DE60310708T2

DE60310708T2 - In vivo stabilsierung von plasmiden

Info

Publication number: DE60310708T2
Application number: DE60310708T
Authority: DE
Inventors: Julian Hanak; Rocky Cranenburgh; Scott Gorman
Original assignee: Cobra Biologics Ltd
Current assignee: Cobra Biologics Ltd
Priority date: 2002-05-18
Filing date: 2003-05-19
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2023-05-20
Also published as: SI1507863T1; PT1507863E; ES2279963T3; DE60310708D1; AU2003232336A1; WO2003097838A1; ATE349539T1; DK1507863T3; GB0211459D0; EP1507863B1; EP1507863A1; ZA200410202B

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft eine transformierte attenuierte bzw. abgeschwächte Bakterienzelle zur Verwendung als Medikament.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Expression von rekombinanten Proteinen in Wirtszellen ist wichtig für eine Vielzahl von therapeutischen Anwendungen. Insbesondere ist die Expression von antigenen Proteinen in einer geeigneten Wirtszelle ein wirksames Verfahren zur Immunisierung gegenüber pathogenen Organismen. Ein geeignetes Verfahren um dies zu erreichen ist es, eine rekombinante Wirtszelle mit einem Plasmid zu erzeugen, das eines oder mehrere Antigene oder Epitope kodiert. Um jedoch solche Plasmide in einer ausreichenden Kopienzahl aufrecht zu halten, ist einiger Selektionsdruck notwendig. Dies liegt daran, dass extrachromosomale DNA, die von Wirtszellen getragen wird, inhärent instabil ist, weil Zellen, die Plasmide enthalten, für gewöhnlich eine gesteigerte metabolische Belastung im Vergleich zu Plasmid freien segregierenden Zellen tragen.
Das herkömmliche Verfahren zum Aufrechterhalten der Kopienzahl von gewünschten Plasmiden in Zellen in Kultur ist es, einen Selektionsmarker einzuschließen, wie ein Antibiotika-Resistenzgen auf dem Plasmid, und die Zellen in der Anwesenheit eines geeigneten Antibiotikums zu kultivieren. Bei Zellen oder Plasmiden, die für die therapeutische Verwendung vorgesehen sind, weist dies bestimmte Nachteile selbst in in vitro Kultur auf, zum Beispiel das potenzielle Risiko der Verbreitung der Antibiotika-Resistenzgene. Zum Beispiel kann für die in vivo Verwendung die benötigte Anwesenheit einer ausreichenden Konzentration von Antibiotika, um die Selektion von Zellen sicherzustellen, die eine hohe Kopienzahl an Plasmiden tragen, unerwünscht, unpraktisch oder unmöglich sein.
Andere erfolgreiche Verfahren zum Aufrechterhalten von Plasmiden verwenden keine Antibiotikaselektion sondern beruhen vielmehr auf einem mutanten Wirt, der nicht in der Lage ist, einen essentiellen Metaboliten zu synthetisieren und das Einbauen des Gens, welches diese Synthese in dem Plasmid bereitstellt. Andere Lösungen schließen das Einbauen eines Gens, das für ein toxisches Produkt kodiert, in das Chromosom und das anschließende Einschließen eines entsprechenden Inhibitor oder Repressor Systems in das Plasmid ein, mit dem Ergebnis, dass Plasmid freie Zellen wirksam bei der Segregation abgetötet werden.
QIAN Feng et al. (Infection and Immunity, 2002, 70:2029-2038) und Mastroeni et al. (Veterinary Journal, 2001, 161(1): 132-164) offenbaren Verfahren zum Exprimieren eines Gens von Interesse in einer transformierten Zelle innerhalb eines Empfängerorganismus. Die EP 0 851 932 beschreibt ein Verfahren zum Aufrechterhalten von Plasmiden innerhalb von Wirtszellen in in vitro Kultur mittels einer Operator Repressor Titration. Dies schließt das Engineering einer geeigneten Wirtszelle ein, sodass die Expression eines essentiellen chromosomalen Gens durch den Einbau einer Operatorsequenz in eine Kontrollregion konditional gemacht wird. Dieser Operator bindet ein Repressor Protein, und in der Anwesenheit eines solchen gebundenen Repressors wird die Expression des Gens herunterreguliert, und in der Abwesenheit seines essentiellen Produkts sterben die Zellen oder sie können sich nicht mehr teilen. Das Chromosom des Wirts wird weiter verändert, sodass es ein Gen enthält, welches das Repressor Protein exprimiert, sodass die Zelle jetzt lebensfähig ist, außer das Gen wird auf irgendeine Weise unterdrückt oder die Auxotrophie der Zelle wird durch Zugabe des benötigten essentiellen Produkts als ein ergänzender Nährstoff in dem Kulturmedium aufgehoben.
Die gewünschten Plasmide für die Aufrechterhaltung in dieser Wirtszelle werden derart verändert, dass sie eine oder mehrere Operatorstellen ähnlich jener, welche die Expression des oben beschriebenen essentiellen Wirtszellgens kontrollieren, enthalten. Wenn sie in die Wirtszelle transformiert werden, konkurrieren solche Plasmide hinsichtlich der Bindung des Repressors innerhalb der Zelle. Wenn eine ausreichende Kopienzahl erreicht ist, ist der gesamte Repressor durch die Plasmide gebunden und das essentielle zelluläre Gen ist dereprimiert, die Zelle wird aus ihrer Auxotrophie befreit, was es ihr erlaubt zu wachsen und sich in der Abwesenheit von ergänzenden Nährstoffen zu teilen.
Obwohl die EP 0 851 932 und Crananburgh et al., 2001, Nucleic Acids Research 29: E26 ein solches System für die Verwendung in vitro beschreiben, gibt es keine Offenbarung von geeigneten Wirtszellen und Plasmiden für die sichere und einfache in vivo therapeutische Verwendung. Folglich gibt es einen Bedarf für ein System für die einfache Expression einer Vielzahl von Plasmid basierten therapeutischen Genen in verträglichen Wirtszellen für in vivo therapeutische Verwendung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung beruht auf modifizierten Wirtszellen für in vivo therapeutische Verwendung, die verwendet werden können, um ein therapeutisch nützliches Plasmid basiertes Gen unter Verwendung eines Plasmid Aufrechterhaltungssystems zu exprimieren, das die Verwendung eines Plasmid basierten dominanten Selektionsmarkers nicht benötigt sondern ein System der Repressor Titration verwendet.
Eine besonders nützliche Anwendung davon liegt in dem Gebiet der Vakzinierung. Die frühesten Formen der prophylaktischen Immunisierung schließen die Verwendung von attenuierten Stämmen von pathogenen Organismen ein, die Antigene tragen, die sie mit den gefährlicheren Wildtyp Organismen teilen. Die Immunreaktion, die gegenüber den attenuierten Stämmen erzeugt wurde, war protektiv gegenüber einer Infektion mit dem Wildtyp Organismus. Dieser Ansatz wird heute immer noch verwendet, zum Beispiel in der Verwendung des BCG Stamms von Mycobacterium bovis.
So wie hier verwendet, bedeutet "Immunisierung" die Stimulation einer protektiven oder therapeutischen Immunantwort. "Vakzinierung" ist die bewusste bzw. gut überlegte Verabreichung von Antigenen, die in der Lage sind, eine protektive oder therapeutische Immunantwort für den Zweck einer Prophylaxe zu stimulieren. In diesem Zusammenhang können solche Antigene als "Immunogene" bezeichnet werden.
Ein "attenuierter bzw. abgeschwächter" Organismus ist in diesem Zusammenhang einer, der eine verringerte pathogene Wirkung (idealerweise eine geringe oder keine) zeigt, wenn er an einen Empfängerorganismus verabreicht wird, im Vergleich zu einem Wildtyp Pathogen. Solche attenuierten Organismen können natürlich entstehen, sie können sorgfältig durch die wiederholte Passage in vivo oder in vitro selektiert werden, oder sie können durch rekombinante DNA Technologie durch Manipulieren oder Entfernen von Genen, von denen bekannt ist, dass sie mit Virluenz assoziiert sind, konstruiert werden.
Jedoch gibt es Beschränkungen für den Ansatz der Verwendung attenuierter Stämme von bestimmten Pathogenen als Vakzinen gegen die Infektion, die durch ihre Wildtyp Äquivalente verursacht wird. Es kann kein attenuierter Stamm des relevanten Pathogens zur Verfügung stehen, oder ein solcher Stamm kann eine schlechte protektive Immunantwort hervorrufen. Die Verwendung von rekombinanten DNA Technologien erlaubt im Prinzip die Identifizierung von Genen, die für die Expression von spezifischen Antigenen durch Pathogene verantwortlich sind, die in der Lage sind, eine protektive Immunantwort zu bilden, und ihre Übertragung auf sicherere, geeignetere Wirtszellen, die als Vakzinen verwendet werden können. Solche Gene können direkt Protein Antigene kodieren, oder sie können Enzyme kodieren, die für die Biosynthese von komplexeren Kohlenhydrat oder Lipid antigenen Strukturen verantwortlich sind. Darüber hinaus erlaubt dies die Verwendung einer begrenzten Anzahl von attenuierten Wirtsstämmen, um rekombinante Antigene von irgendeinem des großen Bereichs der Spezies von Pathogenen zu transportieren.
Antigen assoziierte Gene, die auf eine geeignetere und sicherere (vorzugsweise attenuierte) Wirtszelle auf diese Weise übertragen wurden, können im Prinzip entweder in das Wirtschromosom inseriert (integriert) werden, oder sie können auf einem extra chromosomalen Element, wie einem selbst replizierenden Plasmid getragen werden. Der Vorteil der Integration liegt darin, dass das Gen stabil als ein Teil des Chromosoms aufrecht erhalten wird. Der Nachteil ist, dass eine solche stabile Integration ein komplexer und zeitaufwändiger Vorgang ist, insbesondere wenn eine Vielzahl von verschiedenen Antigen assoziierten Genen exprimiert werden soll. Die zufällige Integration kann unerwartete Wirkungen aufgrund von Insertionsinaktivierung von Wirtszellgenen hervorrufen. Die seitenspezifische Integration durch homologe Rekombination ist komplex und benötigt beachtliche Mühe und Vorsicht.
Die Vakzinierung kann mit rekombinanten attenuierten Organismen durchgeführt werden, die geeignete Antigen assoziierte Gene exprimieren, die auf chromosomalen Elementen, wie Plasmiden getragen werden (zum Beispiel Oyston et al., 1995, Infect. Immun. 63:563-568; Titball et al., 1995, Infect. Immun. 63:563-568). Die Konstruktion von geeigneten Expressionsvektoren ist vergleichsweise einfach, und die Transformation und Transfektion von solchen Vektoren stellt Routine für viele Zelltypen dar. Der Nachteil liegt darin, dass solche Plasmide nicht stabil über wiederholte Zellteilungen in der Abwesenheit von Selektionsmitteln repliziert werden. Herkömmlicherweise wird dies im Fall von transformierten Zellen in Kultur durch einen dominant selektierbaren Marker erreicht, fast immer ein Antibiotika-Resistenzgen, das von dem Plasmid getragen wird. Die Zellen wachsen in einem Medium, zu dem das relevante Antibiotika in einer geeigneten Konzentration zugegeben wird, und nur Zellen, welche das Plasmid tragen und damit das Resistenzgen exprimieren, überleben und teilen sich. Dies weist eindeutig große praktische Schwierigkeiten auf, wenn es auf die in vivo Verwendung von solchen Zellen für die therapeutische Verwendung, wie Vakzinierung, angewendet wird. Zusätzlich zu dem Risiko der Ausbreitung von Antibiotikaresistenz und der Möglichkeit einer unangebrachten Immunantwort gegenüber dem Produkt des Resistenzgens, kann es schwierig oder unmöglich sein, eine ausreichende Konzent ration des Antibiotikas in dem geeigneten Gewebe oder Kompartiment des Empfängerorganismus aufrecht zu erhalten. Es ist auf jeden Fall unerwünscht, den Empfänger gegenüber der benötigten Dosis des Antibiotikums auszusetzen, wenn es verhindert werden kann.
Die gegenwärtige Erfindung erlaubt das stabile Aufrechterhalten eines Plasmids innerhalb einer Wirtszelle, in der Abwesenheit irgendeiner externen Selektion, wie einem Antibiotikum. Die Operator Repressor Titration erlaubt es Plasmiden, sich selbst in einer geeigneten modifizierten Wirtszelle zu selektieren. Eine solche modifizierte Wirtszelle ("ORT^® Wirtszelle") muss bezüglich zweier chromosomaler Gene verändert werden, aber wenn sie einmal hergestellt wurde, kann sie für irgendeine Anzahl von "ORT^® Plasmiden" verwendet werden, die verschiedene Transgene exprimieren. Die Fähigkeit, irgendeine Anzahl von verschiedenen Antigenen unter Verwendung der gleichen attenuierten (und validierten) Wirtszelle, einfach durch Transformieren mit einem ORT^® Plasmid, welches das geeignete Antigen assoziierte Gen kodiert, zu exprimieren, wäre ein großer Vorteil. Der Mangel des Bedarfs für einen äußerlich hinzugefügten Selektionsdruck erlaubt es Wirtszellen, die innerhalb einen Empfängerorganismus gegeben wurden, Plasmide stabil aufrecht zu erhalten, die ein nützliches therapeutisches Gen kodieren und exprimieren (wie ein immunogenes Antigen oder ein Epitop davon).
Genauso wichtig erlaubt die Erfindung die Transformation eines Plasmids, das frei von irgendeinem Antibiotika-Resistenzgen ist, in eine geeignete modifizierte Bakterien- (oder andere) Wirtszelle, mit anschließendem bevorzugten Wachstum und Selektion von resultierenden Transformanten in der Abwesenheit von Antibiotika.
