EP1476551A2 - Verfahren zur identifikation von gewebespezifischen regulatorischen sequenzen - Google Patents

Verfahren zur identifikation von gewebespezifischen regulatorischen sequenzen

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EP1476551A2
EP1476551A2 EP03742546A EP03742546A EP1476551A2 EP 1476551 A2 EP1476551 A2 EP 1476551A2 EP 03742546 A EP03742546 A EP 03742546A EP 03742546 A EP03742546 A EP 03742546A EP 1476551 A2 EP1476551 A2 EP 1476551A2
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EP
European Patent Office
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expression
sequences
promoter
sequence
nucleic acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03742546A
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English (en)
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Inventor
Dirk Bumann
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Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Original Assignee
Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Publication date
Application filed by Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV filed Critical Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1082—Preparation or screening gene libraries by chromosomal integration of polynucleotide sequences, HR-, site-specific-recombination, transposons, viral vectors
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    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying regulatory sequences in the genome of microorganisms which are isolated ex vivo from infected tissue.
  • the invention further relates to promoters in Salmonella identified with this method.
  • regulatory sequences are understood to be those sequences which influence the expression level of a gene product (protein).
  • regulatory sequences are sequences which are arranged on the 5 'side of the structural gene coding for the gene product, such as promoters and binding sites for regulatory proteins or sequences which are arranged on the 3' side of the structural gene, such as terminators.
  • Strong expression is understood to mean expression with a strength of more than 25,000 copies of a protein per cell (bacterium) present at the same time.
  • Weak expression means an expression with a strength of less than 4,500 copies of the protein per cell (bacterium) present at the same time. Expression of 4,500 to 25,000 copies is called moderate expression.
  • Factors that influence the level of expression are e.g. the
  • a promoter is said to be weak (moderately strong, strong) if it can cause a weak (moderately strong, strong) expression of a protein under given physiological conditions.
  • the Shine-Dagamo sequence in prokaryotes is a sequence that is 1 to 20 nucleotides upstream of the start codon and is essential for the initiation of translation.
  • the sequence TTTAAGAAGGAGATATACAT originates from gene 10 of phage T7 (NCBI database gi: 9627425) and generally brings about maximum translation in bacteria.
  • the half-life of bacterial proteins ranges from a few minutes to more than 48 hours.
  • Differential gene expression is understood to mean the specific expression of individual genes or gene groups which is dependent on the development state of a cell, in particular depending on the external conditions and / or the host environment in which the cell is located.
  • Salmonella strains e.g. serovar Typhimurium in mice, serovar Typhi in humans
  • orally ingested Salmonella penetrate mainly into the intestinal wall through the M cells of Peyer pauques and are taken up by phagocytes such as dendritic cells, macrophages and neutrophils. Probably in these phagocytes the salmonella also reach the draining mesenteric lymph nodes and from there via the bloodstream to the liver, spleen, bone marrow, brain and other tissues. The salmonella proliferates intracellularly in all infected tissues. If the host cannot control the infection, multi-organ failure and death will result. Strains that are not host-adapted usually only result in self-healing enteritis with diarrhea. The intestinal mucosa is partially reversibly damaged, deeper tissues are not affected.
  • Sa / mone / la-based live vaccines consist of an attenuated Salmonella strain, which triggers a limited infection without symptoms of disease, and an expression cassette with the foreign antigen, the expression of which is driven by an upstream promoter.
  • an immune response against the Salmonella carrier and also against the heterologously expressed antigen is induced.
  • the expression of a foreign antigen can place such a heavy burden on Salmonella that it only triggers a very slight infection, in the course of which an adequate immune response does not arise. It is therefore advantageous to express as little foreign antigen as possible, as long as the Salmonella have not yet reached immune-competent host tissue and only then to induce the expression.
  • Such in vivo inducible expression systems are usually based on differentially regulated promoters. Although there is some qualitative information too there are no quantitative expression data published so far that would allow the selection of an optimal in vivo inducible promoter for a live vaccine.
  • the method is based on the fact that individual genes are irreversible through transposon mutagenesis! be deactivated. If genes that are essential in vivo are affected, the corresponding clones do not multiply in the infected animal. The clones are missing in ex vivo isolates (negative selection). The clones are clearly identified by an individual tag that the transposons wear. Disadvantages of this method are that only those mutations are found that already have a strongly attenuating effect individually, although many relevant genes expressed in vivo are only important for the infection when they interact with other genes (Mahan et al., 2000). In addition, negative selection can only detect the first tissue-specific activation (only qualitative), but not transient activity or repression in the course of the infection. A positive selection is not possible. Quantitative statements on gene expression or selection according to the level of expression are not possible.
  • Differently regulated promoters can also be analyzed using reporter gene assays.
  • the reporter genes ⁇ -galactosidase (Slauch, Mahan and Mekalanos, 1 994) and luciferase (Contag et al., 1 995; Jacobi et al., 1998; Dunstan, Simmons and Strugnell, 1 999) allow sensitive detection in vivo. Expression is demonstrated by a color reaction in tissue homogenate catalyzed by these enzymes and is therefore semi-quantitative. Reporter gene assays are therefore mainly used to examine individual genes that are already known. Ex vivo screening procedures with these reporters have not been described so far.
  • a special form of the reporter gene assay is the IVET method (Mahan, Heithoff, Sinsheimer, and Low, 2000), which is often used to research pathogenic microorganisms.
  • the IVET method uses reporter genes that complement a lethal metabolic defect or confer resistance to an antibiotic. Only those clones in which the reporter gene is inserted downstream of in vivo active promoters can survive in vivo (complementation of the metabolic defect or resistance to treatment with antibiotics). Resistance markers and complementation markers allow a positive selection.
  • various in vivo inducible promoters were found in various pathogens, including Salmonella, some of which have an important role in the infection. The method is based on the qualitative comparison of expression in vitro with expression in vivo.
  • the reporter gene is therefore often coupled with another marker, which, for example, mediates a color reaction.
  • the method primarily identifies promoters with very low in vitro background expression, which is disadvantageous because many important genes are also expressed in vitro. Quantitative statements on in vivo gene expression are not possible (Gort and Miller, 2000).
  • RIVET uses resolvase as a reporter gene, which selectively removes a resistance cassette from the genome when expressed. The ratio of resistant and sensitive clones is determined by plating and used as a qualitative measure for the expression. This procedure makes it necessary to use specially adapted reporter constructs depending on the in vitro activity of the promoters used, so that screening of previously unknown promoters is impossible. Due to the irreversible removal of the resistance cassette, only the activation can be demonstrated become, but not a transient activity or a repression. Quantitative data cannot be obtained either.
  • the green fluorescent protein GFP can also be used in reporter gene assays. GFP does not require cofactors, and GFP-mediated fluorescence can be measured quantitatively on living samples using fluorescence microscopy and flow cytometry. Different fluorescent cell populations can be separated with fluorescence-activated cell sorting (FACS). In cell culture models with the help of GFP e.g. some Sa // 77 ⁇ / 7e // a promoters are identified that are selectively activated in infected host cells (Valdivia and Falkow, 1 997). So far, this screening method has been used in vitro in cell culture infection models with a high MOl (multiplicity of infection).
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • infected tissue homogenates contain a large number of host cell fragments with bacterial-like scattering behavior and GFP-like autofluorescence, which until now could not be distinguished from GFP-expressing bacteria via FACS.
  • This disturbing particle background made it impossible to use GFP as a quantitative in vivo reporter for mainly intracellular pathogens such as Salmonella (Lee and Camilli, 2000).
  • Salmonella Lee and Camilli, 2000.
  • this method can also be used to a limited extent in vivo.
  • the frog pathogen Mycobacterium marinum was e.g. qualitatively examined in highly infected frog granulomas. A quantitative determination of the GFP expression was not possible.
  • a ratiometric method was recently published (Bumann, 2001 a), with which tissue autofluorescence can be clearly distinguished from GFP emission in individual bacteria by measuring fluorescence with two wavelengths. This provides a method to measure the quantitative protein expression (promoter strength) also in those bacteria that were isolated ex vivo and that immediately after the. Isolation should be examined without being previously cultivated. This method was used to monitor the activity of some individual known promoters in the infection pathway from Salmonella from the intestinal passage via Peyer's plaques and mesenteric lymph nodes to the liver and spleen.
  • the individual promoters (eg psicA, pssaH, pphoP-1, pbgP and ppagC) were cloned as transcriptional fusions before GFP and transformed into Salmonella.
  • homogenates of the lymph nodes, the liver and the spleen were treated with detergent and analyzed with 2-wavelength FACS. This enabled the activation and repression of some known Sa // 77 ⁇ A7e // a promoters to be monitored quantitatively in certain tissues for the first time.
  • a first aspect of the present invention relates to a method for screening bacterial genomes for new regulatory sequences and / or already known regulatory sequences with previously unknown function.
  • the method allows the identification and quantitative characterization of new or known regulatory sequences with tissue-specific activity that was previously not possible. All existing regulatory sequences (in particular promoters) in the examined bacterium are tested collectively without prior information about the sequences in question being required.
  • the method is suitable for identifying regulatory sequences which bring about differential expression in vivo and in vitro and preferably show a ratio of in vivo to in vitro expression of at least about 8. These regulatory sequences can be used, for example, for the production of live vaccines.
  • Another embodiment of the invention relates to the identification of regulatory sequences which, in addition to strong expression in vivo, also cause strong expression in vitro. Such regulatory sequences are suitable for the production of live vaccines because of their strong in vivo expression.
  • the strong in vitro expression can improve the immune response to recombinant proteins, since in this case the immune response can be two-phase.
  • the ratio of in vivo / in vitro expression is preferably at least about 2 to a maximum of about 6.
  • the method according to the invention comprises the steps:
  • step (e) optionally isolating individual bacterial cells from step (d).
  • Step (c) of the method preferably comprises one or more of the following substeps:
  • such clones can be enriched in the genome bank if the following additional process steps are carried out:
  • step (h) repeating steps (c) to (d) or (c) to (e) with the test animals infected in step (g).
  • Steps (i) to (k) are used, for example, to create an expression profile of a regulatory sequence in different tissues.
  • Steps (a) and (b) the genome bank of a target bacterium to be examined is set up in a host bacterium which can survive and multiply in vitro and in vivo under suitable conditions.
  • pieces of the genome with a length of e.g. about 0.1-2 kB in a suitable vector, preferably upstream of the coding sequence of a reporter gene; inserted.
  • all regulatory elements which are necessary for the initiation of the transcription are previously removed from the sequence upstream of the reporter gene.
  • An efficient Shine-Dalgamo sequence e.g. TTTAAGAAGGAGAT ATACAT; SEQ ID NO.
  • the reporter gene can be expressed when the regulatory sequences are activated, provided the regulatory sequences are in the correct orientation to the coding sequence of the reporter gene (promoter-trap vector).
  • a constitutive promoter and a Shine-Dalgarno sequence are connected upstream of the reporter gene, other regulatory sequences which influence the activity of the promoter can be identified by insertion upstream of the promoter.
  • the genome bank can be produced from the genomes of any target bacteria. Any bacteria can also be used as the host. As a result, the target and host bacteria can be the same or different. Gram-positive and gram-negative bacteria are suitable for both purposes. Bacteria of the Enterobacteriacae family, the Genera Salmonella, Escherichia, Yersinia or the species / Serovare Salmonella enterica Serovar Typhimurium, Salmonella enterica Serovar Enteritidis, Salmonella enterica Serovar Typhi, Salmonella enterica Serovar Dublin, Salmonella enterica Serovar Cholerasuis. The Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL 1 344 is particularly suitable.
  • bacteria with a defensive effect on the human immune system that are approved as food additives (probiotic bacteria), which are therefore also suitable as carriers for live vaccines (e.g. orally administrable), e.g. the family Lactobacillae (gram-positive), Lactococcae (gram positive) and the (gram negative) E. c ⁇ // strain Nissle (1 91 7).
  • the genome bank can be created in an intermediate host.
  • the plasmid DNA is isolated with the inserts from the intermediate host, with which the final host bacterium is transformed.
  • E. coli is particularly suitable as an intermediate host.
  • the genome bank preferably comprises more than 90%, particularly preferably more than 99% of the bacterial genome.
  • a size of the Sa / monel / a genome of approximately 5 Mb (McClelland et al., 2001) and a size of the DNA insert of 0.5 kb the Sa / monel / a genome can be represented with approximately 20,000 clones (without redundancy, but with both orientations).
  • banks in the intermediate host E. coli can be generated which contain more than 2x10 5 independent clones with insert-carrying plasmids.
  • the plasmids can be isolated from this library and transformed into the final host, for example Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1 344. A total of 10 6 transformants can be generated in order to obtain the most complete coverage of the genome.
  • Preferred embodiments are those in which the bank is produced from the genome of the host in the host itself.
  • inserts with a length of 500 to 1,500 bp are well suited.
  • a length of 500 to 700 bp is particularly suitable.
  • the vector for the production of the genome bank essentially consists of elements for replication in the host (and possibly in intermediate hosts), one or more marker or reporter genes for selection and sequences for cloning.
  • the reporter genes encodes a fluorescent protein, e.g. GFP (green fluorescent protein) or GFP variants (e.g. with improved fluorescence yield: enhanced GFP or EGFP, or with UV excitation: GFPuv; see e.g. Sullivan and Kay, 1999, especially p. 24) or red fluorescent DsRed and improved variants ,
  • GFP green fluorescent protein
  • GFP variants e.g. with improved fluorescence yield: enhanced GFP or EGFP, or with UV excitation: GFPuv; see e.g. Sullivan and Kay, 1999, especially p. 24
  • red fluorescent DsRed and improved variants The use of GFP as a fluorescent reporter protein has been described in detail (Sullivan and Kay, 1999).
  • Expression vectors (especially promoter trap vectors) for GFP are described in Val
  • GFP is generally very stable in living cells with a half-life of more than 24 hours. GFP variants with a significantly shorter in vivo lifespan can be obtained by changing the C-terminus, which accelerates the breakdown of the GFP.
  • the C-terminal sequence AANDENY ALAA (SEQ ID NO. 2) is specifically recognized by proteases that specifically break down proteins from the C-terminus (Andersen et al., 1998). The rate of degradation can be modulated by changing the last 3 amino acids of this sequence (Keiler and Sauer, 1996).
  • GFP variant GFPJDVA (Bumann, 2001 b) can be used as a reporter protein, which enables stable constructs even with high expression (Example 1).
  • variants with a modulated lifespan are so far unknown.
  • GFP_OVA To detect weak promoters, GFP_OVA must be replaced by very stable GFP.mut3 because of the higher concentration that can be achieved (Example 1).
  • Step (c) preferably comprises one or more of the sub-steps (ci) to (cv).
  • the usual methods can be used to administer the genome bank according to step (ci) to a test animal: injection (max. 2x10 7 CFU intravenously, 2x10 9 CFU intramuscularly, 2x10 9 CFU subcutaneously, 2x10 7 CFU intraperitoneally), oral administration with 5x10 10 CFU (Pretreatment with streptomycin 5 g / l in drinking water) or nasal administration (5x10 6 CFU).
