DE69629808T2 - Promotoren für Gen Expression - Google Patents
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Description
- GEBIET DER ERFINDUNG
- Diese Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik, wie auf bakterielle Wirte angewandt. Insbesondere betrifft die Erfindung Expressionssysteme zur Produktion von Proteinen in bakteriellen Wirten.
- HINTERGRUND DER ERFINDUNG
- Das Aufkommen der rekombinanten DNA-Technologie hat die Produktion von verschiedenen natürlich vorkommenden und synthetischen Proteinen in Organismen wie etwa Bakterien, Pilzen, Hefe und Säugerzellen ermöglicht. Im Allgemeinen umfasst sie das Einbringen von Genen, die für ein gewünschtes Protein kodieren, in einen Wirtsorganismus, und die Verwendung der zellulären Maschinerie des Wirts, um das Gen zu exprimieren.
- Rekombinante DNA-Technologie entwickelt sich kontinuierlich weiter, um eine Produktion von Proteinen in kommerziell akzeptablen Ausbeuten zu erreichen. Ein limitierender Faktor bei der rekombinanten Produktion von Proteinen ist die Rate, mit der das Gen, welches für das gewünschte Protein kodiert, exprimiert wird. Insbesondere wurde herausgefunden, dass die Promoterregion eines Gens im Transkriptionsverfahren der Genexpression kritisch ist. Ein effizienter Promoter, wie etwa der in E. coli vorkommende trp Promoter, bindet fest an DNA-gerichtete RNA-Polymerase, wobei die Transkription des Gens mittels Erzeugung von mRNA initiiert wird. Ein weniger effizienter Promoter, wie etwa der lac Promoter, bindet weniger fest an RNA-Polymerase, was zu einer niedrigeren Rate der mRNA-Erzeugung führt.
- Der trp Promoter wurde bei der Produktion von heterologen Proteinen in breitem Umfang verwendet, aufgrund seiner Fähigkeit, die Transkription effizient zu initiieren. Trotz seiner Effizienz besteht ein inhärenter Nachteil des trp Promoters darin, dass er nicht leicht kontrolliert werden kann. Spezifisch ist der trp Promoter nicht vollständig reprimierbar, d. h. er kann die Transkription antreiben bevor der Wirt in Kultur zu einer für die Proteinproduktion geeigneten Phase angezüchtet worden ist. Ein anderer in breitem Umfang verwendeter Promoter ist lac, der weniger effizient ist als trp, aber besser kontrolliert werden kann.
- Um effizientere Promotoren zu entwickeln, wurden funktionelle Komponenten von unterschiedlichen Promotoren kombiniert, beispielsweise die in US Patent Nr. 5,362,646 beschriebenen. In einem Beispiel wurden Teile des Bakteriophage T7-Promoters A1 (PA1) mit zwei lac Operatoren kombiniert. Spezifisch wurden die Abstandhalterregion zwischen der so genannten -35 und -10 Region des Bakteriophage T7-Promoters durch eine modifizierte lac Operatorsequenz ersetzt, und zur Kontrolle des resultierenden Promoterhybrids wurde stromabwärts ein zweiter lac Operator eingefügt. Es wurde festgestellt, dass das resultierende Promoter/Operator-System, das in den kommerziell erhältlichen pUHE Plasmiden vorhanden ist, nach Induktion die Transkription effizient initiiert, und vor Induktion dennoch in hohem Maße reprimiert ist.
- Ein anderer, von Tsung et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1990, 87:5940) beschriebener Promoter umfasst die effiziente trp -35 Region, die -10 Region aus dem sehr effizienten IppP-5 Promoter (eine Variante des Ipp Promoters) und einen vom lac Promoter abgeleiteten Abstandhalter. Es ist gezeigt worden, dass dieser Promoter derart stark effizient ist, die Transkription zu initiieren, so dass er zu Zelllethalität führt.
- Obwohl verschiedene Promotoren verbesserte Proteinausbeuten in mikrobiellen Wirten ermöglicht haben, besteht immer noch ein Bedarf an Promotoren, welche die Produktion von kommerziell wertvollen Proteinen effizienter antreiben.
- ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
- Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein neues rekombinantes DNA-Konstrukt bereitgestellt, welches zur Expression eines Proteins in einem bakteriellen Wirt geeignet ist. Das Konstrukt umfasst eine für ein Protein kodierende Region, welche operativ mit einer Kontrollregion verknüpft ist, umfassend einen Promoter mit der nachfolgenden DNA-Sequenz:
- KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
-
1 veranschaulicht die Nukleotidsequenz und eine schematische Darstellung einer Expressionskassette, welche rekombinante DNA-Konstrukte gemäß der Erfindung umfasst; -
2 veranschaulicht Nukleotidsequenzen von erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten, umfassend eine Promoter- und Operator-Region. - AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
- Die vorliegende Erfindung stellt DNA-Sequenzen bereit, welche geeignet sind, die DNA-Expression in bakteriellen Wirten wie etwa E. coli mit hoher Effizienz anzutreiben. Die Verwendung von Expressionsvektoren, welche diese Sequenzen umfassen, stellt ein wertvolles Mittel bereit, um eine erhöhte Produktion von exprimierbaren Proteinen, sowohl endogenen als auch heterologen, zu erreichen. Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird ein neues rekombinantes DNA-Konstrukt bereitgestellt, welches zur Expression eines Proteins in einem bakteriellen Wirt geeignet ist. Das Konstrukt umfasst eine für das Protein kodierende Region, welche operativ mit einer Kontrollregion verknüpft ist, umfassend einen Promoter, um die Expression des Proteins in dem Wirt zu ermöglichen, wobei der Promoter die nachfolgende DNA-Sequenz umfasst:
- Diese Promotoren haben eine -35 Region der Konsensussequenz TTGACA und eine -10 Region der Sequenz TATACT gemeinsam. Die Abstandhaltersequenz, d. h. die dazwischen liegende Sequenz von 18 Basen, ist erfindungsgemäß die Sequenz ACATAAAAAACTTTGTGT. Demgemäß stellt die Erfindung DNA-Konstrukte bereit, bei denen eine für ein gewünschtes Protein kodierende DNA operativ unter Expressionskontrolle mit einem Promoter der Sequenz 5'-TTGACAACATAAAAAACTTTGTGTTATACT-3' verknüpft ist.
- Der Fachmann wird erkennen, dass die erfindungsgemäßen Promotoren ein essentielles Element der erforderlichen Komponenten darstellen, innerhalb der funktionellen Kontrollregion, um die Expression anzutreiben. Darüber hinaus können diese Promotoren unter Verwendung von Standardverfahren in jeden geeigneten Expressionsvektor eingeführt werden, der in gramnegativen oder grampositiven Bakterien replizieren kann. Noch spezifischer, und um eine Kontrollregion zur Genexpression zu bilden, werden die vorliegenden Promotoren zusammen mit anderen Kontrollelementen eingebaut, die typischerweise für diese Expression erforderlich sind, umfassend eine Ribosomen-Bindungsstelle, und in erfindungsgemäßen Ausführungsformen, einen Operator, welcher derart wirkt, so dass er die Promoterfunktion kontrolliert.
- Diese Komponenten sind notwendigerweise relativ zueinander derart angeordnet, wie erforderlich, damit Genexpression auftritt, gemäß gut verstandener Prinzipien der Genexpression.
- In einer Ausführungsform der Erfindung umfasst die Kontrollregion des Konstrukts einen Operator. Operatoren, die verwendet werden können, umfassen diejenigen, die direkt durch chemische Induktoren induzierbar sind, und diejenigen, wie etwa lac, die de-reprimierbar sind. Beispiele von geeigneten Operatoren umfassen die E. coli Lactose-, Galactose-, Tryptophan- und Tetracyclinoperatoren (siehe Miller et al., "The Operon", Cold Spring Harbour Laboratory, 1980, und Hillen et al., J. Mol. Biol. 1984, 172:185). Bevorzugte Operatoren sind in hohem Maße reprimierbar, so dass die Expression der für das Protein kodierenden DNA kontrolliert werden kann. In einer spezifischen Ausführungsform umfasst die Kontrollregion den lac Operator (
1 ), welcher eine Expression von dem Promoter in der Abwesenheit des synthetischen Induktors Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) und des natürlichen Induktors Lactose verhindert. - Die Kontrollregion umfasst weiter eine Sequenz für eine Ribosomen-Bindungsstelle (RBS), um die Bindung von Ribosomen an das mRNA-Transkript zu erleichtern und dadurch die Translation der kodierenden Region der RNA, wodurch das Protein erzeugt wird, zu initiieren. Geeignete Ribosomen-Bindungsstellen umfassen lac und Bakteriophage T5.
