JPS60199387A - 縦列配列した遺伝子をもつハイブリツド核酸配列 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は遺伝子工学に用いるためのノ・イブリツビ核酸
配列、特に遺伝子が縦列整列したノ・イブリッド配列に
関する。

遺伝子工学の目的の１つは、細胞において希望する遺伝
子生成物の産生を増大させることである。

遺伝子の発現は遺伝子操作により転写および翻訳の段階
で高めることができる。さらＶ（プラスミド内に位置す
る遺伝子については、細胞により産生される遺伝子生成
物の量は遺伝子を含むグラスミビのコピー数を増すか、
（たとえば温度により調節されるランアウェイ（ｒｕｎ
ａｗａｙ）　プラスミドゝを使用して）またはプラスミ
ビ内の遺伝子−プロモーター複合体のコピー数を増すこ
とにより高めることもできることが認められている。Ｂ
、ウーリン、Ｓ、モリン、Ｐ、ダスターフソン、および
Ｋ。

ノルピストローム（１９７９年）ｌ遺伝子１６：９１−
１０６、ならびにＮ、リー、Ｋ、ナカムラ、Ｍ、イノウ
ニ（１９８１年）　Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｊａｌｏ、１４
６：８６１−８６６を参照されたい。

理論的には、クローン化された遺伝子のコピー数が多い
はと遺伝千振効果は高くなるであろう。

しかし一定の拘束がある。ランアウェイプラスミドの場
合のようにコピー数が多すぎると、細胞は過剰蓋または
本質的な細胞活性の崩壊の結果死滅するであろう。さら
に、プラスミドの寸法が大きくなるのに伴って多くの型
の細胞の形質転換効率は低下し、比較的大きな寸法のプ
ラスミドが低いコピー数をもつことになる。Ｓ、Ｒ，ク
シュナー、”ジエネテイソク・エンジニアリング’、）
１．Ｗ。

ポイヤーおよびＳ、ニコシア（編）、１９７８年、１７
−２３頁（エルスフイール／ノースホラント９・バイオ
メディカル・プレス、アムステルダム）、ならびにＰ、
プログ（１９７９年）、“プラスミズ”（Ｗ、Ｈ，フリ
ーマン社、サンフランシスコ）ヲ参照されたい。特に多
くの種類の細胞についてシラスミドの寸法が１５Ｋｂ以
上に増大すると形質転換効率が低下することが認められ
た。Ｒ，ロ＋−’リゲツンおよびＲ，ティト、１組み換
えＤＮＡ法”。

４頁（アディソン・ウェスレイ、リーディング、−ｒサ
チュセツノ（１９８３年）を参照されたい。従ってこれ
らの細胞種についてはプラスミドの長さを慎重に制御し
なければならない。

今日まで特定の遺伝子生成物の産生のために構成された
ハイブリッドプラスミド 的に製造されたハイブリッド核酸配列は少な（とも下記
の領域または部位をもつ：プロモーター領域：リポソー
ム結合領域；翻訳開始領域；目的遺伝子用のコーディン
グ領域；翻訳終止領域；および転写終止領域。（″領域
（ｒｅｇｉｏｎ）および”部位（ｓｉｔｅ）という語は
ここでは、その配列が一般的な翻訳開始または終止の部
位の場合のようにわずかな残基を含むか、あるいは一般
的なプロモーターまたはリポソーム結合部位の場合のよ
うに多量の残基な含むかにかかわらず、特定の機能をも
つ核酸配列を記述するために交換ｂ」能なものとして用
いられていることを留意されたい）。

強力なプロモーターおよび精細に同調したリポソーム結
合領域を伴う場合、この種の構造は高水準の遺伝子発現
を生じるであろう。しかしこの配列がクローン化された
各橘成遺伝子につき遺伝千振効果を得るために遺伝子の
複数のコピーをクローニングする際に用いられる場合、
プロモーター領域および転写領域もクローン化されなけ
ればならない。これらの領域の複数のコピーが存在する
ことは、たとえばクローニングに用いられる・・イブリ
ッドプラスミド し，これにより寸法の比較的大きなプラスミドに関して
先きに述べた形質転換効率および低コピー数という問題
が生じる。

当技術分野における以上のような状況からみて。

本発明の目的は多数の選ばれた遺伝子をもち、なおかつ
同一数の遺伝子をもつ従来技術のノ・イブリッド配列よ
りも寸法の小さな・・イブリッド核酸配列を提供するこ
とである。これにより、細胞内に導入されるハイノリラ
ド配列の数および寸法を増大させることなく、選ばれた
遺伝子のコピーをより多量細胞内にパックすることがで
きるので，遺伝千振効果を高めることができる。同様に
異種であるが関連のある遺伝子、たとえば生物活性をも
つ分子を組立てる構成蛋白質に対して、または組合せに
おいて相乗的な生物学的効果をもつ関連蛋白質をコード
する遺伝子を密にパックすることにより、遺伝千振効果
を損うことなく改良された最終産物およびより効果的な
産生を得ることができる。

これらおよび他の目的を達成するために，本発明はその
観点の１つによれば単一遺伝子の複数のコピーが縦列配
列し、すなわち順次配列し、単一のプロモーターおよび
単一の転写ターミネークー（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）の
制御下に置かれたノ・イブリツピ核酸配列が提供される
。各遺伝子はそれに付随したリボンーム結合部位、翻訳
開始部位および翻訳終止部位をもつ。重要な点は、各遺
伝子がそれ自身のプロモーター領域および転写ターミネ
ータ−領域のコピ０−をもたず、そのため望まれている
ハイブリッド核酸配列の全体的寸法の低下が得られるこ
とである。遺伝子はハイブリッド配列内ですべてが同一
の読み取り方向をもつように配置されている。

本発明はその他の観点によれば、異なるポリＲプチドを
コードする多数の遺伝子が縦列配列し。

かつ単一のプロモーターおよび単一の転写ターミネータ
−の制御下に置かれたハイブリッド核酸配列を提供する
。この場合も遺伝子は同一の読み取り方向に配列し、各
遺伝子はそれ自身のりボノーム結合部位、翻訳開始部位
および翻訳終止部位をもつが、それ自身のプロモーター
および転写ターミネータ−のコピーをもたない。この実
施態様により製造されたハイブリットゞ核酸配列は、宿
主細胞に導入された場合ポリシストロン性の細菌性オＲ
ロンの場合と同様に機能する。この穐の天然の第２ロン
には、単一の情報として翻訳される数種の遺伝子が含ま
れる。その例には３個の連結した遺伝子（ｈゾＺ、（ａ
ｃＹ、および（ａｃＡ）を含むｅａｃオペロン、および
５個の連結した遺伝子Ｈ，ミラーおよびＷ、Ｓ、レソニ
コフ（編者）（１９８０年）、“オに口ノ”第２版（コ
ールド゛・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーヌ゛、
ニューヨーク）を径照される。

本発明は他の実施態様によれば、核酸配列をそれらの読
み取り方向が同一の向きをもつように結合させる方法で
あって、 （ａｌ　一方の末端に第１型のりゲート可能な末端をも
ち、他方の末端に第２型のりゲート可能な末端をもつ配
列を調製または選択し、配列の読み取り方向は第１型の
りゲート可能な末端から第２８！！のりゲート可能な末
端へ向かうものであり、第１型のりゲート可能な末端２
個の連結は第１制限酵素による開裂に対し感受性であり
、第２型のりゲート可能な末端２個の連結は第２制限酵
素による開裂に対し感受性であり、第１型のりゲート可
能な末端と第２型のりグー）　ＯＪ能な末端との連結は
第１または第２の制限酵素のいずれによる開裂に対して
も実質的に感受性でなく； （ｂ）　上記配列をリケードさせ；そして（ｃ）　’Ｊ
デートされた配列を第１および第２制限酵素で処理する 工程からなる方法が提供される。