  • injection max. 2x10 7 CFU intravenously, 2x10 9 CFU intramuscularly, 2x10 9 CFU subcutaneously, 2x10 7 CFU intraperitoneally
  • oral administration with 5x10 10 CFU Pretreatment with streptomycin 5 g / l in drinking water
  • nasal administration 5x10 6 CFU.
  • the customary auxiliaries and carriers which are known to the person skilled in the art are added.
  • Administration is preferably carried out intravenously (for example into the tail vein), since the highest colonization rates in the target organs (for example lymph nodes, spleen, liver) can be achieved in this way.
  • All mammals are suitable as experimental animals, in particular the mouse, the rabbit, the rat, apes or calves.
  • BALB / c mice, immunodeficient mice, immunized or immunosuppressed IFN (R (- / -) mice can be used.
  • the method can be used for the development of live vaccines in humans, provided that bacteria are used which have no or only a very low pathogenicity and which can be administered orally or nasally.
  • the duration of infection after step (cii) is based on the course of infection and the target organs to be examined. In mice as experimental animals and Salmonella as the host of the gene bank, infection times between 1 h and 120 h can be used to follow the course of the infection from the colonization of Peyer's plaques to the colonization of the liver and spleen. In order to be able to comply with the provisions of animal welfare, the early and middle phase of the infection should be examined. Terminally ill animals should not be examined.
  • the tissue samples according to step (cii) are homogenized and lysed using conventional methods under mild conditions, so that the bacteria obtained in the Single cell suspension remains viable and able to multiply to a very large extent.
  • tissue can be used as tissue, in particular the intestinal lumen (ie the intestinal contents are examined), intestinal tissue, Peyer plaques, spleen, liver, lymph nodes, kidney, bone marrow, brain, blood, intraperitoneum, uterus, fallopian tubes, connective tissue.
  • the method is also suitable for the identification of tissue-specific effective regulatory sequences.
  • the identification according to step (ciii) is carried out by the methods that are suitable for the respective reporter protein. It is important that the expression level of the bacteria is measured ex vivo immediately after isolation, without significant protein degradation or significant protein re-synthesis or growth and / or multiplication taking place. Furthermore, processes must be used that do not restrict the viability and multiplication of the bacteria. Methods are therefore preferred which can determine fluorescent proteins quantitatively in the living bacterium. FACS allows the identification and isolation of individual bacteria that meet a given criterion of fluorescence intensity (as a threshold or as an area with upper and lower threshold). This makes it easy to identify and isolate bacteria that express a fluorescent protein.
  • the expression level in step (ciii) is preferably specified as a threshold for carrying out a positive selection (for clones which express the gene).
  • the individual bacterium must exceed the threshold so that it can be selected.
  • the individual bacteria isolated after step (ciii) thus represent clones which, under the selected conditions, express the reporter protein with a certain minimum strength. In this way, those clones are isolated in which the insertion sequence in front of the reporter gene contains a promoter which is active in the tissue examined.
  • At least 25,000 copies of the protein per bacterium are understood as the threshold for the identification of strong promoters (positive selection). Other suitable thresholds can be chosen between 25,000 and 250,000 copies / cell. If step (ciii) is run more than once (step (h) and / or step (k), see below), a threshold of 4,500 copies is also suitable for the first run.
  • the selection criterion can be an area with a lower and an upper threshold within which the expression must lie.
  • an area e.g. medium-sized promoters are identified.
  • an area with a lower threshold of 4,500 and an upper threshold of 25,000 copies is used.
  • clones are selected that express between 25,000 and 250,000 copies / cell. Clones which express between 50,000 and 250,000 copies / cell are particularly preferred. The limits must be lowered for toxic recombinant proteins if the infectivity is limited by the toxicity.
  • step (ciii) The clones obtained in step (ciii) are cultured according to step (civ) in vitro under suitable conditions, preferably together or in aliquots. These suitable conditions are known to the person skilled in the art.
  • the expression level according to step (cv) is determined as described above.
  • step (d) the bacteria obtained from step (ciii) are subjected to a second selection step using the methods suitable for steps (civ) and (cv).
  • a threshold for carrying out a negative selection is preferably determined. Less than 2,000 or 4,500 copies / cell (in 2-wavelength FACS) are understood as the threshold for negative selection. If necessary, this threshold can be lowered further. Steps (c) and (d) therefore represent a two-stage selection.
  • step (e) individual clones can easily be isolated from the bacterial suspension from step (d) by standard microbiological methods known to the person skilled in the art.
  • Step (f)
  • step (f) The culture of the bacteria in step (f) is carried out as in step (civ) by a method known to the person skilled in the art.
  • the bacteria cultured in (f) are administered in accordance with step (g) as described for step (ci).
  • step (g) the same route of administration and the same animal species as in step (ci) is used.
  • step (h) serves to enrich clones with the desired expression properties.
  • the selection thresholds for the in vivo and / or in vitro expression level are modified if necessary (see there).
  • the same parameters and methods can be used as in the previous implementation of the method steps.
  • Step (i) The conditions under which the individual clones from steps (d), (e) or (h) can be cultivated are known to the person skilled in the art.
  • the conditions already used in step (c) are preferably used.
  • step (i) The administration of bacteria cultivated in (i) in accordance with step (j) is carried out as described above. Preferably the same route of administration and the same animal species as in step (ci) and / or in step (g) is used. Step (k)
  • step (k) serves to further investigate the expression properties of previously identified clones.
  • a profile of the expression level in different host tissues e.g. Peyer plaques, spleen, liver
  • host cell types e.g. neutrophils, dendritic cells
  • Individual host cell types can be purified by standard procedures e.g. magnetic cell sorting MACS or FACS (Yrlid, Svensson, Hakansson, Chambers, Ljunggren and Wick, 2001; Salcedo, Noursadeghi, Cohen and Holden, 2001) can be obtained.
  • Another aspect of the invention relates to the regulatory sequences that are contained in the inserts of the clones identified by the method. These clones can easily be checked for insert in the vector using standard methods known to those skilled in the art.
  • the insert can be easily sequenced using standard methods. This allows the regulatory sequences in the inserts obtained to be further narrowed down. For this purpose, steps (i), (j) and (k) are carried out with clones which contain the partial sequences. If one assumes that the regulatory sequences in total do not make up more than between 50 and 200 successive bases, such a sequence can be identified in a few steps by halving the insert and further examining the functional clone in each case.
  • both subclones are no longer active, it is assumed that the regulatory sequence is in the middle and has been cut and one continues to work with a construct of the same length which contains the cut sequence. In this way, a functional sequence of about 60 (200) bases would have been identified after a minimum of three and a maximum of six steps, assuming a length of the insert of 500 bp (1,500 bp).
  • Another possibility for the exact localization of the regulatory sequences is to make a prediction using the computer. Any existing reading frames (ie sequences from the start codon with as many subsequent triplets as possible without a stop codon) can be identified within the sequences of the insert. These predictions can be confirmed by comparing the sequences from the GENBANK.
  • the regulatory sequences in the inserts usually end at the proximal start codons at the latest.
  • the sequences before the start codon can still be examined for putative promoters (transcription starts).
  • An implementation of the algorithms is available on the Internet at http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html.
  • the results of the computer analysis for the sequences according to the invention are shown in Tables 2 and 5.
  • regulatory sequences can thus be limited to the sequence between the putative start of transcription and the proximal ORF.
  • the sequence upstream should be extended by 10, 20, 30, 40 or 50 bp, for example.
  • a sequence of 50, 100, 1 50 or 200 nucleotides upstream of the transcription start is preferably added in order to reliably detect the parts of the regulatory sequences lying within this sequence (e.g. the -10 and the -35 region). Components of the regulatory sequences upstream of the -35 region can be easily determined (e.g. as described above).
  • Another aspect of the invention relates to the use of regulatory sequences according to the invention for the development of a
  • the insert or a partial sequence thereof contains at least one regulatory sequence from a bacterial genome and is sufficient to control the tissue-specific expression of recombinant proteins.
  • the insert or a partial sequence thereof is thus simultaneously suitable for the tissue-specific expression of a recombinant antigen.
  • the insert or a partial sequence thereof is placed in front of the gene to be expressed. This construct is either integrated into the genome of a suitable vaccine strain or introduced into a vector which is replicable in the vaccine strain and which is transformed into the vaccine strain.
  • the construct can be inserted into the genome of the host cell, for example as a tandem, ie it is inserted close to the natural gene locus which is expressed by the regulatory sequence according to the invention.
  • Suitable antigens would be, for example, the Helicobacter antigen urease or AIDA fusions.
  • the regulatory sequences of the invention can also be used by inserting a heterologous nucleotide sequence coding for a recombinant antigen or other heterologous protein into the genome of the host cell, e.g. of a bacterium, is integrated so that the regulatory sequence in its natural functional context can cause the expression of the heterologous nucleotide sequences.
  • the gene that is naturally expressed by the regulatory sequence according to the invention can be switched off by the insertion, provided that it is a non-essential gene (for example virK, ugd, sifB, pSLT046, phoN, iicA, stm2585A, see Table 4) , Furthermore, the heterologous sequence can be inserted into an existing operon without the expression of this sequence interfering with the expression of the naturally existing sequences. Another possibility is to express the heterologous sequence as a fusion with the natural gene.
  • the advantage of these different configurations is that Inheritance is more stable in the chromosome than on expression vectors.
  • the stability of the genetic configuration is an essential criterion for the approval of a recombinant live vaccine.
  • the regulatory sequences according to the invention are particularly well suited for integration into the genome (a maximum of 841,000 copies / cell in vivo when using expression vectors). Since only one or a few copies of the heterologous sequence are usually present in the chromosome, a lower expression is to be expected than when using expression vectors which generally have a higher number of copies. Since 75,000 copies / cell are sufficient for a saturating immune reaction (see Example 3), a reduction in expression of up to 90% can be accepted when using the regulatory sequences according to the invention with chromosomal integration. Therefore, the regulatory sequences 4.5G, A.8H, 2.1 F and 1.3G are particularly preferred. A.8H and 2.1 F contain regulatory sequences that express non-essential genes.
  • paratyphi B is used as the vaccine strain
  • the expression of the recombinant protein takes place under the control of the autologous regulatory sequence within the natural regulatory network.
  • the expression of the recombinant protein follows the activity of the regulatory sequence in the course of the infection and becomes easier to control and predict.
  • Another aspect of the invention relates to the graded modulation of expression.
  • the level of expression that should be chosen for a live vaccine with maximum effectiveness depends on antigen-specific factors, in particular toxicity, degradation rate and immunogenicity.
  • An efficient method to selectively optimize the effectiveness of a recombinant live vaccine is to use an identified regulatory sequence that can produce strong in vivo expression and to specifically weaken the expression by modifying the Shine-Dalgamo sequence in a targeted manner. The effectiveness of a recombinant live vaccine can thus be optimized in a targeted manner.
  • Another object of the invention are in vivo active Salmonella promoters, contained in the inserts 4.5G, 1 c, A.8H, 1 f, 3g, 2a, 4a, 10g, 12b, A.2A, A.7A, A.9D , A.10F, A.1 1 B, A.1 1 H, A.12A, A.12G, CLII.3A, CLII.4C, CLII.9B, CLII.1 1 C, CLII.12C, 3.2E, 3.4F, 3.6B, 3.9A, 3.9E, A.1 1 A, A8.B, CLI.5A, 4.4G or A1.A (see Fig.
  • promoters mentioned in Example 4 are also described here for the first time with regard to their in vivo expression strength.
  • those promoters are particularly suitable which show an expression ratio in vivo / in vitro of at least about 8. These are described in more detail below.
  • Data for expression in cell culture are available for the promoters of the sequences A.1, B, 2.2A, CLII.4C, 2.4A, A.9D, A.7A, 3.4F, 3.2E, 3.6B, 3.9E.
  • Qualitative data on /> 7 V ⁇ expression are also available for the promoter of sequence 3.9E before (Valdivia and Falkow, 1997). All sequences except 1.3G are homologous to the known genome sequence of S.
  • enterica Serovar Typhimurium LT2 enterica Serovar Typhimurium LT2 (McClelland et al., 2001).
  • the promoters of the sequences A.1 1B, CLII.9B, CLII.12C, A.2A, 2.1 F and 1 .3G approximately meet the preferred selection criteria given in Example 4.
  • the v / yro threshold was exceeded in some cases, but the ratio of expression levels was greater than 8. Accordingly, in addition to the 13 sequences, the fully meet the preferred selection criteria, these 1 1 regulatory sequences are also suitable for the differential expression of recombinant proteins (see Table 4).
  • the absolute strength of the in vivo expression is also an important criterion for the suitability for producing a live vaccine.
  • the regulatory sequences which are present in the sequences A.11A, A.8B, CLI.5A, 4.4G, A.1 A are particularly advantageous for the production of a live vaccine because they have a partially larger in vivo expression (95,000 to 222,000 copies / Cell, see Table 4) in the target tissue as those regulatory sequences that fully or approximately meet the selection criteria.
  • the expression ratio is at least 2 and a maximum of 6. This is due to the in vitro expression of 36,000 to 59,000 copies / cell, which is larger than that of the regulatory sequences described above, apart from 4.5G.
  • the regulatory sequences A.1 1A, A.8B, CLI.5A, 4.4 G, A1 .A the additional advantage that an initial amount of antigen is provided in a live vaccine due to the higher in vitro expression, which is crucial for the formation of antibodies.
  • the strong in vitro expression can therefore be used to induce a biphasic immune response.
  • the sequences of these promoters are shown in Figures 33-37.
  • the plasmid 1 c contains a transcriptional fusion of gfpjova with aroQ, which encodes the periplasmic chorismate mutase (Calhoun et al., 2001).
  • the plasmid 1 f contains a genome fragment which is located immediately upstream of sifB.
  • SifB is induced under various in vitro conditions, so far nothing has been known about the expression in host cells in vitro or in vivo (Miao and Miller, 2000).
  • SifB is 30% identical to the known virulence factor SifA (see also below, plasmid 1 2b) and is presumably translocated into the host cell cytosol by a type III secretion system, but the significance of SifB for the infection is so far unclear.
  • the promoter contained in the plasmid 1 f is comparatively little active in different strains of the serovar Typhimurium and also the serovar Typhi strain Ty21 a approved as a live vaccine in vitro during the logarithmic growth phase (below 2,500 copies per cell) and inducible in late-stationary cultures, making constructs containing this promoter widely applicable and easy to test in vitro.
  • the plasmid 2a contains a transcriptional fusion of gfp ova mftphoN, which codes for a PhoP-regulated acid phosphatase. PhoN is induced in macrophages in cell culture; data on in vivo expression has so far been lacking. PhoN is not necessary for that in the mouse model (Miller, Kukral and Mekalanos, 1 989).
  • the plasmid 3g contains a transcriptional fusion of gfpjova with a reading frame that is not present in Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2, but has low homology to reading frame stm21 37 (cf. McCIeland et al., 2001). There is a high degree of homology to a sequence section from Salmonella enterica serovar Dublin that is not further characterized.
  • the low level of expression in vitro and the dynamics of induction in vivo are superior in comparison to all other previously quantified promoters for the heterologous expression of foreign antigens and comparable to the promoter P sifB (see above, plasmid 1 f).