- In einer bevorzugten Ausführungsform ist die RBS eine von der Bakteriophage T5-RBS abgeleitete Sequenz mit der Sequenz 5'-ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC-3'.
- Die Kontrollregionen von erfindungsgemäßen Konstrukten sind operativ mit einer für ein endogenes oder ein heterologes Protein kodierenden Region verknüpft. Der Begriff "heterologes Protein" bezeichnet ein Polypeptid oder Protein, das obwohl es nicht natürlich von dem Bakterienwirt produziert wird, von diesem Wirt exprimiert wird, wenn er geeignet mit DNA, die für das Protein kodiert, transformiert ist; genomische DNA, cDNA und synthetische DNA können verwendet werden um den Wirt zu transformieren. Proteine, die unter Verwendung des hierin beschriebenen Systems produziert werden können, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Hormone, wie etwa Parathyroidhormon (PTH), Glucagon oder Fragmente davon und verwandte Peptide wie etwa GLP-1 und GLP-2; Wachstumsfaktoren wie etwa epidermaler Wachstumsfaktor (EGF); und Lymphokine wie etwa Interleukin-6 und -8 (IL-6, -8). Um die Isolierung der authentischen Form des Proteins, d. h. das Protein ohne einen zusätzlichen N-terminalen Met-Rest, zu erleichtern, können auch Fusionsproteine produziert werden, die nach der Expression gespalten werden. Beispielsweise kann einer für ein interessierendes Protein kodierende DNA eine DNA vorangehen, die für ein Signalpeptid, wie etwa das äußere Membranprotein ompA von E. coli, kodiert. In diesem Fall erzeugt das exprimierte Gen ein Fusionsprotein, das ein N-Met enthaltendes ompA Signalpeptid, gefolgt von dem gewünschten Protein, umfasst. Das Signalpeptid schleust das Fusionsprotein durch die Intermembran des Bakteriums, wo das Signalpeptid abgespalten wird. Andere Signalpeptide, die verwendet werden können, umfassen alkalische Phosphatase, wärmestabiles Enterotoxin II aus E. coli und Protein A aus Streptococcus. Alternativ kann ein Fusionsprotein synthetisiert und in einem separaten Verfahren gespalten werden um das gewünschte Protein zu erzeugen. Beispielsweise kann Glutathion-S-Transferase (GST) mit Thrombin oder Faktor Xa von einem gewünschten Protein abgespalten werden.
- In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung umfasst die kodierende Region DNA, die für humanes PTH kodiert, dessen Aminosäuresequenz von Hendy et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1981, 78:7365) beschrieben worden ist. In den hierin beschriebenen Beispielen ist die für PTH kodierende DNA-Sequenz direkt und im Leseraster an DNA gekoppelt, die für das ompA Signalpeptid kodiert.
- Die in
1 gezeigten bevorzugten rekombinanten DNA-Konstrukte, mit dem Ipp oder dem lacUV5 Abstandhalter, wurden aus einzelsträngigen Oligonukleotiden erzeugt, die mittels der Phosphoamidit-Methode synthetisiert worden waren. Der Gel-gereinigte Strang, umfassend die Sequenzen von der Xhol zu der EcoRl Restriktionsstelle wurde danach als ein PCR-Anfangstarget verwendet und wurde mittels PCR zu einem doppelsträngigen DNA-Fragment amplifizien, unter Verwendung von komplementären einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden, die spezifisch an das Ende entweder der gezeigten Anfangsoligonukleotidsequenz oder des komplementären Strangs hybridisierten. Somit werden die Konstrukte hergestellt unter Verwendung von Standard-Gensynthese-Methodik, wie beispielsweise von Maniatis et al. ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbour Laboratories, 1982) und Innis et al. ("PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications") beschrieben. - Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung werden Expressionsvektoren bereitgestellt, die zur Herstellung von Bakterienwirtszell-Transformanten, welche ein rekombinantes DNA-Konstrukt gemäß der Erfindung umfassen, geeignet sind. Erfindungsgemäße DNA-Konstrukte können mittels etablierter Techniken als eine "Kassette" in einen Vektor, bevorzugt einen Plasmidvektor eingebaut werden. Im Allgemeinen wird ein Vektor an Restriktionsstellen gespalten, die Restriktionsstellen an jedem Ende der Kassette entsprechen. Die Kassette wird danach durch Ligieren der Enden an die komplementären gespaltenen Stellen des Vektors eingebracht.