本発明の他の実施態様によれば、第１型の核酸配列を第
２型の核酸配列と結合させて、第１および第２配列の読
み取り方向が同一の向きをもち、かつ第１および第２配
列の数かほぼ等しい・・イノリッド配列を形成する方法
であって、 （ａｌ　一方の末端に第１型のリグ−）０４能な末端を
もち、他方の末端に第２型のりゲート０ｊ能な末端をも
つ第１型配列を調製または選択し、配列の読み取り方向
が第１型のりゲート可能な末端から第２型のりゲート可
能ガ末端へ向かうものであり、第１型のりダート可能な
末端は第２型のりゲート可能な末端とけ実濁的にリケー
ドできす、第１型のりゲート可能な末端２個の連結は第
１制限酵素による開裂に対して感受性であり、第２型の
リケード可能な末端２個の連結は第２制限酵素による開
裂に対して感受性であり； （ｂ）　一方の末端に第３型のりゲート可能な末端をも
ち、他方の末端に第４型のリケード可能な末端をもつ第
２配列を調製または選択し、配列の読み取り方向は第３
型のりゲート用能な末端から第４型のりゲート０ｊ能な
末端へ向かうものであり、第３型の７ゲート可能な末端
は第４型のりゲート０ｊ能な末端とは実質的にリケード
できす、第１型のりグー）　ＯＪ能な末端は第３型のり
ゲート可能な末端とは実質的にリケードできず、第２型
のりゲート可能な末端は第４型のりゲート可能力末端と
は実質的にリケードできす、第３型のりゲート円能な末
端２個の連結は第３制限酵素による開裂に対して感受性
であシ、第４型のりゲート０ｊ能な末端２個の連結は第
４制限酵素による開裂に対して感受性であり、第１型の
りゲート可能な末端と第４型のりゲート可能な末端との
連結、および第２型のりゲート可能な末端と第３型のり
ゲート可能な末端との連結は第１、第２、第３または第
４制限酵素のいずれによる開裂に対しても実質的に感受
性でなく； ｆｃ）　第１型および第２型の配列を相互にリグートさ
せ；そして （ｄ）　リグートした配列を第１、第２、第３および第
４制限酵素で処理する工程からなる方法が提供される。

本発明の特定の好ましい実施態様によれば１本発明の縦
列配列遺伝子技術がヒト白血球インターフェロンの免疫
学的および生物学的活性を示すボＩＪ−！プチドの製造
に用いられる。

第１図［；１ＩＮＦ’−Ｂ’を含むＨｌｎａ　ｍ断片（
１，ＩＫｂ）の２個のコピーのうち一方または両方を誘
導る」能な発現ビヒクルｐＩＮ−，ｎ−Ａ３　にクロー
ニングする過程を概略的に示す。ｐＮＬＯＯＩ　は１個
のＨｌｎａ　ｍ断片を、ｐＮＬＯＯ２は２個のＨｌｎｄ
　ＩＩＩ断片を縦列に含む。使用した略語は下記のとお
りである。ＩＢ、ｌｐ−酵母ガラクトースプロモーター
。

ｐ−ｐｏ−リボ蛋白質プロモーター＋　ｌａｃプロモー
ター−オＲレータ−１Ａｒ　−アンピシリン耐性、Ｂ′
−イｙ　ｐ　−７工ｏ　７１３’遺伝子、Ｘｂ−Ｘｂａ
ｌ、Ｈ−ＨｌｎｄＩＩｌ、Ｃ−Ｃ１ａ　ｌ、　Ｓ−８ａ
ｌｌ、　Ｐ　−５ｔ１０ 第２図は第１図および第４〜７図の方法で製造されたハ
イブリッドインターフェロン遺伝子のリボ蛋白質プロモ
ーターまたはラクトースプロモーター−オＲレータ−に
対して３′の方向の直後のコーディング領域のＮ末端を
示す。

第３図は第１図および第４〜５図の方法で縦列配列した
２個のＩＦＮ−Ｂ’遺伝子間のシストロン間領域を示す
。第２のＩＦＮ−Ｂ’遺伝子に対して５′の方向に１１
個の塩基対を介した太い棒線で示された部分がリポソー
ム結合部位である。第２のＩＦＮ−Ｂ’遺伝子に対する
開始コドンは細い棒線で示す。

第４図は２個の連鎖したＩＦＮ−Ｂ／遺伝子を含むハイ
ブリッドプラスミドｐＮＬＯ１２の構成を示す。

ｐＮＬｏ　１１　はｐＮＬＯＯｌ　に類似するが、ただ
しｌａｃフロモーターオイレーター領域が除かれており
、このため転写がリボ蛋白質プロモーターのみによって
調節されておシ、従って転写は構成的になる。使用した
略語は以下のとおシである：１ｐｐｐ−リボ蛋白質プロ
モーター；Ｂ’　、Ｘｂ、Ｈ，Ｃ５Ｓ、ＰおよびＡｒは
第１図と同じ。

第５図は、３個の連鎖したＩＦＮ−Ｂ’遺伝子および４
個の連鎖したＩＦＮ−Ｂ’遺伝子をそれぞれ含むハイブ
リッドプラスミド ０２７　の構成を示す。使用した略語は第４図の場合と
同じである。

第（）図はハイブリッドプラスミドｐＮＬＯ２２　の構
成を示す。１）ＮＬＯ２２はＸｈｏｔ部位がリボプロテ
ィンプロモーターに対して５′の方向に位置することを
除いてｐＮＬＯｌｌ　に類似する。使用した略語は以下
のとおりである：Ｘｈ＝Ｘｈｏｌ　；残りは第４図の．
ｖａ合と同じである。

第７図はハイブリッドプラスミドｐＮＬＯ２４−１およ
びｐＮＬＯ２４−２の構成を示す。これらのプラスミド
はそれぞれ２個のプロモーター−遺伝子単位を含む。略
語は第６図の場合と同じである。

第８〜ＩＯ図は、本発明の自動的な読み取り方向整列の
観点を概略的に示したものである。

上記のように．本発明は同一の遺伝子数につき先行技術
の遺伝子工学により製造されたものよりも小さな全体的
寸法をもつ遺伝子工学的に製造されたハイブリッド核酸
配列に関する。ここで用いる“ハイブリッド核酸配列”
という語は選ばれたポリにプチド配列１個または２個を
コードする構造遺伝子を含み、かつ宿主生体をこの選は
れたポリ々プチド配列を産生ずるように形質転換させる
のに使用できる、遺伝子工学的に製造されたあらゆる型
の核酸配列を含むものとする。従ってこの語はハイブリ
ッドプラスミド 細胞の内生染色体に導入することができる交換可能な要
素、コスミ）゛（ｃｏｓｍｉｄ）などを制限なしに含む
ものとする。

ハイメリット核酸配列寸法の低下は、多数の縦列配列し
た遺伝子を、それぞれ宿主細胞によりｇ識される単一の
プロモーターおよび単一の転写ターミネータ−による調
節下に置くととＫよって達成される。先行技術によるハ
イブリッド核酸配列、特にハイプリツビプラスミトＳけ
そのプラスミドゝにより運ばれる構造遺伝子それぞれＫ
つき１個のプロモーターおよび１個の転写ターミネータ
−を含んでいた。本発明により証明されるようＫ、この
余分な配列を除き、こうして達成された全体的配列寸法
を実質的に節約することができる。

本発明により達成できる寸法低下の規模を示すものとし
て、プロモーター領域が長さ０．２３　Ｋｂをもち、目
的の構造遺伝子ならびＫそれに付随する翻訳開始および
終止部位が制限酵素法により１１Ｋｂの長さをもつ単位
として得られ、転写終止領域け１０Ｋｂの長さをもつも
のを考慮された。い。

これらの値媒後記の実施例で用いたプロモーター。

ヒト白血球インターフェロンの構造遺伝子、および転写
終止領域の長さに相当する値である。

先行技術により構成され、構造遺伝子のコピー２０１個
を含むハイフリット９核酸Ｏ己列はｎ　Ｘ　２．３３Ｋ
ｂの長さをもつであろう。これに対し同一数の遺伝子を
含むが本発明により構成される・・イノリッド核酸の遺
伝子配列Ｆｉ１．２３＋ｎＸ］、ＩＫｂの長さをもつで
あろう。これは（ｎ＋１）Ｘ１２３Ｋｂの節約、すなわ
ちｎ−２については１．２３Ｋｂ；ｎ−３については２
．４６Ｋｂ；　ｎ＝４については３、６９　Ｋｂの節約
などを表わす。極端な場合は、”ｎ“がきわめて大きく
なるのに伴って、先行技術による・・イブリッド核酸配
列は同一数の遺伝子に関する本発明の・・イブリッド核
酸配列の２倍以上の長さになるであろう（（ｎＸ２．３
３）／（１，２３＋ｎＸ１．１）→２１）。

構造遺伝子を運ぶ単位の長さをたとえは異なる組の制限
酵素または他の酵素、またはこの単位を構成するだめの
技術分野で既知の他の方法を用いてより小さくできるな
らば１節約度はいっそう大きくなるであろう。たとえば
構造遺伝子単位の長さを１．　Ｉ　Ｋｂから０．５６　
Ｋ’ｂに縮小することＫより、°ｎ“が大きな場合先行
技術による核酸配列の長さと本発明の核酸配列の長さと
の比は２１から３２に高まる。これは同一数の遺伝子に
つき本発明の・・イブリッド核酸配列は、先行技術の方
法で構成された場合にもつと思われる配列の長さの３分
の１以下の長さをもつことを意味する。