  • This promoter also has a generally low background expression and high induction dynamics in vivo.
  • the inducibility in the stationary phase enables easy in vitro testing of new vaccine constructs.
  • the importance of insert 3g for 5a / 77 ⁇ ? E // a virulence is so far unknown.
  • the isolate LT2 which lacks corresponding sequences, has a low virulence in the mouse model (Wilmes-Riesenberg, Foster and Curtiss, III, 1997).
  • sequences such as insert 3g may also be responsible for this.
  • Upstream of the transcriptional fusion is a reading frame (bp 572-375) with homology to phage invertases.
  • Insert 3g may therefore be a mobile element that could be unstable in the salmonella genome. This is also indicated by the fact that part of the tRNA 2 for serine (serLI) (bp 22-83) lies further upstream with a high degree of agreement with the genome sequence.
  • tRNA genes are often insertion points for mobile elements, such as pathogenicity islands. In the vicinity of serU, for example, "high pathogenicity island” is inserted in pathogenic E. coli (Schubert et al., 1 999), which is quickly lost in laboratory passages.
  • the plasmid 4a contains a transcriptional fusion of gfpjova with pagD, which codes for a cell envelope protein (Gunn et al., 1 995).
  • PagD is induced in macrophages in cell culture, so far nothing has been known about the expression in vivo. PagD itself is not required for Salmonella virulence in the mouse model, because a deletion has no effect on the LD 50 .
  • transposon mutagenesis of this gene leads to a strong attenuation, which can probably be explained by the fact that the interfering transposon reduces the expression of a downstream, possibly essential gene (stm 1243) from the P pagD promoter.
  • the plasmid 10g contains a transcriptional fusion of gfpjova with pipB from the Sa // 77 ⁇ A7e // a pathogenicity island V (Pfeifer et al., 1 999).
  • salmonella upregulate the expression of pipB in macrophage-like cells. In vivo data on expression have so far been lacking. PipB is necessary for full virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium in the mouse model with oral inoculation of low doses.
  • Plasmid 12b contains a transcriptional fusion of gfpjova with sifA.
  • SifA is induced in macrophages in cell culture; data on in vivo expression has so far been lacking (Beuzon et al., 2000).
  • the phenotype of s / 74 mutants (see below) is detectable in the spleen, one can assume that sifA is expressed there (Salcedo, Noursadeghi, Cohen and Holden, 2001).
  • SifA is secreted by the type III secretion system of Sa / A? 7 ⁇ / 7e // a pathogenicity island II and is necessary for the maintenance of the phagosomal membrane (Beuzon, et al., 2000).
  • Example 4 Three regulatory sequences from Example 2 (1 c, 10g and 1 2b) were found again in Example 4 (here A.2A, 3.4F and 3.6B, see Fig. 30-32). Homologous regions of the sequences show slight deviations from one another. In example 4, a stronger expression was found. This affects the upper threshold for in v / Vo selection rather than the lower threshold for in wY / O selection and therefore leads to an increase in the expression ratio in vivo / in vitro (cf. Table 4 and Table 2). The reason is that residues (or longer residues) of the autologous gene in the clones from Example 2 hindered the expression of a GFP fusion protein.
  • regulatory sequences according to the invention for the differential expression of a recombinant protein, to connect the sequence coding for this protein directly to the proximal start codon (see Table 2 and Table 5). Then regulatory sequences in clones from Table 4 could also be suitable for differential expression, the expression ratio of which according to the experimental results in Table 4 is less than 8.
  • the regulatory sequence of insert 3.6B shows a ratio of expression in vivo / in vitro of more than 400. This regulatory sequence is therefore particularly suitable for the differential expression of a recombinant Suitable protein.
  • the homologous regulatory sequence from insertion 1 2b which shows an expression ratio of about 19 (cf. Table 2), is also particularly suitable. This ratio can be improved by cutting off the proximal start codon.
  • the regulatory sequence of insert A.1 1 A contains the promoter for UDP-glucose / GDP-mannose dehydrogenase, which is not essential for virulence.
  • the function of the genes which are expressed by the regulatory sequences of inserts A.8B, 4.4G and A.1 A is not known.
  • the corresponding genes code for putative cytoplasmic proteins.
  • the regulatory sequence of the insert CLI.5A controls the expression of the pho-P-dependent regulator mig-14, which is essential for virulence.
  • the green fluorescent protein is a commonly used reporter for gene expression in a variety of organisms.
  • a long GFP lifespan leads to high concentrations in the steady state, which can be measured well, but may also put a strain on the expressing cells.
  • GFP variants with a short lifespan place less stress on the expressing cells due to the lower amounts of GFP in the steady state, but at the same time the correspondingly weaker fluorescence signal affects them Measurability. Therefore, an important prerequisite is the choice of a GFP variant that, in combination with the expression strength of attractive promoter candidates, leads to optimal expression of GFP.
  • GFP GFP with a long lifespan (GFP.mut3, Cormack, Valdivia and Falkow, 1 996) and different variants (GFPJDVA, GFP_ASV, GFP LVA, Andersen, Sternberg, Poulsen, Björn, Givskov and Molin, 1 998) were compared as in vivo reporters for a strong (P pag c) or a weak promoter (P spvA ).
  • Plasmids pJBA27 (GFP.mut3), pJBA1 1 3 (GFP_ASV), pJBA1 1 1 (pGFP_LVA) were digested with Xbal and HindIII. The 1 kb fragments were exchanged for corresponding fragments in pMW57 (P pagC -GFP_OVA) or pMW74 (P spvA -GFP_OVA).
  • the resulting constructs were transformed into Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1 344 (a streptomycin-resistant wild-type isolate from the calf, virulent in the mouse model, see Hoiseth and Stocker, 1 981).
  • Female 8-1 2 week old BALB / c mice were orally infected with approx. 3x10 8 CFU. After 4 days, the colonization of the Peyer plaques was determined by plating out. GFP fluorescence (copies per cell) was measured by 2-wavelength FACS.
  • the results are summarized in Table 1.
  • the controls show that a colonization rate of 100,000 to 1 20,000 CFU can be expected under the given test conditions. Furthermore, the data show that GFP expressions of ⁇ 4,000 copies per cell do not hinder colonization.
  • GFP expression between 50,000 and 250,000 copies is accompanied by a reduction in colonization to 75-85% of the control.
  • a GFP Expression of 400,000 copies reduces colonization to approximately 25% (P pagC -GFP_ASV). 2,000,000 copies of GFP per cell massively hinder colonization of the host tissue ( ⁇ 1%).
  • GFP expression of 237,000 and 1779,000 copies per cell with a number of 90,000 and 80,000 CFUs isolated ex vivo was measured. Since colonization reaches at least 75% of the control strain, these GFP variants are suitable for the identification of strong and medium-strong promoters.
  • the variant GFP.mut3 is not suitable because the number of CFUs was reduced too much by the high expression. To search for medium and strong promoters, a GFP variant with a shorter half-life must be selected as GFP.mut3, so that 250,000 copies per cell are not exceeded.
  • the variants GFPJDVA and GFP_ASV are not suitable for inducing weak promoters, because when the weak promoter P spvA was used , the number of copies per cell was too low for detection ( ⁇ 4,000).
  • the variant GFP. mut3 achieved sufficient expression under these conditions.
  • a GFP variant with a longer half-life than GFPJDVA must be selected (e.g. GFP.mut3, which bears the C-terminus of the wild type, see Cormack et al., 1 996) so that at least 10,000 copies / cell can be achieved. This value is a factor of 2 above the detection threshold.
  • GFP variants or other fluorescent proteins can be tested for their suitability for use in the method according to the invention by reworking the example. All that is required is the coding sequence of the GFP or GFPJDVA in the expression vectors indicated by the coding sequence of the desired one Protein to be replaced. A number of copies between 10,000 and 250,000 must be achieved to carry out the process. With more fluorescent GFP variants that may be available in the future, lower expression levels are also sufficient.
  • the promoters used here are P pagC as an example of a strong promoter and P spvA as an example of a weak promoter, which cover this area.
  • Salmonella strains or other types of bacteria can be used if they achieve at least a colonization rate of 75% of a plasmid-free, otherwise identical control strain.
  • a genomic library was created in Salmonella enterica serovar Typhimurium to obtain information on Salmone / Ia promoters that are active in the course of an infection. Mice were infected with aliquots from this bank. The clones were isolated from infected mice and sorted using FACS.
  • Plasmid pMW82 was digested with BamHI and dephosphorylated. Genomic DNA was isolated from a 5 ml liquid culture of Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344.
  • genomic DNA was partially digested with Sau3a, so that mainly fragments in the size range 0.5 to 1.5 kb were formed.
  • genomic fragments in the size range 500-700 bp were generated by shearing genomic DNA with ultrasound. These fragments were treated with DNA polymerase to obtain blunt ends.
  • genomic fragments and the promoter-free plasmid fragment were ligated under optimal proportions (high
  • Enable bank diversity (> 10 6 ). A total of banks were created which contained more than 2x10 5 independent clones with insert-containing clones
  • the plasmids were isolated from this library and transformed into Salmonella enterica serovar Typhimurium SL 1344. A total of 10 6
  • Salmonella with more than 4,500 GFPJDVA copies per cell were purified using FACS (FacsSort, B&D or Vantage, B&D) using their typical green and orange emission (2-wavelength method).
  • the detection threshold for this FACS device is 500 copies per cell.
  • the detection threshold for tissue samples using the 2-wavelength method is approximately 4,500 copies / cell, due to the detection against the background.
  • About 0.1-0.3% of the total clones were selected, which was in line with expectations (Valdivia and Ramakrishnan, 2000).
  • the fluorescence signal was calibrated with the aid of a densitometric protein determination in the SDS gel (Coomassie staining) with reference samples of different concentrations.
  • the 60,000 clones obtained were cultured in vitro as a collective.
  • salmonellae that express less than 2,000 copies of GFPJDVA during exponential in vitro growth in LB were isolated.
  • the 75,000 clones obtained are highly redundant. These were collectively recultivated and used for a new intravenous infection in mice (same procedure as in the first round of selection). Salmonellae that contained more than 25,000 copies of GFPJDVA per cell in the spleen after 24 hours were sorted and recultivated.
  • Any reading frames i.e. sequences from the start codon with as many subsequent triplets as possible without a stop codon
  • This prediction was confirmed by comparing the sequences from the NCBI's publicly accessible GENBANK database installed on a local blast server.
  • the complete genome sequence of Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 was used.
  • restriction enzymes can also be used, which can be used in the PCR buffer and whose interfaces usually occur frequently in the genome, e.g. MspI. If a buffering is carried out, all restriction enzymes can be used.
  • the resulting 214 bp fragments were digested with Xbal (interface Tj CTAGA) and Ncol (interface C
  • the corresponding plasmids pGO_mut1, pGO_mut2, pGO_mut3, pGO_mut4 and pGOjnut ⁇ were transformed into attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium aroA SL3261.
  • the GFPJDVA can be replaced by any other antigens.
  • the relative expression level for any antigen can be quickly determined, which is a maximum
  • the immune response is effected by determining the colonization and immune response in parallel for corresponding constructs in accordance with this example. An absolute determination of the antigen as copies / cell is no longer necessary for this purpose, so that the reporter gene is no longer necessary.
  • Salmonella with more than 4,500 GFPJDVA copies per cell were identified based on their typical green and orange emission (2-wavelength method)
  • Detection threshold for this FACS device is 500 copies per cell.
  • the method is approximately 4,500 copies / cell, due to the detection against the background. There were about 0.1-0.3% of the total
  • the 60,000 clones obtained were cultured in vitro as a collective (plate culture in LB medium with a NaCl content reduced to 4 g instead of 10 g per liter).
  • salmonellae that express less than 2,000 copies of GFPJDVA during exponential in v / z o growth in LB were isolated.
  • the 75,000 clones obtained are highly redundant. These were collectively recultivated and used for a new intravenous infection in mice (same procedure as in the first round of selection). Salmonella more in the spleen after 24 h when 25,000 copies contained GFPJDVA per cell, were sorted and recultivated.
  • the genomic plasmid insert was amplified by PCR with the primers "up” ⁇ '-GGCC ACGATGCGTC (SEQ ID NO. 46) and “down” 5'-TACTCATATGTATATCT CCTTCTTA (SEQ ID NO. 47) and by digestion typed with Alul and Hpal.
  • the 61 non-redundant clones identified in this way were individually checked for the desired expression properties (here: induction in the spleen), 58 of which had correct GFPJDVA expression (see Table 4).
  • the inserts of the 58 clones were partially sequenced with the primer "down" (sequence see above).
  • the screening process thus found regulatory sequences which act as strong promoters in the spleen but which show little or no activity in vitro.
  • Any existing reading frames i.e. sequences from the start codon with as many subsequent triplets as possible without a stop codon
  • sequences from the NCBI's publicly accessible GENBANK database installed on a local blast server.
  • NCBI's publicly accessible GENBANK database installed on a local blast server.
  • the sequences before the start codon were examined for putative promoters (transcription starts).
  • the ratio of the expression strengths in these cases is at least about 8.
  • the in vitro threshold was exceeded in some cases (clones A.1 0F, CLII.3A, 2.2A, 4.5G, A.8H), but was the ratio of expression levels was also greater than 8 because the / 77 v / V ⁇ expression was correspondingly stronger.
  • a total of 24 of the ⁇ 8 clones contain regulatory sequences from Salmonella which can cause differential protein expression in vivo and in vitro, the expression in vivo being at least eight times stronger than in vitro.
  • the finding that only five of these 24 clones do not meet the preferred selection criteria shows that the method can be carried out successfully with great certainty.
  • clones with a strong in vitro and in vivo expression are also suitable for the production of live vaccines because they are able to trigger an improved two-phase immune response.
  • the clones 10g and 1 2b differentiate from their more GFP-expressing homologues 3.4F and 3.6B by a part of the autologous gene that is missing in 3.4F and 3.6B. This creates a fusion protein in 10g and 12b, which can be folded differently and could therefore be broken down more quickly.
  • rare codons can be formed at the fusion site, some of which are translated much more poorly, and the residues of the autologous gene can hinder GFP translation if both genes are not in the same reading frame, since GFP has its own start codon.
  • a fusion protein is also formed when expressed in clones 1 c and A.2A, but in the case of 1 c it contains a significantly larger proportion of the autologous protein, which explains the weaker expression of 1 c.
  • the regulatory sequences should therefore be cut off before the start codon.
  • the 24 regulatory sequences (Table ⁇ , No. 3 ⁇ - ⁇ 8) are therefore suitable for selectively expressing heterologous proteins other than GFP in the spleen, in particular heterologous antigens. These sequences are therefore suitable for the production of a live vaccine.
  • the most suitable is the clone 3.6B (sifA), which on the one hand shows a very low / 7-v / -7O activity and on the other hand with the highest / 7-Vo activity.
  • Copies / cell which also have strong expression in vitro (36,000 to 69,000 copies / cell).
  • the ratio of in vivo / in vitro expression is at least 2 and a maximum of 6. Because of the strong expression in vivo, these sequences are also suitable for expressing large amounts of heterologous proteins other than GFP in tissues, for example in the spleen, in particular heterologous ones antigens. They are also suitable for use in live vaccines.
