KR19990014906A - 유전자 발현용 프로모터 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세균성 숙주내에서의 단백질의 생산을 위한 신규한 발현계를 제공한다. 이 계는 전사를 개시하는데 있어 매우 효율적이어서 단백질 수율을 증가시키는 신규한 프로모터를 이용한다. 프로모터는 컨센서스 대장균 프로모터의 -35 영역, lppP-5 프로모터의 -10 영역, 및 이들 두 영역 사이에 lpp 또는 lacUV5 프로모터 중 어느 하나로부터 유래된 스페이서를 포함한다.
Description
재조합 DNA 기술의 출현은 세균, 진균, 효모 및 포유 동물의 세포 등의 유기체내에서 다양한 천연 단백질 및 합성 단백질의 생산을 가능하게 했다. 일반적으로, 이것은 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자를 숙주 유기체 중에 삽입하고, 이 숙주의 세포 기관을 이용하여 유전자를 발현시키는 것을 수반한다.
재조합 DNA 기술은 계속적으로 진보하여 상업적으로 허용되는 수율의 단백질의 생산을 성취하고 있다. 단백질의 재조합 생산에 있어 제한 요인은 목적하는 단백질을 암호화하는 유전자가 발현되는 속도이다. 특히, 본 발명자는 유전자의 프로모터 영역이 유전자 발현의 전사 과정에 있어 중요하다는 것을 밝혀내었다. 대장균에서 발견되는 trp 프로모터 등의 효율적인 프로모터는 DNA 의존성 RNA 중합효소에 강하게 결합하여, mRNA 생산시에 유전자의 전사를 개시한다. Lac 프로모터 등의 덜 효율적인 프로모터는 RNA 중합효소에 덜 강하게 결합하여 낮은 속도의 mRNA 생산을 초래한다.
trp 프로모터는 전사를 효율적으로 개시하는 그의 능력 때문에 이종성 단백질의 생산에 널리 사용되어 왔다. 그의 효율성에도 불구하고, trp 프로모터의 고유한 단점은 쉽게 조절할 수 없다는 것이다. 특히, 이 trp 프로모터는 완전하게 억제할 수 없는데, 즉 이 프로모터는 숙주가 배양물 중에서 단백질 생산에 적절한 기까지 증식하기 전에 전사를 작동시킬 수 있다. 널리 사용되는 또 다른 프로모터는 trp 프로모터 보다는 덜 효율적이나, 잘 제어할 수 있는 lac 프로모터이다.
더욱 효율적인 프로모터를 개발하기 위해, 상이한 프로모터의 관능성 성분을 조합하였고, 예를 들면 미국 특허 제 5,362,646호에 기재된 것들이다. 한 예를 들자면, 박테리오파아지 T7 프로모터 A1(PA1)의 일부분을 두 개의 lac 작동인자와 조합하였다. 구체적으로는, 박테리오파아지 T7 프로모터의 소위 -35 및 -10 영역 사이의 스페이서 영역을 변형된 하나의 lac 작동인자 서열로 대체하고, 제조된 프로모터 하이브리드를 제어하기 위하여, 제2 lac 작동인자를 그의 하류에 도입하였다. 시판 중인 pUHE 플라스미드에 도입된, 이 결과의 프로모터/작동인자 계가 유도시에는 전사를 효율적으로 개시하는 것으로 알려졌으나, 여전히 유도 전에는 고도로 억제된다.
문헌 [Tsung et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:5940]에 기재된 또 다른 프로모터는 효율적인 trp -35 영역, 매우 효율적인 lppP-5 프로모터 (lpp 프로모터의 한 변이체)로 부터의 -10 영역 및 lac 프로모터로부터 유래된 스페이서를 포함한다. 이 프로모터는 세포 치사를 초래할 정도로 전사 개시에 있어 매우 효율적인 것으로 입증되었다. 다양한 프로모터에 의해 미생물 숙주내에서의 단백질 수율 개선이 가능하였지만, 상업적으로 가치있는 단백질의 생산을 더욱 효율적으로 작동시키는 프로모터의 필요성이 여전히 남아있다.