Die vorliegende Erfindung ist deshalb insbesondere nützlich für die Expression von einem oder mehreren antigenen Proteinen oder Peptiden oder von Enzymen, die für die Biosynthese von Nicht-Peptidantigenen benötigt werden, in Wirtszellen, um solche rekombinanten Wirtszellen an einen Empfängerorganismus zum Zweck der Bildung einer protektiven Immunantwort gegen das Pathogen, von dem das/die Antigen/e stammt/en, zu verabreichen. Solche Wirtszellen können weiter hin wachsen und sich in dem Empfängerorganismus teilen oder nicht. Das/Die von dem Plasmid abstammende/n Gen/e, welche/s das/die Antigen/e kodierten, kann/können in der Wirtszelle vor der Verabreichung an den Empfängerorganismus oder nur nach der Verabreichung an den Empfängerorganismus exprimiert werden. Die Stufe, an dem das Antigen exprimiert wird, kann reguliert werden, indem das von dem Plasmid abstammende Gen unter die Kontrolle von verschiedenen Promotoren gesetzt wird. Wo zum Beispiel die Wirtszelle eine Bakterienzelle ist und das von dem Plasmid abstammende Gen unter der Kontrolle eines bakteriellen Promotors steht, wird das Antigen in den Wirtszellen exprimiert werden, in denen das Plasmid vor der Verabreichung an einen Empfängerorganismus aufrecht erhalten wird. Wo die Wirtszelle eine Bakterienzelle ist und das von dem Plasmid abgeleitete Gen unter der Kontrolle eines eukaryonten Promotors steht, wird das Antigen in Wirtszellen nicht vor der Verabreichung exprimiert werden, sondern es wird nach Verabreichung an Wirtszellen exprimiert, welche das Plasmid in einem eukaryonten Empfängerorganismus aufrecht erhalten, wie in Garmory et al., (FEMS Microbiol Rev., 2002, 26(4):339-53) gezeigt wurde.
Dem Fachmann sind Antigene bekannt, die verwendet werden können, um eine Immunantwort gegen Pathogene zu bilden, und das Plasmid, das an die erfindungsgemäße Wirtszelle verabreicht wird, kann irgendeines dieser Antigene kodieren. Zum Beispiel wurde für das caf Operon von Y. pestis gezeigt, dass es ein vielversprechender Vakzinkandidat ist, einschließlich hoher Mengen an Immunität gegenüber Y. pestis (Titball et al., 1997, Infection & Immunity, 65: 1926-1930). Eine ORT Wirtszelle, die ein ORT Plasmid umfasst, das ein caf Operon umfasst, könnte deshalb verwendet werden, um eine Immunantwort gegenüber Y. pestis zu erzeugen.
Alternativ dazu können die Antigene von einem Tumor abgeleitet sein, und die verwendete Technik bildet eine Antitumor Immunantwort mit dem Ziel der Zerstörung des Tumors, oder zumindest zur Verlangsamung seines Wachstums.
In einer alternativen Ausführungsform kann die Erfindung verwendet werden, um therapeutische Genprodukte für andere Zwecke als die Bildung einer Immunantwort zu exprimieren und zu transportieren. Generell kann ein großer Bereich von rekombinanten Therapeutika durch dieses Verfahren transportiert werden.
Zum Beispiel können Proteine transportiert werden, um das fehlende oder verringerte Produkt eines defekten Gens, wie a-1-Antitrypsin in einer a-1-Antitrypsin Defizienz, oder Faktor VIII in Hämophilie zu ersetzen. Insbesondere geeignet wären Anwendungen, wo Therapeutika in das Darmlumen durch eingeführte rekombinante Organismen sekregiert werden, die erfindungsgemäß hergestellt wurden. Beispiele schließen die Herstellung von Bauchspeicheldrüsenenzymen ein, um natürliche Enzyme zu ersetzen, die als ein Ergebnis von zystischer Fibrose, Pankreatitis oder Pankreatektomie verringert oder abwesend sind, oder die Herstellung von extra Vitamin K.
Es ist vorgesehen, dass das Produkt des Gens, das auf dem ORT^® Plasmid kodiert wird, auf der Oberfläche der Zelle (insbesondere nützlich für Vakzinierungszwecke) exprimiert oder von der Wirtszelle sekregiert werden kann. Im Fall einer bakteriellen Wirtszelle, die in der Lage ist, innerhalb der Zellen des Empfängerorganismus zu überleben (zum Beispiel Listeria und Salmonella), erlaubt dieses System rekombinanten Antigenen, direkt in intrazelluläre Kompartimente eingeführt zu werden, was Vorteile im Fall von Antigen-präsentierenden Zellen haben kann, was die Art der nachfolgenden Präsentation durch Moleküle des Haupthistokompatibilitätskomplexes beeinflusst. Solche Vorteile sind für den Fachmann im geeigneten Technikbereich klar. Geeignete Verfahren für die Sekretion von Antigenen, die in Gram-negativen Bakterien exprimiert werden, schließen das Hämolysin Sekretionssystem von E. coli ein (Gentschev et al., 1996, Gene 179: 133; Gentschev et al., 2001, Vaccine 79:2621).
Die Erfindung kann auch verwendet werden, um therapeutische Genprodukte zu transportieren, welche die Transkriptionsprodukte von Genen sind, die von Plasmiden abstammen, wie Antisense-Oligonukleotide. Es ist auch vorgesehen, dass die Erfindung verwendet werden kann, um Gene, die von Plasmiden abstammen, zu transportieren, die selbst therapeutische Produkte sind, zum Beispiel für Gentherapiezwecke.
Die Erfindung umfasst eine transformierte attenuierte bakterielle Wirtszelle mit einem Plasmid, umfassend ein Gen von Interesse und einen Operator, welcher für das Binden durch einen Repressor, der in trans exprimiert wird, empfänglich ist, ein zweites Gen, welches den Repressor kodiert und welches auf einem Chromosom vorliegt, und ein drittes chromosomales Gen, das funktionell mit einem Operator verbunden ist und essentiell für das Wachstum ist, wobei das Plasmid in der Zelle in ausreichender Anzahl vorliegt, um den Repressor zu titrieren, so dass das essentielle Gen exprimiert wird, wodurch das Zellwachstum ermöglicht wird.
Vorzugsweise ist das dritte Gen kein Antibiotika-Resistenzgen.
So wie hier verwendet, bedeutet "funktionell assoziiert" oder "operativ assoziiert" bezüglich einer Operatorsequenz und einem assoziierten Gen, dass der Operator in cis mit dem Gen verbunden ist, so dass die Expression des Gens zur Unterdrückung durch das Binden eines Repressors an den Operator empfänglich ist.
Es wird vom Fachmann verstanden, dass der Begriff Operator verwendet wird, um irgendeine Nukleinsäuresequenz zu definieren, an die ein Repressor bindet, um Transkription von einem assoziierten Promotor zu verhindern. Die Operatorsequenz, die auf dem Plasmid anwesend ist, braucht keine Sequenz zu sein, die identisch zu der Operatorsequenz auf dem chromosomalen Gen ist, dahingehend, dass der Plasmid Operator nur aus den minimalen Sequenzen bestehen muss, die für die Bindung des Repressors notwendig sind, der die Transkription von dem chromosomalen Gen reprimiert. Es wird auch verstanden, dass mutierte Operatorsequenzen erfindungsgemäß auch nützlich sind, zum Beispiel Sequenzen, die eines oder mehrere Nukleotide inseriert, deletiert oder substituiert haben, was zu einer erhöhten oder verringerten Affinität für den entsprechenden Repressor führt.
So wie hier verwendet, betrifft "Zellwachstum" die ansteigenden Zahlen von Zellen in einem Kulturmedium oder in vivo über die Zeit, und bezieht sich auch auf das Zellüberleben, wenn sich die Anzahl der Zellen über die Zeit nicht erhöht, sondern sich die Anzahl der lebenden Zellen über die Zeit nicht verringert.
Vorzugsweise kodiert das Repressor Gen einen der E. coli lac Repressoren, insbesondere den lacI^q Repressor, den E. coli trp Repressor, den E. coli galR Repressor, den E. coli araC Repressor, den E. coli ArgRNV Repressor (Burke et al. (1994) Mol. Microbiol., 13, 609-618) und den E. coli Tet Repressor.
Wie oben beschrieben, ist jeder Repressor in trans mit einer trans-assoziierten Operatorsequenz operativ, die sowohl auf dem Chromosom als auch auf dem Plasmid anwesend ist. Die Erfindung umfasst die Anwesenheit von einem oder mehreren Repressor Genen auf dem Wirtschromosom, z.B. eines, zwei oder drei Repressor Gene, um Plasmid Stabilität sicherzustellen, wenn ein chromosomales Repressor Gen mutiert oder deletiert wird.
Bevorzugte Operatorsequenzen schließen deshalb den lac Operator, den A Operator, den trp Operator, den gal Operator, den ara Operator, den Arg Operator und den Tet Operator ein. Wenn es gewünscht ist, kann der korrespondierende Promotor funktionell mit seinem Operator assoziiert sein.
Mehr als ein verschiedenes essentielles chromosomales Gen, das funktionell mit dem Operator assoziiert ist, kann in dem Chromosom der Zelle anwesend sein, wobei das essentielle Gen mit einem Operator verbunden ist und deshalb für die Unterdrückung durch den Repressor empfänglich ist, um vor Verlust der Repressor Empfänglichkeit an einen chromosomalen Operator zu schützen. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Gen, welches das Repressor Protein kodiert, in zwei oder drei Kopien an verschiedenen Stellen in dem Chromosom anwesend, um vor dem Verlust der Repressor Expression an einer chromosomalen Stelle zu schützen.
Bevorzugte essentielle Gene, die auf dem Wirtschromosom angeordnet sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Gene, die in die folgenden Kategorien fallen: Gene, die Produkte kodieren, die mit der Biosynthese von Zellmetaboliten in Verbindung stehen, wie Zellwandvorläufer, Gene deren Produkte in den Kohlenhydrat Metabolismus involviert sind, Gene, die für Antibiotikaresistenz kodieren, und Gene, die Biosynthese oder Regulation von Makromolekülen kodieren, z.B. Gene, die essentiell für die DNA und/oder RNA Synthese und Replikationsfunktionen sind.
Vorzugsweise umfasst das Plasmid einen Replikationsursprungspunkt, der Replikation von ungefähr 20 Kopien des Plasmids pro Wirtszelle, oder so viele wie ungefähr 200 Kopien Plasmid pro Wirtszelle erlaubt. Beispiele von solchen Plasmiden schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf jene, die den pBR322 Replikationsursprungspunkt enthalten, und die pUC Serie von Plasmiden, die durch Vieira & Messing (1982, Gene, 19(3), 259268) und Yanisch-Perron et al. (1985, Gene, 33(1), 10S-119) beschrieben sind, die hier als pUC bezeichnet werden. Alternative Plasmide, die verwendet werden können, schließen das pAHL Plasmid, das von dem pAH34L Plasmid abgeleitet ist, das von Titball et al. (1997, Infection & Immunity, 65: 1926-1930) beschrieben wurde, ein.
So wie hier verwendet, betrifft "Replikationsursprungspunkt" jene Sequenzen auf dem Plasmid, die für das Aufrechterhalten des Plasmids in einer gegebenen Kopienzahl pro Zelle notwendig sind.
Das hier beschriebene Repressor Titrationssystem erlaubt die stabile Aufrechterhaltung von Plasmiden in mittlerer oder hoher Kopienzahl ohne die Verwendung von Plasmid kodierten dominanten Selektionsmarkern, wie für Antibiotikaresistenz, und es kann mit irgendeinem Wirt verwendet werden, der ein trans wirkendes Repressor/Operatorsystem unterstützen kann. Ein Vorteil der Erfindung liegt darin, dass sie sich auf die Plasmid Aufrechterhaltung anstelle von Antibiotikaselektion von Plasmid tragenden Zellen stützt. Die Abwesenheit von dominanten Selektionsmarkern, wie Antibiotika-Resistenzgenen auf dem Plasmid, so wie hier be schrieben, ist auch vorteilhaft dahingehend, dass sie die möglicherweise ernsten Probleme vermeidet, die mit der Expression dieser Gene in einem Empfängerorganismus, insbesondere einem Menschen, in Verbindung stehen, und dass sie die weit verbreitete Verwendung von bakteriellen Genen, die Antibiotikaresistenz kodieren, vermeidet, deren Verwendung dazu neigt, die Übertragung von solchen Genen in der bakteriellen Population als Ganzes zu fördern.
Die transformierte attenuierte Bakterienzelle ist vorzugsweise eine enterobakterielle Zelle, weiter bevorzugt eine Zelle des Genus Salmonella, und am meisten bevorzugt eine Zelle der Spezies Salmonella typhimurium oder der Spezies Salmonella typhi.
Es ist weiterhin bevorzugt, dass die transformierte attenuierte Bakterienzelle attenuiert wurde, um ihre Pathogenität durch eine Modifikation ihres aroA-Gens, aroC-Gens, aroD-Gens oder htrA-Gens zu verringern. Die transformierte Zelle kann eine Modifikation von einem oder mehrerer dieser Gene aufweisen.
Am meisten bevorzugt stammt die attenuierte transformierte Zelle von dem Stamm Salmonella typhimurium SL3261 oder von dem Stamm Salmonella typhi CVD 908-htr.
Es ist auch bevorzugt, dass das dritte Gen, das von der Zelle umfasst ist, ein Enzym kodiert, das für die bakterielle Zellwandsynthese benötigt wird. Weiter bevorzugt ist das Gen dapD.
Alternativ dazu kodiert das dritte Gen, das in der Zelle enthalten ist, ein Enzym, das für die Fettsäuresynthese benötigt wird. Weiter bevorzugt ist das dritte Gen fabA.
Das Gen von Interesse kann irgendein Gen sein, von dem gewünscht wird, dass es zu dem Empfängerorganismus transportiert wird. Das Gen von Interesse kann ein Antigen sein, oder das Transkriptionsprodukt des Gens von Interesse kann ein Antisense-Oligonukleotid sein. Vorzugsweise ist das Gen von Interesse funktionell mit einem bakteriellen Promotor oder einem eukaryonten Promotor verbunden.
Die transformierte attenuierte Bakterienzelle wird als ein Medikament verwendet. Die Verwendung der transformierten Zelle als ein Medikament wird von der Natur des Gens von Interesse abhängen. Vorzugsweise kann die transformierte Zelle als ein Gen Transportsystem verwendet werden. Zum Beispiel kann die transformierte Zelle verwendet werden, um ein Gen von Interesse für Gentherapiezwecke zu transportieren. Die transformierte Zelle kann auch verwendet werden, um ein Gen von Interesse zu transportieren, dessen Transkriptionsprodukt eine therapeutische Wirkung aufweist, wie ein Antisense-Oligonukleotid, oder um ein Gen von Interesse zu transportieren, das ein Antigen kodiert, das eine therapeutische Wirkung aufweist.