  • Illustration 1
  • Nucleotide sequence of the expression vector pGFPJDVA (SEQ ID NO. 3)
  • GFP reporter proteins
  • the table summarizes the data from 58 clones from Example 4, sorted according to the ratio of in Vo expression to in v / fro expression.
  • Table 5 Overview of the properties of the regulatory sequences best suited for differential expression from Table 4 (see also Table 2)
  • Salmonella maintains the integrity of its intracellular vacuole through the action of SifA EMBO J. 1 9: 323 ⁇ -3249.
  • Salmonella typhimurium virulence genes are induced upon bacterial invasion into phagocytic and nonphagocytic cells Infect.lmmun.67: 5690-6698.
  • PpagC-GFP_ASV 25,000 ⁇ 10,000 24 : 385,000 + 40,000
  • Measured values below the in vivo detection limit values are based on estimates based on in vitro data.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von regulatorischen Sequenzen im Genom von Mikroorganismen, die ex vivo aus infiziertem Gewebe isoliert werden. Wieterhin betrifft die Erfindung mit diesem Verfahren identifizierte Promotoren in Salmonellen.

Description

Verfahren zur Identifikation von gewebespezifischen regulatorischen Sequenzen
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von regulatorischen Sequenzen im Genom von Mikroorganismen, die ex vivo aus infiziertem Gewebe isoliert werden. Weiterhin betrifft die Erfindung mit diesem Verfahren identifizierte Promotoren in Salmonellen.
Definitionen
Unter regulatorischen Sequenzen werden solche Sequenzen verstanden, die die Expressionsstärke eines Genproduktes (Proteins) beeinflussen. Beispiele solcher regulatorischer Sequenzen sind Sequenzen, die 5'-seitig des für das Genprodukt kodierenden Strukturgens angeordnet sind, wie etwa Promotoren und Bindungsstellen für Regulatorproteine oder Sequenzen, die 3'-seitig des Strukturgens angeordnet sind, wie etwa Terminatoren.
Unter starker Expression wird eine Expression mit einer Stärke von mehr als 25.000 gleichzeitig vorhandenen Kopien eines Proteins pro Zelle (Bakterium) verstanden. Unter schwacher Expression wird eine Expression mit einer Stärke von weniger als 4.500 gleichzeitig vorhandenen Kopien des Proteins pro Zelle (Bakterium) verstanden. Expression von 4.500 bis 25.000 Kopien wird als mittelstarke Expression bezeichnet.
Faktoren, die die Expressionsstärke beeinflussen, sind z.B. die
Eigenschaften des Promotors, insbesondere die Promotorstärke, die
Eigenschaften der Shine-Dalgarno-Sequenz und die Halbwertszeit des Proteins innerhalb der Zelle. Ein Promotor wird als schwach (mittelstark, stark) bezeichnet, wenn er unter gegebenen physiologischen Bedingungen eine schwache (mittelstarke, starke) Expression eines Proteins bewirken kann.
Die Shine-Dagamo-Sequenz in Prokaryoten ist eine Sequenz, die 1 bis 20 Nukleotide stromaufwärts des Startkodons liegt und für die Initiation der Translation wesentlich ist. Die Sequenz TTTAAGAAGGAGATATACAT stammt aus dem Gen 10 des Phagen T7 (NCBI-Datenbank gi:9627425) und bewirkt in Bakterien im Allgemeinen eine maximale Translation. Eine Übersicht über Effekte mutierter Shine-Dalgarno-Sequenzen geben z.B. Yarchuk et al. (1992) und Lee et al. (1999).
Die Halbwertszeit von bakteriellen Proteinen beträgt wenige Minuten bis zu mehr als 48 Stunden.
Unter differenzieller Genexpression wird die vom Entwicklungszustand einer Zelle abhängige spezifische Expression einzelner Gene oder Gengruppen verstanden, insbesondere in Abhängigkeit von den äußeren Bedingungen und/oder dem Wirtsmilieu, in dem sich die Zelle befindet.
Genexpression in Salmonella, in vitro und in vivo
Bei wirtsadaptierten Salmonellenstämmen (z.B. serovar Typhimurium bei der Maus, serovar Typhi beim Menschen) dringen oral aufgenommene Salmonellen hauptsächlich durch die M-Zellen der Peyer'schen PIaques in die Darmwand ein und werden von Phagocyten, wie Dendritischen Zellen, Makrophagen und Neutrophilen, aufgenommen. Wahrscheinlich in diesen Phagocyten gelangen die Salmonellen auch zu den drainierenden mesenterischen Lymphknoten und von dort über die Blutbahn zu Leber, Milz, Knochenmark, Gehirn und anderen Geweben. In allen infizierten Geweben vermehren sich die Salmonellen intrazellulär. Wenn der Wirt die Infektion nicht kontrollieren kann, kommt es zu Multiorganversagen und Tod. Bei nicht wirtsadaptierten Stämmen kommt es meist nur zu einer von selbst ausheilenden Enteritis mit Durchfällen. Dabei wird zum Teil die Darmmukosa reversibel geschädigt, tiefer liegende Gewebe sind nicht betroffen.
Sowohl der infizierte Wirt als auch die Salmonellen verfügen über umfangreiche regulatorische Netzwerke, die die Expression zahlreicher Gene an die sich ändernde Mikroumgebung anpassen können (Hensel, 1998). In vitro Studien mit Zellkulturmodellen zeigen, dass Salmonellen mehrere hundert, größtenteils noch nicht identifizierte Proteine differenziell in Abhängigkeit von der Wirtszellinie exprimieren können (Burns-Keliher et al., 1998). Diese in vitro Daten lassen vermuten, dass Salmonellen möglicherweise auf die Vielzahl unterschiedlicher Mikroumgebungen im Laufe der Infektion (Darmlumen, Peyer'sche Plaques, mesenterische Lymphknoten, Milz, Leber, Knochenmark) jeweils angepasst reagieren können (Yrlid et al., 2001 ; Salcedo et al., 2001). Die wenigen vorhandenen Daten zu anderen Pathogenen, wie Vibrio cholerae (Lee, Butler und Camilli, 2001 ) Staphylococcus aureus (Goerke et al., 2000), zeigen jedoch, dass in vivo z.T. völlig andere Regulationsmechanismen wirksam sind als in vitro. Daher ist davon auszugehen, dass die Zellkulturdaten zum Verständnis der Genregulation während der Sa//r?o/7e//a-Wirt-lnteraktion bei der Infektion nur wenig beitragen können.
Qualitative, nicht-gewebsspezifische Untersuchungen zur Genexpression bei Salmonella in vivo haben die Induktion von bis zu 100 Genen in infizierten Mäusen (Burns-Keliher, Nickerson, Morrow und Curtiss, 1998) nachgewiesen. Ein funktioneller Zusammenhang zwischen bestimmten regulatorischen Sequenzen und der differenziellen Genexpression in verschiedenen Wirtsgeweben konnte bisher nicht nachgewiesen werden und ist auch sonst aus dem Stand der Technik nicht ersichtlich. Für diesen Mangel sind in erster Linie die Schwierigkeiten verantwortlich, die Genexpression in Bakterien in infiziertem Gewebe zu messen. Damit sind wesentliche Aspekte der Pathogen-Wirt-Interaktion im komplexen Verlauf der Salmonellose noch nicht verstanden. Sowohl die Pathogenese von virulenten Salmonellen als auch die Wirksamkeit rekombinanter Sa//77θ 7e//a-Lebendimpfstoffe hängen von den Sa/λ77θA7e//a-Wirt-lnteraktionen während der Besiedelung ab. Daher besteht Bedarf an einem Verfahren, um diejenigen Gene oder Gruppen von Genen zu identifizieren, die differenziell in verschiedenen Wirtsgeweben exprimiert werden. So ist zum Beispiel für die Wirksamkeit eines Lebendimpfstoffes die Frage von Bedeutung, ob Salmonellen während der extrazellulären frühen Phase im Darmlumen" andere Gene exprimieren als während der späteren intrazellulären Phase in Leber-Makrophagen. Die Untersuchung aller ca. 4.600 Gene von Salmonella enterica serovar Typhimurium (McClelland et al., 2001 ) auf differenzielle in vivo Expression ist in der Laborpraxis aus Kosten- und Zeitgründen mit bekannten Verfahren nicht durchführbar, denn kein bekanntes Verfahren kann als Screeningverfahren nach quantitativer, gewebsspezifischer Expression eingesetzt werden.
Sa/mone/la-baslerte Lebendimpfstoffe bestehen aus einem attenuierten Salmonellenstamm, der eine begrenzte Infektion ohne Krankheitssymptome auslöst, und einer Expressionskassette mit dem fremden Antigen, dessen Expression von einem stromaufwärts liegenden Promotor getrieben wird. Im Verlauf einer begrenzten Infektion nach oraler Gabe des Lebendimpfstoffes wird eine Immunantwort gegen den Salmonellenträger und auch gegen das heterolog exprimierte Antigen induziert. In der Praxis hat sich jedoch gezeigt, dass die Expression eines fremden Antigens die Salmonellen so stark belasten kann, dass sie nur eine sehr geringe Infektion auslösen, in deren Verlauf keine ausreichende Immunantwort entsteht. Es ist daher günstig, möglichst wenig fremdes Antigen zu exprimieren, solange die Salmonellen immunkompetentes Wirtsgewebe noch nicht erreicht haben und erst danach die Expression zu induzieren. Solche in vivo induzierbaren Expressionsysteme beruhen in der Regel auf differenziell regulierten Promotoren. Obwohl es einige qualitative Informationen zu differenziell in vivo induzierten Promotoren gibt, sind bisher keine quantitativen Expressionsdaten veröffentlicht, die es erlauben würden, einen optimalen in vivo induzierbaren Promotor für einen Lebendimpfstoff auszuwählen.
Bekannte Methoden zur Analyse der Genexpression in vitro und in vivo und zum Screening
Moderne Verfahren zur globalen Analyse von Transkriptomen mit DNA-Microarrays und Proteomen mit zweidimensionaler Gelelektrophorese oder ICAT bieten optimale Möglichkeiten, die Genregulation in vitro zu untersuchen. Bei Salmonellen bildet die vollständige Genomsequenzierung von mehreren Salmonella-Serovaren eine geeignete Datenbasis für diese Methoden. Unter in vivo Bedingungen sind diese Methoden aber nur bei extrem stark infizierten Geweben anzuwenden, da nur dann die Zahl der Bakterien groß genug ist, um Bakterien-RNA bzw. Bakterien-Proteine von einer großen Mengen an Wirts-RNA und Wirtsproteinen abtrennen zu können. Zur Untersuchung von Geweben, die im normalen Verlauf einer Salmonellose oder experimentell infiziert werden (Mäuse, Inokulum von bis zu 1010 CFU oral oder 107 CFU i.V.), sind diese Verfahren nicht geeignet (Diehn und Relman, 2001 ), da die Zahl der Bakterien im Gewebe zu gering ist (bei Salmonellen z.B. 1 02-105 in den Peyer'schen Plaques).
Die kürzlich entwickelte Echtzeit-RT-PCR zur Verstärkung bakterieller Transkripte direkt aus infizierten Gewebeproben (Goerke, Bayer und Wolz, 2001 ; Rokbi et al., 2001 ) ist bisher die einzige Möglichkeit, quantitative Aussagen zur Genexpression von Pathogenen in vivo zu erhalten. Die Methodik ist sehr sensitiv, benötigt aber für jedes Gen spezifische Primer sowie angepasste Temperaturzyklen. Daher ist sie nicht für den Einsatz im Screening nach Genen und/oder Promotoren mit definierten Eigenschaften geeignet. Attenuierende Mutationen deuten darauf hin, dass die betroffenen Gene zumindest zu einem bestimmten Zeitpunkt in vivo exprimiert werden. Eine elegante Screeningmethode, die "signature-tagged mutagenesis" (Hensel, 1 998), ermöglicht die schnelle Identifizierung funktionell wichtiger Mutationen bei Salmonellen und vielen anderen Pathogenen. Die Methode basiert darauf, dass individuelle Gene durch Transposon-Mutagenese irreversible! inaktiviert werden. Sind Gene betroffen, die in vivo essentiell sind, so vermehren sich die entsprechenden Klone nicht im infizierten Tier. Die Klone fehlen in ex vivo Isolaten (negative Selektion). Die eindeutige Identifikation der Klone erfolgt durch ein individuelles Tag, das die Transposons tragen. Nachteile dieser Methode bestehen darin, dass nur solche Mutationen gefunden werden, die bereits einzeln stark attenuierend wirken, obwohl viele relevante in vivo exprimierte Gene erst im Zusammenspiel mit anderen Genen bedeutend für die Infektion sind (Mahan et al., 2000) . Außerdem kann durch die negative Selektion nur die erste gewebsspezifische Aktivierung nachgewiesen werden (nur qualitativ), nicht aber eine transiente Aktivität oder eine Repression im Infektionsverlauf. Eine positive Selektion ist nicht möglich. Quantitative Aussagen zur Genexpression oder Selektion nach Stärke der Expression sind nicht möglich.
Differenziell regulierte Promotoren können auch anhand von Reportergen-Assays analysiert werden. Eine sensitive Detektion in vivo erlauben die Reportergene ß-Galactosidase (Slauch, Mahan und Mekalanos, 1 994) und Luciferase (Contag et al., 1 995; Jacobi et al., 1998; Dunstan, Simmons und Strugnell, 1 999). Der Nachweis der Expression erfolgt über eine durch diese Enzyme katalysierte Farbreaktion in Gewebehomogenat und ist damit semiquantitativ. Reportergen-Assays werden daher vorwiegend zur Untersuchung einzelner bereits bekannter Gene eingesetzt. Ex vivo Screeningverfahren mit diesen Reportern wurden bisher nicht beschrieben. Eine spezielle Form des Reportergen-Assays ist die IVET-Methode (Mahan, Heithoff, Sinsheimer, und Low, 2000), die zur Erforschung von pathogenen Mikroorganismen häufig benutzt wird. In der IVET-Methode werden Reportergene verwendet, die einen letalen Stoffwechseldefekt komplementieren oder eine Resistenz gegen ein Antibiotikum vermitteln. Nur solche Klone, bei denen das Reportergen stromabwärts von in vivo aktiven Promotoren inseriert ist, können in vivo überleben (Komplementation des Stoffwechseldefektes bzw. Resistenz gegen Behandlung mit Antibiotika). Resistenzmarkerund Komplementationsmarker erlauben eine Positivselektiön. Mit Hilfe dieser Methode wurden bei verschiedenen Pathogenen, darunter auch Salmonellen, verschiedene in vivo induzierbare Promotoren gefunden, die z.T. eine bedeutende Rolle für die Infektion haben. Das Verfahren beruht auf dem qualitativen Vergleich der Expression in vitro mit der Expression in vivo. In der Praxis wird das Reportergen deshalb oft mit einem weiteren Marker gekoppelt, der z.B. eine Farbreaktion vermittelt. Mit dem Verfahren werden vor allem Promotoren mit sehr geringer in vitro Hintergrundexpression identifiziert, was nachteilig ist, weil viele wichtige Gene auch in vitro exprimiert werden. Quantitative Aussagen zur in vivo Genexpression sind nicht möglich (Gort and Miller, 2000).