발명의 요약
본 발명의 특성에 따르면, 세균성 숙주내에서의 단백질 발현에 유용한 신규 재조합 DNA 구조체가 제공된다. 이 구조체는 단백질을 암호화하는 영역 및 그것과 함께 작동가능하게 연결된, 하기의 서열들 중에서 선택된 DNA 서열을 갖는 프로모터를 포함하는 조절 영역을 포함한다:
5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'; 및
5'-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3'.
본 발명은 세균성 숙주에 적용되는 바와 같은 유전 공학의 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 세균성 숙주내에서의 단백질의 생산을 위한 발현계에 관한 것이다.
도 1은 본 발명에 따른 재조합 DNA 구조체를 도입한 발현 카세트의 누클레오티드 서열 및 개략도;
도 2 및 도 3은 프로모터 및 작동인자 영역을 포함하는 본 발명에 따른 DNA 구조체의 누클레오티드 서열도.
본 발명은 대장균과 같은 세균성 숙주내에서의 DNA 발현을 매우 효율적으로 작동시키는데에 유용한 DNA 서열을 제공한다. 이들 서열을 포함하는 발현 벡터를 사용함으로써 발현가능한 내인성 및 이종성 단백질 모두의 생산을 증가시킬 수 있는 가치있는 수단을 제공한다. 본 발명의 한 특성을 들자면, 세균성 숙주내에서 단백질을 발현시키는데에 유용한 신규 재조합 DNA 구조체를 제공하는 것이다. 이 구조체는 숙주 내에서의 상기 단백질의 발현을 가능하게 하는 프로모터를 포함하는 조절 영역과 작동가능하게 연결되어 있는 단백질 암호화 영역을 포함하며, 여기에서 프로모터는 하기의 서열들 중에서 선택된 DNA 서열을 포함한다:
5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'; 및
5'-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3'.
이들 프로모터는 -35 영역의 컨센서스 (consensus) 서열 TTGACA 및 -10 영역의 서열 TATACT를 공통적으로 갖는다. 스페이서 서열, 즉 사이에 끼어든 18개 염기의 서열은 본 발명에 따라, 서열 ACATAAAAAACTTTGTGT 또는 CTTTATGCTTCCGGCTCG 중 하나일 수 있고, 바람직하게는 서열 ACATAAAAAACTTTGTGT이다. 따라서, 본 발명은 바람직한 실시태양으로, 목적하는 단백질을 암호화하는 DNA가 발현 조절하에 서열 5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는 DNA 구조체를 제공한다.
당기술 분야의 당업자라면 본 발명의 프로모터가 관능적 조절 영역내의, 발현시키는데 필요한 성분 중의 한 필수 요소를 구성함을 알 것이다. 더욱이, 이들 프로모터는 표준 방법을 사용하여 그람 음성 또는 양성 세균 내에서 복제할 수 있는 모든 적합한 발현 벡터 중에 삽입할 수 있다. 그리고, 보다 구체적으로, 유전자 발현 조절 영역을 형성하기 위해 본 발명의 프로모터는 리보솜 결합 부위 및 바람직한 실시태양으로 프로모터 관능을 조절하는 기능을 하는 작동인자를 비롯하여 그 발현에 통상 필요한, 그러한 다른 조절 요소와 함께 도입될 것이다.
이들 성분은 널리 인지된 유전자 발현 원리에 따라 발현을 일으키기 위해 필요한 바대로 서로에 대해 반드시 배열된다.
본 발명의 바람직한 한 실시태양으로, 구조체의 조절 영역에 작동인자를 도입한다. 사용할 수 있는 작동인자로는 화학적 유도인자 (inducer)에 의해 직접적으로 유도할 수 있는 인자와 탈억제가능한 인자, 예를 들면 lac가 있다. 적합한 작동인자의 예로는 대장균의 락토스, 갈락토스, 트립토판 및 테트라싸이클린 작동인자 둥이 있다 (Miller et al., The Operon, Cold Spring Harbour Laboratory, 1980 및 Hillen et al., J. Mol. Biol., 1984, 172:185를 참조). 단백질을 암호화하는 DNA의 발현을 조절할 수 있을 정도로 잘 억제할 수 있는 작동인자가 바람직하다. 구체적인 실시태양으로, 조절 영역은 프로모터가 합성 유도인자 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG) 및 천연 유도인자 락토스 부재하에 발현하는 것을 막는 lac 작동인자 (도 1)를 포함한다.