Alternativ dazu kann die transformierte Zelle als ein Immunogen verwendet werden. Gemäß dieser Ausführungsform kann das Gen von Interesse eines oder mehrere Antigene kodieren, die eine Immunantwort in dem Empfängerorganismus hervorruft/en. Der Fachmann kennt Gene von Interesse, die Antigene kodieren, die eine Immunantwort in dem Empfängerorganismus auslösen, und die in das Plasmid in der erfindungsgemäßen transformierten Zelle eingeschlossen werden können. Ein Beispiel von Genen von Interesse, die in das Plasmid eingeschlossen werden können, um eine Immunantwort in dem Empfängerorganismus hervorzurufen, sind die cafI, cafIA und cafIM Gene des caf Operons.
Das Gen von Interesse kann in der transformierten Zelle transkribiert, oder transkribiert oder translatiert werden, vor der Verabreichung an einen Empfängerorganismus oder nur im Anschluss an die Verabreichung an den Empfängerorganismus, in Abhängigkeit von der Identität des Promotors und der transformierten Zelle. Wo zum Beispiel das Gen von Interesse ein Antigen kodiert, das eine Immunantwort hervorruft, das mit einem eukaryonten Promotor verbunden ist, und die transformierte Zelle eine Bakterienzelle ist, wird das Antigen nur exprimiert um eine Immunantwort im Anschluss an die Verabreichung an den Empfängerorganismus hervorzurufen.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur Verwendung als ein Medikament bereitgestellt, umfassend irgendeine der oben beschriebenen Zellen zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Bindemittel, Verdünnungsmittel oder Puffer, die dem Fachmann im relevanten Gebiet gut bekannt sind. Gemäß einer Ausführungsform dieses Aspekts ist die pharmazeutische Zusammensetzung eine Vakzinzusammensetzung. Die Vakzinzusammensetzung kann eines oder mehrere Adjuvans/Adjuvantien zusätzlich zu dem Bindemittel, Verdünnungsmittel oder Puffer enthalten.
Andere Eigenschaften und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon und aus den Patentansprüchen offensichtlich.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist ein Diagramm, das die Verwendung des Plasmids pKO3 (1A) für Geninsertion (1B) von Link et al., 1997, J. Bacteriol. 179:6228-6237 darstellt.
2A zeigt den chromosomalen dapD Locus, und B zeigt die PCR Produkte, die durch den Klonierungsvorgang daraus gebildet werden.
3 zeigt Karten von Plasmiden, die in der Konstruktion von SL3261dapD verwendet wurden (A: pTrc99; B: pGEM-T Easy; C: placPdapD6; D: pTrc99dapD; E: pGEM-TeasydapDL(–); F: pGEM-TeasydapDR(–); G: pDRdapD(+); H: pdapDB(+); I: pKO3; J: pKO3dapD).
4A zeigt den chromosomalen fabA Locus, und B zeigt die PCR Produkte, die durch den Klonierungsvorgang daraus gebildet werden.
5 zeigt Karten von Plasmiden, die in der Konstruktion von SL3261fabA verwendet wurden (A: pCR2.1; B: pORT1; C: pCR2.1STfabA(–); D: pORfabA(+); E: placfabA; F: pTrc99fabA; G: pORIIacfabA; H: pKO3fabA).
6 ist ein Vergleich der Wachstumskurven von SL3261 in LB und von SL3261dapD in LB und IPTG.
7: Das Plasmid pUC18I.
8: In vitro Aufrechterhaltung von pUC18I in SL3261dapD. Durchschnittliche Kolonienzahlen von SL3261dapD(pUC18I) auf LB-IPTG und auf Ampicillin sind gezeigt.
9: In vitro Aufrechterhaltung von pUC18I in SL3261dapD. Agarosegel von Minipräps, um die Anwesenheit von pUC18I in SL3261dapD zu zeigen. M = kb Leiter; C = pUC18I Referenz. Die Zeitpunkte von "Tag 0" bis "Tag 5", wie in Beispiel 4 beschrieben, wurden in chronologischer Reihenfolge aufgetragen. 1-2-3: SL3261dapD(pUC18I) Klone.
10: In vivo Aufrechterhaltung von pUC18I in SL3261dapD in Mäusen.
Erste Gruppe von Mäusen wurde mit SL3261 als einer Kontrolle injiziert: geschlossene Rauten = gesamt lebende Salmonella, die in Milzzellen nachgewiesen wurden, die auf LB Agar ausplattiert wurden; offene Rauten = gesamt lebende Salmonella, die in PP Zellen nachgewiesen wurden, die auf LB Agar ausplattiert wurden.
Zweite Gruppe von Mäusen, die mit SL3261 enthaltend pUC18I injiziert wurden: geschlossene Dreiecke = gesamt lebende Salmonella, die in Milzzellen nachgewiesen wurden, die auf LB Agar ausplattiert wurden; offene Dreiecke = Salmonella enthaltend pUC18I, die in Milzzellen nachgewiesen wurde, die auf LB Agar mit Ampicillin ausplattiert wurden; Dreiecke mit einem Strich = gesamt lebende Sal monella, die in PP Zellen nachgewiesen wurden, die auf LB Agar ausplattiert wurden; Dreiecke mit mehreren Strichen = Salmonella enthaltend pUC18I, die in PP Zellen nachgewiesen wurde, die auf LB Agar mit Ampicillin ausplattiert wurden.
Dritte Gruppe von Mäusen, die mit SL3261dapD enthaltend pUC18I injiziert wurden: geschlossene Kreise = gesamt lebende Salmonella, die in Milzzellen nachgewiesen wurden, die auf LB Agar und IPTG ausplattiert wurden; offene Kreise = Salmonella enthaltend pUC18I, die in Milzzellen nachgewiesen wurden, die auf LB Agar mit Ampicillin ausplattiert wurden; Kreise mit einem Strich = gesamt lebende Salmonella, die in PP Zellen nachgewiesen wurden, die auf LB Agar mit IPTG ausplattiert wurden; Dreiecke mit mehreren Strichen = Salmonella enthaltend pUC18I, die in PP Zellen nachgewiesen wurden, die auf LB Agar mit Ampicillin ausplattiert wurden.
Bakterielle Anzahlen bzw. Kolonien für die drei Gruppen von Mäusen, gezeigt 8, 12 und 16 Tage nach Injektion. Die horizontale Linie entlang der Graphik unmittelbar überhalb von 1 auf der vertikalen Achse zeigt die Nachweisgrenze.
11: Das Plasmid pAHL.
12: Wachstumskurven von SL3261(pAH34L) in LB-Kanamycin und von SL3261dapD(pAHL) in LB.
13: In vitro Aufrechterhaltung von pAHL in SL3261dapD. Durchschnittliche Kolonienzahlen von SL3261dapD(pAHL) auf IPTG und auf LB sind gezeigt.
14: In vitro Aufrechterhaltung von pAHL in SL3261dapD. Agarosegel der Minipräps, um die Anwesenheit von pAHL in SL3261dapD zu zeigen. M = kb Leiter; K = pAHL Referenz. Die Zeitpunkte von "Tag 0" bis "Tag 5", wie in Beispiel 7 beschrieben, wurde in chronologischer Reihenfolge aufgetragen. 1-2-3: SL3261dapD(pAHL) Klone.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung wird durch die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele dargestellt, worin die folgenden Materialien und Methoden eingesetzt wurden. Die gesamte Offenbarung von jeder der Literaturstellen, die hier im Folgenden zitiert sind, ist durch Bezugnahme hierauf eingeschlossen.
Erfindungsgemäß nützliche Repressor/Operatorsysteme.
Die Erfindung kann mit irgendeinem trans-wirkenden Repressor/Operatorsystem verwendet werden. Zum Beispiel kann das hier beschriebene Repressor Titrationssystem irgendeinen Repressor einschließen, der eine ausreichende Affinität für seine DNA Bindungssequenz aufweist, so dass er in der Lage ist, die Expression eines essentiellen chromosomalen Gens zu verhindern, aber der auch durch eine von einem Plasmid stammende DNA Bindungssequenz titrierbar ist.
Das essentielle chromosomale Gen, das gegenüber einer Repression durch den Repressor empfänglich ist, wird gegenüber der Repression empfänglich gemacht, indem es unter die Kontrolle eines Operators/Promotors gestellt wird, der den Repressor bindet, oder die Repressor Bindungssequenz (d.h. Operator) wird in den natürlichen Promotor des essentiellen Gens in einer solchen Weise inseriert oder ist mit ihr assoziiert, dass sie die Transkription verhindern kann, wenn sie durch den Repressor gebunden ist, aber so dass sie die Fähigkeit des natürlichen Promotors, die Transkription des essentiellen Gens in der Abwesenheit von Repressor Bindung zu initiieren, nicht zerstört.
Mehr als ein verschiedenes essentielles Gen kann in dem Chromosom anwesend sein, z.B. zwei oder drei Gene, wobei jedes Gen funktionell mit einer Operatorsequenz verbunden ist und somit gegenüber der Repression durch den Repressor empfänglich ist. Die Anwesenheit von verschiedenen Repressor empfänglichen essentiellen Genen auf dem Chromosom, vorzugsweise an verschiedenen Stellen in dem Chromosom, reduziert die Möglichkeit des Verlusts der Plasmid Stabilität über eine Mutation oder Deletion, was zu einem Verlust von Repression eines essentiellen chromosomalen Gens führt.
Der Repressor wird durch ein chromosomales Gen kodiert. Erfindungsgemäß sind eine oder mehrere vorzugsweise eine, zwei oder drei Kopien des chromosomalen Repressor Gens in der Wirtszelle anwesend. Das chromosomale Repressor Gen kann ein natürlich vorkommendes Gen sein, das nicht modifiziert wurde, oder es kann eine genetische Mutation enthalten, die dem Repressor Molekül eine höhere oder geringere Affinität bezüglich der Stärke der Bindung an ihren entsprechenden Operator verleiht. Solche Mutationen sind im Stand der Technik bekannt, zum Beispiel kann die Affinität des lac Repressors für seinen Operator durch einzelne Aminosäure Austausche verstärkt werden (siehe Betz, (1986) Gene, 42, 283-292 und Khoury et al., (1991) J. Mol. Biol., 219, 623-634). Alternativ können eine oder mehrere Kopien der Operator Bindungsstelle in das Plasmid eingeführt werden, oder mehr oder weniger Kopien des Repressor Gens können in das Chromosom eingeführt oder in einer alternativen Ausführungsform auf einem Plasmid getragen werden.
Alternativ dazu können die Sequenzen, welche die Expression des Repressor Gens initiieren, wie Promotoren, Enhancer etc., mutiert oder genetisch verändert sein, so dass eine höhere oder niedrigere Zahl von Repressor Molekülen in der Zelle hergestellt wird.
Zum Beispiel kann die Anzahl von Kopien des lacI Repressors durch die Einführung der lacI^q Mutation (siehe Carlos (1978) Nature 274, 762-765) gesteigert werden. Die Zahl von Repressor Molekülen, die in der Zelle anwesend sind, wird von der Kopienzahl des Plasmids abhängen, das die entsprechende Operatorsequenz trägt. Gemäß dem erfindungsgemäßen Repressor Titrationssystem ist die Konzentration des Repressors, der in der Wirtszelle anwesend ist, derart, dass in der Abwesenheit des Plasmids das essentielle Gen von Interesse nicht exprimiert wird, aber in der Anwesenheit des Plasmids der Repressor von dem essentiellen Gen wegtitriert wird. Wenn mehr als eine Kopie des Repressor Gens in dem Chro mosom anwesend ist, z.B. zwei oder drei Kopien, wird die Menge des Repressor Proteins, das in der Zelle hergestellt wird, relativ zu der Anwesenheit des einen Gens ansteigen; dieser Anstieg wird berücksichtigt, wenn ein entsprechender Replikationsursprungspunkt ausgewählt wird, und bei der Auswahl der Anzahl von chromosomalen Operator/essentiellen Genen, die in der Zelle anwesend sind.
Die Stärke der Operatoren und die Affinitäten des Repressors können derart verändert werden, um das System für die Verwendung mit Plasmiden mit verschiedenen Kopienzahlen maßzuschneidern. Zum Beispiel kann das Ausmaß der Repression des lac Operons durch die Einführung eines optimal angeordneten hilfsweise idealen lac Operators (d.h. ein lac Operator mit verstärkter Repressor Affinität) oder die Einführung eines idealen Operators innerhalb des Promotors (Muller et al., (1996) Mol. Biol., 257, 21-29 und Lewis et al., (1996) Science 271, 1247-1254) verstärkt werden.
Alternativ dazu könnte die Stärke des Operators durch die Einführung eines nicht idealen Operators, einer nicht optimalen Positionierung des Operators oder Eliminierung eines Hilfsoperators (Muller et al., (1996) Mol. Biol., 257, 21-29 und Oehler et al., (1990) EMBO J. 219, 973-979) verringert werden. Zum Beispiel kann die Affinität des lac Repressors für seinen Operator durch einzelne Aminosäure Austausche (Betz, (1986) Gene, 42, 283-292) verstärkt werden.
Erfindungsgemäße nützliche Repressor Systeme
Erfindungsgemäß nützliche Repressor Systeme schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die Folgenden. Der E. coli lac Repressor ist beschrieben in "The Lactose Operon", J. Beckwith, in Escherichia coli und Salmonella typhimurium, Hrsg., J.L. Ingraham et al., 1987 Amer. Soc. Micro. S. 1444-1452, und Dickson et al., 1975, Science 187:27-35.
Das lac Operon wird wie folgt reguliert. Unter nicht induzierten Bedingungen (wie Wachstum auf Glucose) bindet LacI den Operator des lac Operons und verhindert die Transkription von β-Galactosidase (LacZ), Lactose Permease (LacY) und einer Transacetylase (LacA). Unter induzierenden Bedingungen (wie Wachstum auf Lactose oder Zugabe von IPTG, ein nicht metabolisierbares Analog) bindet der Repressor nicht länger an den Operator, und Transkription findet statt. Die Expression des Operons wird einfach durch einen Assay für β-Galactosidase nachgewiesen. Andere Repressor Systeme, die erfindungsgemäß nützlich sind, schließen das Lac Repressor System, das oben beschrieben ist, und das tet Repressor System zur Verwendung zur Regulation von Genaktivität ein eukaryonten Zellen ein (Gossen et al., (1994) Current Opinions in Biotechnology, 5, 516-520). Das tet Repressor System wurde in Hefe, Dictyostelium, Pflanzenzellen und Tabakpflanzen verwendet. Ein weiteres Repressor System, das erfindungsgemäß nützlich ist, ist das ArgRNV Repressor System (Burke et al., (1994) Mol. Microbiol. 13, 609-618). Der ArgR Repressor bindet normalerweise an seinen Operator in der Anwesenheit von Arginin. Jedoch bindet der mutante ArgRNV Repressor an den Operator in der Abwesenheit von Arginin und bleibt in der Anwesenheit von Arginin gebunden und weist eine transdominante Wirkung auf. Eine idealisierte ArgR Bindungsstelle (Operator) mit zwei symmetrischen Arg Boxen kann in dem Plasmid von Interesse verändert werden, um die Titration von ArgRNV weg von einem essentiellen Gen zu ermöglichen, dessen Expression durch die ArgR Bindungsstelle kontrolliert wird.