Erst die neue IVET-Variante RIVET (Lee et al., 1 999) erlaubt eine kinetische Analyse der Promotoraktivierung im Laufe der Infektion. RIVET verwendet Resolvase als Reportergen, die bei Expression selektiv eine Resistenzkassette aus dem Genom entfernt. Das Verhältnis resistenter und sensitiver Klone wird durch Ausplattieren bestimmt und als qualitatives Maß für die Expression verwendet. Diese Vorgehensweise macht es notwendig, speziell angepasste Reporterkonstrukte je nach in vitro Aktivität der verwendeten Promotoren zu verwenden, so dass ein Screening bisher unbekannter Promotoren unmöglich ist. Aufgrund der irreversiblen Entfernung der Resistenzkassette kann nur die Aktivierung nachgewiesen werden, nicht aber eine transiente Aktivität oder eine Repression. Quantitative Daten können ebenfalls nicht gewonnen werden.
Weiterhin kann in Reportergen-Assays das grün fluoreszierende Protein GFP eingesetzt werden. GFP benötigt keine Kofaktoren, und die GFP-vermittelte Fluoreszenz kann an lebenden Proben mit Fluoreszenzmikroskopie und Durchflusszytometrie quantitativ gemessen werden. Unterschiedlich fluoreszierende Zellpopulationen kann man mit fluorescence-activated cell sorting (FACS) auftrennen. In Zellkulturmodellen konnten mit Hilfe von GFP z.B. einige Sa//77θ/7e//a-Promotoren identifiziert werden, die selektiv in infizierten Wirtszellen aktiviert werden (Valdivia and Falkow, 1 997). Bisher wurde diese Screeningmethode in vitro in Zellkultur-Infektionsmodellen mit hoher MOl (multiplicity of infection) verwendet. Im Gegensatz zu Zellkulturen enthalten infizierte Gewebehomogenate sehr viele Wirtszellfragmente mit bakterienähniichem Streuverhalten und GFP-ähnlicher Autofluoreszenz, die bisher über FACS nicht von GFP-exprimierenden Bakterien unterschieden werden konnten. Dieser störende Partikelhintergrund machte die Verwendung von GFP als quantitativer in vivo Reporter für hauptsächlich intrazellulär vorkommende Pathogene wie Salmonellen unmöglich (Lee and Camilli, 2000). Unter den besonderen Bedingungen eines hochinfizierten Gewebes kann diese Methode auch in vivo eingeschränkt verwendet werden. Das Froschpathogen Mycobacterium marinum wurde z.B. in hochinfizierten Froschgranulomen qualitativ untersucht. Eine quantitative Bestimmung der GFP-Expression war nicht möglich.
Kürzlich wurde ein ratiometrisches Verfahren publiziert (Bumann, 2001 a), mit dem die Gewebe-Autofluoreszenz von der GFP-Emission in einzelnen Bakterien durch Messung der Fluoreszenz mit zwei Wellenlängen eindeutig unterschieden werden kann. Damit steht ein Verfahren bereit, um die quantitative Proteinexpression (Promotorstärke) auch in solchen Bakterien zu messen, die ex vivo isoliert wurden und die unmittelbar nach der. Isolierung untersucht werden sollen, ohne vorher kultiviert zu werden. Dieses Verfahren wurde eingesetzt, um die Aktivität einiger einzelner bekannter Promotoren beim Infektionsweg von Salmonellen von der Darmpassage über die Peyer'schen Plaques und mesenterischen Lymphknoten zur Leber und Milz zu verfolgen. Die einzelnen Promotoren (z.B. psicA, pssaH, pphoP- 1, pbgP und ppagC) wurden als transkriptioneile Fusionen vor GFP kloniert und in Salmonellen transformiert. Im Verlauf der Infektion wurden Homogenate der Lymphknoten, der Leber und der Milz mit Detergens behandelt und mit 2-Wellenlängen-FACS analysiert. Damit konnte erstmalig die Aktivierung und die Repression einiger bekannter Sa//77θA7e//a-Promotoren während der Infektion in bestimmten Geweben quantitativ verfolgt werden.
Beschreibung des Verfahrens Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zum Screening von bakteriellen Genomen nach neuen regulatorischen Sequenzen und/oder bereits bekannten regulatorischen Sequenzen mit bisher unbekannter Funktion.
Das Verfahren erlaubt die Identifikation und die quantitative Charakterisierung von neuen oder bekannten regulatorischen Sequenzen mit gewebespezifischer Aktivität, die bisher nicht möglich war. Alle vorhandenen regulatorischen Sequenzen (insbesondere Promotoren) im untersuchten Bakterium werden kollektiv getestet, ohne dass Vorinformationen über in Frage kommende Sequenzen benötigt werden. Insbesondere eignet sich das Verfahren zur Identifizierung von regulatorischen Sequenzen, die eine differenzielle Expression in vivo und in vitro bewirken und vorzugsweise ein Verhältnis von in vivo zu in vitro Expression von mindestens etwa 8 zeigen. Diese regulatorischen Sequenzen können beispielsweise zur Herstellung von Lebendimpfstoffen eingesetzt werden. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Identifizierung von regulatorischen Sequenzen, die neben einer starken Expression in vivo auch eine starke Expression in vitro bewirken. Derartige regulatorische Sequenzen sind wegen ihrer starken in vivo Expression zur Herstellung von Lebendimpfstoffen geeignet. Zusätzlich kann die starke in vitro Expression die Immunantwort auf rekombinante Proteine verbessern, da die Immunantwort in diesem Fall zweiphasig verlaufen kann. Bei derartigen regulatorischen Sequenzen liegt das Verhältnis von in vivo/in vitro Expression bei vorzugsweise mindestens etwa 2 bis maximal etwa 6.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die Schritte:
(a) Einbringen von jeweils unterschiedlichen Teilsequenzen aus dem Genom eines bakteriellen Zielorganismus in eine Vielzahl von Vektoren, wobei die bakteriellen Sequenzen in operativer Verknüpfung mit einem Reportergen, insbesondere stromaufwärts eines Reportergens, aber auch stromabwärts eines Reportergens inseriert werden,
(b) Transformieren von Wirtsbakterien mit den Vektoren aus (a), wobei eine Genombank des bakteriellen Zielorganismus in einem Wirtsbakterium erhalten wird,
(c) Vergleichen der Expressionsstärke des Reportergens in einzelnen Bakterienzellen in vivo und in vitro,
(d) Identifizieren von Bakterienzellen, die eine vorbestimmte erste Expressionsstärke in vivo und eine vorbestimmte zweite Expressionsstärke in vitro aufweisen und
(e) gegebenenfalls Isolieren von einzelnen Bakterienzellen aus Schritt (d).
Damit stehen entweder nach Schritt (d) und/oder (e) einzelne Klone zur Verfügung, die Promotoren bzw. andere regulatorische Elemente mit den gewünschten Expressionseigenschaften auf einem Expressionsvektor enthalten. Schritt (c) des Verfahrens umfasst vorzugsweise einen oder mehrere der folgenden Teilschritte:
(ci) Verabreichen von Aliquots der Genombank an mindestens ein
Versuchstier, (cii) Gewinnen von Bakterienzellen aus dem mindestens einen
Versuchstier nach einer vorbestimmten Infektionsdauer, (ciii) Bestimmen der Expressionsstärke des Reportergens in vivo in den in
(cii) gewonnenen Bakterienzellen, (civ) Kultivieren von Bakterienzellen in vitro, die in Schritt (ciii) eine vorbestimmte erste Expressionsstärke des Reportergens in vivo aufweisen, und (cv) Bestimmen der Expressionsstärke des Reportergens in vitro in den in
(civ) kultivierten Bakterienzellen.
Darüber hinaus können derartige Klone in der Genombank angereichert werden, wenn zusätzlich folgende Verfahrensschritte durchgeführt werden:
(f) Gemeinsame in vitro Kultur von mindestens einem Teil der in Schritt
(d) identifizierten Bakterien.
(g) Verabreichung der in (f) kultivierten Bakterien oder eines Aliquots davon an mindestens ein Versuchstier.
(h) Wiederholen der Schritte (c) bis (d) oder (c) bis (e) mit den in Schritt (g) infizierten Versuchstieren.
Einzelne Klone können nach den Schritten (d), (e) oder (h) weiter untersucht werden, indem folgende Verfahrensschritte durchgeführt werden:
(i) Vermehrung des Klons in vitro.
(j) Verabreichung der in (i) kultivierten Bakterien oder eines Aliquots davon an mindestens ein Versuchstier. (k) Wiederholen des Schritts (c) bzw. der Schritte (c) bis (d) oder (c) bis
(e) mit den in Schritt (i) infizierten Versuchstieren. Die Schritte (i) bis (k) dienen z.B. zur Erstellung eines Expressionsprofils einer regulatorischen Sequenz in verschiedenen Geweben.
Schritte (a) und (b) Die Genombank eines zu untersuchenden Zielbakteriums wird entsprechend den Schritten (a) und (b) in einem Wirtsbakterium angelegt, das in vitro und in vivo unter geeigneten Bedingungen überleben und sich vermehren kann. Hierbei werden Stücke des Genoms mit einer Länge von z.B. etwa 0,1 -2 kB in einem geeigneten Vektor, vorzugsweise stromaufwärts der kodierenden Sequenz eines Reportergens; inseriert. In einer Ausführungsform werden alle regulatorischen Elemente, die für die Initiation der Transkription notwendig sind, zuvor aus der Sequenz stromaufwärts des Reportergens entfernt. Eine effiziente Shine-Dalgamo-Sequenz (z.B. TTTAAGAAGGAGAT ATACAT; SEQ ID NO. 1 ) zur Initiation der Translation kann in einem Abstand von 4-14 Nukleotiden vor dem Reportergen vorhanden sein. Falls die inserierten Stücke regulatorische Sequenzen enthalten, insbesondere Promotoren, so kann das Reportergen bei Aktivierung der regulatorischen Sequenzen exprimiert werden, sofern die regulatorischen Sequenzen in der richtigen Orientierung zu der kodierenden Sequenz des Reportergens liegen (promoter-trap vector).
Werden in einer alternativen Ausführungsform ein konstitutiver Promotor und eine Shine-Dalgarno-Sequenz dem Reportergen vorgeschaltet, so können durch Insertion stromaufwärts des Promotors andere regulatorische Sequenzen identifziert werden, die die Aktivität des Promotors beeinflussen.
Die Genombank kann aus den Genomen beliebiger Zielbakterien hergestellt werden. Als Wirt können ebenfalls beliebige Bakterien verwendet werden. Folglich können das Ziel- und das Wirtsbakterium gleich oder verschieden sein. Für beide Zwecke sind gram-positive und gram-negative Bakterien geeignet. Es können Bakterien der Familie Enterobacteriacae, der Gattungen Salmonella, Escherichia, Yersinia verwendet werden bzw. die Arten/Serovare Salmonella enterica Serovar Typhimurium, Salmonella enterica Serovar Enteritidis, Salmonella enterica Serovar Typhi, Salmonella enterica Serovar Dublin, Salmonella enterica Serovar Cholerasuis. Insbesondere ist der Salmonella enterica serovar Typhimurium Stamm SL 1 344 geeignet. Geeignet sind darüber hinaus Bakterien mit abwehrstärkender Wirkung auf das menschliche Immunsystem, die als Nahrungsmittelzusätze zugelassen sind (probiotische Bakterien), die damit auch als Träger für Lebendimpfstoffe (z.B. oral verabreichbar) in Frage kommen, z.B. die Familie Lactobacillae (gram-positiv), Lactococcae (grampositiv) und der (gram-negative) E. cσ//-Stamm Nissle (1 91 7).
Gegebenfalls kann die Genombank in einem Zwischenwirt erstellt werden. In diesem Fall wird die Plasmid-DNA mit den Inserts aus dem Zwischenwirt isoliert, mit der das endgültige Wirtsbakterium transformiert wird. Als Zwischenwirt ist E. coli besonders gut geeignet.
Die Genombank umfasst vorzugsweise mehr als 90 %, besonders bevorzugt mehr als 99 % des bakteriellen Genoms. Bei einer Größe des Sa/monel/a-Genoms von etwa 5 Mb (McClelland et al., 2001 ) und einer Größe der DNA-Insertion von 0,5 kb kann das Sa/monel/a-Genom mit etwa 20.000 Klonen repräsentiert werden (ohne Redundanz, aber mit beiden Orientierungen). Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren können Banken im Zwischenwirt E. coli erzeugt werden, die mehr als 2x105 unabhängige Klone mit inserttragenden Plasmiden enthalten. Aus dieser Bank können die Plasmide isoliert und in den endgültigen Wirt transformiert werden, z.B. Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1 344. Insgesamt können 106 Transformanden erzeugt werden, um eine möglichst vollständige Abdeckung des Genoms zu erhalten.
Bevorzugt sind Ausführungsformen, bei denen die Bank aus dem Genom des Wirtes im Wirt selbst hergestellt wird. Zur Identifizierung regulatorischer Sequenzen sind Inserts mit einer Länge von 500 bis 1 .500 bp gut geeignet. Besonders geeignet ist eine Länge von 500 bis 700 bp.
Der Vektor zur Herstellung der Genombank besteht im Wesentlichen aus Elementen zur Replikation im Wirt (und gegebenenfalls in Zwischenwirten), einem oder mehreren Marker- bzw. Reportergenen zur Selektion und Sequenzen zur Klonierung. Vorzugsweise kodiert mindestens eines der Reportergene für ein fluoreszierendes Protein, z.B. GFP (green fluorescent protein) oder GFP-Varianten (z.B. mit verbesserter Fluoreszenzausbeute: enhanced GFP oder EGFP, -oder mit UV-Anregung: GFPuv; siehe z.B. Sullivan und Kay, 1999, besonders S. 24) oder rot fluoreszierendes DsRed und verbesserte Varianten. Die Verwendung von GFP als fluoreszierendes Reporterprotein ist detailliert beschrieben (Sullivan und Kay, 1999). Expressionsvektoren (insbesondere promoter-trap-V ektoren) für GFP sind bei Valdivia und Ramakrishnan (2000) beschrieben.
GFP ist in lebenden Zellen allgemein sehr stabil mit einer Halbwertszeit von mehr als 24 h. GFP-Varianten mit deutlich kürzerer in vivo Lebensdauer können durch eine Veränderung des C-Terminus erhalten werden, durch die das GFP beschleunigt abgebaut wird. Die C-terminale Sequenz AANDENY ALAA (SEQ ID NO. 2) wird von Proteasen, die Proteine spezifisch vom C-Terminus her abbauen, spezifisch erkannt (Andersen et al., 1998). Durch Veränderung der letzten 3 Aminosäuren dieser Sequenz kann die Abbaurate moduliert werden (Keiler und Sauer, 1996).