同ｉ遺伝子のコピーを多数含むノ・イブリッド核酸配列
を製造するほかに１本発明は単一のプロモーターおよび
単一の転写ターミネータ−の制御下にある一群の構造遺
伝子をもつ配列を製造するために使用することもできる
。この種の配列はこの配列に含まれる各、０１１　’プ
チドをコードする遺伝子の相対数に基づいて選はれた比
率で選はれたポリハプチト８を同時に産生ずるために用
いることができる。たとえは組合せにおいて相乗的治療
効果を生じる２種以上の異なるインターフェロン、たと
えは２柚以上のα−インターフェロンを産生しうる構造
遺伝子紮もつ・・イズリッド配列に構成することができ
る。２個の遺伝子それぞれの配列内にあるコピーの数を
調節することにより、製造される２種のインターフェロ
ンの相対量を希望に応じて変えることができる。望まし
い同時製造用途の他の例には生物活性分子の成分の同時
製造、たとえばインシュリンＡとインシュリンＢの製造
、免疫グロブリンの構成成分の製造などが含まれる。

本発明のハイノリラド核酸配列の製造は組合せられた場
合特に１）プロモーター領域；２）それぞれがリボンー
ム結合部位、翻訳開始部位および翻訳終止部位を含む構
造遺伝子コーディング領域、ならびに３）転写終止領域
を含む全体配列を生じる小配列（Ｓｕｂｅｅｑｕｅｎｃ
θ）を製造または選択する工程を伴う。

最も好都合な場合は、全体配列が一組のりゲート可能な
（ｌｉｇａｔａｂｌｅ）断片を調製または選択し、次い
でこれらの断片をリグート酵素（ｌｉｇａｔｉｏｎｅｎ
ｚｙｍｅ）　によりリグートしで希望する全体配列とな
すことによって構成される。この−組の断片はもちろん
それらの組合せによって実際に希望する全体配列が得ら
れるように選ばれなけれはならない。これらの断片は当
業者に既知の撞々の力欣で得られ、これには制限酵素お
よび遺伝子操作の分野で用いられる他の種々の酵素によ
るもの、ならひに部位特異性の変異誘発によるものが金
管れる。断片が得られるとこれらを各種の方法で、たと
えは当技術分野で知られている種々のリガービを用いて
互いにリグートさせることができる。

概念的に、本発明のノ・イブリッド核酸配列を構成する
ために使用できる最も簡単な一組の断片は下記のとおり
である。第１断片ニ一端にプロモーター領域および他端
に転写ターミネータ−をもち、この断片の読み取り方向
は転写ターミネータ−をもつ端からプロモーターへ向か
うものである；第２断片君）：各断片かリポソーム結合
部位、翻訳開始領域、構造遺伝子コーディング領域、お
よび翻訳終止領域をもち、各断片の読み取り方向はリポ
ソーム結合部位から翻訳終止領域へ向かうものである。

当業者には明らかであろうか、第１断片または伺加的な
別個の断片に複製の始点および選択的マーカーが含まれ
、これによりノ・イブリッド核酸配列か複製され、かつ
ノ・イブリッド配列により形質転換した宿主細胞を転換
していない宿主細胞から区別することができる。

各断片が適宜なりゲート可能な末端をもつと仮定すると
、第１断片と第２断片群とのリグーンヨンによって希望
する１プロモーターーー複数の構造遺伝子−一転写ター
ミネーター°の形をもつ最終配列が得られるであろう。

形は正しいであろうがｔ重々の断片の読み取り方向は必
すしもすべて整列してはいないかも知れない。この整列
の問題を解決することは本発明の成功にとって重要であ
るが、後記のようにこの問題は多数の方法で解決するこ
とができる。

上記の一組の断片から最終配列を構成することが概念的
には最も理解しやすく、かつ多くの場合本発明の核酸配
列の製造に使用できるが、他の場合には用いられる制限
酵素の型およびハイブリッド配列に取込まれる構造遺伝
子の供給源のため。

含量および含有されるものの配列の異なる断片を使用す
ることがより好都合であるかも知れない。

たとえは後記の実施例では下記の型の断片を使用した。

第１断片：特に転写ターミネータ−、プロモーターリポ
ソーム結合部位、および翻訳開始部位をもち、この断片
の読み取り方向は転写ターミネータ−から翻訳開始部位
へ向かうものである；第２断片群：特に翻訳開始部位、
希望する構造遺伝子のコーディング領域、翻訳終止部位
、およびリポソーム結合部位ｒもち、これらの断片の読
み取り方向は翻訳開始部位からリポソーム結合部位へ向
かうものである。

これらの断片のリグーションおよびそれらの読み取り方
向の整列によってこの場合も希望する”プロモーターー
ー複数の構造遺伝子−一転写ターミネータ−１の配列様
式が得られるが、この場合自身のリポソーム結合部位を
もつ遺伝子を含む断片よりもむしろ第１断片か第１栴造
遺伝子に対してのりポノーム結合部位？含み、ヤれそれ
の構造遺伝子断片は自身に対するよりもむしろ次の構造
遺伝子断片に対するリポソーム結合部位をもつ。

この配列様式の場合プロモーターと第１構造遺伝子に対
するコーディング領域との−１に余分の翻訳開始部位が
ある点に注目されたい。翻訳過程ｉ　＋１ボソ一ム結合
部位の後に現われる第１翻訳開始部位に反応すると思わ
れるので、第１禍造遺伝子により産生されるポ１１　Ｓ
プチドは第１翻訳開始部位の後および構造遺伝子のコー
ディング領域の前の領域に対応する若干の余分な開始ア
ミノ酸を含むであろう。同様に第１栴造遺伝子に関する
断片にはその翻訳終止部位の下流にリポソーム結合部位
が含１れるので、選はれた構造遺伝子により定められる
もの以外のポ１１　６プチビ配列が形質転換された宿主
によって産生されるｂ」能性かある。

当業者には明らかてあろうか、希望する“プロモーター
　−一複数の桐造遺伝子−一　転写ターミネータ−゛の
配列様式はここに記載したもの以外の各種の構造會もつ
断片をリグートすることによって達成できる。

上記のように複数の遺伝子をもつ／・イブリッド核酸配
列を単一のプロモーターおよび単一の転４ターミネータ
−の制御下に製造する際の決定的工程の１つは、各種の
断片？それらの読み取り方向がすべて同一の向きをもつ
ように整列されることである。この問題につき第８図で
概略的に説明する。

ランダム組み換えに関しては、結合する断片の数が増す
のに伴い、逆向きに配列する組合せの数は指数的に増大
する。たとえば２個の遺伝子については、両遺伝子が同
一の読み取り方向をもつ組み換え体をランダムに得る機
会は２回のうち１回である。３個の遺伝子については、
これは４回のうち１回に低下し；・１個の遺伝子につい
ては８回のうち１回になる。読み取り方向が整列した組
み換え体を選択することは、機能に基づいで、すなわち
宿主細胞を形質転換させ、希望する生成物をその遺伝子
に関する高いコピー数に対応して大量に産生ずる細胞を
捜すことによって行うことかできる。明らかにこれは冗
長なかつ時間のかかる方法である。

この知的でない方法よりも今日では、断片のりゲート６
」能な末端か適正に選はれているならは、配列が形成さ
れるのに伴って本質的に自動的に、ハイメリット核酸配
列を形作る断片の読み取シ方向を整列させうろことが見
出された。詳細には。

本発明のこの観点における一実施態様によれは（第９図
参照）、各断片にその上流末端に第１型のりゲート可能
な部位を与え、下流末端に第２型のりゲート可能な部位
を与える。第１および第２型のりゲート可能な末端は、
第１型自体の結合は第１制限酵素により開裂させること
ができ、第２型自体の結合は第２制限酵素により開裂さ
せることができるように選はれる。これらのりゲートｂ
」能な末端はさらに、第１型と第２型の結合は第１型ま
たは第２型の制限酵素のいずれによる開裂からも実質的
に免れるように選はれる。

リグート可能な末端をこのように選択した場合、読み取
り方向全整列させるために必要なすべては。

リグートした断片を第１および第２の制限酵素で処理す
ることである。この処理によって、整列方向の誤ったも
の（上流／上流＝第１型／・第１型、および下流／下流
＝第２型／第２型）は自動的に開裂し、一方適正な配列
（下流／上流−第２型／第１型）は本質的に影響を受け
ずに残される。断片をリグーション酵素ならひに第１お
よび第２制限酵素の双方で同時に処理するか、あるいけ
リグーション工程と整列工程を別個に（断片をまずリグ
ートさせ、次いで整列させ、次いで再びリグートさせる
など）行うことにより、整列処理を断片のリグーション
と同時に行うことかできる。

