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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Diese Erfindung betrifft das Gebiet
der Gentechnik, wie auf bakterielle Wirte angewandt. Insbesondere betrifft
die Erfindung Expressionssysteme zur Produktion von Proteinen in
bakteriellen Wirten.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Das Aufkommen der rekombinanten DNA-Technologie
hat die Produktion von verschiedenen natürlich vorkommenden und synthetischen
Proteinen in Organismen wie etwa Bakterien, Pilzen, Hefe und Säugerzellen
ermöglicht.
Im Allgemeinen umfasst sie das Einbringen von Genen, die für ein gewünschtes
Protein kodieren, in einen Wirtsorganismus, und die Verwendung der
zellulären
Maschinerie des Wirts, um das Gen zu exprimieren.
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Rekombinante DNA-Technologie entwickelt
sich kontinuierlich weiter, um eine Produktion von Proteinen in
kommerziell akzeptablen Ausbeuten zu erreichen. Ein limitierender
Faktor bei der rekombinanten Produktion von Proteinen ist die Rate,
mit der das Gen, welches für
das gewünschte
Protein kodiert, exprimiert wird. Insbesondere wurde herausgefunden,
dass die Promoterregion eines Gens im Transkriptionsverfahren der
Genexpression kritisch ist. Ein effizienter Promoter, wie etwa der
in E. coli vorkommende trp Promoter, bindet fest an DNA-gerichtete
RNA-Polymerase,
wobei die Transkription des Gens mittels Erzeugung von mRNA initiiert
wird. Ein weniger effizienter Promoter, wie etwa der lac Promoter,
bindet weniger fest an RNA-Polymerase, was zu einer niedrigeren
Rate der mRNA-Erzeugung führt.
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Der trp Promoter wurde bei der Produktion
von heterologen Proteinen in breitem Umfang verwendet, aufgrund
seiner Fähigkeit,
die Transkription effizient zu initiieren. Trotz seiner Effizienz
besteht ein inhärenter Nachteil
des trp Promoters darin, dass er nicht leicht kontrolliert werden
kann. Spezifisch ist der trp Promoter nicht vollständig reprimierbar,
d. h. er kann die Transkription antreiben bevor der Wirt in Kultur
zu einer für
die Proteinproduktion geeigneten Phase angezüchtet worden ist. Ein anderer
in breitem Umfang verwendeter Promoter ist lac, der weniger effizient
ist als trp, aber besser kontrolliert werden kann.
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Um effizientere Promotoren zu entwickeln,
wurden funktionelle Komponenten von unterschiedlichen Promotoren
kombiniert, beispielsweise die in US Patent Nr. 5,362,646 beschriebenen.
In einem Beispiel wurden Teile des Bakteriophage T7-Promoters A1 (PA1) mit zwei
lac Operatoren kombiniert. Spezifisch wurden die Abstandhalterregion
zwischen der so genannten -35 und -10 Region des Bakteriophage T7-Promoters
durch eine modifizierte lac Operatorsequenz ersetzt, und zur Kontrolle
des resultierenden Promoterhybrids wurde stromabwärts ein
zweiter lac Operator eingefügt.
Es wurde festgestellt, dass das resultierende Promoter/Operator-System,
das in den kommerziell erhältlichen
pUHE Plasmiden vorhanden ist, nach Induktion die Transkription effizient
initiiert, und vor Induktion dennoch in hohem Maße reprimiert ist.
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Ein anderer, von Tsung et al. (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87:5940) beschriebener Promoter umfasst
die effiziente trp -35 Region, die -10 Region aus dem sehr effizienten
IppP-5 Promoter (eine Variante des Ipp Promoters) und einen vom
lac Promoter abgeleiteten Abstandhalter. Es ist gezeigt worden,
dass dieser Promoter derart stark effizient ist, die Transkription
zu initiieren, so dass er zu Zelllethalität führt.