Weiterhin kann die GFP-Variante GFPJDVA (Bumann, 2001 b) als Reporterprotein verwendet werden, das auch bei hoher Expression stabile Konstrukte ermöglicht (Beispiel 1 ). Für GFPJDVA sind Varianten mit einer modulierten Lebensdauer bisher unbekannt. Zum Nachweis schwacher Promotoren muss GFP_OVA durch sehr stabiles GFP.mut3 wegen der höheren erreichbaren Konzentration ersetzt werden (Beispiel 1 ). Schritt (c)
Schritt (c) umfasst vorzugsweise einen oder mehrere der Teilschritte (ci) bis (cv). Zur Verabreichung der Genombank entsprechend Schritt (ci) an ein Versuchstier können die üblichen Methoden verwendet werden: Injektion (max. 2x107 CFU intravenös, 2x109 CFU intramuskulär, 2x109 CFU subkutan, 2x107 CFU intraperitoneal), orale Gabe mit 5x1010 CFU (Vorbehandlung mit Streptomycin 5 g/l im Trinkwasser) oder nasale Gabe (5x106 CFU). Gegebenenfalls werden die üblichen Hilfs- und Trägerstoffe hinzugefügt, die dem Fachmann bekannt sind. Vorzugsweise wird die Verabreichung intravenös (z.B. in die Schwanzvene) durchgeführt, da auf diese Weise die höchsten Kolonisierungsraten in den Zielorganen (z.B. Lymphknoten, Milz, Leber) erreicht werden können. Als Versuchstiere sind alle Säugetiere geeignet, insbesondere die Maus, das Kaninchen, die Ratte, Menschenaffen oder Kälber. Es können z.B. BALB/c-Mäuse, immundefiziente Mäuse, immunisierte oder immunsupprimierte IFN(R (-/-) Mäuse verwendet werden.
Das Verfahren ist zur Entwicklung von Lebendimpfstoffen beim Menschen einsetzbar, sofern man Bakterien verwendet, die keine oder nur eine sehr geringe Pathogenität aufweisen und die oral oder nasal verabreichbar sind.
Die Infektionsdauer nach Schritt (cii) bemisst sich nach dem Infektionsverlauf und nach den Zielorganen, die untersucht werden sollen. Bei Mäusen als Versuchstieren und Salmonellen als Wirt der Genbank können Infektionszeiten zwischen 1 h und 120 h verwendet werden, um den Verlauf der Infektion von der Besiedelung der Peyer'schen Plaques bis zur Besiedelung der Leber und der Milz zu verfolgen. Um den Bestimmungen des Tierschutzes gerecht werden zu können, sollten die frühe und mittlere Phase der Infektion untersucht werden. Terminal kranke Tiere sollten nicht untersucht werden. Die Gewebeproben entsprechend Schritt (cii) werden mit üblichen Verfahren unter milden Bedingungen homogenisiert und lysiert, so dass die Bakterien in der erhaltenen Einzelzellsuspension zu einem sehr großen Anteil lebens- und vermehrungsfähig bleiben. Als Gewebe können alle infizierten Gewebe verwendet werden, insbesondere das Darmlumen (d.h. der Darminhalt wird untersucht), Darmgewebe, Peyer'sche Plaques, Milz, Leber, Lymphknoten, Niere, Knochenmark, Gehirn, Blut, Intraperitoneum, Uterus, Eileiter, Bindegewebe. Das Verfahren eignet sich auch zur Identifizierung von gewebespezifisch wirksamen regulatorischen Sequenzen.
Die Identifikation entsprechend Schritt (ciii) erfolgt durch die Methoden, die für das jeweilige Reporterprötein geeignet sind. Wichtig ist, dass die Expressionsstärke der Bakterien unmittelbar nach der Isolation ex vivo gemessen wird, ohne dass ein nennenswerter Proteinabbau oder nennenswerte Proteinneusynthese bzw. Wachstum und/oder Vermehrung stattgefunden hat. Weiterhin müssen Verfahren eingesetzt werden, die die Lebens- und Vermehrungsfähigkeit der Bakterien nicht einschränken. Bevorzugt sind daher Verfahren, die fluoreszierende Proteine quantitativ im lebenden Bakterium bestimmen können. FACS erlaubt die Identifizierung und Isolierung einzelner Bakterien, die ein vorgegebenes Kriterium an Fluoreszenzstärke (als Schwelle oder als Bereich mit oberer und unterer Schwelle) erfüllen. Damit können Bakterien, die ein fluoreszierendes Protein exprimieren, leicht identifiziert und isoliert werden. Der Einsatz von Standard-FACS mit der üblicherweise durchgeführten Messung von nur einer Emissionswellenlänge führt bei den erfindungsgemäßen Bakteriensuspensionen wegen der Autofluoreszenz der Reste des Wirtsgewebes zu unbrauchbaren Sortierergebnissen. Daher wird ein ratiometrisches Verfahren mit Messung von zwei Emissionswellenlängen eingesetzt (Details der Methode, siehe Bumann, 2001 a), das eine saubere Isolierung von Bakterien mit einer vorgegebenen Expression des Markerproteins erlaubt. Die Fluoreszenzstärke ist ein Maß für die Menge an exprimiertem Protein und kann auf Kopien des Proteins pro Zelle kalibriert werden. Die Kalibrierung kann über den Extinktionskoeffizienten des fluoreszierenden Proteins oder über eine densitometrische Proteinbestimmung mit Referenzproben verschiedener Konzentration, z.B. im SDS-Gel, erfolgen.
Vorzugsweise wird die Expressionsstärke in Schritt (ciii) als Schwelle zur Durchführung einer Positivselektion (auf Klone, die das Gen exprimieren) vorgegeben. Hierbei muss das einzelne Bakterium die Schwelle überschreiten, damit es selektioniert wird. Die einzelnen nach Schritt (ciii) isolierten Bakterien stellen also Klone dar, die unter den gewählten Bedingungen das Reporterprotein mit einer bestimmten Mindeststärke exprimieren. Damit werden solche Klone isoliert, in denen die Insertionssequenz vor dem Reportergen einen Promotor enthält, der in dem untersuchten Gewebe aktiv ist.
Ais Schwelle zur Identifikation von starken Promotoren (Positivselektion) werden mindestens 25.000 Kopien des Proteins pro Bakterium verstanden. Weitere geeignete Schwellen können zwischen 25.000 und 250.000 Kopien/Zelle gewählt werden. Wird der Schritt (ciii) mehr als einmal durchlaufen (Schritt (h) und/oder Schritt (k), siehe unten), so ist beim ersten Durchlauf auch eine Schwelle von 4.500 Kopien geeignet.
Alternativ kann das Selektionskriterium ein Bereich mit unterer und oberer Schwelle sein, innerhalb dessen die Expression liegen muss. Mit einem solchen Bereich könnten z.B. mittelstarke Promotoren identifiziert werden. Vorzugsweise wird ein Bereich mit einer unteren Schwelle von 4.500 und einer oberen Schwelle von 25.000 Kopien verwendet.
Wählt man bestimmte Selektionsbedingungen aus dem Bereich möglicher Schwellen aus, so lässt sich zusätzlich erreichen, dass die selektionierten Bakterienklone den natürlichen Infektionsverlauf genauso gut durchlaufen können wie der Wirtsstamm alleine. Die Infektivität dieser Klone ist also unter diesen Bedingungen nicht geringer als die Infektivität des Wirtsstammes alleine. Eine Reduktion der Kolonisierung um bis zu 25 % schränkt die Infektivität nicht wesentlich ein. Ein Klon, der in Schritt (ciii). etwa 4.500-250.000 Kopien/Zelle eines rekombinanten Proteins exprimiert, erfüllt daher diese Bedingungen, da hier keine Verminderung der Kolonisierung von mehr als 25 % gemessen wird. Vorzugsweise werden Klone ausgewählt, die zwischen 25.000 und 250.000 Kopien/Zelle exprimieren. Besonders bevorzugt sind Klone, die zwischen 50.000 und 250.000 Kopien/Zelle exprimieren. Für toxische rekombinante Proteine müssen die Grenzen abgesenkt werden, sofern die Infektivität durch die Toxizität eingeschränkt ist.
Die in Schritt (ciii) erhaltenen Klone werden entsprechend Schritt (civ) in vitro unter geeigneten Bedingungen vorzugsweise gemeinsam oder in Aliquots kultiviert. Dem Fachmann sind diese geeigneten Bedingungen bekannt. Die Bestimmung der Expressionsstärke gemäß Schritt (cv) erfolgt entsprechend wie zuvor beschrieben.
Schritt (d)
Entsprechend Schritt (d) erfolgt mit den aus Schritt (ciii) erhaltenen Bakterien ein zweiter Selektionsschritt mit den nach den Schritten (civ) und (cv) geeigneten Verfahren. Vorzugsweise wird eine Schwelle zur Durchführung einer Negativselektion (Klone, die unter den gewählten Bedingungen das Reportergen unterschwellig exprimieren) bestimmt. Als Schwelle zur Negativselektion werden weniger als 2.000 bzw. 4.500 Kopien/Zelle (im 2-Wellenlängen-FACS) verstanden. Gegebenenfalls kann diese Schwelle weiter abgesenkt werden. Die Schritte (c) und (d) stellen also eine zweistufige Selektion dar.
Schritt (e)
Entsprechend Schritt (e) können aus der Bakteriensuspension aus Schritt (d) einzelne Klone durch mikrobiologische Standardmethoden, die dem Fachmann bekannt sind, leicht isoliert werden. Schritt (f)
Die Kultur der Bakterien in Schritt (f) erfolgt wie in Schritt (civ) nach einem dem Fachmann bekannten Verfahren.
Schritt (g)
Die Verabreichung von in (f) kultivierten Bakterien entsprechend Schritt (g) erfolgt wie für Schritt (ci) beschrieben. Vorzugsweise wird derselbe Verabreichungsweg und dieselbe Versuchstierart wie in Schritt (ci) verwendet.
Schritt (h)
Die Wiederholung der Selektionsschritte entsprechend Schritt (h) dient der Anreicherung von Klonen mit den gewünschten Expressionseigenschaften. Die Selektionsschwellen für die in vivo oder/und in vitro Expressionsstärke werden gegebenenfalls modifiziert (siehe dort). Darüber hinaus können dieselben Parameter und Verfahren wie bei der/den vorhergehenden Durchführung/en der Verfahrensschritte verwendet werden.
Schritt (i) Die Bedingungen, unter denen die einzelnen Klone aus den Schritten (d), (e) oder (h) kultiviert werden können, sind dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise werden die schon in Schritt (c) eingesetzten Bedingungen verwendet.
Schritt (j)
Die Verabreichung von in (i) kultivierten Bakterien entsprechend Schritt (j) erfolgt wie zuvor beschrieben. Vorzugsweise wird derselbe Verabreichungsweg und dieselbe Versuchstierart wie in Schritt (ci) und/oder in Schritt (g) verwendet. Schritt (k)
Die Wiederholung der Verfahrensschritte entsprechend Schritt (k) dient der weiteren Untersuchung der Expressionseigenschaften vorher identifizierter Klone. Insbesondere kann ein Profil der Expressionsstärke in verschiedenen Wirtsgeweben (z.B. Peyer'sche Plaques, Milz, Leber) oder Wirtszelltypen (Makrophagen, Neutrophile, dendritische Zellen) erstellt werden. Einzelne Wirtszelltypen können durch Aufreinigung mit Standardverfahren z.B. magnetische Zellsortierung MACS oder FACS (Yrlid, Svensson, Hakansson, Chambers, Ljunggren und Wick, 2001 ; Salcedo, Noursadeghi, Cohen und Holden, 2001 ) erhalten werden.
Eingrenzung der regulatorischen Sequenzen
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die regulatorischen Sequenzen, die in den Inserts der mit dem Verfahren identifizierten Klone enthalten sind. Diese Klone können mit dem Fachmann bekannten Standardmethoden leicht auf das Insert im Vektor überprüft werden. Das Insert kann mit Standardmethoden leicht sequenziert werden. Damit können die regulatorischen Sequenzen in den erhaltenen Inserts weiter eingegrenzt werden. Hierzu werden die Schritte (i), (j) und (k) mit Klonen, die die Teilsequenzen enthalten, durchgeführt. Geht man davon aus, dass die regulatorischen Sequenzen insgesamt nicht mehr als zwischen 50 und 200 aufeinanderfolgende Basen ausmachen, so kann eine solche Sequenz mit wenigen Schritten identifiziert werden, indem das Insert halbiert wird und der jeweils funktioneile Klon weiteruntersucht wird. Sind beide Subklone nicht mehr aktiv, so geht man davon aus, dass die regulatorische Sequenz in der Mitte liegt und zerschnitten wurde, und man arbeitet mit einem gleichlangen Konstrukt weiter, das die geschnittene Sequenz enthält. Auf diese Weise hätte man nach minimal drei, nach maximal sechs Schritten eine funktioneile Sequenz von etwa 60 (200) Basen identifiziert, geht man von einer Länge des Inserts von 500 bp (1 500 bp) aus. Eine weitere Möglichkeit zur genauen Lokalisation der regulatorischen Sequenzen besteht in einer Vorhersage mithilfe des Computers. Innerhalb der Sequenzen des Inserts können eventuell vorhandene Leseraster (d.h. Sequenzen aus Startkodon mit möglichst vielen folgenden Tripletts ohne Stopkodon) identifiziert werden. Diese Vorhersagen können durch Vergleich der Sequenzen aus der GENBANK bestätigt werden. Die regulatorischen Sequenzen in den Inserts enden also in der Regel spätestens an den proximalen Startkodons. Die Sequenzen vor dem Startkodon (die intergenen Regionen) können weiterhin auf putative Promotoren (Transkriptionsstarts) untersucht werden. Hierzu sind die Algorithmen von Reese (1 994), Reese und Eeckman ( 1 995) und Reese et al. ( 1 996) geeignet. Eine Implementation der Algorithmen steht im Internet unter http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html zur Verfügung. Die Ergebnisse der Computeranalyse für die erfindungsgemäßen Sequenzen liegen in Tabelle 2 und 5 vor. In der Insertion können regulatorische Sequenzen also auf die Sequenz zwischen putativem Transkriptionsstart und proximalem ORF eingegrenzt werden. Um Ungenauigkeiten in der Vorhersage des Transkriptionsstarts zu vermeiden, sollte die Sequenz stromaufwärts um z.B. 10, 20, 30, 40 oder 50 bp verlängert werden.
Vorzugsweise hinzugefügt wird noch eine Sequenz von 50, 100, 1 50 oder 200 Nukieotiden stromaufwärts des Transkriptionsstartes, um die innerhalb dieser Sequenz liegenden Teile der regulatorischen Sequenzen zuverlässig zu erfassen (z.B. die -10 und die -35-Region). Bestandteile der regulatorischen Sequenzen stromaufwärts der -35-Region können ohne Weiteres leicht bestimmt wrden (z.B. wie oben beschrieben).