더욱이, 조절 영역은 리보솜 결합 부위 (RBS) 서열을 추가로 포함함으로써 mRNA 전사체에 대한 리보솜의 결합을 촉진하여, 단백질을 생산하는 RNA 암호화 영역의 해독을 개시한다. 적합한 리보솜 결합 부위는 lac 및 박테리오파아지 T5를 포함한다. 바람직한 실시태양에 있어서, RBS는 서열 5'-ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC-3'을 갖는 T5 박테리오파아지 RBS로부터 유래된 서열이다.
본 발명에 따른 구조체의 조절 영역은 내인성 또는 이종성 단백질을 암호화하는 영역과 작동가능하게 연결되어 있다. 용어 이종성 단백질이란 비록 세균성 숙주에 의해 천연적으로 생산된 것은 아니지만, 단백질을 암호화하는 DNA로 적합하게 형질전환될 때 이 숙주에 의해 발현되는 폴리펩티드 또는 단백질을 의미하는 것이며; 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA가 숙주를 형질전환시키는데에 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 계를 사용하여 생산될 수 있는 단백질로는 부갑상선 호르몬 (PTH), 글루카곤 또는 그의 단편, 및 GLP-1 및 GLP-2 등의 관련된 펩티드 등의 호르몬; 표피 생장 인자 (EGF) 등의 생장 인자 및 인터루킨-6 및 -8 (IL-6, -8) 등의 림포킨 등이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 확실한 형태의 단백질, 즉 부가의 N-말단 Met 잔기가 없는 단백질을 용이하게 단리하게 위해, 융합 단백질로 생산할 수도 있으며, 이 융합 단백질은 발현 후에 절단된다. 예를 들면, 해당 단백질을 암호화하는 DNA가 대장균의 외막 단백질 ompA 등의 신호 펩티드를 암호화하는 DNA에 후행해도 좋다. 이 경우에 있어서, 발현된 유전자는 목적하는 단백질에 선행하는 N-Met 함유 ompA 신호 펩티드를 포함하는 융합 단백질을 생산한다. 이 신호 펩티드는 세균의 막간을 통하여 융합 단백질을 운반하며, 여기서 신호 펩티드가 절단된다. 사용되는 다른 신호 펩티드로는 알칼리성 포스파타아제, 대장균의 열안정성 장독소 Ⅱ 및 스트렙토코쿠스로부터의 단백질 A 등이 있다. 별법으로, 융합 단백질을 별도의 절차로 합성하고 절단하여 목적하는 단백질을 생산할 수도 있다. 예를 들면, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST)는 트롬빈 또는 인자 Xa를 사용하여 목적하는 단백질로부터 절단할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시태양에 있어서, 암호화 영역은 인간의 PTH를 암호화하는 DNA를 포함하며, 이것의 아미노산 서열은 헨디 등 (Hendy et al.)에 의해 다음 문헌에 기재되어 있다 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:7365). 본 명세서에 기재된 실시예에 있어서는, PTH를 암호화하는 DNA 서열을 ompA 신호 펩티드를 암호화하는 DNA에 직접적으로 해독 프레임 (reading frame) 내에 연결시킨다.
lpp 또는 lacUV5 스페이서를 갖는, 도 1에 예시한 바람직한 재조합 DNA 구조체는 포스포라미다이트 방법에 의해 합성되는 단일 가닥의 올리고누클레오티드로부터 제조하였다. XhoⅠ 내지 EcoRⅠ 제한효소 부위의 서열을 포함하는 겔 정제된 가닥을 초기 PCR 표적으로서 사용하였고, 제시된 초기 올리고누클레오티드 서열 또는 그의 상보성 가닥 중 하나의 양 말단에 특이적으로 혼성화하는 상보성 단일 가닥 DNA 올리고누클레오티드를 사용하여 이중 가닥 DNA 단편으로 PCR 증폭시켰다. 이리하여, 예를 들면 매니아티스 등 (Maniatis et al., Molecular Cloning Cold Spring Harbour Laboratories, 1982) 및 이니스 등 (Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Application)에 의해 기재된 바와 같이, 표준 유전자 합성 방법론을 사용하여 구조체를 제조한다.