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Obwohl verschiedene Promotoren verbesserte
Proteinausbeuten in mikrobiellen Wirten ermöglicht haben, besteht immer
noch ein Bedarf an Promotoren, welche die Produktion von kommerziell
wertvollen Proteinen effizienter antreiben.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Gemäß einem Aspekt der vorliegenden
Erfindung wird ein neues rekombinantes DNA-Konstrukt bereitgestellt,
welches zur Expression eines Proteins in einem bakteriellen Wirt
geeignet ist. Das Konstrukt umfasst eine für ein Protein kodierende Region,
welche operativ mit einer Kontrollregion verknüpft ist, umfassend einen Promoter
mit der nachfolgenden DNA-Sequenz:
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KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 veranschaulicht
die Nukleotidsequenz und eine schematische Darstellung einer Expressionskassette,
welche rekombinante DNA-Konstrukte gemäß der Erfindung umfasst;
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2 veranschaulicht
Nukleotidsequenzen von erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten, umfassend eine Promoter-
und Operator-Region.
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung stellt
DNA-Sequenzen bereit, welche geeignet sind, die DNA-Expression in bakteriellen
Wirten wie etwa E. coli mit hoher Effizienz anzutreiben. Die Verwendung
von Expressionsvektoren, welche diese Sequenzen umfassen, stellt
ein wertvolles Mittel bereit, um eine erhöhte Produktion von exprimierbaren
Proteinen, sowohl endogenen als auch heterologen, zu erreichen.
Gemäß einem
Aspekt der Erfindung wird ein neues rekombinantes DNA-Konstrukt
bereitgestellt, welches zur Expression eines Proteins in einem bakteriellen
Wirt geeignet ist. Das Konstrukt umfasst eine für das Protein kodierende Region,
welche operativ mit einer Kontrollregion verknüpft ist, umfassend einen Promoter,
um die Expression des Proteins in dem Wirt zu ermöglichen,
wobei der Promoter die nachfolgende DNA-Sequenz umfasst:
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Diese Promotoren haben eine -35 Region
der Konsensussequenz TTGACA und eine -10 Region der Sequenz TATACT
gemeinsam. Die Abstandhaltersequenz, d. h. die dazwischen liegende
Sequenz von 18 Basen, ist erfindungsgemäß die Sequenz ACATAAAAAACTTTGTGT.
Demgemäß stellt
die Erfindung DNA-Konstrukte bereit, bei denen eine für ein gewünschtes
Protein kodierende DNA operativ unter Expressionskontrolle mit einem
Promoter der Sequenz 5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3' verknüpft ist.
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Der Fachmann wird erkennen, dass
die erfindungsgemäßen Promotoren
ein essentielles Element der erforderlichen Komponenten darstellen,
innerhalb der funktionellen Kontrollregion, um die Expression anzutreiben.
Darüber
hinaus können
diese Promotoren unter Verwendung von Standardverfahren in jeden
geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden, der in gramnegativen
oder grampositiven Bakterien replizieren kann. Noch spezifischer,
und um eine Kontrollregion zur Genexpression zu bilden, werden die
vorliegenden Promotoren zusammen mit anderen Kontrollelementen eingebaut,
die typischerweise für
diese Expression erforderlich sind, umfassend eine Ribosomen-Bindungsstelle,
und in erfindungsgemäßen Ausführungsformen, einen
Operator, welcher derart wirkt, so dass er die Promoterfunktion
kontrolliert.
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Diese Komponenten sind notwendigerweise
relativ zueinander derart angeordnet, wie erforderlich, damit Genexpression
auftritt, gemäß gut verstandener
Prinzipien der Genexpression.
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In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst
die Kontrollregion des Konstrukts einen Operator. Operatoren, die
verwendet werden können,
umfassen diejenigen, die direkt durch chemische Induktoren induzierbar
sind, und diejenigen, wie etwa lac, die de-reprimierbar sind. Beispiele
von geeigneten Operatoren umfassen die E. coli Lactose-, Galactose-,
Tryptophan- und Tetracyclinoperatoren (siehe Miller et al., "The Operon", Cold Spring Harbour
Laboratory, 1980, und Hillen et al., J. Mol. Biol. 1984, 172:185).
Bevorzugte Operatoren sind in hohem Maße reprimierbar, so dass die
Expression der für
das Protein kodierenden DNA kontrolliert werden kann. In einer spezifischen
Ausführungsform
umfasst die Kontrollregion den lac Operator (1), welcher eine Expression von dem Promoter
in der Abwesenheit des synthetischen Induktors Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
(IPTG) und des natürlichen
Induktors Lactose verhindert.