Der Fachmann wird erkennen, dass bestimmte Modifikationen an dem hier beschriebenen Repressor Titrationssystem gemacht werden können, die dazu dienen, das System an ein gegebenes Protokoll anzupassen. Wo zum Beispiel das Wachstumsmedium Bestandteile enthält, welche die Repression des Operators induzieren anstatt sie zu erlauben und induzierende Bedingungen während des Wachstums nicht gewünscht sind, können Operator- oder Repressor Mutanten verwendet werden, um die Induktion zu überwinden und die Repression zu erlauben. Ein Beispiel eines mutanten Repressors ist eine LacI Mutante des lac Repressors. Eine LacI Mutante weist nicht länger die Fähigkeit auf, den Induktor zu binden. Beispiele von lacI Mutanten schließen z.B. LacI Mutanten (Beyreuthe, 1978, Cold Spring Harbor Laboratory, CSH, NY) und andere Mutanten wie Asp276 → Asn274 (Chang et al., 1994, Biochem. 10, 22:3607-3616) ein. Durch das Austauschen des Wildtyp Repressors gegen einen mutanten Repressor der nicht sensitiv gegenüber dem Induktor ist, ist der Repressor in der Lage an den Operator während des Wachstums zu binden, und das Plasmid wird in der Wirtszelle selbst unter Bedingungen aufrecht erhalten, die normalerweise den Repressor induzieren.
Der E. coli trp Repressor ist auch erfindungsgemäß nützlich (siehe "The tryptophan Operon", Yanofsky und Crawford, in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Hrsg., J.L. Ingraham et al., 1987, Amer. Sec. Micro. S. 1453-1472). Der trp Repressor ist in ungefähr 50 Kopien/Zelle anwesend und benötigt die Anwesenheit von Tryptophan in dem Fermentationsmedium als einen Induktor der Repressor Bindung.
Der E. coli gal R Repressor ist auch erfindungsgemäß nützlich (siehe "The Galactose Operon", S. Adhya, in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Hrsg., JL. Ingraham et al., 1987, Amer. Soc. Micro., S. 1503-1512).
Der E. coli ara C Repressor ist auch erfindungsgemäß nützlich (siehe "The L-Arabinose Operon", R. Schlief, in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Hrsg., JL. Ingraham et al., 1987, Amer. Soc. Micro., S. 1473-1481; Dunn et al., 1984, Proc. Nat. Aca. Sci. 81; 5017-5020). Der ara C Repressor weist eine erhöhte Bindungsaffinität in der Anwesenheit von Arabinose auf. Schließlich ist der A Repressor erfindungsgemäß nützlich (Introduction to Lambda Phages, in Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel, et al., 1994, Abschnitt III, Einheit 1.9; Hochschild et al., 1986, Cell 47(5); 807-816).
Erfindungsgemäß nützliche Plasmide
Die Erfindung kann vorteilhafterweise mit einem Plasmid Replikationsursprungspunkt verwendet werden, der eine Replikation von mindestens 5, vorzugsweise mindestens 10 – 100 und am meisten bevorzugt mindestens 100 – 500 Kopien des Plasmids pro Wirtszelle erlaubt. Diese Replikationsursprungspunkte, welche die Replikation von mittleren (d.h. 20 – 50) bis hohe Plasmid (d.h. 100 – 500) Kopienzahlen erlauben, sind insbesondere nützlich dahingehend, dass mittlere bis hohe Plasmid Kopienzahlen die Repressor Moleküle einfach titrieren können. Selbstverständlich kann, wenn gewünscht, ein Plasmid mit einer Kopienzahl so hoch wie 1000 – 2000 Kopien pro Zelle ebenfalls verwendet werden.
Plasmide mit niedrigen Kopienzahlen (d.h. 5 Kopien oder weniger) werden am vorteilhaftesten erfindungsgemäß nach einer Mutation verwendet, um eine gesteigerte Kopienzahl hervorzubringen (J. Scott, 1984, Microbial Reviews 48:1-23). Von den häufig verwendeten Replikationsursprungspunkten ist pBR322 (20 Kopien/Zelle) erfindungsgemäß nützlich, und pUC (bei 200 Kopien/Zelle) ist bevorzugt. Obwohl sie nicht bevorzugt sind, sind andere Plasmide, die erfindungsgemäß nützlich sind, jene, welche die Anwesenheit von Plasmid kodierten Proteinen für die Replikation benötigen, zum Beispiel der pT181, FII und FI Replikationsursprungspunkt.
Beispiele von Replikationsursprungspunkten, die erfindungsgemäß in E. coli und S. typhimurium nützlich sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf pMB1 (25 oder mehr Kopien pro Zelle, 20 Bolivar et al., 1977, Gene 2:95-113), ColEI (15 oder mehr Kopien pro Zelle, Kahn et al., 1979, Methods Enzymol. 68:268-280), p15A (ungefähr 15 Kopien pro Zelle, Chang et al., 1978, J. Bacteriol. 134:1141-1156); pSC101 (ungefähr 6 Kopien pro Zelle, Stoker et al., 1982, Gene 18:335-341); R6K (weniger als 15 Kopien pro Zelle, Kahn et al., 1979, supra); R1 (Temperatur abhängiger Replikationsursprungspunkt, Uhlin et al., 1983, Gene 22:255-265); Lambda dv (Jackson et al., 1972, Proc. Nat. Aca. Sci. 69:2904-2909). Ein Beispiel eines Replikationsursprungspunktes, der in Staphylococcus nützlich ist, ist pT181 (ungefähr 20 Kopien pro Zelle, J. Scott, 1984, Microbial Reviews 48:1-23). Von den oben beschriebenen Replikationsursprungspunkten sind pMBI, p15A und ColEI bevorzugt, weil diese Ursprungspunkte keine Plasmid kodierten Proteine für die Replikation benötigen.
Erfindungsgemäß nützliche Wirtszellen.
Die Erfindung ist auf alle Zelltypen einschließlich tierischer Zellen wie Säuger- und Insektenzellen, Pflanzenzellen, Pilze, wie Hefe, und die meisten Bakterienstämme, zum Beispiel Gram-positive und -negative bakterielle Stämme anwendbar, vorausgesetzt es existiert ein Plasmid, das in der Lage ist, in der Wirtszelle in einer mittleren bis hohen Kopienzahl aufrecht erhalten zu werden.
Gram-negative Bakterien, die erfindungsgemäß nützlich sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf E. coli und Salmonella, z.B. S. typhimurium.
Gram-positive Spezies, die erfindungsgemäß nützlich sind, schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf Bacillus, Streptomyces, Lactobacillus und Lactococcus, für die bereits Plasmide mit hohen Kopienzahlen existieren. Beispiele von Plasmiden, die erfindungsgemäß in Lactococcus nützlich sind, sind pNZ2123 und pIL253 (Simon et al., Biochimie 60:559, 1988). Das lactokokkale Lactose Operon wurde verwendet, um die Expression von heterologen Proteinen zu kontrollieren (Wells et al., 1993, Mol. Microbiol. 8(6):1155-1162). Dieses Operon verwendet den IacR Repressor (von Rooigan et al., J. Biol. Chem. 265:18499-18503, 1990), um die Expression von T7 Polymerase zu kontrollieren, die wiederum die Expression des heterologen Proteins kontrolliert. Beispiele von Plasmiden, die in Bacillus erfindungsgemäß nützlich sind, sind pC194, pUB110 und pT181. In Bacillus, z.B. B. subtilis wurde der A Repressor verwendet, um die Expression von heterologen Proteinen zu kontrollieren. Der A Repressor wurde unter die Kontrolle des sak42D Promotors gesetzt, der wirksam in B. subtilis transkribiert werden kann (Breitling et al., 1990, Gene 93(1): 35-40).
Hefen sind erfindungsgemäß nützlich, weil hohe Kopienzahlen von Plasmiden in Hefen aufrecht erhalten werden. Beispiele von solchen Plasmiden schließen die YRp Plasmide (basierend auf autonom replizierenden Sequenzen (ARS)), die Kopienzahlen von ungefähr 100 Kopien pro Zellen aufweisen, und die YEp Plasmide (basierend auf dem 2 Mikron Kreis), mit einer Kopienzahl von 50 – 100 pro Zelle, ein (siehe Sikorski, "Extrachromosomal cloning vectors of Saccharomyces cerevisiae", in Plasmids, A Practical Approach, Hrsg. K.G. Hardy, IRL Press, 1993; und Yeast Cloning Vectors and Genes, Abschnitt II, Einheit 13.4, Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg, Ausubel et al., 1994). Hefen sind in der Lage, das E. coli IacZ Gen zu exprimieren, es ist deshalb erfindungsgemäß vorgesehen, das lac Repressor Titrationssystem zu verwenden, um die Expression von essentiellen Hefegenen, wie ura3 oder leu2 zu kontrollieren, Gene, die für die Aufrechterhaltung von Plasmiden in Hefen verwendet wurden (Gunge, 1983, Ann. Rev. Micro. 37:253-276).
Insbesondere nützlich sind attenuierte Wirtszellen, die attenuiert wurden, so dass sie im Wesentlichen frei von Nebenwirkungen für die therapeutische Verwendung in Empfängerorganismen sind. Abhängig von der Spezifität der Zelle können sie geeignet für veterinärmedizinische oder humane therapeutische Verwendung sein.
Unter den attenuierten Bakterien stehen die folgenden zur Verfügung:
Salmonella typhimurium einschließlich den Stämmen SL3261 (aroA Mutante, Titball et al., 1997, Infection and Immunity 65: 1926, Titball, et al., 1995, Infection and Immunity 63: 563), VNP20009 (purI und msbB Mutante, Toso et al., 2002, J Clin Oncol 29: 142);
Salmonella typhi einschließlich der Stämme CVD 908-htrA, χ4073, χ4632, Ty800, CVD 909 und CVD 915 (Galen et al., 1999, Infect. Immun. 67: 6424-6433; Morona et al., 1991, Gene 107: 139-144; Tacket et al., 1997, Infect. Immun. 65: 3381-3385; Garmory et al., 2002, FEMS Microbiology Reviews 26: 339-353);
Salmonella gallinarum einschließlich Stamm 9R (für Vogelvakzinierung, Feberwee et al., 2001, Avian Dis 45: 1024);
Escherichia coli einschließlich aroA, cnfI und OMP Mutanten (Rippere-Lampe et al., 2001, Infect Immunol 69: 3954);
Shigella flexneri einschließlich Stamm S. flexneri 2a guaBA (Altboum et al., 2001, Infect Immunol 69: 3150);
Vibrio cholerae einschließlich Stamm Peru2 (Ryan et al., 2000, Infect. Immun. 68: 221-226);
Listeria monocytogenes einschließlich PrfA und SvpA Mutanten (Sheehan et al., 1996, Mol Microbiol 20: 785; Borezee et al., 2001, Microbiology 747:2913);
Brucella abortus einschließlich Stamm RB51 (Vemulapalli et al., 2000, Infect Immunol 68:3290);
Mycobacterium bovis einschließlich dem Stamm Calmette-Guerin (BCG); und
Mycobacterium tuberculosis. Auxotrophe von M. tuberculosis sind bekannt, die direkt für den ORT^® Ansatz verwendet werden können, wie die trpD Mutante (Tryptophan auxotroph, Smith et al., 2001, Infect Immun 69: 1142).
Erfindungsgemäß nützlich essentielle Gene.
Die Erfindung kann in Verbindung mit einer Vielzahl von verschiedenen essentiellen chromosomalen Wirtsgenen für die stabile Aufrechterhaltung des Plasmids verwendet werden. Diese essentiellen Gene schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die folgenden Kategorien, z.B. Gene, die Produkte kodieren, die mit der Biosynthese von Zellmetaboliten in Verbindung stehen, Gene, deren Produkte in den Kohlehydrat Metabolismus involviert sind, Gene, die für Antibiotikaresistenz kodieren und Gene, welche die Biosynthese oder die Regulation von Makromolekülen kodieren, z.B. Gene, die essentiell für die DNA und/oder RNA Synthese und Replikationsfunktionen sind.
1. Essentielle Gene, die Produkte kodieren, die mit der Synthese von Bestandteilen der Zellstruktur in Verbindung stehen.
Bestimmte Gene, die Enzyme kodieren, die in die Versorgung von Zellwandbestandteilen involviert sind, insbesondere die Versorgung von Zellwandvorläufern, sind ebenfalls essentiell für das Wirtszellwachstum und sind erfindungsgemäß nützlich. Zum Beispiel enthält die Bakterienzellwand Mesodiaminopimelinsäure (DAP) und eine Unfähigkeit, diesen Bestandteil zu synthetisieren, führt zur Zelllyse.
Es wurde gezeigt, dass Mutanten, in denen das asd Gen (Aspartat p-Semialdehyd Dehydrogenase) oder das dapD Gen (Tetrahydrodipicolinat N-Succinyl Transferase) deletiert sind, für die Aufrechterhaltung von Plasmiden, die eine vollständige Kopie dieses Gens auf dem Plasmid tragen, verwendet werden können (Nakayama et al., Bio/technology 6:693-697, 1988; DeGryse, U.S. Pat Nr. 5,198,343).
Eine Vielzahl von anderen Genen in dem DAP biosynthetischen Weg könnte ebenfalls verwendet werden, nämlich die dapA, dapB, dapC und dapE Gene. dapA und dapB wurden kloniert und sequenziert, und dapB steht als ein einzelnes Cistron zur Verfügung (Richaud et al., J. Bacteriol. 166:297-300, 1986; Bouvier et al., J. Biol. Chem. 259:14829-14834, 1984).
Die Gene, die in die Biosynthese von anderen Zellwandbestandteilen involviert sind, wie D-Alanin Biosynthese, sind ebenfalls erfindungsgemäß nützlich (Walsh, 1989, J. Biol. Chem. 264(5):2393-2396). Eine DNA Sequenz, die einen Bestandteil für D-Alanin kodiert, wurde für die Stabilisierung von Plasmiden ohne die Verwendung von Antibiotika verwendet (siehe EP 85/309020).
Gene, die in die Fettsäure Biosynthese involviert sind, sind ebenfalls erfindungsgemäß nützlich. Ein Beispiel ist fabA, das 3-Hydroxydecanoyl-ACP Dehydrase kodiert, das für die Einfügung einer Doppelbindung in die wachsende Fettsäurekette an dem Punkt verantwortlich ist, wo sich ungesättigte und gesättigte Fettsäu re Biosynthese teilt (Cronan Jr.J.E. und Rock. C.O. (1987), Biosynthesis of membrane lipids. In "Escherichia coli und Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology", Neidhardt F.C. (Hrsg.) American Society of Microbiology, Washington D.C.). Das Enzym ist in einer relativ hohen Konzentration anwesend, und fabA Mutanten lysieren, außer sie werden mit einer ungesättigten Fettsäure ergänzt.
Die Erfindung sieht die Verwendung von Repressor Titration in Verbindung mit solchen Genen vor. Das Wildtyp Gen von Interesse ist aus dem Wirtsstamm deletiert und gegen eine Kopie ausgetauscht, in der die Expression durch einen Promotor/Operator gesteuert wird, der das gewählte Repressor Protein bindet, unter Verwendung eines Wirtsstamms, der das Repressor Protein synthetisiert. Die Transformation des Stamms mit einem Plasmid, das die Repressor Bindungssequenz enthält, führt deshalb zur Titration des Repressors weg von dem biosynthetischen Gen, was die Expression des essentiellen Gens erlaubt.