본 발명의 또 다른 특성은 본 발명에 따른 재조합 DNA 구조체를 도입한 세균성 숙주 세포 형질전환체를 생산하는데에 유용한 발현 벡터를 제공하는 것이다. 본 발명에 따른 DNA 구조체는 카세트로서 벡터, 바람직하게는 플라스미드 벡터 중으로 확립된 기술에 의해 도입할 수 있다. 일반적으로, 벡터는 카세트 상의 양 말단상의 제한 부위에 상응하는 제한 부위에서 절단된다. 어어서 이 카세트는 벡터 상의 상보적으로 절단된 부위에 양 말단을 라이게이션시킴으로써 도입된다.
박테리오파아지 기재 벡터를 사용할 수도 있지만, 플라스미드 벡터, 예를 들면 pBR322 및 pUC 계열의 플라스미드가 바람직하다. 일단 적합한 벡터 중으로 도입되면, 결과의 플라스미드가 숙주내에서 증폭되어 후속하는 클로닝 작업에 충분한 양을 제공할 수 있다. 선택된 단백질을 암호화하는 DNA는 다수의 클로닝 부위가 제공되어 있는 플라스미드에, 표준 클로닝/라이게이션 방법을 사용하면 편리하게 도입됨을 알 수 있다. 또한, 플라스미드에 필수적으로 복제 개시점을 도입해야 하고, 가장 바람직하게는 형질전환된 세포의 선별을 가능하게 하는 암피실린 또는 테트라싸이클린 내성 유전자 등의 표지를 도입할 것이다. 또한, 모든 3 해독 프레임 중의 전사 정지 코돈 및 정확하게 위치된 전사 종료 영역이 목적하는 단백질의 충분한 발현에 필요함을 알 수 있다. 적합한 전사 종료 암호로는 대장균의 trpA, thr, his 및 phe 유전자의 전사 종료 암호 등이 있다.
일단 목적하는 단백질을 암호화하는 DNA가 벡터에 도입되면, 선택된 세균성 숙주를 표준 염화칼슘 매개 형질전환 기술을 사용하여 이 벡터로 즉시 형질전환시킨다. 적합한 세균성 숙주로는 대장균 및 살모넬라 등의 그람 음성 세균 등이 있다. 숙주로는 시판 중인 대장균 균주가 바람직하고, JM101 및 그의 유도체가 가장 바람직하다.
DNA 구조체의 조절 영역이, 이하 더욱 상세히 기재된 바와 같이 lac 작동인자를 포함할 경우에는, 형질전환된 숙주 균주가 lacⅠ 생성물을 발현할 수 있고, 바람직하게는 몇몇 경우에 있어서 과잉 생산할 수 있어서 프로모터 관능 및 단백질의 발현을 조절할 수 있어야 한다. 몇몇 형질전환체에 있어서 lacⅠ 과잉 생산의 필요는 본 발명의 한 실시태양에 따라서, lacⅠ 생성물의 과잉 생산을 초래하는 lacⅠq유전자를 이미 가지고 있는 숙주를 사용함으로써 충족될 수 있다. 숙주로서 사용할 수 있는, lacⅠ을 과잉 생산하는 대장균의 균주로는 (Clontech Laboratories Inc., California, USA로부터 입수한) JM 계열의 균주 등이 있다. 특히 사용에 적합한 숙주 균주로는 JM101, JM105 및 JM107 등이 있다. 별법으로, 형질전환체내에서의 lacⅠ 과잉 생산은 lacⅠq유전자를 본 발명의 벡터에 도입시킴으로써 충족될 수 있다. 이 상황에 있어서 lacⅠ의 과잉 생산은 벡터에 의해 매개되므로, 대장균 균주 DH1, RR1, C600, CMK603 및 EB505를 포함하여, 시판 중인 다양한 세균성 숙주 균주 중 어느 것이라도 사용할 수 있다. 벡터에 도입하고자 하는 lacⅠq유전자는 문헌 [Bagdasarian et al., Gene, 1983, 26:273]에 기재된 플라스미드 pMMB22의 1.2 kb HindⅢ 단편으로서 얻고, 이어서 플라스미드 벡터의 임의의 부위에 비파괴적으로 도입할 수 있다.