Lebendimpfstoffe
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft den Einsatz von erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen zur Entwicklung eines
Lebendimpfstoffes. Durch den Nachweis der Expression im Gewebe und der fehlenden Expression in vitro ist gleichzeitig gezeigt, dass das Insert oder eine Teilsequenz hiervon, so wie es das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert hat, mindestens eine regulatorische Sequenz aus einem bakteriellen Genom enthält und zur Steuerung der gewebsspezifischen Expression rekombinanter Proteine hinreichend ist. Damit ist das Insert oder eine Teilsequenz hiervon gleichzeitig für die gewebespezifisclre Expression eines rekombinanten Antigens geeignet. Das Insert oder eine Teilsequenz hiervon wird hierzu vor das zu exprimierende Gen gebracht. Dieses Konstrukt wird entweder in das Genom eines geeigneten Impfstammes integriert oder in einen im Impfstamm replizierbaren Vektor eingebracht, der in den Impfstamm transformiert wird. Das Konstrukt kann in das Genom der Wirtszelle z.B. als Tandem eingefügt werden, d.h. es wird nahe demjenigen natürlichen Genlokus inseriert, der durch die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz exprimiert wird. Geeignete Antigene wären z.B. das Helicobacter-Antigen Urease oder AIDA-Fusionen.
Die erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen können auch verwendet werden, indem eine heterologe Nukleotidsequenz, die für ein rekombinantes Antigen oder ein anderes heterologes Protein kodiert, an der entsprechenden Stelle in das Genom der Wirtszelle, z.B. eines Bakteriums, integriert wird, so dass die regulatorische Sequenz in ihrem natürlichen funktioneilen Kontext die Expression der heterologen Nukleotidsequenzen bewirken kann.
Das Gen, das natürlicherweise durch die erfindungsgemäße regulatorische Sequenz exprimiert wird, kann durch die Insertion ausgeschaltet werden, sofern es sich um ein nicht-essentielles Gen handelt (z.B. virK, ugd, sifB, pSLT046, phoN, iicA, stm2585A, siehe Tabelle 4). Weiterhin kann die heterologe Sequenz in ein vorhandenes Operon eingefügt werden, ohne dass durch die Expression dieser Sequenz die Expression der natürlicherweise vorhandenen Sequenzen gestört wird. Eine weitere Möglichkeit ist, die heterologe Sequenz als Fusion mit dem natürlichen Gen zu exprimieren. Der Vorteil dieser verschiedenen Konfigurationen ist, dass die Vererbung im Chromosom stabiler ist als auf Expressionsvektoren. Die Stabilität der genetischen Konfiguration ist ein wesentliches Kriterium für die Zulassung eines rekombinanten Lebendimpfstoffes.
Die erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen sind zur Integration in das Genom aufgrund ihrer starken Expression besonders gut geeignet (in vivo maximal 841 .000 Kopien/Zelle bei Verwendung von Expressionsvektoren). Da im Chromosom üblicherweise nur eine oder wenige Kopien der heterologen Sequenz vorhanden sind, ist mit einer geringeren Expression zu rechnen als bei Verwendung von Expressionsvektoren, die in der Regel eine höhere Kopienzahl aufweisen. Da 75.000 Kopien/Zelle für eine sättigende Immunreaktion ausreichend sind (siehe Beispiel 3), kann bei Verwendung der erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen bei chromosomaler Integration eine Reduktion der Expression um bis zu 90 % akzeptiert werden. Daher sind die regulatorischen Sequenzen 4.5G, A.8H, 2.1 F und 1.3G besonders bevorzugt. A.8H und 2.1 F enthalten regulatorische Sequenzen, die nichtessentielle Gene exprimieren. Diese Gene können deshalb gegen heterologe Sequenzen ausgetauscht werden, ohne die Kolonisierungsfähigkeit der Salmonellen zu beeinträchtigen. 4.5G und 1.3G sind bisher nicht bezüglich ihrer Virulenz-Funktion charakterisiert, aber beide sind Phagen-assoziiert. Da Phagen in der Regel nur geringe Effekte auf die Salmonellen-Virulenz haben, kann davon ausgegangen werden, dass auch die von 4.5G und 1 ,3G regulierten Gene ohne Nachteil für die Kolonisierungsfähigkeit gegen heterologe Sequenzen ausgetauscht werden können.
Für die Entwicklung eines Lebendimpfstoffes sind diejenigen erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen zur Expression rekombinanter Proteine von besonderem Interesse, die natürlicherweise in den humanpathogenen Stämmen Salmonella typhimurium, S. typhi, S. paratyphi A oder S. paratyphi B vorhanden sind. Es ist daher vorteilhaft, aus der Gruppe der erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen anhand von Tabelle 4 solche auszuwählen, die in mindestens in Salmonella typhimurium, S. typhi, S. paratyphi A oder S. paratyphi B oder zweien oder mehreren hiervon vorkommen. Der Vorteil liegt darin, dass bei Einsatz eines attenuierten Stammes von Salmonella typhimurium, S. typhi, S. paratyphi A oder S. paratyphi B als Impfstamm die Expression des rekombinanten Proteins unter Kontrolle der autologen regulatorischen Sequenz innerhalb des natürlichen regulatorischen Netzwerkes stattfindet. Somit folgt die Expression des rekombinanten Proteins der Aktivität der regulatorischen Sequenz im Infektionsverlauf und wird leichter kontrollierbar und vorhersagbar.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die graduierte Modulierung der Expression. Die Expressionsstärke, die für einen Lebendimpfstoff mit maximaler Wirkung gewählt werden sollte, hängt von antigenspezifischen Faktoren ab, insbesondere Toxizität, Abbaurate und Immunogenität. Eine effiziente Methode, um die Wirksamkeit eines rekombinanten Lebendimpfstoff gezielt zu optimieren, besteht in der Verwendung einer identifizierten regulatorischen Sequenz, die eine starke in vivo Expression bewirken kann, und der gezielten Abschwächung der Expression durch eine gezielte Modifikation der Shine-Dalgamo-Sequenz. Damit lässt sich die Wirksamkeit eines rekombinanten Lebendvakzines gezielt optimieren. Es genügt, neben dem Wildtyp pGO WT eine von fünf hier beschriebenen Mutationen der Shine-Dalgamo-Sequenz von Gen 10 aus dem Phagen T7 im 1 6S-RNA-komplementären Tetranukleotid GGAG bzw. der angrenzenden Nukleotide (siehe Plasmide pGO WT, pGOjnutl , pGO_mut2, pGO_mut3, pGO_mut4, pGO_mut5) einzusetzen, um die Expressionsstärke vorhersagbar und graduiert auf bis zu etwa 2 % des Ausgangswerts zu senken. Damit kann der gesamte für die Proteinexpression und/oder Antigenexpression sinnvolle Bereich abgedeckt werden. Durch Mutation der Shine-Dalgamo-Sequenz kann die Expressionsstärke beliebiger Promotoren gezielt abgeschwächt werden. Beschreibung neuer Promotoren, identifiziert mit dem erfindungsgemäßen Verfahren
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind in vivo aktive Salmonella Promotoren, enthalten in den Insertionen 4.5G, 1 c, A.8H, 1 f, 3g, 2a, 4a, 10g, 12b, A.2A, A.7A, A.9D, A.10F, A.1 1 B, A.1 1 H, A.12A, A.12G, CLII.3A, CLII.4C, CLII.9B, CLII.1 1 C, CLII.12C, 3.2E, 3.4F, 3.6B, 3.9A, 3.9E, A.1 1 A, A8.B, CLI.5A, 4.4G oder A1.A (siehe Abb. 3-29 und 33-37) sowie davon durch Mutationen, z.B. durch Insertionen, Deletionen oder/und Substitutionen einzelner Basen oder kurzer, z.B. bis zu 3 Basen langen Sequenzabschnitten, abgeleitete Promotoren und deren Verwendung zur Herstellung von Lebendimpfstoffen, insbesondere zur Expression rekombinanter, vorzugsweise heterologer Antigene in Lebendimpfstoffen.
Alle nachfolgend beschriebenen Promotoren sind hier erstmalig bezüglich ihrer in vivo Expressionsstärke beschrieben. Zu Plasmiden 2a, 4a, 10g und 12b lagen bereits Daten zur Induktion in Makrophagen in Zellkultur vor, die aber keine sichere Vorhersage zu in vivo Bedingungen ermöglichen (Beuzon, Unsworth und Holden, 2001 ). Für die besonders attraktiven Promotoren 1f und 3g sowie für den Promotor 1 c lagen bisher überhaupt keine Daten zur Expression in Wirtszellen vor, weder für Zellkultur-Infektionsmodelle noch für/>7 vivo Modelle. Alle Sequenzen außer 3g sind homolog zu der bekannten Genomsequenz von S. enterica Serovar Typhimurium LT2 (McClelland et al., 2001 ).
Alle in Beispiel 4 genannten Promotoren werden hier ebenfalls erstmalig bezüglich ihrer in vivo Expressionsstärke beschrieben. Zur differentiellen Expression rekombinanter Proteine sind diejenigen Promotoren besonders geeignet, die ein Expressionsverhältnis in vivo/in vitro von mindestens etwa 8 zeigen. Diese sind im folgenden näher beschrieben. Für die Promotoren der Sequenzen A.1 1 B, 2.2A, CLII.4C, 2.4A, A.9D, A.7A, 3.4F, 3.2E, 3.6B, 3.9E liegen Daten zur Expression in Zellkultur vor. Für den Promotor der Sequenz 3.9E liegen zusätzlich qualitative Daten zur />7 Vσ-Expression vor (Valdivia und Falkow, 1997). Alle Sequenzen außer 1 .3G sind homolog zu der bekannten Genomsequenz von S. enterica Serovar Typhimurium LT2 (McClelland et al., 2001 ). Die Promotoren der Sequenzen A.1 1 B, CLII.9B, CLII.12C, A.2A, 2.1 F und 1 .3G erfüllen die im Beispiel 4 angegebenen bevorzugten Selektionskriterien annähernd. In den Klonen A.10F, CLII.3A, 2.2A, 4.5G und A.8H wurde die in v/Yro-Schwelle teilweise stark überschritten, jedoch war das Verhältnis der Expressionsstärken größer als 8. Demnach sind neben den 13 Sequenzen, die die bevorzugten Selektionskriterien voll erfüllen, auch diese 1 1 regulatorischen Sequenzen zur differentiellen Expression rekombinanter Proteine geeignet (vergl. Tabelle 4).
Neben dem in vivo/in vitro Verhältnis der Expression ist auch die absolute Stärke der in vivo Expression ein wesentliches Kriterium für die Eignung zur Herstellung eines Lebendimpfstoffs. Die regulatorischen Sequenzen, die in den Sequenzen A.11A, A.8B, CLI.5A, 4.4G, A.1 A vorliegen, sind zur Herstellung eines Lebendimpfstoffs besonders vorteilhaft, weil sie eine teilweise größere in vivo Expression (95.000 bis 222.000 Kopien/Zelle, siehe Tabelle 4) im Zielgewebe als diejenigen regulatorischen Sequenzen zeigen, die die Selektionskriterien voll oder annähernd erfüllen. Das Expressionsverhältnis liegt bei mindestens 2 und maximal 6. Dies hat seinen Grund in der in vitro Expression von 36.000 bis 59.000 Kopien/Zelle, die größer ist als die der oben beschriebenen regulatorischen Sequenzen, von 4.5G abgesehen. Neben der T-Zell-Antwort, für die eine verzögerte Antigenexpression optimal ist, wie sie durch die regulatorischen Sequenzen mit sehr niedriger in vitro Expression bewirkt wird, haben die regulatorischen Sequenzen A.1 1 A, A.8B, CLI.5A, 4.4G, A1 .A den zusätzlichen Vorteil, dass in einem Lebendimpfstoff aufgrund der höheren in vitro Expression eine initiale Antigenmenge bereitgestellt wird, die für die Bildung von Antikörpern entscheidend ist. Die starke in vitro Expression kann also zur Induktion einer biphasischen Immunantwort genutzt werden. Die Sequenzen dieser Promotoren sind in den Abbildungen 33-37 gezeigt. Das Plasmid 1 c enthält eine transkriptioneile Fusion von gfpjova mit aroQ, das die periplasmatische Chorismatmutase kodiert (Calhoun et al., 2001 ) . Bisher war nichts zur in vitro und in vivo Expression von aroQ bekannt. Chorismatmutase ist an der Biosynthese der aromatischen Aminosäuren Tyrosin und Phenylalanin beteiligt. Mehrere stark attenuierende Mutationen (aroA, aroC, aroD) liegen in Genen, die an demselben Stoffwechselweg beteiligt sind (Groisman and Ochman, 1 997). Möglicherweise ist aroQ ebenfalls nötig für die volle Viurulenz. Andererseits enthält das Salmonellen-Genom mehrere Chorismatmutasegene (aroQ, pheA, tyrA), weshalb die Bedeutung von aroQ bisher unklar ist.
Das Plasmid 1 f enthält ein Genomfragment, das unmittelbar stromaufwärts von sifB liegt. SifB wird unter verschiedenen in vitro Bedingungen induziert, über die Expression in Wirtszellen in vitro oder in vivo war bisher nichts bekannt (Miao and Miller, 2000). SifB ist zu 30 % identisch mit dem bekannten Virulenzfaktor SifA (s. auch unten, Plasmid 1 2b) und wird vermutlich durch ein Typ lll-Sekretionssstem in das Wirtszelizytosol transloziert, die Bedeutung von SifB für die Infektion ist bisher aber unklar. Die niedrige Expressionsstärke in vitro und die Dynamik der Induktion in vivo von PsifB sind überlegen im Vergleich zu allen anderen bisher quantitativ charakterisierten Promotoren für die heterologe Expression von fremden Antigenen (bisher bester Promotor PpagC: in vitro Aktivität in verschiedenen Salmonellen-Stämmen 10.000-50.000 Kopien GFPJDVA pro Zelle, in vivo 1 50.000 bis 230.000 Kopien pro Zelle, Bumann, 2001 b). Insbesondere ist der im Plasmid 1 f enthaltene Promotor in verschiedenen Stämmen vom serovar Typhimurium und auch dem als Lebendimpfstoff zugelassenen serovar Typhi-Stamm Ty21 a in vitro der logarithmischen Wachstumsphase vergleichbar gering aktiv (unter 2.500 Kopien pro Zelle) und in spät-stationären Kulturen induzierbar, womit Konstrukte, die diesen Promotor enthalten, breit anwendbar und leicht in vitro zu testen sind. Das Plasmid 2a enthält eine transkriptioneile Fusion von gfp ova mftphoN, das für eine PhoP-regulierte saure Phosphatase kodiert. PhoN wird in Makrophagen in Zellkultur induziert, Daten zur in vivo Expression fehlten bisher. PhoN ist nicht notwendig für die im Mausmodell (Miller, Kukral und Mekalanos, 1 989).