2. Gene, die für das Zellwachstum essentiell sind
Das erfindungsgemäße Repressor Titrationsverfahren kann mit Genen verwendet werden, die in die Verwertung von Kohlenstoffquellen involviert sind. Insbesondere kann das Verfahren mit dem Lactose Operon und der Verwertung von Lactose als der einzigen Kohlenstoffquelle, wie hier beschrieben, verwendet werden. Andere Modifikationen werden für den Fachmann offensichtlich sein. Es existieren Mutanten des lac Repressors, die nicht länger in der Lage sind, den Induktor (Allolactose) zu binden und die an den lac Operator bei normalen induzierenden Bedingungen gebunden bleiben. Sie werden durch die lac IS Mutanten typisiert; jedoch existieren andere Mutationen, die keine Fähigkeit besitzen, den Induktor zu binden, aber die in allen anderen Funktionen normal sind (Chang et al., Biochem. 33:3607-3616 (1994)).
Stämme, die die Mutationen tragen, wären nicht in der Lage, die Gene des lac Operons zu exprimieren, und damit nicht in der Lage, mit Lactose als der einzigen Kohlenstoffquelle zu wachsen. Die Transformation solcher Stämme mit Plasmiden mit hohen Kopienzahlen, die Wildtyp lac Operatorsequenzen enthalten, werden den Repressor weg von dem lac Operon titrieren und das Wachstum auf Lactose erlauben.
Glutaminsynthetase ist ein essentielles Gen für eukaryonte Zellen, wie die NSO Myelom Zelllinie (Bebbington et al., (1992) Bio/Technology 10, 169-175) und wird vorzugsweise vervendet, wenn die Wirtszelle eine eukaryonte Zelle ist.
3. Gene, welche die Synthese von Nukleinsäuren kodieren
Die Erfindung kann auch in Verbindung mit essentiellen Genen verwendet werden, die DNA und/oder RNA Synthese oder Replikationsproteine in der Wirtszelle kodieren. Beispiele von solchen Genen bezüglich dieser essentiellen Funktionen und Bakterien, wie E. coli und Salmonella werden in McMacken et al. (in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Cellular and Molecular Biology, Hrsg., Neidhardt et al., Amer. Soc. Micro., Wash. D.C., 1987, S. 564-612) bereitgestellt, und schließen ein, aber sind nicht beschränkt auf die folgenden Gene: dnaA, dnaB, dnaC, ssb, dnaG, polC (dnaE), dnaQ (MutD) dnaN, dnaZX, gyrA, gyrB, polA, lig, dnaT, rpoA, rpoB, rpoC und rpoD.
4. Gene, die einen selektierbaren Vorteil für das Überleben in einem Empfängerorganismus verleihen
Für Wirtszellen, die an einen Empfängerorganismus verabreicht werden, kann abhängig von dem Verabreichungsweg eine Vielzahl von Faktoren in der lokalen Umgebung einen Selektionsdruck ausüben. Wo die Fähigkeit, einem solchen Druck zu widerstehen mit einem identifizierten Gen verbunden ist, kann dieses als ein Selektionsmarker verwendet werden. Zum Beispiel für Zellen, insbesondere Bakterienzellen, die oral verabreicht werden sollen, bildet die Resistenz gegenüber dem niedrigen pH-Wert von Magenbestandteilen einen signifikanten selektiven Vorteil. Unter den Genen, von denen gezeigt wurde, dass sie damit assoziiert sind, sind das uvrA Gen von Streptococcus mutans (Hanna et al., 2001 J Bacteriol 183: 5964), die gadA, B und C Gene von E. coli (Castanie-Cornet und Foster, 2001, Microbiology 147: 709), die rpoS, fur, atp und atbR Gene von Salmonella typhimurium (Baik et al., 1996 Microbiology 142: 3195), die IepA, Frasel, czcA, uvrA, atpF' und Aldo-Keto Reduktasegene von Helicobacter pylori (Bijlsma et al., 2000, J Infect Dis 182: 1566) und die Gene, welche die F_oF₁ ATPase von Listeria monocytogenes kodieren (Cotter et al., 2000 Int J Food Microbial 60: 137).
Gene, die intrazelluläres Überleben (zum Beispiel SvpA in Listeria monocytogenes Borezee et al., 2001, Microbiology 147:2913) oder Resistenz gegenüber teilweisen intrazellulären Orten verleihen, wie Lysosomen, können ebenfalls in geeigneten Wirtszellen nützlich sein.
5. Gene, die für Antibiotikaresistenz kodieren
Obwohl es nicht bevorzugt ist, kann die Erfindung auch in Verbindung mit Antibiotikaresistenz verwendet werden. Das Resistenzgen wird derart konstruiert, dass seine Expression unter der Kontrolle des Promotors/Operators steht, der das gewünschte Repressor Protein bindet. Dieses Konstrukt wird dann in das Chromosom des Wirtsstamms eingebaut. Die Transformation des Stamms mit Plasmid, das die Repressor Bindungssequenz enthält, wird den Repressor von dem Antibiotika-Resistenzgen titrieren und die Expression und damit das Wachstum in der Anwesenheit dieses Antibiotikums erlauben. Ein Antibiotika-Resistenzgen ist ein solch nützlicher Selektionsmarker, dass eine Person, welche die Erfindung durchführt, Antibiotikresistenz als das wirtsessentielle Gen auswählen könnte, obwohl die systemischen Wirkungen auf den Empfänger beachtet werden müssen. In diesem Fall liegt der Vorteil der Verwendung des Operator Repressor Titrationsansatzes in der Fähigkeit des Plasmids. Die Tatsache, dass das Antibiotika-Resistenzgen selbst auf dem Wirtszellchromosom kodiert ist, steigert die Größe des Inserts, das in das ORT^® Expressionsplasmid kloniert werden kann.
Erfindungsgemäß nützliche Gene, die von Plasmiden abgeleitet sind Das Gen von Interesse, das von dem Plasmid in den erfindungsgemäßen transformierten attenuierten Zellen getragen wird, kann irgendein Gen sein. Das Gen kann eines sein, von dem gewünscht ist, dass es an den Empfängerorganismus aufgrund seiner therapeutischen Wirkung transportiert wird. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, das Gen an den Empfängerorganismus für die Zwecke der Gentherapie zu transportieren.
Alternativ dazu kann es wünschenswert sein, das Gen zu dem Empfängerorganismus zu transportieren, weil das Transkriptionsprodukt oder das Transkriptions- und Translationsprodukt des Gens eine therapeutische Wirkung aufweist. Zum Beispiel kann das Transkriptionsprodukt des Gens von Interesse ein Antisense-Oligonukleotid sein, oder das Gen von Interesse kann ein Antigen kodieren, das eine therapeutische Wirkung aufweist. Insbesondere kann das Gen von Interesse eines oder mehrere Antigene kodieren, das/die eine Immunantwort in dem Empfängerorganismus hervorruft/en. Ein Beispiel für Gene von Interesse, die in das Plasmid eingeschlossen werden können, um eine Immunantwort in dem Empfängerorganismus zu induzieren, sind die cafI, cafIA und cafIM Gene des caf Operons.
Wo es gewünscht ist, dass das Gen von Interesse transkribiert oder transkribiert und translatiert wird, ist es vorzugsweise funktionell mit einem Promotor verbunden. Vorzugsweise ist der Promotor ein eukaryonter Promotor oder ein bakterieller Promotor. Die Wahl des Promotors, der funktionell mit dem Gen von Interesse verbunden ist, und die Wahl der Wirtszellen bestimmt, ob das Gen von Interesse in der Wirtszelle vor der Verabreichung an den Empfängerorganismus oder nur nach Verabreichung an den Empfängerorganismus transkribiert, oder transkribiert und translatiert wird.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, Wirtszellen zu transportieren, die bereits ein Gen von Interesse exprimieren, in diesem Fall wird der Promotor, der funktionell mit dem Gen von Interesse verbunden ist, derart gewählt, dass er in der Wirtszelle wirksam ist und die Transkription und Translation des Gens von Interesse in der Wirtszelle fördert. Wo die Wirtszelle zum Beispiel eine Bakterienzelle ist, kann der Promotor, der mit dem Gen von Interesse funktionell verbunden ist in dieser Situation ein bakterieller Promotor sein.
In anderen Fällen kann es wünschenswert sein, Wirtszellen zu dem Empfängerorganismus zu transportieren, die ein Plasmid umfassen, das ein Gen von Interesse umfasst, aber welche die Expression des Gens von Interesse bis nach dem Transport der Zellen zu dem Empfängerorganismus verzögern. Wo zum Beispiel die Wirtszelle eine Bakterienzelle ist, kann der Promotor, der mit dem Gen von Interesse funktionell verbunden ist, in dieser Situation ein eukaryonter Promotor sein, der die Transkription und Translation des Gens von Interesse in der Wirtszelle nicht fördert, dies aber nach der Verabreichung einen Empfängerorganismus tun wird.
Erfindungsgemäß nützliche Verfahren zur Vakzinierung
Es ist vorgesehen, dass eine Vakzinierung mit erfindungsgemäßen rekombinanten lebenden attenuierten Zellen einer von einer Vielzahl von Verabreichungswegen sein kann. Für Mycobacterium ist der gewöhnliche Weg über intradermale oder subkutane Injektion. Für Enterobakterien, wie Salmonella, Shigella oder E. coli ist die orale Verabreichung (insbesondere von Säure resistenten Transformanten) oder die rektale Verabreichung bevorzugt. Unter bestimmten Umständen kann die mukosale, intravenöse oder intraperitoneale Verabreichung bevorzugt sein.
Verabreichung für andere in vivo Anwendungen
Es ist vorgesehen, dass eine Anzahl von Verfahren zur Verabreichung für Nicht-Vakzinierungsanwendungen verwendet werden kann.
Zusätzlich zu den enteralen und parenteralen Verabreichungswegen, die für Vakzinierung verwendet werden, kann eine Nicht-Vakzinanwendung andere Vorgänge benötigen. Unter diesen sind die Verwendung von implantierbaren permeablen Behältern, in denen die erfindungsgemäßen Zellen enthalten sind.
BEISPIELE
Beispiel 1: Umwandlung von Salmonella typhimurium SL3261 in einen dapD ORT^® Stamm
Die Salmonella typhimurium aroA Mutante SL3261 (Oyston et al., 1995, Infect. Immun. 63:563-568; Titball et al., 1997, Infect. Immun. 63: 563-568) wird in einen Stamm umgewandelt, der die Aufrechterhaltung des Plasmids durch Operator Repressor Titration (ORT erleichtert. Dies schließt das Austauschen eines essentiellen chromosomalen Gens gegen dasselbe Gen unter der Kontrolle des lac Operator/Promotors ein (lacO/P; Williams et al., 1998, Nucleic Acids Res. 26: 2120-2124). Der Genaustausch wird unter Verwendung einer Strategie durchgeführt, die kein Antibiotika-Resistenzgen auf dem SL3261 Chromosom zurücklässt.
Essentielles dapD Gen das durch lacO/P kontrolliert wird
Das Gen dapD kodiert Tetrahydrodipicolinat N-Succinyl Transferase, das die Umwandlung von Tetrahydrodipicolinat und Succinyl-CoA in N-Succinyl-α-amino-ε-keto-pimilat und CoA in dem Lysin/Diaminopimelat Weg katalysiert (Richaud et al., 1984, J. Biol. Chem, 259.14824-14828; Gilvarg, 1961, J. Biol. Chem. 236: 1429-1431). Der chromosomale dapD Locus ist in 2A gezeigt. DAP vernetzt Peptidoglykan in der Bakterienzellwand und ist ein Vorläufer für Lysin Biosynthese (Work, 1950, Nature 765: 74-75). Mutanten mit zerstörtem dapD sind deshalb DAP und Lysin auxotroph. Weil Lysin in dem Vollmedium, das häufig verwendet wird, um E. coli und S. typhimrium (wie LB-Nährlösung) anzuziehen, häufig anwesend ist, und DAP dies nicht ist, werden dapD Mutanten eine Zelllyse durchlaufen, es sei denn DAP wird zu dem Medium zugegeben (Davis, 1952, Nature 169: 534- 536). dapD wurde bereits erfolgreich als das ORT^® Gen in dem E. coli Stämmen DH1/acdapD und DH1/acP2dapD verwendet (Cranenburgh et al., 2001, Nucleic Acids Research 29: E26). Deshalb werden die E. coli lac-dapD Konstrukte verwendet, um dapD in S. typhimurium zu komplementieren.
Erzeugen der lac-Gen Fusionskonstrukte
Das Konstrukt mit dem E. coli dapD unter der Kontrolle des mutierten, nicht durchlässigen lac Promotors (lacP2) sind in dem Plasmid placPdapD6 anwesend. Das 3'-Ende des Lactose Repressor Gens lacI ist bereits in diesen Konstruktes anwesend, sodass das Gesamtlängen Gen hinein kloniert werden muss. Dies ist notwendig, weil lacI in S. typhimurium SL3261 entweder abwesend oder nicht funktionell ist (Oyston et al., 1995, Infect. Immun. 63:563-568 und durch die Erfinder bestätigt). Die Quelle dieses Gens ist das Plasmid pTrc99 (Amersham-Pharmacia), das die überexprimierende Mutation lacI^q aufweist.
Erzeugen der Gen Austauschkassette
Die Regionen, die dapD aus S. typhimurium flankieren, wurden durch PCR amplifiziert, und diese Produkte (gezeigt in 2B) wurden in getrennte pGEM-T Easy Plasmide (Promega) kloniert. Diese linken und rechten Flankierungen wurden herausgeschnitten und in einen geeignet vorbereiteten pTrc99dapD (der lacO/PdapD neben lacI^q aufweist) an jeder Seite der Expressionskassette (d.h. lacI^q und lacO/P-dapD flankierend) und in der korrekten Orientierung relativ zu dem chromosomalen dapD kloniert. Dieser Vorgang erzeugte das Plasmid pdapDB(+).
Insertion der ORT^® Kassette in das SL3261 Chromosom
Das Integrationsplasmid beruht auf pKO3 (Link, 1997, J. Bacteriol. 179: 6228-6237), welches das Levansucrase Gen sacB aus Bacillus subtilis als eine Gegenselektion verwendet. sacB wandelt Sucrose in eine toxische Verbindung um, die Zellen mit pKO3 abtötet. Die Gen Austauschkassette wird aus pdapDB+ in den Polylinker von pKO3 subkloniert, anschließend stellt das Chloramphenicol Resistenzgen cat die Selektion für die anfängliche chromosomale Integration über ein einzelnes Rekombinationsereignis bereit. Der nächste Schritt ist die Selektion hinsichtlich der Auflösung des Kointegrants in der Anwesenheit von Sucrose, um das Entfernen der pKO3 Sequenzen aus dem Chromosom zu erreichen, was nur die lac-Genfusion zurücklässt. Die Prinzipien dieses Vorgangs sind in 1 gezeigt.
Zusammenfassung