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Die Kontrollregion umfasst weiter
eine Sequenz für
eine Ribosomen-Bindungsstelle (RBS), um die Bindung von Ribosomen
an das mRNA-Transkript zu erleichtern und dadurch die Translation
der kodierenden Region der RNA, wodurch das Protein erzeugt wird,
zu initiieren. Geeignete Ribosomen-Bindungsstellen umfassen lac
und Bakteriophage T5.
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In einer bevorzugten Ausführungsform
ist die RBS eine von der Bakteriophage T5-RBS abgeleitete Sequenz mit der Sequenz
5'-ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC-3'.
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Die Kontrollregionen von erfindungsgemäßen Konstrukten
sind operativ mit einer für
ein endogenes oder ein heterologes Protein kodierenden Region verknüpft. Der
Begriff "heterologes
Protein" bezeichnet
ein Polypeptid oder Protein, das obwohl es nicht natürlich von
dem Bakterienwirt produziert wird, von diesem Wirt exprimiert wird,
wenn er geeignet mit DNA, die für
das Protein kodiert, transformiert ist; genomische DNA, cDNA und
synthetische DNA können
verwendet werden um den Wirt zu transformieren. Proteine, die unter Verwendung
des hierin beschriebenen Systems produziert werden können, umfassen,
sind aber nicht beschränkt
auf Hormone, wie etwa Parathyroidhormon (PTH), Glucagon oder Fragmente
davon und verwandte Peptide wie etwa GLP-1 und GLP-2; Wachstumsfaktoren
wie etwa epidermaler Wachstumsfaktor (EGF); und Lymphokine wie etwa
Interleukin-6 und -8 (IL-6, -8). Um die Isolierung der authentischen
Form des Proteins, d. h. das Protein ohne einen zusätzlichen
N-terminalen Met-Rest, zu erleichtern, können auch Fusionsproteine produziert
werden, die nach der Expression gespalten werden. Beispielsweise
kann einer für
ein interessierendes Protein kodierende DNA eine DNA vorangehen,
die für
ein Signalpeptid, wie etwa das äußere Membranprotein
ompA von E. coli, kodiert. In diesem Fall erzeugt das exprimierte
Gen ein Fusionsprotein, das ein N-Met enthaltendes ompA Signalpeptid,
gefolgt von dem gewünschten
Protein, umfasst. Das Signalpeptid schleust das Fusionsprotein durch
die Intermembran des Bakteriums, wo das Signalpeptid abgespalten
wird. Andere Signalpeptide, die verwendet werden können, umfassen
alkalische Phosphatase, wärmestabiles
Enterotoxin II aus E. coli und Protein A aus Streptococcus. Alternativ
kann ein Fusionsprotein synthetisiert und in einem separaten Verfahren
gespalten werden um das gewünschte
Protein zu erzeugen. Beispielsweise kann Glutathion-S-Transferase (GST)
mit Thrombin oder Faktor Xa von einem gewünschten Protein abgespalten
werden.
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In einer spezifischen Ausführungsform
der Erfindung umfasst die kodierende Region DNA, die für humanes
PTH kodiert, dessen Aminosäuresequenz
von Hendy et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, 78:7365) beschrieben
worden ist. In den hierin beschriebenen Beispielen ist die für PTH kodierende
DNA-Sequenz direkt und im Leseraster an DNA gekoppelt, die für das ompA
Signalpeptid kodiert.