처음에 형질전환된 균주로부터 그의 후손까지 벡터, 특히 플라스미드의 유전성질의 안정성을 향상시키기 위해서, 대장균내에서 관능성인 분획 요소 (par)를 벡터에 도입할 수도 있다. 그러한 한 par 요소를 380 염기쌍의 HincⅡ/AvaⅠ 단편으로서 pSC101로부터 단리시키고, 이어서 벡터의 적합한 부위 중으로 클로닝시킬 수 있다.
형질전환에 이어, 발현 벡터를 갖는 세균성 숙주를 선택된 숙주용으로 가장 적절한 배양 배지 중에서 배양한다. 대장균용으로는 LB 배양액 또는 2YT 배지 (효모 추출물/트립톤)가 본 명세서 중의 그들 균주를 바람직하게 배양하는데에 사용될 수 있다. 형질전환되지 않은 숙주 균주를 사멸시키는 세포독성 약물을 공급함으로써 플라스미드 형질전환체에 대한 선별압을 유지해야 한다. 예를 들면, 테트라싸이클린 내성 유전자를 갖는 플라스미드를 갖는 형질전환체는 테트라싸이클린을 함유하는 배지에서 배양하여야 한다. 테트라싸이클린의 배지 농도는 약 5 내지 15 ㎍/㎖이 적합하다.
구조체 상의 프로모터는 바람직하게는 조절 영역내에서 프로모터에 인접하게 위치한 작동인자에 억제인자 분자를 결합시킴으로써 제어할 수 있다. 바람직한 실시태양에 있어서는, lacⅠ 유전자 생성물은 프로모터에 인접하게 위치한 lac 작동인자에 결합된다. 이 경우에 있어서, lacⅠ 생성물의 결합은 프로모터를 억제하여, 그의 조절하에 암호화 DNA의 발현 수준을 낮춘다. 발현 수준을 증가시키기 위해서는, lacⅠ에 결합하여 프로모터를 탈억제시키는 화학적 IPTG (이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드)를 배양 배지에 첨가하여 프로모터를 탈억제시키고 발현을 유도한다. 적합하게는, 세포가 중간 대수 증식기에 도달했을 때 IPTG를 배양 배지에 첨가한다.
배양이 목적하는 단백질의 최대 수율을 실현하도록 증식되어야 하는 최적 밀도를 결정하기 위하여, 시험을 행할 수 있고 단백질 수준을 시간 경과 실험으로 분석할 수 있다. 비록 더 많은 양의 단백질이 중간 대수 증식기 이후 약 4 내지 5시간 내에 축적될 것으로 기대할 수 있지만, 일반적으로 합당한 수율의 단백질은 일단 세포가 중간 대수 증식기에 도달할 때 회수할 수 있다.
목적하는 단백질은 그 단백질에 적절한 방식으로 당기술분야에 확립된 기술로 정제할 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시태양에 있어서, 발현된 PTH는 주변세포질 공간을 넘어서 배양액 중으로 분비되고, 거기에서 직접적으로 회수된다. 단백질이 분비될 때, 사용한 배지는 단백질의 성질을 그의 분자 크기, 순전하, 등전점 등에 의해 반영하는 생화학적 기술을 사용하여 단리할 수 있다. 먼저, 배지를 예를 들면 동결건조에 의해 농축할 수 있다. 더욱이, 항체를 이용할 수 있거나 또는 목적하는 단백질에 대한 천연의 리간드를 이용할 수 있는 경우에는, 친화성 칼럼을 사용해도 좋다. 이제, 본 발명의 구체적인 실시태양을 도면을 참조하여 설명하고자 한다.