1. Lac-Genfusionen werden in pTrc99 unmittelbar benachbart zu lacI^q kloniert.
2. Amplifizieren der Regionen, die dapD aus S. typhimurium chromosomaler DNA flankieren, durch PCR.
3. Zusammenbauen der deletierten Genloci.
4. Klonieren der PCR Produkte der deletierten Genloci in pGEM-T Easy.
5. Ausschneiden der dapD Genflanken und ligieren an jeder Seite an lacI^q und lacO/P-dapD.
6. Ausschneiden der Deletionskassette und Ligieren in die multiple Klonierungsstelle von pKO3.
7. Verwenden dieses pKO3 basierten Plasmids, um die lacI^q + lac-dapD Kassette in den chromosomalen dapD Locus zu inserieren, während das Wildtyp Gen in diesem Verfahren deletiert wird.
8. Verifizieren des ORT^® Stamm Genotyps durch PCR und Southern Analyse, und Testplasmid Selektion und Aufrechterhaltung durch ORT^®.

Detaillierte Klonierungsstratgie für einen dapD ORT^® Stamm von Salmonella typhimurium SL3261

1. Schneiden von pTrc99 (3A) mit Pf/MI und Erzeugen von stumpfen Enden (mit T4 DNA Polymerase).
2. Entfernen der E. coli lacZ-dapD Expressionskassette aus placPdapD6 (3C) als ein Af/II-EarI Fragment und Erzeugen von stumpfen Enden.
3. Ligieren, um pTrc99dapD (3D) zu erzeugen. Die Orientierungen von dapD und lacI^q müssen entgegengesetzt sein.
4. Amplifizieren der 5'- und 3'-Flankierungen von dapD aus Salmonella typhimurium SL3261 chromosomaler DNA durch PCR unter Verwendung der Primer 5STdapD mit LST2dapD (PCR Produkt = 2406 bp) und RSTdapD mit 3STdapD (PCR Produkt = 1361 bp). Die flankierenden Primer (5STdapD und 3STdapD) enthalten SphI und NotI Stellen.
5. Klonieren von beiden Flankierungen in pGEM^®-T Easy (Promega), der in 3B gezeigt ist, um pGEM-TeasydapDL(–) (3E) und pGEM-TeasydapDR(–) (3F) zu erzeugen.
6. Ausschneiden der rechten Flankierung aus pGEM-TeasydapDR(–) (3F) als ein NsiI Fragment, Erzeugen von stumpfen Enden und sein Ligieren in pTrc99dapD (3D), der mit EclI 136lI geschnitten wurde, um pDRdapD(+) (3G) zu erzeugen. Anschließendes Ausschneiden der linken Flankierung aus pGEM-TeasydapDL(–) (3F) als ein NsiI Fragment und sein Ligieren in pDRdapD(+) (3G), das mit NsiI geschnitten wurde, um pdapDB(+) (3H) zu erzeugen.
7. Ausschneiden des Inserts aus pdapDB(+) (3H) als ein NotI Fragment und Ligieren in NotI-geschnittenen pKO3 (3I) um pKO3dapD (3J) zu erzeugen (die Insertorientierung ist nicht wichtig).
8. Verwenden von pKO3dapD (3J) um Wildtyp dapD gegen lacZ-dapD in S. typhimurium SL3261 auszutauschen. Der resultierende Stamm ist SL3261dapD.