本発明に関しては第１および第２の型のりグー）　ＩＩ
Ｉ能な末端の種々な組合せを用いることかできる。特に
好ましい選択ＶＣは、制限酵素χｈｏ　ｌ　により形成
されたりゲート可能な末端と制限酵素５ａｌｌ　により
形成されたりグー）　ＯＪ能な末端、との組合せ、およ
び制限酵素Ｂｃｌ　ｌ　により形成されたりゲート可能
な末端と制限酵素ＢａｍＨ１により形成されたりゲート
可能な末端との組合せか含ま扛る。１１１者の場合整列
させるために用いられる第１および第２の制限酵素ＨＸ
ｈｏ＋　および５ａｌｌ　であり、一方後者の場合これ
らＨＢｃｌｌおよびＢａｍＨｌ　である。組合せのうち
いずれの員子も、すべての断片が同一の上流末端および
下流末端をもつ限り、上流または下流のりグー）　ＱＪ
能な末端として用いられる。本発明のこの観点を実施す
る際に使用できる他のりゲート可能な末端の組合せは、
現在知られているものおよび将来開発される可能性のあ
るものを含めて当業者には明らかであろう。

本発明の自己整列の観点における他の実施態様を第１０
図に示す。この場合２ｆ！Ｉｆの配列、すなわち第１の
構造遺伝子をもつ第１型と第２の構造遺伝子をもつ第２
型を組み合わせる。このためには、リグーション操作は
断片の読み取り方向の向きを制御するだけでなく、好ま
しくは結合する各型の断片の量をも制御すべきである。

第１０図に示した方法によれは、これらの目的が双方と
も達成される。

詳述すると、本発明のこの観点によれは、第１型の配列
（第１０図のｌ　ａ′）はその上流末端に第１型のりゲ
ート可能な末端Ｕ（たとえはＸｈｏ　＋）を、またその
下流末端に第２型のりゲートＯＪ能な末端Ｖ（たとえば
Ｂｃｌ　ｌ）をもつよう［４％成される。第１型および
第２型のりゲート可能な末端はそれら自体リゾートしう
る（ＵＵまたけＶＶ）が、相互にはリゾートしない（Ｕ
ＶＩ。いずれの場合も自己リグーションは適宜な制限酵
素Ｕおよび■、たとえばＸｈｏ　ＩおよびＢｃｌ　Ｉに
より開裂する。

同様に第２の型（ｂｌはその上流末端に第３型のりゲー
ト可能な末端Ｖ′（たとえばＢａｍＨｌ）を、またその
下流末端に第４型のりグー）　ＯＪ能な末端Ｕ′（たと
えば５ａｌＩ　）をもつように構成される。この場合も
これらのりゲート可能な末端はそれら自体は、リゾート
しうるが相互にけりゲートできない。１５Ｊ　様に自己
リグ−ジョンは適宜な制限酵素Ｕ′およびＶ′、たとえ
ばＢａｍＨｌおよび５ａ１１　によって開裂される。

読み取りの方向をそろえること、および結合させる２捕
の相対量を制御することの２目的を達成するためには、
第１、第２、第３および第４型のりゲートＥＪ能な末端
は以下の関係にるる。すなわち第１型のりグー）ＥＪ能
な末端（Ｕ）　は第４型のりゲートＴ３Ｊ能な末端（Ｕ
′）とはりデートしうるが、第３型のりゲート可能な末
端（Ｖ勺　とけりゲートできず、第４型のりゲート可能
な末端とのリグーション（ＵＵ’）Ｖｉ第】、第２．第
３または第４の制限酵素のいずれＫよる開裂からも本質
的に免れる；第２型のりゲート可能な末端（Ｖ）　は第
３型のりゲート可能な末端（ｖ勺　とけりデートしうる
が、第４型のりゲート可能な末端（Ｕ′）とは連結でき
ず、第３型のりゲート可能な末端とのリグーション（ｖ
ｖ’）は第１．第２．第３または第４の制限酵素のいず
れによる開裂からも本質的に免れる。

第１０図に示すようにこれらの特性をもつりゲート可能
な末端に関しては、第１％第２．第３および第４の制限
酵素による処理と組み合わせたリガービによるリグーシ
ョンによって、自動的に読み取り方向がそろい、また第
１および第２の交互配列からなるハイブリッド配列（ａ
ｂａｂａｂ・・・）、すなわち各配列の制御された相対
量が得られる。

２ｆ１！の配列がそれぞれ構造遺伝子のコピー１個を含
む場合、ハイブリッド配列は本質的に等しい数の各遺伝
子を含むであろう。他方、これらの配列のうちの１つが
たとえばその構造遺伝子のコピー２個をもち、一方他の
配列が１個のコピーのみをもつならは、ノ・イブリッド
配列は本質的に第２遺伝子の２倍数の第１遺伝子をもつ
であろう。同様な直伝子の比率がこれらの配列のうちの
一方を２抽の形で、すなわち第１および第２のりゲート
可能な末端をもつ第１の形、および第３および第４の型
のりゲート可能な末端をもつ第２の形を供給することに
よって達成される。この場合、ハイブリッド配列には２
撞の形で供給された配列の隣接反復したものが含まれ、
従って平均するとこの配列がもつ遺伝子（１抽または２
抽以上）により多量含むであろう。当業者に明らかなよ
うに、このような方法を用いることにより希望するいか
なる遺伝子比率も達成することができる。

リグーションおよび読み取り方向の整列が終了すると、
このハイブリッド核酸配列はそのまま適宜な微生物をこ
れらの構造遺伝子により短められる生成物（ｌ抽または
２棟以上）を産生ずるように形質転換するのに使用でき
る。この楡の形質転換、これに続く転換した微生物の培
養および目的生成物の採取のだめの手法は当技術分野で
周知である。たとえば“分子のクローニング：実駁室用
手引き“、Ｔ、マニアチスら（コールド・スプリング・
ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・スプリング・・・
−バー、ニューヨーク（１９８２年））を参照されたい
。ノ・イブリッド配列に適した宿主にけ原核細胞および
真核細胞の双方が含まれる。

一般に宿主細胞はノ・イノリツｌ−゛核酸配列を構成す
る機能要素、すなわちプロモーター、転写ターミネータ
−、リポソーム結合部位、翻訳開始部位、および翻訳終
止部位を認識するものでなりれはならない。

本発明全以下の具体例によっていっそう十分に記述する
が、これは本発明全いかなる様式でも限定するものでは
ない。具体例においてはヒトインターフェロン遺伝子の
コピー４個までを単一のプロモーターおよび単一の転写
ターミネータ−の制御下に苫むハイブリッドプラスミド
を構成した。

比較のため、同一遺伝子を複数個含むが、たたし各遺伝
子がそれ自身のプロモーターおよびそれ自身の転写ター
ミネータ−をもつノ・イブリッドシラスミドも構成した
。各棟のプラスミドについて考察するために、同一遺伝
子のコピー複数個を１個のプロモーターおよび１個の転
写ターミネータ−の制御下に含むプラスミドａ″ホモポ
リシストロン性”と呼び、一方複数個のプロモーター−
遺伝子−ターミネータ−配列を含むものを１ポリモノシ
ストロン性１と呼ぶ。ここで１シストロンＩは構造遺伝
子ならひにこれに付随する翻訳開始および終止部位とい
うその通常の意味をもつ。

倒斜および方法 菌株およびプラスミド 大腸菌（Ｅ＋ｃｏｌｉ）　Ｋ　−１２株ＪＡ２２１（と
四Ｍ　＋　ｈｓｄ　Ｒ−ｒｅｃ　Ａ　Ｌｅｎ　Ｌａｃ　
Ｙ　ｔｒｐ）およびＪＡ２２１（μ咀Ｍ十巴Ｒ−ユＱシ
＋ｎＬａｃＹ■／ド′互慧ＩＱｌａｃＺ＋１ａｃＹ＋ｐ
ｒｏＡ＋ｐｒｏＢ＋）　を形質転換宿主として用いた。

クローニングビヒクルｐＩＮ−ｎ−Ａ３、ｐＩＮ　−ｔ
　−Ａ３（ｐＫＥＮＯ３７（Ａ３））、ｐＫＢ：Ｎ　Ｏ
３０およびｐｃｃｓ２６１　を本発明の新規なノ・イブ
１ｊッド核酸配列の製造に用いた。第１ビヒクルの構成
はＫ。

ナカムラおよびＭ、イノウニ（１９８２年）、　Ｊ、。

Ｖｏｌ、１．７７１−７７５に記載されている。第２お
よび第３ビヒクルの構成は米国特許出願第２２２，０１
０号および第２８ｆｉ０７０号明細書（それぞれ１９８
１年１月２日および］９８１年７月２３日出願、１９８
２年７月２８日に英国特許出願ＣＢ２，０９１，２６９
Ａ号として公表）に記載されている。第４ビヒクルの構
成は米国特許出願第４１８，５２１号明細書（１９８２
年９月１５日出願）に記載されている。これらの特許出
願明細書および参考文献の関係ある部分を参考としてこ
こに引用する。