실시예 1
PTH는 그의 완성형태가 인간 내에서 작용하여 혈중 칼슘을 증가시키고 뼈 형성을 조정하는 84-아미노산 펩티드이다. 인간 PTH를 암호화하는 DNA를, 확립된 기술을 사용하고 상기 헨디 등 (Hendy et al.)에 의해 공개된 아미노산 서열에 따라 합성하였고, 도 1에 도시된 바와 같이, 하기 기재된 구조체 내에 도입하였다.
기준 프로모터 #3 및 #4 뿐만아니라 프로모터 #1 및 #2이 도입되어 있는 바람직한 재조합 DNA 구조체를 표 1 및 도 1에 설명하였고, 현재 만들어진 기준은 포스포라미다이트 방법에 의해 합성된 단일 가닥 올리고누클레오티드로부터 제조하였다. XhoⅠ 내지 EcoRⅠ의 제한 부위 서열을 포함하는 겔 정제된 가닥을 초기 PCR 표적으로서 사용하였고, 제시된 초기 올리고누클레오티드 서열 또는 그의 상보성 가닥 중 하나의 양 말단에 특이적으로 혼성화하는 상보성 단일 가닥 DNA 올리고누클레오티드를 사용하여 이중 가닥 DNA 단편으로 PCR 증폭시켰다. 이리하여, 구조체는 예를 들면 매니아티스 (Maniatis, Molecular Cloning Cold Spring Harbour Laboratories, 1982) 및 이니스 등 (Innis et al., PCR Protocols, A Guide to Methods and Application)에 의해 기재된 바와 같이, 표준 유전자 합성 방법론을 사용하여 제조된다.
이어서, 구조체를 암피실린 내성 대신에 테트라싸이클린 내성을 부여하는 pUC18 유래 플라스미드 중으로 클로닝하였다. 이어서, JM101 유래 대장균 숙주를 확립된 기술에 따라 형질전환시켰다 (Maniatis et al., Molecular Cloning Cold Spring Harbour Laboratory, 1982를 참조).
실시예 2 형질전환된 숙주의 발현
PTH 벡터를 함유하는 형질전환체를 30 ℃에서 0.5 % 글루코스 및 테트라싸이클린을 함유하는 2YT 배양액에서 밤새 배양하였고, 이어서 동일 조성의 새 배지에 접종하였고, 중간 대수 증식기에 도달할 때까지 30 ℃에서 계속 배양하였다. 이어서, 배양을 1시간 증식 간격으로 유도하였고 (1 mM IPTG), 배양액 일정량씩을 회수하고 분획하여, 분비된 PTH 생성물을 표준 알레그로 분석을 사용하여 확인하기 위한 배양액의 시료를 산출했다. 이들 분석의 결과는 하기 표 1에 제시되어 있다:
| 프로모터 | RBS | 최대 PTH (㎎/ℓ)6-8 시간 | |
| # | -35 영역 스페이서 -10 영역 | ||
| 1 | trp lpp lppP-5 | T5lac | 245148 |
| 2 | trp lacUV5 lppP-5 | T5lac | 12110 |
| 3 | trp lacO lppP-5 | T5lac | 505 |
| 4 | T7 lacO T7 | T5lac | 10010 |
알레그로 분석의 결과는 18 염기쌍의 lpp 및 lacUV5 서열에 도입되어 있는 프로모터가 이종성 PTH 단백질의 함량 중대를 촉진시킨다는 것을 나타낸다. 프로모터 #1 및 #2는 유리하게는 프로모터 #3 및 #4에 비교되는데, 여기에서 프로모터 #3에서는 스페이서가 변형된 lac 작동인자 서열 (lacO)로 대체되었고; 프로모터 #4에서는 -35 및 -10 영역이 박테리오파아지 T7로부터 온것이고, 스페이서는 lacO 프로모터이다. 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제 (CAT)를 암호화하는 유전자를 발현시키는 동일한 프로모터에 관한 연구는 프로모터 #1 및 #2의 향상된 발현의 결과와 유사하였다. 또한, 연구된 각 프로모터가 lac 유래 RBS에 비해 박테리오파아지 T5 RBS와 조합될 때 향상된 단백질 수율을 나타낸다는 것이 알려졌다.