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Die in 1 gezeigten
bevorzugten rekombinanten DNA-Konstrukte, mit dem Ipp oder dem lacUV5 Abstandhalter,
wurden aus einzelsträngigen
Oligonukleotiden erzeugt, die mittels der Phosphoamidit-Methode synthetisiert
worden waren. Der Gel-gereinigte Strang, umfassend die Sequenzen
von der Xhol zu der EcoRl Restriktionsstelle wurde danach als ein
PCR-Anfangstarget verwendet und wurde mittels PCR zu einem doppelsträngigen DNA-Fragment
amplifizien, unter Verwendung von komplementären einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden,
die spezifisch an das Ende entweder der gezeigten Anfangsoligonukleotidsequenz
oder des komplementären
Strangs hybridisierten. Somit werden die Konstrukte hergestellt
unter Verwendung von Standard-Gensynthese-Methodik, wie beispielsweise
von Maniatis et al. ("Molecular
Cloning", Cold Spring
Harbour Laboratories, 1982) und Innis et al. ("PCR Protocols, A Guide to Methods and
Applications") beschrieben.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der
Erfindung werden Expressionsvektoren bereitgestellt, die zur Herstellung
von Bakterienwirtszell-Transformanten, welche ein rekombinantes
DNA-Konstrukt gemäß der Erfindung
umfassen, geeignet sind. Erfindungsgemäße DNA-Konstrukte können mittels
etablierter Techniken als eine "Kassette" in einen Vektor,
bevorzugt einen Plasmidvektor eingebaut werden. Im Allgemeinen wird
ein Vektor an Restriktionsstellen gespalten, die Restriktionsstellen
an jedem Ende der Kassette entsprechen. Die Kassette wird danach
durch Ligieren der Enden an die komplementären gespaltenen Stellen des
Vektors eingebracht.
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Obwohl Vektoren auf Basis von Bakteriophagen
verwendet werden können,
sind Plasmidvektoren, wie etwa pBR322 und die pUC Plasmidreihe bevorzugt.
Nach dem Einbau in einen geeigneten Vektor kann das resultierende
Plasmid in einem Wirt amplifiziert werden, um ausreichende Mengen
für die
nachfolgende Klonierungsarbeit bereitzustellen. Es wird erkannt
werden, dass die für
das ausgewählte
Protein kodierende DNA günstig
in das Plasmid mit mehreren darauf bereitgestellten Klonierungsstellen
eingebracht wird, unter Verwendung von Standard-Klonierungs/Ligierungsmethoden.
Ein Plasmid wird notwendigerweise auch einen Replikationsursprung
umfassen, und höchst
wünschenswert
auch einen Marker umfassen, wie etwa das Ampcillin-oder Tetracyclin-Resistenzgen,
um eine Selektion von transformierten Zellen zu ermöglichen.
Es wird ebenfalls erkannt werden, dass Translationsstopcodons in
allen drei Leserastern und eine korrekt positionierte Transkriptionsterminationsregion
für eine
zufrieden stellende Expression des gewünschten Proteins erforderlich sein
werden. Geeignete Transkriptionsterminatoren umfassen die Transkriptionsterminatoren
der E. coli Gene trpA, thr, his und phe.
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Sobald eine für ein gewünschtes Protein kodierende
DNA in den Vektor eingebaut worden ist, wird ein ausgewählter Bakterienwirt
damit transformiert, unter Verwendung von Calciumchlorid-vermittelten
Standard-Transformationstechniken. Geeignete Bakterienwirte umfassen
gramnegative Bakterien wie etwa E. coli und Salmonella. Bevorzugt
ist der Wirt ein kommerziell erhältlicher
E. coli Stamm, und am meisten bevorzugt JM101 und Derivate davon.
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Wenn die Kontrollregion des DNA-Konstrukts
den lac Operator umfasst, wie nachstehend hierin ausführlicher
beschrieben, sollte der transformierte Wirtsstamm fähig sein,
das lacl-Produkt zu exprimieren, und wünschenswert in manchen Fällen zu überproduzieren,
so dass die Promoterfuktion und somit die Expression des Proteins
reguliert werden kann. Das Erfordernis einer lacl-Überproduktion
von manchen Transformanten kann gemäß einer Ausführungsform
der Erfindung erreicht werden durch die Verwendung von Wirten, die
bereits das für
eine Überproduktion
des lacl-Produkts verantwortliche laclq-Gen
beinhalten. Lacl-überproduzierende
E. coli-Stämme,
die als Wirte verwendet werden können,
umfassen die von Clontech Laboratories Inc., Kalifornien, USA, erhältliche
JM-Reihe von Stämmen.
Spezifische, zur Verwendung geeignete Wirtsstämme umfassen JM101, JM105 und
JM107.