ビヒクルｐｃＧｓ２６１に関しては、このプラスミドハ
白血球インターフェロン遺伝子（ＬｅＩＦＮ−Ｂ’、ま
たはＩＦＮα８′としても知られている）を酵母ガラク
トースプロモーターの制御下に酵母において発現させる
ために含む。これを構成する際には、インターフェロン
蛋白質の信号配列をコードすると考えられる塩基６９個
のＤＮＡ配列を除去し。

１個の翻訳開始コドンＡＴＧを代わりに入れた。

ゲラデルら（Ｄ、ゲラデル、Ｄ、レウング、Ｔ、ダル、
Ｍ、グロス、Ｒ，ローン、Ｒ，マツクカントゞリス、Ｐ
、シーバーダ、Ａ、ウルリツヒ、Ｅ、エルバーソンおよ
びＰ、グレー（１９８１）ネイチャー、２９０：２０−
２６参照）により報告されたＬｅＩＦＮ−Ｂ　のコーテ
ィング領域の核酸配列は以下の点を除いてこの白血球イ
ンターフェロン遺伝子に等しい。１個の塩基を削除し、
塩基を１２個離してから１個の塩基を導入する。これに
より９９〜１０２番目のアミノ酸残基をコードする配列
がＶａｌ−Ｌｅｕ−Ｃｒｙｓ−Ａｓｐから５ｅｒ−Ｃｙ
ｓ−Ｖａｌ　−ＭθｔｉＣ変化した。プラスミドｐＣＧ
Ｓ２６１を含む培養物ｉ、ｔＡ’ｒｃｃ　（１２３０１
パークローン・　ドライブ５０ツクフイル、マリ−ラン
ド）に寄託されている。これらの培養物は受託番号２０
６４４％菌株表示ＣＧＹ　１４４により同定され、コラ
ボレーテイブ・リサーチ社（ワルタム、マサチュセツツ
）により寄託されている。

プラスミドはタナ力およびワイスズルム（Ｔ。

タナ力およびＢ、ワイスプルム（１９７５）Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、ｅ　１２１　：３５４−３６２）
により報告された方法で単離された。

酵素 すべての制限酵素、Ｔ４　ＤＮＡＩ＋ガーゼおよびＤＮ
Ａｙｔリメラーゼｌ　フレナラ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片は
ニューイングランド・バイオ・ラボから得られた。細菌
性アルカリホスファターゼはワーシントン・シアグツス
ティック・システムズ社（フリーホールト’、　Ｎ、　
Ｊ、　）　から得られた。ヌクレアーゼ５１Ｖｉベーリ
ンガーーマンハイム（インディアナｙｌ＋ス、インディ
アナ）から得られた。

総溶解質の調製 アッセイすべきプラスミドを含む大腸菌ＪＡ２２１の細
胞１ｍｌを、アンピシリン５０μ９フ含有し一肉汁培地
中で増殖させた。誘導可能な糸（後記）については６　
０　０　ｎｍで０４の光学密度においてインプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトシド（　ＩＰＴＧ、ングマ）を最
終濃度２ｍＭで添加した。培養物を３７℃で１時間イン
キユイートシたのち細胞を沈降させ、Ｑ、５ｍＭフッ化
フェニルメタンスルホニル（ＰＭＳＦ　、シグマ）ｅ含
ｔｒ５Ｍ塩化グアニジン中（氷上）に、１０分間激しく
攪拌しながら再懸濁した。光学顕微鏡により破壊度％を
調べた。遠心分離したのち抽出液を寿た。構成性の系に
ついてＨ６００ｎｍで０５〜１０の光学密度において細
胞を採取した。

Ｈｅｐ−２細胞における水痘性口内炎ウィルス（Ｖｅｓ
ｉｃｕｌａｒ　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）の
細胞変性効果（ＣＰＥ）抑制を利用して抗ウイルス性の
アッセイを行った。インターフェロンの；Ｉ’［Ｈｔべ
てＮＩＨヒト白血球インターフェロン標準品に対比して
測定された。

ゲル電気泳動 ンヤープらにより報告されたようにアガロースゲル電気
泳動を行った。Ｐ、Ａ、ンヤープ、Ｂ、／ユナイダーお
よびＪ、サンプロープ（１９７３）、バイオケミストリ
ー１２：３０５５−３０６３を参照されたい。断片はゲ
ルからワットマン　ＮＡ−４５紙片上へのエレクトロエ
リューションにより単離され、断片ＶｉＮＦＴ緩衝液（
］　Ｍ、ＮａＣｌ。

ｏ、１　ｍＭ−ＥＤＴＡ、２０ｍＭ　トリＸ　ＨＣｌ　
、ｐ）（８）から回収された。回収率は９０％以上であ
ることが認められ、最終生成物のアガロース混入は認め
られなかった。

例１ ホモボリンストロン性ハイブリットゝプラスミビの製造 第１図に示した方法に従って、ｐＣＧＳ２６１　からの
Ｉ　Ｆ　Ｎ　−Ｂ’遺伝子を含むＬ　］　ＫｂのＨ１ｎ
ｄｌｌｌ断片を、のちに大腸菌外膜リボ蛋白質プロモー
ターおよびラクトースプロモーター−オペレーターの制
御下に大腸菌において発現させるためｐＩＮ−１１−Ａ
３クローニングビヒクルのＨ１ｎｄＩＩＩ音し位にクロ
ーニングした。得られたハイブリソビゾラスミト″はＬ
ｅＩＦ’Ｎ−Ｂ’が遺伝子のコピー１個を含み、ｐＮＬ
ＯＯＩ　と表示された。

同様に第１図に示すように、同一方向に連鎖した１、　
Ｉ　ＫｂのＨｉｎａ　ＩＩ＋ＩＩ２個を含む２．Ｔｏの
ＤＮＡ断片をｐＩＮ−ｎ−Ａ３　のＨｉｎｄ　ｍ部位に
クローニングした。このハイブリッドプラスハトゞはｐ
ＮＬＯＯ２と表示された。制限部位の検査によシｐＮＬ
ＱＱｌおよびｐＮＬＯ０２におけるＬｅＩＦＮ−Ｂ’遺
伝子の配列方向はＩＪ　ホ蛋白質プロモーターおよびラ
クトースプロモーター−オペレーターのものと同じであ
ると判定された。

第２図はｐＮＬＯＯｌ　およびｐＮＬＯＯ２に関してラ
クトースプロモーター−オペレーター要素のコード化領
域のＮ−末端を示す。この図かられかるようにインター
フェロンコード化領域の前に。

ｐＩＮ−ｕ−Ａ３ならひにＨｌｎｄ　ＩＩＩおよびＣ１
ａｌ　制限部位により導入された１０個のアミノ酸があ
る。

リポソーム結合部位は第１Ａ’ｒｃに対して５′の方向
に７個の塩基を介した位置である。ｐＮＬＯＯ２につい
ては第３図に示すように第１　ＬｅＩＦ’Ｎ−Ｂ’の翻
訳終止部位（ＴＧＡ）Ｈ第２ＬｅＩＦＮ−Ｂ’の翻訳開
始部位から塩基６３６個分離れている。第２ＬθＩ　Ｆ
　Ｎ−Ｂ／のＡＴＣに対して５′の方向に１２個の塩基
を介してリポソーム結合部位が存在する。

ｐＮＬＯＯｌ　およびｐＮＬＯＯ２は、これらが含むｌ
ａＣプロモーター−オペレーター要素のため双方とも誘
導可能な系である。発現のためにインデューサーを必要
としない構成性の系を得るために。

ｐＮＬｏ　１１　をｐＩＮ−１４３およびｐＣＧＳ２６
］から構成した。ｐＩＮ−１−Ａ３は１ａＣ−プロモー
タ−第２レータ−を欠く点を除いてｐＩＮ−ＩＩ−Ａ３
と全く同じである。第１図に示された方法に従って、１
）ＮＬＯＯＩをｐＩＮ−ＩＩ−Ａ３およびｐｃＧｓ２６
１から形成したと同じ方法でｐＮＬｏｌｌをｐＩＮ−１
−Ａ３およびｐｃＧｓ２６１から形成した。ｐＮＬＯＯ
ｌ　と同様にｐＮＬＯ］、］　はＬｅＩＦＮ−Ｂ’　の
コピー１個のみを含んでいる。