Verwendete PCR Primer
SphI und NotI Stellen sind fett dargestellt, NsiI Stellen sind unterstrichen.

5STdapD (39 nt) CGAATGGCATGCGGCCGCAGCTATTTTTATCAGGATTTG
LST2dapD (35 nt) GCGAATGCATAGCGGGGGCGACAGCCCCCCTTTGC
3STdapD (39 nt) TGTGGGGCATGCGGCCGCAGTGGTCGCACATCGTCGGAC
RSTdapD (46nt) GCTTTTCACTCGATGCATCTACCCTTTATCGTTTGGATTGAGGGCC

Beispiel 2: Umwandlung von Salmonella typhimurium SL3261 in einen fabA ORT^® Stamm
Essentielles fabA Gen, das durch lacO/P kontrolliert wird
Ein alternatives Gen, das für die Verwendung in einem ORT^® Stamm geeignet ist, ist fabA, das 3-Hydroxydecanoyl-ACP Dehydrase kodiert, das die Einführung einer Doppelbindung in die wachsende Fettsäurekette an dem Punkt katalysiert, wo sich die ungesättigte und gesättigte Fettsäure Biosynthese teilt (Cronan und Rock, 1987, Biosynthesis of membrane lipids. In "Escherichia coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology", Neidhardt, F.C. (Hrsg.). American Society of Microbiology, Washington DC). Der chromosomale fabA Locus ist in 4A gezeigt. Das Enzym ist in einer relativ hohen Konzentration anwesend, und fabA Mutanten lysieren, es sei denn sie sind mit einer ungesättigten Fettsäure, selbst in LB Medium, ergänzt. Dies macht fabA zu einer geeigneten Wahl für einen ORT^® Stamm.
Ein ähnliches Verfahren zu jenem, das in Beispiel 1 beschrieben wird, wird verwendet, um einen fabA ORT^® Stamm zu erzeugen, aber anstelle die zwei flankierenden Regionen des Gens als getrennte PCR Produkte zu amplifizieren, wurde eine einzelne Region, die den gesamten fabA Locus enthält, durch PCR amplifiziert und kloniert. fabA wurde anschließend ausgeschnitten und gegen die lacI^q und lacO/P-fabA Kassette ausgetauscht. Das PCR Produkt, das von dem fabA. Locus für das Klonierungsverfahren erzeugt wurde, ist in 4B gezeigt.
Detaillierte Klonierungsstrategie für die Bildung eines ORT^® Stammes, der auf fabA beruht

1. Ausschneiden von pTrc99 (3A) mit Pf/MI und Erzeugen von stumpfen Enden (mit T4 DNA Polymerase).
2. Entfernen der E. coli lacZ-fabA Expressionskassette aus placfabA (5E) als ein EarI-DraIII Fragment und Erzeugen von stumpfen Enden.
3. Ligieren, um pTrc99fabA (5F) zu erzeugen (die Orientierungen von fabA und lacI^q müssen entgegengesetzt sein).
4. Amplifizieren des fabA locus aus Salmonella typhimurium SL3261 chromosomaler DNA durch PCR (Taq Polymerase) unter Verwendung der Primer 5STfabA und 3STfabA (diese enthalten SphI und NotI Stellen, das PCR Produkt beträgt 4713 bp).
5. Klonieren des PCR Produkts in pCR^®2.1-TOPO (Invitrogen), um pCR2.1 StfabA (5C) zu erzeugen.
6. Ausschneiden des fabA Locus aus pCR2.1 (5A) als ein NotI Fragment und Klonieren in pORT1 (5B), der mit NotI geschnitten wurde, um pORfabA (5D) zu erzeugen.
7. Ausschneiden von lacZ-fabA und lacI^q aus pTrc99fabA (5F) als ein Smal-BsaBI Fragment.
8. Ausschneiden von pORfabA (5d) mit PmlI-BsaBI, um die N-terminale kodierende Region von fabA zu entfernen und Ligieren des SmaI-BsaBI Fragments aus pTrc99fabA (5F), um pORIacfabA (5G) zu erzeugen.
9. Ausschneiden des Inserts aus pORIacfabA (5G) als ein NotI Fragment und Ligieren in NotI-geschnittenen pKO3, um pKO3fabA (5H) zu erzeugen (die Insertorientierung ist nicht wichtig).
10. Verwenden von pKOSfabA (5H) um Wildtyp fabA durch lacZ-fabA in S. typhimurium SL3261 auszutauschen. Der resultierende Stamm wird als SL3261fabA bezeichnet.

Verwendete PCR Primer
SphI und NotI Stellen sind fett dargestellt.

5STfabA (41 nt) CACCGCGCATGAGGCCGCCCGATGCCAAAGGTATTCGTGTG
3STfabA (41 nt) TTTGCAGCATGCGGCCGCGTGTGCAGCGTGACGGGTTAGGC

Beispiel 3: Wachstumsprofile von SL3261 und SL3261dapD
Die Wachstumsgschwindigkeit von SI3261 in LB wurde mit jener von SL3261dapD in LB-IPTG verglichen.
Drei SL3261 und SL3261dapD Klone wurden in 5 ml Kulturen inokuliert und über Nacht bei 37°C in einem sich kreisförmig bewegenden Schüttler bei 200 rpm angezogen. Die Vorkulturen wurden verwendet, um 50 ml Kulturen in einer ausgangsoptischen Dichte von 0,01 O.D.₆₀₀ zu inokulieren, und Messungen wurden stündlich durchgeführt (6).
Die Wachstumskurven zeigten keinen signifikanten Unterschied, was anzeigte, dass das Wachstum des ORT Stammes nicht negativ durch die Modifikationen in dapD beeinflusst ist.
Beispiel 4: In vitro Plasmid Aufrechterhaltung von pUC18I in SL3261dapD
Das pUC18I Plasmid (7) weist den pMB1 Replikationsursprungspunkt und bla (Ampicillinresistenz) aus pUC18 ebenso wie einen idealen palindromen lac Operator auf. Der lac Operator erlaubt ORT, der es der Zelle erlaubt auf einem DAP/IPTG freien Medium zu wachsen.
Die Plasmid Stabilität von pUC18I in SL3261dapD wurde wie folgt untersucht. Drei Klone wurden in 50 ml LB Ampicillin (25 μg/ml) über Nacht bei 37°C in einem sich kreisförmig bewegenden Schüttler bei 200 rpm inkubiert. Die optische Dichte wur de bestimmt und ergab Werte für "Tag 0", anschließend wurden 50 ml frisches LB in der Abwesenheit von Ampicillin auf 0,001 OD₆₀₀ inokuliert, wobei wie zuvor beschrieben inkubiert wurde, was "Tag 1" ergab. Der Vorgang wurde bis zum "Tag 5" wiederholt.
Die Zellen wuchsen ungefähr 11,6 Generationen pro Tag während fünf Tagen, also ungefähr 59 Generationen während des Experiments. Zahl der Generationen jeden Tag = ln(EndOD/AnfangsOD)/ln2.
Um die Plasmid Aufrechterhaltung zu vergleichen wurden jeden Tag 10^-7 OD ml auf permissive und nicht permissive Medien ausplattiert, und die Klone wurden gezählt (8).
Täglich wurden 2 OD ml Proben durch Minipräp untersucht, und die Plasmide wurden durch Agarosegel Elektrophorese untersucht. Wie in 9 gezeigt ist, ist pUC18I in allen Proben von allen Zeitpunkten in einem hoch multimerisierten Zustand eindeutig sichtbar (dies wird erwartet, weil der Stamm rekombinationsprofizient ist, und das Plasmid die korrekten Stellen nicht aufweist, die Reversion zu dem monomeren Zustand erlauben).
Beispiel 5: In vivo Plasmid Aufrechterhaltung von pUC18I in SL3261dapD
Verfahren
S. enterica servovar Typhimurium Stämme SL3261, SL3261(pUC18I) und SL3261dapD(pUC18I) wurden in LB Nährlösung kultiviert, die mit 1 % (v/v) Histidin, 1 % (v/v) "Aromix" (4 mg/ml Tyrosin, 4 mg/ml Phenylalanin, 1 mg/ml p-Aminobenzoesäure, 1 mg/ml Dihydroxybenzoesäure) (um den aro his Genotyp von SL3261 zu ergänzen) ergänzt war. 0,1 mM IPTG wurde zu den SL3261dapD(pUC18I) Kulturen zugegeben. Weil SL3261(pUC18I) und SL3261dapD(pUC18I) beide ein Gen enthalten, das Resistenz gegenüber Ampicillin verleiht, wurden diese Stämme in Medium kultiviert, das auch mit 25 μg/ml Am picillin ergänzt wurde. Um Inocula herzustellen, wurde S. enterica serovar Typhimurium statistisch über Nacht bei 37°C kultiviert, anschließend zentrifugiert (6000 g, 20 min, 4°C), einmal in PBS gewaschen und erneut zentrifugiert und in PBS in einer Endzelldichte von ungefähr 5 × 10⁹ cfu/ml resuspendiert. Lebende Bakterien wurden auf LB Agarplatten, die IPTG/Ampicillin, wo geeignet, enthielten, ausgezählt.
Gruppen von 30 weiblichen Balb/c Mäusen wurden intragastrisch mit ungefähr 5 × 10⁸ cfu/100 μl Dosierung von Salmonella unter Verwendung einer Sondennadel inokuliert. An den Tagen 8, 12 und 16 nach der Inokulation wurden 10 Mäuse durch zervikale Dislokation geopfert, und aus jeder Maus wurde die Milz und 6 Peyersche Plaques (PP) entfernt. Der verwendete Behandlungsplan:
Die Milz oder 6 PP wurden in 1 ml sterilem PBS unter Verwendung von 50 μm Zellsieben (Becton Dickinson Labware) homogenisiert, und geeignete Verdünnungen wurden auf geeigneten Agar für das Auszählen ausplattiert. Insbesondere wurde SL3261 nur auf LB Agar ausplattiert, SL3261(pUC18I) wurde auf LB Agar und LB Agar mit Ampicillin ausplattiert, und SL3261dapD(pUC18I) wurde auf LB Agar mit IPTG oder LB Agar mit Ampicillin ausplattiert.
Ergebnisse
Lebende Bakterien wurden in den Milzen und Lungen aller Gruppen von Mäusen nachgewiesen, die in dem Experiment inokuliert wurden (siehe 10). Die folgenden Beobachtungen wurden gemacht:

1. SL3261 besiedelte die Milzen und die PP's, wie erwartet.
2. SL3261(pUC18I) war in vivo instabil. Signifikant niedrigere Zahlen von SL3261(pUC18I) wurden auf LB Agarplatten mit Ampicillin im Vergleich zu LB Agarplatten nachgewiesen, was anzeigt, dass das Plasmid pUC18I aus den Bakterien verloren gegangen war.
3. SL3261dapD(pUC18I) war in vivo stabil. Ähnliche Zahlen von SL3261dapD(pUC18I) wurden auf LB Agarplatten mit IPTG und LB Agarplatten mit Ampicillin nachgewiesen, was anzeigt, dass das Plasmid pUC18I stabilisiert war.
4. SL3261(pUC18I) und SL3261dapD(pUC18I) (in einigen Fällen) wurde in signifikant niedrigeren Zahlen in sowohl den Milzen als auch den PP's im Vergleich zu SL3261 nachgewiesen. Dies kann die Belastung auf den Salmonel-la, die das Plasmid pUC18I in hoher Kopienzahl tragen, wiederspiegeln.

Schlussfolgerungen

1. pUC18I war in SL3261 in vivo instabil, aber in SL3261dapD stabilisiert.
2. pUC18I verringerte die Fähigkeit von SL3261 und (manchmal) SL3261dapD, die Milzen und PP's zu kolonialisieren.
3. Es ist wahrscheinlich, dass ein Plasmid mit einer niedrigen Kopienzahl, wie pAH34L, das den lac Operator enthält, in SL3261 dapD stabilisiert würde, ohne die nachteiligen Wirkungen auf die Kolonialisierung.

Beispiel 6: Wachstumsprofile von SL3261(pAH34L) und SL3261dapD(pAHL)dapD
Das pAHL Plasmid (11) weist den pSC101 Replikationsursprungspunkt, einen idealen palindromen lac Operator ebenso wie das thermoregulierte caf Operon von Yersinia pestis auf. Der lac Operator erlaubt ORT, was Zellwachstum auf einem DAP/IPTG freien Medium erlaubt. Die Expression bei 37°C und nicht bei 28°C der cafI, cafIA und cafIM Gene wird durch cafIR kontrolliert. Das pAH34L Plasmid ist der Vorläufer von pAHL, es verleiht Resistenz gegenüber Kanamycin, aber es weist den lac Operator, der für ORT notwendig ist, nicht auf.
Die Wachstumsprofile von SL3261(pAH34L) in LB-Kanamycin wurde mit dem Wachstumsprofil von SL3261dapD(pAHL) in LB verglichen. Drei SL3261(pAH34L) und SL3261dapD(pAHL) Klone wurden in 5 ml Kulturen inokuliert und über Nacht bei 37°C in einem sich kreisförmig bewegenden Schüttler bei 200 rpm angezogen. Die Vorkulturen wurden verwendet, um 50 ml Kulturen in einer ausgangsoptischen Dichte von 0,01 OD₆₀₀ zu inokulieren, und Messwerte wurde stündlich durchgeführt (12). Die Wachstumskurven zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen diesen zwei Stämmen.
Beispiel 7: In vitro Plasmid Aufrechterhaltung von pAHL in SL3261 dapD
Die Plasmid Stabilität von pAHL in SL3261dapD wurde wie folgt untersucht. Drei Klone wurden in 50 ml LB inokuliert und über Nacht bei 37°C in einem sich kreisförmig bewegenden Schüttler bei 200 rpm inkubiert. Die optische Dichte wurde bestimmt und ergab Werte für "Tag 0", anschließend wurden 50 ml frisches LB bis zu einer OD von 0,001 OD₆₀₀ inokuliert, wie zuvor angegeben inkubiert, um "Tag 1" zu ergeben. Der Vorgang wurde bis zum "Tag 5" wiederholt.
Die Zellen wuchsen ungefähr 11,6 Generationen pro Tag während fünf Tagen (ungefähr 69 Generationen während des Experiments). Zahl der Generationen pro Tag = ln(EndOD/AnfangsOD)/ln2.
Um die Plasmid Aufrechterhaltung zu zeigen, wurden jeden Tag 10^-7 OD ml auf permissive und nicht permissive Medien ausplattiert, und die Kolonien wurden gezählt. Siehe 13.
Täglich wurden 2 OD ml Proben durch Minipräp untersucht, die Plasmide wurden durch Agarosegel Elektrophorese untersucht. Das Plasmid war in den Proben aus allen Zeitenpunkten (14) eindeutig sichtbar. Alle diese Proben, die aus Salmonella hergestellt wurden, zeigen eine kleine artifizielle Bande, die unter der supercoiled Bande läuft, die wahrscheinlich irreversibel denaturierte DNA darstellt.
Zusammenfassung und Schlussfolgerungen
Der Stamm SL3261 dapD erlaubt Antibiotika freie Plasmid Selektion und Aufrechterhaltung in komplexem Medium (LB) von Plasmiden mit hoher und von sehr geringer Kopienzahl durch ORT. Der Stamm erlaubt auch die stabile in vivo Aufrechterhaltung von pUC18I in Mäusen, wohingegen dieses Plasmid aus dem parenteralen Stamm SL3261 verloren gegangen ist.
Der Stamm SL3261dapD(pAHL) erlaubt die Selektion und stabile Aufrecherhaltung eines Plasmids, welches das caf Operon von Y. pestis trägt. Hiervon wurde gezeigt, dass es ein vielversprechender Vakzinkandidat ist, der hohe Mengen an Immunität gegenüber Y. pestis induziert (Titball et al., 1997, Infection and Immunity 65: 1926-1930).
Die ORT Technologie wird deshalb die Konstruktion von rekombinanten Stämmen von Salmonella erlauben, die für den Antigentransport durch eine lebende Vakzine verwendet werden können. Diese Stämme werden keine Antibiotika-Resistenzgene für die Plasmid Aufrechterhaltung benötigen. Sie werden auch den Vorteil einer großen Menge von Antigenexpression aufweisen, als dies durch chromosomale Integration des Antigengens möglich wäre. Weiterhin wird der Stamm einfach für den Transport von verschiedenen Antigenen durch Transformation mit geeigneten Plasmiden umgewandelt.
ANDERE AUSFÜHRUNGSFORMEN
Andere Ausführungsformen werden für den Fachmann offensichtlich sein. Es sollte verstanden werden, dass die vorherige detaillierte Beschreibung nur für die Klarheit und nur exemplarisch bereitgestellt wird. Der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung ist nicht durch die obigen Beispiele beschränkt, sondern er ist durch die folgenden Patentansprüche definiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Transformierte abgeschwächte Bakterienzelle zur Verwendung als Medikament, wobei die Zelle: a) ein Plasmid, umfassend ein Gen von Interesse und eine Operatorsequenz, welche für das Binden durch einen Repressor empfänglich ist, b) ein zweites Gen, welches den Repressor kodiert und welches auf einem Chromosom vorliegt, und c) ein drittes Gen, welches auf dem Chromosom vorliegt und essentiell für das Wachstum ist, und einen Operator, welcher in cis mit dem dritten Gen verbunden ist, sodass die Expression des dritten Gens zur Unterdrückung durch das Binden eines Repressors an den Operator empfänglich ist, enthält, wobei das Plasmid in der Zelle in ausreichender Anzahl vorliegt, um den Repressor zu titrieren, sodass das essentielle Gen exprimiert wird, wodurch das Zellwachstum ermöglicht wird.
Transformierte Zelle nach Anspruch 1, wobei das dritte Gen kein Antibiotika-Resistenzgen ist.
Transformierte Zelle nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die transformierte Zelle ein Enterobakterium ist.
Transformierte Zelle nach Anspruch 3, wobei die transformierte Zelle von der Gattung Salmonella ist.
Transformierte Zelle nach Anspruch 4, wobei die transformierte Zelle von der Art Salmonella typhimurium ist.
Transformierte Zelle nach Anspruch 4, wobei die transformierte Wirtszelle von der Art Salmonella typhi ist.
Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die transformierte Zelle durch eine Modifikation ihres aroA-Gens, aroC-Gens, aroD-Gens oder htrA-Gens abgeschwächt worden ist.
Transformierte Zelle nach Anspruch 7, wobei die transformierte Wirtszelle vom Stamm Salmonella fyphimurium SL3261 ist.
Transformierte Zelle nach Anspruch 7, wobei die transformierte Wirtszelle vom Stamm Salmonella typhi CVD 908-htr ist.
Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das dritte von der Zelle beinhaltete Gen ein Enzym kodiert, welches für die Synthese von bakteriellen Zellwänden erforderlich ist.
Transformierte Zelle nach Anspruch 10, wobei das dritte Gen dapD ist.
Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das dritte von der Zelle beinhaltete Gen ein Enzym kodiert, welches für die Fettsäuresynthese erforderlich ist.
Transformierte Zelle nach Anspruch 12, wobei das dritte Gen fabA ist.
Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Gen von Interesse funktionell mit einem bakteriellen Promotor verbunden ist.
Transformiere Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei das Gen von Interesse funktionell mit einem eukaryotischen Promotor verbunden ist.
Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Gen von Interesse ein Antigen kodiert.
Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das Transkriptionsprodukt des Gens von Interesse ein Antisense-Oligonukleotid ist.
Verwendung einer transformierten Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 17 in der Herstellung eines Medikaments, umfassend die transformierte Zelle zur Gen-Lieferung.
Verwendung einer transformierten Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 17 in der Herstellung eines Medikaments, umfassend die transformierte Zelle zur Immunisierung.
Zusammensetzung zur Verwendung als Medikament, umfassend eine Zelle nach einem der Ansprüche 1 bis 17 und ein/einen pharmazeutisch verträgliches/verträglichen Bindemittel, Verdünnungsmittel oder Puffer.