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Alternativ kann eine lacl-Überproduktion
in der Transformante durch Einbau des laclq-Gens
in erfindungsgemäße Vektoren
erreicht werden. Da in dieser Situation die Überproduktion von lacl durch
den Vektor vermittelt wird, kann jeder einer Vielzahl von kommerziell
erhältlichen
Bakterienwirtsstämmen
verwendet werden, umfassend die E. coli-Stämme DH1, RR1, C600, CMK603
und EB505. Das in den Vektor einzubauende laclq-Gen
kann als ein 1,2 kb HindIII-Fragment aus dem Plasmid pMMB22 (beschrieben
von Bagdasarian et al. (Gene 1983, 26:273)) erhalten werden und
danach nicht-disruptiv an jeder Stelle des Plasmidvektors eingebaut
werden.
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Um die Vererbungsstabilität von Vektoren,
insbesondere von Plasmiden, vom ursprünglich transformierten Stamm
zu seiner Nachkommenschaft zu erhöhen, kann auch ein in E. coli
funktionelles Partitionselement (par) in den Vektor eingebaut werden.
Ein derartiges par Element kann als ein 380 by Hincll/Aval-Fragment
aus pSC101 freigesetzt werden und danach in eine geeignete Stelle
auf dem Vektor kloniert werden.
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Nach der Transformation werden Bakterienwirte,
die den Expressionsvektor beherbergen, in einem Kulturmedium, das
für den
ausgewählten
Wirt gut geeignet ist, kultiviert. Für E. coli können LB Nährmedium oder 2YT-Medium (Hefeextrakt/Trypton)
verwendet werden, um die hierin bevorzugten Stämme zu kultivieren. Für Plasmidtransformanten
sollte ein Selektionsdruck aufrecht erhalten werden, indem ein cytotoxisches
Mittel bereitgestellt wird, das den nichttransformierten Wirtsstamm
tötet.
Beispielsweise sollte eine Transformante mit einem Plasmid, welches
das Gen für
Tetracyclinresistenz beherbergt, in einem Tetracyclin-enthaltenden Medium
kultiviert werden. Mediumkonzentrationen an Tetracyclin von etwa
5–15 μg/ml sind
geeignet.
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Der Promoter auf dem Konstrukt ist
bevorzugt regulierbar durch Bindung eines Repressormoleküls an einen
Operator, der neben dem Promoter in der Kontrollregion lokalisiert
ist. In einer bevorzugten Ausführungsform
bindet das lacl-Genprodukt
an einen neben dem Promoter lokalisierten lac Operator. In diesem
Fall reprimiert die Bindung des lacl-Genprodukts den Promoter, wobei
Expressionsniveaus von kodierender DNA unter dessen Kontrolle erniedrigt
werden. Um die Expressionsniveaus zu erhöhen, wird dem Kulturmedium
die Chemikalie IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid),
welche an das lacl bindet und den Promoter dereprimiert, zugegeben
um den Promoter zu dereprimieren und die Expression zu induzieren.
IPTG wird dem Kulturmedium zweckmäßig zugegeben, wenn die Zellen
eine mittlere logarithmische Wachstumsphase erreicht haben.
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Um die optimale Dichte zu bestimmen,
bis zu der Kulturen wachsen gelassen werden sollten um eine maximale
Ausbeute an gewünschtem
Protein zu realisieren, können
Versuche durchgeführt
werden und Proteingehalte in einem Zeitverlaufsexperiment gemessen
werden. Im Allgemeinen können
vernünftige
Proteinausbeuten gewonnen werden, sobald die Zellen eine mittlere
logarithmische Phase erreicht haben, obwohl davon ausgegangen werden
kann, dass größere Mengen
an Protein innerhalb von 4–5
Stunden danach akkumulieren.
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Das gewünschte Protein kann mittels
Techniken gereinigt werden, die in der Technik als geeignet für das gewünschte Protein
etabliert sind. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung wird
exprimiertes PTH über
den periplasmatischen Raum hinaus und in das Kulturmedium hinein
sezerniert, wo es direkt gewonnen wird. Wenn das Protein sezerniert
worden ist, kann das verbrauchte Medium unter Verwendung von biochemischen
Techniken isoliert werden, welche der Natur des Proteins hinsichtlich
seiner Molekülgröße, Nettoladung,
dem isoelektrischen Punkt etc. gerecht werden. Das Medium kann zunächst aufkonzentriert
werden, beispielsweise durch Lyophilisation. Weiterhin können, wenn
Antikörper
verfügbar
sind oder ein natürlicher
Ligand für
das Protein verfügbar
ist, Affinitätssäulen verwendet
werden. Spezifische Ausführungsformen
der Erfindung werden nunmehr unter Bezugnahme auf die Zeichnungen
beispielhaft erläutert.