ＬｅＩＦ”Ｎ　−Ｂ’　のコピー２個を含む構成性の糸
を得るために、３．ＩＫｂの断片をｐＮＬＯＯ２の５ａ
１１消化およびＣｌａｌ部分消化により侍て、ｐＮＬＯ
１］の５ａｌｌおよびＣ１ａｌ消化により得た４、□Ｋ
ｂの断片と連結させた。得られたプラスハトをｐＮＬ０
１２　と表示した。第４図を参照されたい。制限部位マ
ツピングにより、２個のＬｅＩＦＮ−Ｂ’　遺伝子はｅ
ｐｐ　プロモーターと同じ配列方向にあることが認めら
れた。

ｐＮＬＯ］　］部を出発材料として用いて５　トリジス
トロン性およびテトランストロン性ＬｅＩＦＮ−Ｂ’遺
伝子を含むプラスミドを第５図に示すように構成した。

Ｃ１ａｌによる部分消化ののち、考えられる２個のＣｌ
ａｌ部位のうちいずれか一方で１回切断されることによ
り直線化されたｐＮＬＱｌ２　である。７１ＫｂのＤＮ
Ａ断片を単離し、ｐＮＬｏ　１２かも寿た１、　１．　
Ｋｂ　ｔＤ　ＬｅＩＦｌｉ−Ｂ’　を含むＣ１ａｌ断ハ
とリゲートさせた。得られたプラスミドけ３種の榊造を
もつｂ」能性かある。大腸菌ＪＡ２２１における形質転
換ののち、各クローンからのプラスミドを精製し、制限
酵素で調べた。３個のＬｅＩＦｈ−Ｂ’が同一方向にあ
るプラスミドをｐＮＬｏ２６　と表示した。４個のＬｅ
ＩＦＮ−Ｂ’　遺伝子が同一方向にあるものも同様に得
られた。

例２ ポリモノンストロン性ハイブリッドプラスミドの製造 ポリ七ノンストロン性ハイブリドプラスミビを構成する
ためには、プロモーターに対して５′の方向で、しかも
、転写終止部位に対して３′の方向に適宜な制限部位を
もつ必要があった。制限部位の性質は、これらが縦列反
復を形成し、縦列反復の相対的方向を制御し、生成した
縦列の寸法を調べるのに適したものであるように選ばれ
た。

この目的でｐＮＬｏ２２　を第６図に示す方法で構成し
た。このプラスミドはリボ蛋白質プロモーターに対し５
′の方向にＸｈｏ　］部位を、転写ターミネータ−に対
し３′の方向に５ａｌＨ部位をもつ。リボ蛋白質プロモ
ーターに対し５’Ｋ　Ｈｉｎｄ　Ｉ１１部位をもつｐＫ
ＥＮＯ３０を出発材料として用いた。ｐＫＥＮ０３０　
をＨｉｎｄ　ｍ制限酵素で線状化し、Ｓｌヌクレアーゼ
によりブランド（ｂｌｕｎｔ）末端化した。次いでχｈ
ｏｌリンカーをプラント末端リグーションにより付着さ
せ、Ｘｈｏ　ｌ開裂により接着末端（ｃｏｈｅｓｉｖｅ
　ｅｎｄ）が形成され、ＤＮＡをリグーンヨンにより再
閉環した。形質転換およびスクリーニングののち、得ら
れたプラスミドをＸｂａ　ｌおよび５ａｅＩで切断し、
得られた大型断片をｐＮＬＱ　１１から得た小型のＸｂ
ａ　］　−Ｓａ／　ｌ　断片にリゲートさせてｐＮＬｏ
２２を形成させた。Ｘｈｏ　ｈ部位以外は、ｐＮＬｏ２
２はｐＮＬＱｌ　１と全く同じである。

希望するポリ七ノンストロン性バイブリドプラスミドを
形成させるために、ｐＮＬｏ２２をＸｈｏ　１およびＳ
ａ／　ｌで切断し、得られた小型の断片を５ａｅＩで線
状化したｐＮＬＯＩＪ　Ｋリゲートした。

第７図を参照されたい。逆向きの配列をもつ、２抽のＥ
Ｊ能性のあるハイブリッドプラスミドをｐＮＬ０２４−
１およびｐＮＬｏ２４−２と表示した。Ｓａ／　１接鳥
末端を他のＳａｄ　１接層末端と結合させるとＳａ／！
１部位が再生され、一方Ｓａｄ　１接着末端とＸｈｏ　
＋接着末端を結合させると制限部位は生じないので、制
限断片の寸法を調べることによりｐＮＬ０２４−１を容
易ＫｐＮＬＯ２４−２から区別することかできた。２ｆ
！ＩｆのプラスミドのＳａｌ　１部位は異なる位置にあ
った。

ポリモノンストロン性バイブリドプラスミドｐＮＬＯ２
４−］　’！ｒ相当するホモポリンストロン性バイブリ
ドシラスミドと比較するために、ｐＩ″ＪＬＯ２２（第
６図参照）と同様にして、ただし出発物質としてｐＮＬ
Ｑｌ　１　の代わりにＩ）ＮＬＯＩ　２　を用いて。

他のホモポリシストロン性ハイブリッドプラスミド（ｐ
ＮＬｏ２３と表示）を構成した。

例３ 核酸配列の自動的な読み取り方向整列法事発明の読み取
シ方向を自動的に整列させる観点につき証明するために
、第６図に従って製造したｐＮＬｏ２２をＸｈｏ　Ｉお
よびＳａ／　１　で開裂し、２３Ｋｂの断片を単離し、
Ｔ４　リガービで自己リゲートさせ、Ｘｈｏ　■および
Ｓａ／　ｔで処理した。リグーンヨン混合物をゲル電気
泳動にかけた。６Ｋｂよりも大きなりＮＡ分子に相当す
る電気泳動バンドが溶出した。これをＳａｄ　ｌおよび
Ｘｈｏ　Ｉ制限酵素で処理し、混合物を再ひゲル電気泳
動にがけた。

電気泳動の結果は、５ａｄｌおよびＸｈｏ　ｌ処理によ
シグルパターンが変化しなかったことを示した。

この結果は、これらのＤＮＡ分子が本質的に１ΩＪ　−
配列方向に縦列整列した２、３Ｋｂの断片からなること
を示す。

例４ ホモポリンストロン性およびポリモノンストロン性ハイ
ブリッドシラスミドによシ製造したインターフェロンの
力価 各抽プラスミドを含む大腸菌細胞（ＪＡ２２１株）のイ
ンターフェロン活性をＨｅｐ−２細胞上の水痘性口内炎
ウィルスの細胞変性効果（ＣＰＥ）抑制により測定した
。

ホモポリンストロン系列のＩ）ＮＬＯＩＩ　（モノシス
トロン）、ｐＮＬＯ１２（ジンストロン）、ｐＮＬ０２
６（トリンストロン）、およびｐＮＬＯ２７（テトラン
ストロン）に関しては、インターフェロン活性はそれぞ
れ２．１０ＸＩＯ’　±７８２×１０３．５．０３Ｘ１
０　±Ｌ６４Ｘ１０　．６．８５ＸＩＯ上２゜６９Ｘｌ
Ｏ、および９．４６Ｘ１０５±３．１７ＸＩＯ’単位／
　ｒｔｔｌ　（細胞培養液）　／　Ｏ，Ｄ、。

すなわち相対比ｔ　ｏ　：　２．４　：　３．３　：　
４．５であった。

ｐＮＬＯ２２（モ／　ンｘトロン）およびｐＮＬＯ２３
（ジンストロン）系列に関しては、インターフェロン活
性はそれぞれ８．０４Ｘ１０　土４．６Ｘ１０’および
１．６０ＸＩＯ５±６．７Ｘ１０’　単位７ｍ１（細胞
培養液）　／　ＯｏＤ、　、すなわち１：］、９９であ
った。この比はｐＮＬＯｌｌ　とｐＮＬＯ１２のものに
近似するが、ｐＮＬＯ２２およびｐＮＬＯ２３系列の力
価は一貫してｐＮＬＯｌｌおよびｐＮＬＯＩ２系列の力
価よシも約３のファクターだけ高いことが認められた。

この差けｐＮＬＯ２２およびｐＮＬＯ２３プラスミド中
にＸｈｏ１部位が存在することによると考えられる。

ポリモノシストロン系（ジンストロン性）のプラスミド
であるプラスミドｐＮＬＯ２４−１は比較されるホモポ
リンストロン性プラスミドｐＮＬ０２３の発現度（１，
６０Ｘ１０５　±６．７Ｘ１０’単位／ＩＩｔｌ！（細
胞培養液）　／　Ｏ，Ｄ、　）と？’ｔ　ｌ”！同じ水
準の発現度（１，４７Ｘ１０５　上６゜２３Ｘ１．Ｏ’
単位／ｍｅ（細胞培養液）　／　Ｏ，Ｄ、　）をもつこ
とか認められた。