- Obwohl Vektoren auf Basis von Bakteriophagen verwendet werden können, sind Plasmidvektoren, wie etwa pBR322 und die pUC Plasmidreihe bevorzugt. Nach dem Einbau in einen geeigneten Vektor kann das resultierende Plasmid in einem Wirt amplifiziert werden, um ausreichende Mengen für die nachfolgende Klonierungsarbeit bereitzustellen. Es wird erkannt werden, dass die für das ausgewählte Protein kodierende DNA günstig in das Plasmid mit mehreren darauf bereitgestellten Klonierungsstellen eingebracht wird, unter Verwendung von Standard-Klonierungs/Ligierungsmethoden. Ein Plasmid wird notwendigerweise auch einen Replikationsursprung umfassen, und höchst wünschenswert auch einen Marker umfassen, wie etwa das Ampcillin-oder Tetracyclin-Resistenzgen, um eine Selektion von transformierten Zellen zu ermöglichen. Es wird ebenfalls erkannt werden, dass Translationsstopcodons in allen drei Leserastern und eine korrekt positionierte Transkriptionsterminationsregion für eine zufrieden stellende Expression des gewünschten Proteins erforderlich sein werden. Geeignete Transkriptionsterminatoren umfassen die Transkriptionsterminatoren der E. coli Gene trpA, thr, his und phe.
- Sobald eine für ein gewünschtes Protein kodierende DNA in den Vektor eingebaut worden ist, wird ein ausgewählter Bakterienwirt damit transformiert, unter Verwendung von Calciumchlorid-vermittelten Standard-Transformationstechniken. Geeignete Bakterienwirte umfassen gramnegative Bakterien wie etwa E. coli und Salmonella. Bevorzugt ist der Wirt ein kommerziell erhältlicher E. coli Stamm, und am meisten bevorzugt JM101 und Derivate davon.
- Wenn die Kontrollregion des DNA-Konstrukts den lac Operator umfasst, wie nachstehend hierin ausführlicher beschrieben, sollte der transformierte Wirtsstamm fähig sein, das lacl-Produkt zu exprimieren, und wünschenswert in manchen Fällen zu überproduzieren, so dass die Promoterfuktion und somit die Expression des Proteins reguliert werden kann. Das Erfordernis einer lacl-Überproduktion von manchen Transformanten kann gemäß einer Ausführungsform der Erfindung erreicht werden durch die Verwendung von Wirten, die bereits das für eine Überproduktion des lacl-Produkts verantwortliche laclq-Gen beinhalten. Lacl-überproduzierende E. coli-Stämme, die als Wirte verwendet werden können, umfassen die von Clontech Laboratories Inc., Kalifornien, USA, erhältliche JM-Reihe von Stämmen. Spezifische, zur Verwendung geeignete Wirtsstämme umfassen JM101, JM105 und JM107.
- Alternativ kann eine lacl-Überproduktion in der Transformante durch Einbau des laclq-Gens in erfindungsgemäße Vektoren erreicht werden. Da in dieser Situation die Überproduktion von lacl durch den Vektor vermittelt wird, kann jeder einer Vielzahl von kommerziell erhältlichen Bakterienwirtsstämmen verwendet werden, umfassend die E. coli-Stämme DH1, RR1, C600, CMK603 und EB505. Das in den Vektor einzubauende laclq-Gen kann als ein 1,2 kb HindIII-Fragment aus dem Plasmid pMMB22 (beschrieben von Bagdasarian et al. (Gene 1983, 26:273)) erhalten werden und danach nicht-disruptiv an jeder Stelle des Plasmidvektors eingebaut werden.
- Um die Vererbungsstabilität von Vektoren, insbesondere von Plasmiden, vom ursprünglich transformierten Stamm zu seiner Nachkommenschaft zu erhöhen, kann auch ein in E. coli funktionelles Partitionselement (par) in den Vektor eingebaut werden. Ein derartiges par Element kann als ein 380 by Hincll/Aval-Fragment aus pSC101 freigesetzt werden und danach in eine geeignete Stelle auf dem Vektor kloniert werden.