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BEISPIEL 1
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In seiner reifen Form ist PTH ein
Peptid von 84 Aminosäuren,
das in Menschen Blutcalcium erhöhend und
als Modulator der Knochenbildung wirkt. DNA, die für humanes
PTH kodiert, wurde unter Verwendung etablierter Techniken und gemäß der von
Hendy et al., vorstehend, veröffentlichten
Aminosäuresequenz
synthetisiert, und in die nachstehend beschriebenen Konstrukte eingebaut,
wie in 1 gezeigt.
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Bevorzugte rekombinante DNA-Konstrukte,
die den Promoter #1 und #2 sowie die Referenzpromotoren #3 und #4
umfassen, erläutert
in Tabelle 1 und 1,
auf die nunmehr Bezug genommen wird, wurden aus einem einzelsträngigen,
durch die Phosphoamidit-Methode synthetisierten Oligonukleotid hergestellt.
Der Gelgereinigte Strang, umfassend die Sequenzen von der Xhol zu
der EcoRl Restriktionsstelle wurde danach als ein PCR-Anfangstarget
verwendet und wurde mittels PCR zu einem doppelsträngigen DNA-Fragment
amplifiziert, unter Verwendung von komplementären einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden,
die spezifisch an das Ende entweder der gezeigten Anfangsoligonukleotidsequenz
oder des komplementären
Strangs hybridisierten. Somit werden die Konstrukte hergestellt
unter Verwendung von Standard-Gensynthese-Methodik, wie beispielsweise
von Maniatis ("Molecular
Cloning", Cold Spring
Harbour Laboratories, 1982) und Innis et al. ("PCR Protocols, A Guide to Methods and
Applications") beschrieben.
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Die Konstrukte wurden danach in ein
von pUC18 abgeleitetes Plasmid, das anstelle von Ampicillin-Resistenz
eine Tetracyclin-Resistenz vermittelt, kloniert. Ein von JM101 abgeleiteter
E. coli Wirtsstamm wurde danach gemäß etablierten Techniken transformiert
(siehe Maniatis et al., "Molecular
Cloning", Cold Spring
Harbour Laboratory, 1982).
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BEISPIEL 2 Expression
des transformierten Wirts
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Die Transformanten, welche die PTH-Vektoren
enthielten, wurden über
Nacht bei 30°C
in 2YT Nährmedium,
enthaltend 0,5% Glucose und Tetracyclin, kultiviert und danach in
frischem Medium der gleichen Zusammensetzung angeimpft, und weiter
bei 30°C
kultiviert bis sie die mittlere logarithmische Phase erreichten. Kulturen
wurden danach in Wachstumsintervallen von 1 Stunde induziert (1
mM IPTG), Kulturaliquots wurden entnommen und fraktioniert, wobei
Kulturmediumproben erzeugt wurden, um sezernierte PTH-Produkte unter Verwendung
eines Standard-Allegro-Assays
zu identifizieren.
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Die Ergebnisse dieser Assays sind
nachstehend in Tabelle 1 angegeben:
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Ergebnisse des Allegro-Assays deuten
darauf hin, dass die Promotoren, welche die 18 by Ipp und IacUV5
Sequenzen umfassen, erhöhte
Gehalte an heterologem PTH-Protein
erleichtern. Die Promotoren #1 und #2 stellen sich als günstig heraus
im Vergleich mit Promoter #3, bei dem der Abstandhalter durch eine
modifizierte lac Operatorsequenz (IacO) substituiert war, und mit
Promoter #4, bei dem die -35 und -10 Regionen von Bakteriophage T7 stammen
und der Abstandhalter der lacO Promoter ist. Studien mit den gleichen
Promotoren, die das für
Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodierende Gen exprimierten,
zeigten ähnliche Ergebnisse
einer erhöhten
Expression für
die Promotoren #1 und #2. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass
jeder der untersuchten Promotoren eine erhöhte Proteinausbeute zeigte,
wenn mit der Bakteriophage T5 RBS kombiniert, im Vergleich zu der
von lac abgeleiteten RBS.