掘々のホモボリンストロン性およびボリモノンストロン
性のプラスミ）−′（特にインターフェロンＢ′遺伝子
２個以上を含むもの）を含む細胞について認められたイ
ンターフェロン力価は、エルバートンンらがＬｅＩＦＮ
−Ｂについて報告したものときわめて類似することが認
められた。ただしプロモーターから下流の第１構造遺伝
子により製造されたインターフェロンについてはアミノ
末端に９個の余分なアミノ酸がある点を留意すべきであ
る。

Ｅ、エルバートソン、Ｄ、レウング％Ｐ、ウニツク、Ｐ
、グレイおよびり、ゲラデル（１９８１）、１ヌクレイ
ツク・アンラド・リサーチ１．９ニア３１−７４１を参
照されたい。これら余分のアミノ酸を除去するといっそ
う高い力価が得られるであろう。

以上の結果を合わせると、ｌ）ホモポリシストロン系に
おいて遺伝子葉効果が起こること、および２）発現度は
比較しうるホモボリンストロン系およびポリモノシスト
ロン系、すなわちシラスミド当たり同一数の構造遺伝子
コピー？もつ糸についてはｔｌは等しいことが証明され
た。以上に詳述したように、これら２現象により２つの
矛盾する因子を最適なものにすることができる。すなわ
ち高いシラスミドコピー数および転換効率を維持するた
めに、プラスミド寸法を最小限に抑えるのと関連させて
シラスミド内のクローン化されん遺伝子のコピー数を最
大限にすることができる。要約するとホモポリシストロ
ン性の形態を採用することによシ、遺伝千振を犠牲にす
ることなくプラスミドの寸法を縮小することができる。

この柔軟度によシ、最高の生成物産生を潜るためにプラ
スばドに取り込ませる遺伝子の最適コピーｉを実験によ
り容易に確立することができる。

シストロン間領域の短縮により、以上の例に述べたより
もいっそう大きな充填密度を得ることができる。天然の
マルチンストロン性オＲロンの場合、シストロン間領域
は一般に２〜３百ないし数百の塩基対に及ぶ。Ｇ、Ｅ、
クリスチーおよびＴ。

プラント（１９８０）、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏ（？、
、１４２　：５１９−５３０．ならびにＥ、セルカーお
よびＣ。

ヤノフスキー（１９７９）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｄ
、。

１３０：１３５−１４３を参照されたい。帛３図に示す
ように、上記各側のプラスミドについては塩基対６３６
のンストロン間領域がある。従ってンストロン間領域の
塩基対６００以上がＢａ１３１消化または部位特異性変
異誘発などの方法で削除されるであろう。

本発明の特定の実施態様につき記述し、図示しだが、本
発明の精神および範囲から逸脱することなく変更をなし
うると鱗すべきである。たとえは上記以外の型の生成物
を産生させるためにデザインされた他の型のハイズリツ
ビ核酸配列を本発明の範囲内圧おいて作成することがで
きる。たとえはリポソーム結合部位を含むンストロン間
領域ケ。

全体的なプラスミド寸法を小さく保った状態で翻訳再開
始効率が最大限となるのに最適なものとすることができ
る。同様に、縦列配列した遺伝子をもつもの以外のプラ
スミドの割合を、生成物産生を高めるのに最適なものに
することができる。たとｌ−ｊハイブリッドプラスミド
にｐａｒ遺伝子が取り込まれた場合、安定性を犠性にす
ることなくプラスミドの寸法を拡大することができ、こ
れによりプラスミドが含みうる希望する遺伝子の総数を
増すことができる。

本発明により調製された微生物および組み換え核酸配列
はたとえばＡＴＣＣ（ロツクフイレ、マリーランビ）に
１９８４年１月２７日に寄託され、ＡＴＣＣ受託番号３
９５８９で表示される培養物により例示される。この培
養物は犬ｉｍＪＡ２２１株内へ移されたプラスミド’ｐ
ＮＬＯ２３に対応し、ｌ５ＥＯ２３と表示される。