- Nach der Transformation werden Bakterienwirte, die den Expressionsvektor beherbergen, in einem Kulturmedium, das für den ausgewählten Wirt gut geeignet ist, kultiviert. Für E. coli können LB Nährmedium oder 2YT-Medium (Hefeextrakt/Trypton) verwendet werden, um die hierin bevorzugten Stämme zu kultivieren. Für Plasmidtransformanten sollte ein Selektionsdruck aufrecht erhalten werden, indem ein cytotoxisches Mittel bereitgestellt wird, das den nichttransformierten Wirtsstamm tötet. Beispielsweise sollte eine Transformante mit einem Plasmid, welches das Gen für Tetracyclinresistenz beherbergt, in einem Tetracyclin-enthaltenden Medium kultiviert werden. Mediumkonzentrationen an Tetracyclin von etwa 5–15 μg/ml sind geeignet.
- Der Promoter auf dem Konstrukt ist bevorzugt regulierbar durch Bindung eines Repressormoleküls an einen Operator, der neben dem Promoter in der Kontrollregion lokalisiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform bindet das lacl-Genprodukt an einen neben dem Promoter lokalisierten lac Operator. In diesem Fall reprimiert die Bindung des lacl-Genprodukts den Promoter, wobei Expressionsniveaus von kodierender DNA unter dessen Kontrolle erniedrigt werden. Um die Expressionsniveaus zu erhöhen, wird dem Kulturmedium die Chemikalie IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid), welche an das lacl bindet und den Promoter dereprimiert, zugegeben um den Promoter zu dereprimieren und die Expression zu induzieren. IPTG wird dem Kulturmedium zweckmäßig zugegeben, wenn die Zellen eine mittlere logarithmische Wachstumsphase erreicht haben.
- Um die optimale Dichte zu bestimmen, bis zu der Kulturen wachsen gelassen werden sollten um eine maximale Ausbeute an gewünschtem Protein zu realisieren, können Versuche durchgeführt werden und Proteingehalte in einem Zeitverlaufsexperiment gemessen werden. Im Allgemeinen können vernünftige Proteinausbeuten gewonnen werden, sobald die Zellen eine mittlere logarithmische Phase erreicht haben, obwohl davon ausgegangen werden kann, dass größere Mengen an Protein innerhalb von 4–5 Stunden danach akkumulieren.
- Das gewünschte Protein kann mittels Techniken gereinigt werden, die in der Technik als geeignet für das gewünschte Protein etabliert sind. In einer spezifischen Ausführungsform der Erfindung wird exprimiertes PTH über den periplasmatischen Raum hinaus und in das Kulturmedium hinein sezerniert, wo es direkt gewonnen wird. Wenn das Protein sezerniert worden ist, kann das verbrauchte Medium unter Verwendung von biochemischen Techniken isoliert werden, welche der Natur des Proteins hinsichtlich seiner Molekülgröße, Nettoladung, dem isoelektrischen Punkt etc. gerecht werden. Das Medium kann zunächst aufkonzentriert werden, beispielsweise durch Lyophilisation. Weiterhin können, wenn Antikörper verfügbar sind oder ein natürlicher Ligand für das Protein verfügbar ist, Affinitätssäulen verwendet werden. Spezifische Ausführungsformen der Erfindung werden nunmehr unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beispielhaft erläutert.
- BEISPIEL 1
- In seiner reifen Form ist PTH ein Peptid von 84 Aminosäuren, das in Menschen Blutcalcium erhöhend und als Modulator der Knochenbildung wirkt. DNA, die für humanes PTH kodiert, wurde unter Verwendung etablierter Techniken und gemäß der von Hendy et al., vorstehend, veröffentlichten Aminosäuresequenz synthetisiert, und in die nachstehend beschriebenen Konstrukte eingebaut, wie in
1 gezeigt. - Bevorzugte rekombinante DNA-Konstrukte, die den Promoter #1 und #2 sowie die Referenzpromotoren #3 und #4 umfassen, erläutert in Tabelle 1 und
1 , auf die nunmehr Bezug genommen wird, wurden aus einem einzelsträngigen, durch die Phosphoamidit-Methode synthetisierten Oligonukleotid hergestellt. Der Gelgereinigte Strang, umfassend die Sequenzen von der Xhol zu der EcoRl Restriktionsstelle wurde danach als ein PCR-Anfangstarget verwendet und wurde mittels PCR zu einem doppelsträngigen DNA-Fragment amplifiziert, unter Verwendung von komplementären einzelsträngigen DNA-Oligonukleotiden, die spezifisch an das Ende entweder der gezeigten Anfangsoligonukleotidsequenz oder des komplementären Strangs hybridisierten. Somit werden die Konstrukte hergestellt unter Verwendung von Standard-Gensynthese-Methodik, wie beispielsweise von Maniatis ("Molecular Cloning", Cold Spring Harbour Laboratories, 1982) und Innis et al. ("PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications") beschrieben. - Die Konstrukte wurden danach in ein von pUC18 abgeleitetes Plasmid, das anstelle von Ampicillin-Resistenz eine Tetracyclin-Resistenz vermittelt, kloniert. Ein von JM101 abgeleiteter E. coli Wirtsstamm wurde danach gemäß etablierten Techniken transformiert (siehe Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbour Laboratory, 1982).