〈서열표〉
(1) 일반적인 정보
(i) 출원인: 알렐릭스 바이오파마슈티칼스 인크.
(ii) 발명의 명칭: 유전자 발현용 프로모터
(iii) 서열의 수: 13
(iv) 서신 주소:
(A) 주소: 니카이도, 마아멜스타인, 머리 및 오람 엘엘피
(B) 거리: 655 피프틴쓰 스트리트 엔.더블유. 스위트 330
(C) 도시: 워싱톤
(D) 주: 콜럼비아주
(E) 국가: 미국
(F) 우편번호: 20005-5701
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0. 버젼 #1.25
(vi) 현재의 출원 자료:
(A) 출원 번호: PCT/IB96/00462
(B) 출원일: 1996년 5월 16일
(C) 분류기호:
(vii) 선행 출원 자료:
(A) 출원 번호: US 08/445,133
(B) 출원일: 1995년 5월 19일
(viii) 변리사/대리인 정보
(A) 성명: 스트라칸, 그래함
(C) 참조/문서 번호: F8074-6007
(ix) 통신 정보
(A) 전화: (202) 638-5000
(B) 팩시밀리: (202) 638-4810
(2) 서열 번호 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 1:
(2) 서열 번호 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 2:
(2) 서열 번호 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 3:
(2) 서열 번호 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 18 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 4:
(2) 서열 번호 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 21 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 5:
(2) 서열 번호 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 136 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 6:
(2) 서열 번호 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 132 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 7:
(2) 서열 번호 8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 136 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 8:
(2) 서열 번호 9에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 132 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 9:
(2) 서열 번호 10에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 136 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 10:
(2) 서열 번호 11에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 132 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 11:
(2) 서열 번호 12에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 101 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 12:
(2) 서열 번호 13에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 101 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 가닥 수: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자 유형: DNA
(xi) 서열 기재: 서열 번호 13:
Claims (11)
- 숙주내에서의 단백질 발현을 가능하게 하는 프로모터를 포함하는 조절 영역이 작동가능하게 연결된 단백질을 암호화하는 영역을 포함하며, 여기서 프로모터 영역이 하기의 서열 중에서 선택된 DNA 서열을 포함하는, 세균성 숙주내에서 단백질을 발현시키는데에 유용한 재조합 DNA 구조체:5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'; 및5'-TTGACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATACT-3'.
- 제1항에 있어서, 상기 프로모터 영역이 DNA 서열5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3'을 포함하는 재조합 DNA 구조체.
- 제1항에 있어서, 상기 세균성 숙주가 대장균인 재조합 DNA 구조체.
- 제3항에 있어서, 상기 조절 영역이 단백질의 발현을 제어하는 작동인자를 추가로 포함하는 재조합 DNA 구조체.
- 제4항에 있어서, 작동인자가 lac 작동인자인 재조합 DNA 구조체.
- 제5항에 있어서, 단백질이 인간의 PTH인 재조합 DNA 구조체.
- 제6항에 있어서, 숙주의 주변세포질로의 단백질 분비를 가능하게 하기 위하여 암호화 영역을 갖는 해독 프레임내에 OmpA 신호 펩티드를 암호화하는 DNA를 추가로 포함하는 재조합 DNA 구조체.
- 제3항에 있어서, 조절 영역이 DNA 서열 ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC를 갖는 T5 리보솜 결합 부위를 포함하는 재조합 DNA 구조체.
- 제3항에 있어서, 도 2에 정의된 바의 서열을 갖는 재조합 DNA 구조체.
- 제3항에 있어서, 도 3에 정의된 바의 서열을 갖는 재조합 DNA 구조체.
- 제1항 내지 제10항 중 한 항에 따른 재조합 DNA 구조체를 포함하는 세균성 숙주 세포 형질전환체의 생산에 유용한 벡터.
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