【図面の簡単な説明】

ｆｉｌ１図にはＩ　Ｎ　Ｆ　−Ｂ／を含むＨ１ｎｄ口１
断片（１１Ｋｂ）の２個のコピーのうち一方または両方
を訪導可能な発現ビヒクルｐ工Ｎ−■−Ａ３にクローニ
ングする過程を概略的に示す。ｐＮＬＱＱｌ　は１個の
Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌ断片を、ｐＮＬＯＯ２は２個のＨ１ｎ
ｄｌｌｌ断片を縦列に含む。使用した略語は下記のとお
りである。ｇａｇｐ−酵母ガラクトースプロモーター、
Ｐ−ＰＯ−リポ蛋白質プロモーター＋ｌａＣプロモータ
ー−オーレータ−１Ａｒ　−アンピンリン抵抗性、Ｂ’
−インター７エｏｙＢ’遺伝子、　Ｘｂ−Ｘｂａ　１　
。 Ｈ−ＨｌｎｄｌＩＩ、Ｃ−Ｃｄａ　ｌ、５＝Ｓａｌ　ｌ
、Ｐ−Ｐｓｔ　ｌ。 第２図＃′ｉ第１図および第４〜７図の方法で製造され
たハイブリッドインターフェロン遺伝子のリボ蛋白質プ
ロモーターまたはラクトースプロモーター−オーレータ
−に対し直後３′の暗号化領域のＮ末端を示す。 第３図は第１図および第４〜５図の方法で縦列配列した
２個のＩＦＮ−Ｂ’遺伝子間のンストロン間領域を示す
。第２のＩＦＮ−Ｂ’遺伝子九対し５′にある１１個の
塩基対が、太い棒線で示されたリポソーム結合部位であ
る。第２のＩＦＮ−Ｂ’遺伝子に対する開始コドンは細
い棒線で示す。 第４図＆′ｉ２個の連鎖したＩＦＮ−Ｂ’遺伝子を含む
ハイブリッドプラスミド ｐＮＬＯｌ　ｌ　はｐＮＬＯＯＩ　に類似するが、ただ
しｉａｃプロモーターオイレーター領域が除かれており
、このため転写が１１　ｚ蛋白質プロモーターのみによ
って調節されており、従って転写は構成性になる。使用
した略語は以下のとおシである：　６ｐｐｐ−リボ蛋白
質プロモーター；Ｂ’　、Ｘｂ、Ｈ，Ｃ１ｓ、ｐおよび
Ａｒは第１図と同じ。 第５図は、３個の連鎖したＩＦＮ−Ｂ’遺伝子および４
個の連鎖したＩＦＮ−Ｂ’遺伝子をそれぞれ含むハイブ
リッドプラスミド ０２７　の構成を示す。使用した略語は第４図の場合と
同じである。 第６図はハイブリッドプラスミド 構成を示す。ｐＮＬＯ２２　けＸｈｏ　１９位がリボ蛋
白質に対し５′に位置する点を除いてｐＮＬＯＩＩ　に
類似する。使用した略語は以下のとおりである：Ｘｈー
Ｘｈｏｌ；残りは第４図の場合と同じである。 第７図はハイブリッドプラスミド’ｐＮＬＱ２４−１お
よびｐＮＬＯ２４−２の構成を示す。これらのプラスミ
ドはそれぞれ２個のプロモーター−遺伝子単位を含む。 略語は第６図の場合と同じである。 第８〜１０図は、本発明の自動的な読み取り方（外５名
） 特閘昭ＧＯ−１９９３８７（１６） ＦＩＧ、　３ 第１頁の続き ■Ｉｎｔ、ＣＩ、’　識別記号　庁内整理番号Ｃ１２Ｒ
１：１９）　６７６０−４Ｂ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （＋）選ばれたポリペプチド１種または２種以上を宿主
   細胞内で産生させるために用いるハイブリッド核酸配列
   であって、一方の末端における。 宿主細胞により認識されるプロモーター配列；他の末端
   における、宿主細胞により認識される転写ターミネータ
   −；ならびにプロモーター配列と転写ターミネータ−配
   列の間における：リボソーム結合部位、翻訳開始部位、
   上記の選ばれたボリハプチド１種または２種以上のうち
   の１棟用のコーデイ／グ領域、および翻訳終止部位を含
   むが、プロモーター配列または転写ターミネータ−配列
   は含まない第１領域；ならびにそれぞれがリボソーム結
   合部位、翻訳開始部位、−上月ｉ：８の選ば才ｔたｓＹ
   す投プチド１柚もしくは２柚以」二のうちの同一かもし
   くは異なるもの用のコーディング領域、および翻訳終止
   部位を含むが、プロモーター配列または転写配列は含ま
   ない第２領域１または２以上からなり；プロモーター配
   列、転写終止配列、第１領域およびそれぞれの第２領域
   の読み取り方向が同一の配列方向をもつハイノリラド核
   酸配列。 （２）選ばれたホリ梗プチド１棟または２種以上のうち
   少なくとも１棟はヒト白血球イ／ターフエロンがもつ免
   疫学的または生物学的活性を示す、特許請求の範囲第１
   項に記載の・・イノリッド核酸配列。 （３）特許請求の範囲第１項に記載の・・イブリント核
   酸配列を含む形質転換された宿主細胞。 （４）　特許請求の範囲第３項に記載の形質転換された
   宿主細胞により産生されるポリｇプテトゝもしくは断片
   およびそれらの誘導体。 （５）微生物内で選ばれたボｌ）　Ｓプチド１個または
   ２個以上を合成するための方法であって、（ａ）　一方
   の末端における。微生物により認識されるプロモーター
   配列；他の末端における。 微生物により認識される転写ターミネータ−；ならびに
   プロモーター配列と転写ターミネータ−配列の間におけ
   る：リボンーム結合部位、翻訳開始部位、上記の選ばれ
   たボ１％プチド１棟または２種以上のうちの１橿用のコ
   ーデイ／グ領域、および翻訳終止部位を含むが、プロモ
   ーター配列または転写ターミネータ−配列は含まない第
   １領域；ならびにそれぞれがリボノーム結合部位、翻訳
   開始部位、上記の選ばれたポリ４プチド１穐もしくは２
   種以上のうちの［Ｐｌ」−かもしくは異なるもの用のコ
   ーデイ／グ領域、および翻訳終止部位を含むが、プロモ
   ーター配列または転写配列は含まない第２領域ｌまたは
   ２以上からなり；プロモーター配列、転写終止配列、第
   １領域およびそれぞれの第２領蛾の読み取り方向が同一
   の配列方向をもつハイズリラド核酸配列を用いて微生物
   を形質転換させ；（ｂｌ　形質転換された微生物を培養
   し；そして （ｃ）　上記の選ばれたボＩＪ−？ゾチド１種または２
   種以上を採取する 工程からなる方法。 （６）選ばれたｙｐ　ＩＪ−？ゾチド１種または２種以
   上のうち少なくとも１種はヒト白血球インターフェロン
   がもつ免疫学的または生物学的活性を示す、特許請求の
   範囲第５項に記載の方法。 （力　特許請求の範囲第５項に記載の方法により産生さ
   れるポリにプチドもしくは断片およびそれらの誘導体。 （８）選ばれたポリ４プチド１穐または２１以上をコー
   ドする領域が縦列配列し、１個の共通のプロモーター配
   列および１個の共通の転写ターミネータ−配列の制御下
   に置かれているノ・イズリツビ核酸配列の製法であって
   。 （ａ）　リグート可能な末端をもつプロモーター配列ま
   たは転写ターミネータ−配列を含まず、（１１選ばれた
   ポリペプチド１棟もしくは２　ｒｉｍ以上をコードする
   領域；（２）翻訳開始部位；（３）翻訳終止部位：およ
   び（４）リボンーム結合部位を含む第１核酸配列を調製
   または選択し； （ｂ）　第１核酸配列をリグートさせて、リグート可能
   な末端をもちかつ上記の選ばれたポリ４プチド１穐また
   は２棟以上をコードする縦列配列を含む第２核酸配列を
   形成させ； （Ｃ）　リグート可能な末端をもちかつプロモーター配
   列および転写ターミネータ−配列を含む第３核酸配列を
   調製または選択し； （ｃｌ）　第２核酸配列を第３核酸配列とリグートさせ
   て第４核酸配列を形成させ；そして（ｅｌ　上記の選ば
   れたポリ４プチド１穐もしくは２種以上をコート９する
   領域のそれぞれ、翻訳開始部位のそれぞれ、翻訳終止部
   位のそれぞれ、リボノーム結合部位のそれぞれ、プロモ
   ーター配列、および転写終止配列が同一の読み取り方向
   をもつ第４核酸配列を選択する 工程からなる方法。 （９）第４核酸配列を選択する工程が 一方の末端に第１型のりゲートしうる末端をもち、他方
   の末端に第２型のりゲートしうる末端をもつ第１核酸配
   列を調製または選択し、第１核酸配列の読み取り方向は
   第１型のりゲート可能な末端から第２型のりグー）ＥＪ
   能な末端へ向かうものであり、第１型のりゲート可能な
   末端２個の連結は第１制限酵素による開裂に対し感受性
   であり、第２型のりゲート可能な末端２個の連結は第２
   制限酵素による開裂に対し感受性であり、第１型のりゲ
   ートｏＪ能な末端と第２型のりゲート可能な末端との連
   結は第１または第２制限酵素のいずれによる開裂に対し
   ても実質的に感受性でなく；そして 第２核酸配列を第１および第２制限酵素で処理する 工程を含む、特許請求の範囲第８項に記載の方法。 ＱＯＩ　第４核酸配列を選択する工程が一方の末端にお
   いて第１型のりグー）　０１能な末端をもち、他方の末
   端において第２型のりゲ−）　ｌ−Ｊ能な末端をもつ第
   ３核酸配列を調製または選択し、第３核酸配列の読み取
   り方向が第１型のりゲート可能な末端から第２型のりゲ
   ート可能な末端へ向かうものであり；そして第４核酸配
   列を第１および第２の制限酵素で処理する 追加工程を含む、特許請求の範囲第９項に記載の方法。 Ｑｌ）　選ばれたポリＳブチ１１棟または２種以上のう
   ち少なくとも１梅はヒト白血球インターフェロンがもつ
   免疫学的または生物学的活性を示す、特許請求の範囲第
   ８項に記載の方法。 Ｏｚ　核酸配列をそれらの読み取り方向が同一の向きを
   もつように結合させる方法であって。 （ａ）　一方の末端に第１型のりゲート可能な末端をも
   ち、他方の末端に第２型のりゲート可能な末端をもつ配
   列を調製または選択し、配列の読み取り方向は第１型の
   りゲート可能な末端から第２型のりゲート可能な末端へ
   向かうものであり、第１型のりゲート可能な末端２個の
   連結は第１制限酵素による開裂に対し感受性であり、亮
   ２型のりグー）　ＯＪ能な末端２個の連結は第２制限酵
   素による開裂に対し感受性であり、第１型のりゲート可
   能な末端と第２型のりゲート可能な末端との連結は第１
   または第２の制限酵素のいずれによる開裂に対しても実
   質的に感受性でなく； （ｂ）　上記配列をリグートさせ；そして（ｃ）　リグ
   ートされた配列を第１および第２制限酵素で処理する 工程からなる方法。 （１３１第１型の核酸配列を第２型の核酸配列と結合さ
   せて、第１および第２配列の読み取り方向が同一の向き
   をもち、かつ第１および第２配列の数がほぼ等しい）・
   イブリッド配列を形成する方法であって、 （ａ）一方の末端に第１型のりゲート可能な末端をもち
   、他方の末端に第２型のりゲート可能な末端をもつ第１
   型配列を調製または選択し、配列の読み取り方向が第１
   型のりグー）　１＝Ｊ能な末端から第２型のりゲート可
   能な末端へ向かうものであり、第１型のりゲートＯＪ能
   な末端は第２型のりゲート可能な末端とは実質的にリグ
   ートできず、第１型のりゲート可能な末端２個の連結は
   第１制限酵素による開裂に対して感受性であり、第２型
   のりゲート可能な末端２個の連結岐第２制限酵素による
   開裂に対して感受性であり； 価）一方の末端に第３型のりゲート可能な末端をもち、
   他方の末端に第４型のりゲート可能な末端をもつ第２配
   列を調製または選択し、配列の読み取り方向は第３型の
   りゲート可能な末端から第４型のりゲート可能な末端へ
   向かうものであり、第３型のノグート可能な末端は第４
   型のりグー）　１＝Ｊ能な末端とは実質的にリケ゛−ト
   できず、第１型のりゲート可能な末端は第３型のりゲー
   ト可能な末端とけ実質的にリグートできず、第２型のり
   ゲート可能な末端は第４型のりゲート可能な末端とは実
   質的にリグートできず、第３型のりゲート可能な末端２
   個の連結は第３制限酵素による開裂に対して感受性であ
   り、第４型のりグー）ｏＪ能な末端２個の連結は第４制
   限酵素による開裂に対して感受性であり、第１型のりゲ
   ート可能な末端と第４型のりゲート可能な末端との連結
   、および第２型のりゲート可能な末端と第３型のりゲー
   ト可能な末端との連結は第１、第２、第３または第４制
   限酵素のいずれによる開裂に対しても実質的に感受性で
   なく； ｆｃ）　第１型および第２型の配列を相互にリグートさ
   せ；そして （ｄ）　１７ゲートした配列を第１、第２、第３および
   第４制限酵素で処理する工程からなる方法。