- BEISPIEL 2 Expression des transformierten Wirts
- Die Transformanten, welche die PTH-Vektoren enthielten, wurden über Nacht bei 30°C in 2YT Nährmedium, enthaltend 0,5% Glucose und Tetracyclin, kultiviert und danach in frischem Medium der gleichen Zusammensetzung angeimpft, und weiter bei 30°C kultiviert bis sie die mittlere logarithmische Phase erreichten. Kulturen wurden danach in Wachstumsintervallen von 1 Stunde induziert (1 mM IPTG), Kulturaliquots wurden entnommen und fraktioniert, wobei Kulturmediumproben erzeugt wurden, um sezernierte PTH-Produkte unter Verwendung eines Standard-Allegro-Assays zu identifizieren.
- Die Ergebnisse dieser Assays sind nachstehend in Tabelle 1 angegeben:
- Ergebnisse des Allegro-Assays deuten darauf hin, dass die Promotoren, welche die 18 by Ipp und IacUV5 Sequenzen umfassen, erhöhte Gehalte an heterologem PTH-Protein erleichtern. Die Promotoren #1 und #2 stellen sich als günstig heraus im Vergleich mit Promoter #3, bei dem der Abstandhalter durch eine modifizierte lac Operatorsequenz (IacO) substituiert war, und mit Promoter #4, bei dem die -35 und -10 Regionen von Bakteriophage T7 stammen und der Abstandhalter der lacO Promoter ist. Studien mit den gleichen Promotoren, die das für Chloramphenicolacetyltransferase (CAT) kodierende Gen exprimierten, zeigten ähnliche Ergebnisse einer erhöhten Expression für die Promotoren #1 und #2. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass jeder der untersuchten Promotoren eine erhöhte Proteinausbeute zeigte, wenn mit der Bakteriophage T5 RBS kombiniert, im Vergleich zu der von lac abgeleiteten RBS.
Claims (13)
- Rekombinantes DNA-Konstrukt, das ein Protein in einer Bakterienwirtszelle exprimiert, wobei das Konstrukt eine für das Protein kodierende Region umfasst, welche operativ mit einer Kontrollregion verknüpft ist, umfassend einen Promoter, der die Expression des Proteins in der Wirtszelle fördert, wobei der Promoter die nachfolgende DNA-Sequenz umfasst:
- Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die Bakterienzelle eine E. coli Zelle ist.
- Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kontrollregion weiter einen Operator zur Regulierung der Expression des Proteins umfasst.
- Rekombinantes DNA-Konstrukt nach Anspruch 3, wobei der Operator der lac Operator ist.
- Rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Protein humanes Parathyroidhormon ist.
- Rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Konstrukt für das Protein GLP-2 kodiert, das in einer Bakterienwirtszelle exprimierbar ist.
- Rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 6, weiter umfassend DNA, welche für das Omp A Signalpeptid im Leseraster mit der kodierenden Region kodiert, wodurch die Sezernierung des Proteins in das Periplasma der Wirtszelle gefördert wird.
- Rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Kontrollregion eine T5 Ribosomenbindungsstelle mit der DNA-Sequenz ATTAAAGAGGAGAAATTAAGC umfasst.
- Rekombinantes DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Kontrollregion die in
2 angegebene Sequenz umfasst. - Vektor, umfassend das rekombinante DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
- Bakterienwirtszelle, transformiert mit einem Vektor nach Anspruch 10.
- Bakterienwirtszelle nach Anspruch 11, die eine E. coli Zelle ist.
- Verfahren zur Produktion eines rekombinanten Proteins, umfassend das Kultivieren einer Wirtszelle nach Anspruch 11 oder 12 unter Bedingungen, bei denen das Protein produziert wird, und Gewinnen des Proteins.
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