ml ampicillin. Der udvalgtes seks hvide transformanter fra hver transformation, og kulturer blev dyrket i LB- medium indeholdende 100 pg/ml ampicillin. DNA fra disse kulturer blev isoleret ved standardmetoder og analyseret for dets størrelse og tilstedeværelsen af I 40 steder for restriktionsendonucleaserne EcoRI, Hindlll, Hinfl, Pstl og Xhol. To I plasmider, som var afledt af pDS2/PN25X/o,t02+ og pDSXII,3, og som udviste de ^ 'ΐ'·" ' ____ >c-· ;.

DK 175331 B1 15 forventede mønstre efter elektroforese i 6%'s polyacrylamidgeler, fik betegnelsen henholdsvis pDS3/PN2sX/o,to2+ (fig. 8b) og pDSXIII,l {fig. 8c).

5 EKSEMPEL 4

Ekspression af chloramphenicolacetyltransferase i plasmider, der indeholder promotor/operatorfusionen PN2sX/o 10 Til påvisning af anvendeligheden af promotor/operatorfusionen PN25x/0 blev syntesen af chloramphenicolacetyltransferase i celler, der indeholder plasmider bærende pN2$X/0f overvåget. B. coli M15-celler transformeret med enten pDS2/PN25X/o,to2+, pDSXIII,l eller pDS3/PN25X/o,t,>2+ blev dyrket i nærværelse eller fraværelse af 1 mM IPTG i LB-medium indeholdende 100 Mg/ml ampicillin ved 37°C til en tæthed på 1,7 x 109 15 celler/ml. 1,5 x 108 celler blev indsamlet ved centrifugering og resuspenderet i prøvepuffer indeholdende 1% SDS, 1% β-mercaptoethanol, 10% glycerol og 62,5 mM Tris-HCI (pH 6,8). Prøverne blev kogt i 5 minutter, afkølet på is, centrifugeret ved 12.000 x g i 30 sekunder og underkastet elektroforese i en SDS-holdig polyacryl-amidgel (12,5% acrylamid) som beskrevet af U. Laemmli, "Cleavage of structural 20 proteins during the assembly of the head of Bacteriophage T4“, Nature 227, 1970, s.

680-682). Efter farvning af proteinerne med Coomassie brilliant Blue R-250 blev ubundet farvestof fjernet fra gelen. Et fotografi af denne gel er vist i fig. 9.

Ved sammenligning af bånd 1, 2 og 3 i fig. 9 er det tydeligt, at pDSXIII,l (bånd 1) 25 som forventet indkoder /ac-repressor (R), men ikke chloramphenicolacetyltransferase (CAT), hvorimod repressoren i celler, som er transformeret med pDS2/PN25X/o,t02+ (bånd 2 og 3), er fraværende, og chloramphenicolacetyltransferase dannes i store mængder uafhængigt af tilstedeværelsen af IPTG i mediet. Selv om pDS3/PN25X/o,t02+ kun afviger fra pDS2/PN2sX/o,t02+ ved, at det omfatter genet for /ac-repressoren (fig.

30 8b), dannes kun usynlige mængder chloramphenicolacetyltransferase i celler, som er transformeret med pDS3/PN25X/o,to2+' i fraværelse af IPTG (sammenlign bånd 4 og 5 med bånd 1, 2 og 3). Imidlertid dannes der i celler, som indeholder pDS3/PN2sX/o,to2+, og som dyrkes i nærværelse af IPTG, i det væsentlige samme mængde chloramphenicolacetyltransferase som i celler, som indeholder pDS2/PN25X/o,to2+ 35 (sammenlign bånd 6 og 7 med bånd 2 og 3).

De ovenfor beskrevne resultater viser, at promotoren PN25x/0 undertrykkes i nærværelse af/ac-repressor og induceres i det væsentlige til fuld aktivitet ved tilsætning af induceren IPTG.

40

Claims (22)

1. 2. Ekspressionskontrol-DNA-sekvens ifølge krav 1, H kendetegnet ved, at coliphag T5-promotoren er PN2s-promotoren.
2. 3. Ekspressionskontrol-DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at fac- operatoren eller en funktionel del deraf overlapper T5- promotorsekvensen.
3. 4. Ekspressionskontrol-DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, 15 kendetegnet ved, at den omfatter den funktionelle del af den i fig. 7 viste nucleotidsekvens.
4. 5. Ekspressionsvektor, kendetegnet ved, at den omfatter en ekspressionskontrol-DNA-sekvens ifølge 20 et hvilket som helst af kravene 1-4.
5. 6. Ekspressionsvektor ifølge krav 5, kendetegnet ved, at den er et plasmid, der er i stand til at replikere i gramnegative og/eller grampositive bakterier. I 25
6. 7. Ekspressionsvektor ifølge krav 6, kendetegnet ved, at den er i stand til at replikere i en £.co//-stamme.
7. 8. Ekspressionsvektor ifølge krav 6, 30 kendetegnet ved, at den er i stand til at replikere i en B.subtilis- stamme.
8. 9. Ekspressionsvektor ifølge krav 6 eller 7, I kendetegnet ved, at den er et medlem af pDSl-plasmidfamilien. I 35 10. Ekspressionsvektor ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den er pDS2/PN25X/o,to2+.
9. 11. Ekspressionsvektor ifølge krav 9, kendetegnet ved, at den er pDS3/PN25X/o,to2+. I 40 17 DK 175331 B1
10. 12. Transformant, kendetegnet ved, at den bærer en ekspressionsvektor ifølge et hvilket som helst af kravene 5*11.
11. 13. Transformant ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den er en E. coli- stamme.
12. 14. Transformant ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den er en E. coli M15-stamme. 10
13. 15. Transformant ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den er en B. subtilis-stamme.
14. 16. Fremgangsmåde til fremstilling af et pro- eller eukaryot polypeptid, 15 kendetegnet ved, at en vært transformeres med en ekspressionsvektor, der indeholder den DNA-sekvens, som koder for polypeptidet, operativt forbundet med en ekspressionskontrol-DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, transformanten dyrkes under hensigtsmæssige vækstbetingelser, og det ønskede polypeptid isoleres fra kulturen. 20
15. 17. Fremgangsmåde ifølge krav 16, kendetegnet ved, at vektoren er et plasmid, der er i stand til at replikere i gramnegative og/eller grampositive bakterier.
16. 18. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at plasmidet er i stand til at replikere i en E. coli- stamme.
17. 19. Fremgangsmåde ifølge krav 17, kendetegnet ved, at plasmidet er i stand til at replikere i en B. subtilis-30 stamme.
18. 20. Fremgangsmåde ifølge krav 17 eller 18, kendetegnet ved, at plasmidet er et medlem af pDSl-familien.
19. 21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at plasmidet er pDS2/PN2sX/0/to2+.
20. 22. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at plasmidet er pDS3/PN2sX/o»to2+. 40
21. 23. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 16-22, kendetegnet ved, at polypeptidet er chloramphenicolacetyltransferase. I DK 175331 B1 Η 18
22. 24. Anvendelse af en ekspressionskontrol-DNA-sekvens ifølge et hvilket som helst af I I kravene 1-4 til udtrykkelse af et pro- eller eukaryot polypeptid. I