Das Plasmid 3g enthält eine transkriptionelle Fusion von gfpjova mit einem Leseraster, das nicht in Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 vorhanden ist, aber geringe Homologie zu Leseraster stm21 37 hat (vergleiche hierzu McCIeland et al., 2001 ). Eine hohe Homologie besteht zu einem nicht weiter charakterisierten Sequenzabschnitt aus Salmonella enterica serovar Dublin. Die Sequenz des Genoms ist beim National Center for Biotechnology Information zu finden (Taxonomy ID 98360, ref = NC_002961 , Contig UIUC 98360). Zur Expression in vitro und in vivo war bisher nichts bekannt. Die niedrige Expressionsstärke in vitro und die Dynamik der Induktion in vivo sind überlegen im Vergleich zu allen anderen bisher quantitativ charakterisierten Promotoren für die heterologe Expression von fremden Antigenen und vergleichbar zum Promotor PsifB (siehe oben, Plasmid 1 f). Dieser Promotor hat ebenfalls eine allgemein geringe Hintergrundexpression und hohe Induktionsdynamik in vivo. Die Induzierbarkeit in der stationären Phase ermöglicht eine leichte in vitro Testung neuer Vakzin-Konstrukte. Die Bedeutung von Insert 3g für die 5a/77θ ?e//a-Virulenz ist bisher unbekannt. Das Isolat LT2, dem entsprechende Sequenzen fehlen, hat eine geringe Virulenz im Mausmodell (Wilmes-Riesenberg, Foster und Curtiss, III, 1997). Neben einem mutierten rpoS Gen sind möglicherweise auch Sequenzen, wie das Insert 3g, die im Wildtyp vorhanden sind, dafür verantwortlich. Stromaufwärts von der transkriptionellen Fusion liegt ein Leseraster (bp 572-375) mit Homologie zu Phagen-Invertasen. Möglicherweise ist Insert 3g deshalb ein mobiles Element, das im Salmonellengenom instabil sein könnte. Dafür spricht auch, dass weiter stromaufwärts ein Teil der tRNA 2 für Serin (serLI) (bp 22-83) mit hoher Übereinstimmung zur Genomsequenz liegt. tRNA-Gene sind häufig lnsertionsstellen für mobile Elemente, wie z.B. Pathogenitätsinseln. In der Nähe von serU lst z.B. in pathogenen E.coli ύ\e "high pathogenicity island" insertiert (Schubert et al., 1 999), die bei Laborpassagen schell verlorengeht.
Das Plasmid 4a enthält eine transkriptioneile Fusion von gfpjova mit pagD, das für ein Zellhüllenprotein kodiert (Gunn et al., 1 995). PagD wird induziert in Makrophagen in Zellkultur, über die Expression in vivo war bisher nichts bekannt. PagD selber wird nicht für die Salmonella-Virulenz im Mausmodell benötigt, denn eine Deletion hat keinen Einfluß auf die LD50. Andererseits führt Transposon-Mutagenese dieses Gens zu einer starken Attenuierung, die vermutlich damit erklärt werden kann, dass das störende Transposon die Expression eines stromabwärts liegenden, möglicherweise wesentlichen Gens (stm 1243) vom PpagD Promotor vermindert.
Das Plasmid 10g enthält eine transkriptionelle Fusion von gfpjova mit pipB aus der Sa//77θA7e//a-Pathogenitätsinsel V (Pfeifer et al., 1 999). In einem in vitro Zellkultur-Infektionsmodell regulieren Salmonellen die Expression von pipB in makrophagenartigen Zellen hoch. In vivo Daten zur Expression fehlten bisher. PipB ist nötig für die volle Virulenz von Salmonella enterica serovar Typhimurium im Mausmodell bei oraler Inokulation von niedrigen Dosen.
Das Plasmid 12b enthält eine transkriptioneile Fusion von gfpjova mit sifA. SifA wird in Makrophagen in Zellkultur induziert, Daten zur in vivo Expression fehlten bisher (Beuzon et al., 2000). Da der Phänotyp von s/74-Mutanten (siehe unten) aber in der Milz nachweisbar ist, kann man annehmen, dass sifA dort exprimiert wird (Salcedo, Noursadeghi, Cohen und Holden, 2001 ). SifA wird von dem Typ Ill-Sekretionssystem von Sa/A?7θ/7e//a-Pathogenitätsinsel II sekretiert und ist nötig für den Erhalt der phagosomalen Membran (Beuzon, et al., 2000). SifA-Mutanten sind im Mausmodell stark attenuiert. Die Eigenschaften der Promotoren, die in den Sequenzen 10.9B, 4.1 A, 1 0.1 B, 10.1 A, 10.6A, A.7D, 4.4A, 4.7C, 4.8H, 1 0.7A, 4.1 B, CLII.5C, A.2G, A.8D, CLII.2B, 1 0.1 2A, A.3H, A.1 A, A.8B, 4.4G, A.1 1 C, CLII.8C, A.4H, CLII.1 B, A.7H, CLII.7B, A.3D, A.1 1 A, CLI.5A, A.8C, CUI.5A, CLII.4A, CLII.9C, A.9E, A.1 1 B, A.10F, CLII.3A, CLII.9B, CLII.1 2C, 2.2A, CLII.4C, CLII.1 1 C, A.1 1 H, 4.5G, A.1 2A, A.2A, 2.4A, A.1 2G, A.8H, A.9D, A.7A, 3.4F, 3.2E, 3.9A, 2.1 F, 1 .3G, 3.9E, 3.6B enthalten sind, werden in Tabelle 4 und 5 beschrieben, insbesondere ihre Funktion, die durch sie exprimierte Gene und ihr Vorkommen in verschiedenen Salmonella- Arten bzw. Serovaren und anderea.Bakterienarten.
Drei regulatorische Sequenzen aus Beispiel 2 (1 c, 10g und 1 2b) wurden in Beispiel 4 erneut gefunden (hier A.2A, 3.4F und 3.6B, siehe Abb. 30-32) . Homologe Regionen der Sequenzen zeigen leichte Abweichungen zueinander. In Beispiel 4 wurde eine stärkere Expression gefunden. Dies betrifft eher die obere Schwelle zur in v/Vo-Selektion als die untere Schwelle zur in wY/O-Selektion und führt daher zu einem Anstieg des Expressionsverhältnisses in vivo/in vitro (vergl. Tab. 4 und Tab. 2). Die Ursache liegt darin, dass in den Klonen aus Beispiel 2 Reste (bzw. längere Reste) des autologen Gens die Expression eines GFP-Fusionsproteins behinderten. Daher ist es vorteilhaft, bei Verwendung der erfindungsgemäßen regulatorischen Sequenzen zur differentiellen Expression eines rekombinanten Proteins, die für dieses Protein kodierende Sequenz direkt am proximalen Startkodon anzuschließen (siehe Tabelle 2 und Tabelle 5). Dann könnten auch regulatorische Sequenzen in Klonen aus Tabelle 4 zur differentiellen Expression geeignet sein, deren Expressionsverhältnis den experimentellen Ergebnissen in Tabelle 4 nach kleiner als 8 ist.
Die regulatorische Sequenz des Inserts 3.6B zeigt ein Verhältnis der Expression in vivo/in vitro von mehr als 400. Daher ist diese regulatorische Sequenz besonders zur differentiellen Expression eines rekombinanten Proteins geeignet. Besonders geeignet ist auch die hierzu homologe regulatorische Sequenz aus Insertion 1 2b, die ein Expressionsverhältnis von etwa 1 9 zeigt (vergl. Tabelle 2). Dieses Verhältnis kann durch Abschneiden am proximalen Startkodon verbessert werden.
Die regulatorische Sequenz des Inserts A.1 1 A enthält den Promotor für die UDP-Glukose/GDP-Mannosedehydrogenase, die für die Virulenz nicht essentiell ist. Die Funktion der Gene, die durch die regulatόrischen Sequenzen der Inserts A.8B, 4.4G und A.1 A exprimiert werden, ist nicht bekannt. Die entsprechenden Gene kodieren für putative cytoplasmatische Proteine. Die regulatorische Sequenz des Inserts CLI.5A steuert die Expression des für die Virulenz wesentlichen Pho-P-abhängigen Regulators mig-14.
Weiterhin soll die Erfindung durch die nachfolgenden Abbildungen und Beispiele erläutert werden.
Beispiele
Beispiel 1
Vergleich verschiedener GFP-Varianten als Reporter für die Salmonella- Genexpression in infizierten Geweben, Test auf Eignung zum Einsatz im erfindungsgemäßen Screeningverfahren
Das grün fluoreszierende Protein (GFP) ist ein häufig verwendeter Reporter für Genexpression in einer Vielzahl von Organismen. Eine hohe GFP-Lebensdauer führt zu hohen Konzentrationen im Fließgleichgewicht, die gut gemessen werden können, aber möglicherweise auch die exprimierenden Zellen stark belasten. GFP-Varianten mit kurzer Lebensdauer belasten wegen der geringeren Mengen an GFP im Fließgleichgewicht die exprimierenden Zellen weniger, aber gleichzeitig beeinträchtigt das entsprechend schwächere Fluoreszenzsignal die Messbarkeit. Daher ist eine wichtige Voraussetzung die Wahl einer GFP-Variante, die in Zusammenspiel mit der Expressionsstärke von attraktiven Promotorkandidaten eine optimale Expression von GFP bewirkt.
Um optimale GFP-Varianten für Untersuchungen zur Salmonella- Genexpression während einer Infektion auszuwählen, wurden GFP mit langer Lebensdauer (GFP.mut3, Cormack, Valdivia und Falkow, 1 996) und verschiedene Varianten (GFPJDVA, GFP_ASV, GFP LVA, Andersen, Sternberg, Poulsen, Björn, Givskov und Molin, 1 998) als in vivo Reporter für einen starken (Ppagc) oder einen schwachen Promotor (PspvA) verglichen.
Plasmide pJBA27 (GFP.mut3), pJBA1 1 3 (GFP_ASV), pJBA1 1 1 (pGFP_LVA) wurden mit Xbal und Hindlll verdaut. Die 1 kb-Fragmente wurden gegen entsprechende Fragmente in pMW57 (PpagC-GFP_OVA) oder pMW74 (PspvA-GFP_OVA) ausgetauscht.
Die entstehenden Konstrukte wurden in Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1 344 (ein Streptomycin-resistentes Wildtypisolat aus dem Kalb, virulent im Mausmodell, siehe Hoiseth und Stocker, 1 981 ) transformiert. Weibliche 8-1 2 Wochen alte BALB/c Mäuse wurden mit ca. 3x108 CFU oral infiziert. Nach 4 Tagen wurde die Kolonisierung der Peyer'schen Plaques durch Ausplattieren bestimmt. Die GFP-Fluoreszenz (Kopien pro Zelle) wurde durch 2-Wellenlängen-FACS gemessen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Die Kontrollen zeigen, dass unter den gegebenen Versuchsbedinungen mit einer Kolonisierungsrate von 100.000 bis 1 20.000 CFU zu rechnen ist. Weiterhin zeigen die Daten, dass eine GFP-Expressionen von < 4.000 Kopien pro Zelle die Kolonisierung nicht behindert.
Eine GFP-Expression zwischen 50.000 und 250.000 Kopien geht mit einer Reduktion der Kolonisierung auf 75-85 % der Kontrolle einher. Eine GFP- Expression von 400.000 Kopien reduziert die Kolonisierung auf etwa 25 % (PpagC-GFP_ASV). 2.000.000 Kopien GFP pro Zelle behindern die Kolonisierung des Wirtsgewebes massiv ( < 1 %) .
Mit dem starken Promotor PpagC konnte bei Verwendung der GFP-Varianten GFPJDVA und GFPJ.VA eine GFP-Expression von 237.000 bzw. 1 79.000 Kopien pro Zelle bei einer Anzahl von 90.000 bzw. 80.000 ex vivo isolierten CFU gemessen werden. Da die Kolonisierung mindestens 75 % des Kontrollstammes erreicht, sind diese GFP-Varianten damit zur Identifikation von starken und mittelstarken Promotoren geeignet. Die Variante GFP.mut3 ist nicht geeignet, da die Zahl der CFU durch die hohe Expression zu stark reduziert wurde. Für die Suche nach mittelstarken und starken Promotoren muss also eine GFP-Variante mit kürzerer Halbwertszeit als GFP.mut3 gewählt werden, so dass 250.000 Kopien pro Zelle nicht überschritten werden.
Die Varianten GFPJDVA und GFP_ASV sind nicht geeignet, um schwache Promotoren zu indifizieren, denn bei Verwendung des schwachen Promotors PspvA waren die Zahlen der Kopien pro Zelle zur Detektion zu gering ( < 4.000). Die Variante GFP. mut3 erzielte unter diesen Bedingungen ausreichende Expression. Zur Suche nach schwachen und mittelstarken Promotoren, wie z.B. PspvA, muss also eine GFP-Variante mit längerer Halbwertszeit als GFPJDVA gewählt werden (z.B. GFP.mut3, das den C-Terminus des Wildtyps trägt, siehe Cormack et al., 1 996), so dass mindestens 10.000 Kopien/Zelle erreicht werden können. Dieser Wert liegt um den Faktor 2 über der Detektionsschwelle.
Weitere GFP-Varianten oder andere fluoreszierende Proteine können durch Nacharbeitung des Beispiels auf ihre Eignung zum Einsatz im erfindungsgemäßen Verfahren getestet werden. Hierzu braucht nur die kodierende Sequenz des GFP bzw. GFPJDVA in den angegebenen Expressionsvektoren durch die kodierende Sequenz des gewünschten Proteins ersetzt zu werden. Zur Durchführung des Verfahrens muss eine Kopienzahl zwischen 10.000 und 250.000 erreicht werden. Bei eventuell zukünftig verfügbaren stärker fluoreszierenden GFP-Varianten sind auch geringere Expressionsniveaus ausreichend. Als Promotoren können die hier verwendeten Promotoren PpagC als Beispiel für einen starken Promotor und PspvA als Beispiel für eine schwachen Promotor verwendet werden, die diesen Bereich abdecken.
Beliebige andere Salmonellenstämme oder andere Bakterienarten können eingesetzt werden, wenn sie mindestens eine Kolonisierungsrate von 75 % eines Plasmid-freien, ansonsten identischen Kontrollstammes erreichen.
Beispiel 2
Konstruktion einer Sd/mo/7e//a-Genombank und Sortierung nach GFP-Expression in vivo, Selektionsverfahren zur Identifikation von Promotoren, die gewebespezifisch reguliert werden
Um Informationen zu Salmone/Ia-Promotoren zu erhalten, die im Verlauf einer Infektion aktiv sind, wurde eine Genombank in Salmonella enterica serovar Typhimurium erzeugt. Mäuse wurden mit Aliquots dieser Bank infiziert. Die Klone wurden aus infizierten Mäusen isoliert und über FACS sortiert.
Das Plasmid pGFPJDVA (Bumann, 2001 a) wurde mit BamHI verdaut. Durch diesen Verdau wurde ein 269 bp Fragment mit dem Ptac Promotor aus pGFPJDVA entfernt. Das verbleibende 5, 1 kb Fragment wurde über Gelelektrophorese gereinigt und rezirkularisiert, wodurch Plasmid pMW82 mit einer promotorlosen GFP-Variante zum Nachweis starker und mittelstarker Promotoren entstand. Plasmid pMW82 wurde mit BamHI verdaut und dephosphoryliert. Genomische DNA wurde aus einer 5 ml-FIüssigkultur von Salmonella enterica serovar Typhimurium SL1344 isoliert. Die genomische DNA wurde mit Sau3a partial verdaut, so dass hauptsächlich Fragmente im Größenbereich 0,5 bis 1 ,5 kb entstanden. Daneben wurden auch genomische Fragmente im Größenbereich 500-700 bp durch Scheren von genomischer DNA mit Ultraschall erzeugt. Diese Fragmente wurden mit DNA-Polymerase behandelt, um glatte Enden zu erhalten.
Die genomischen Fragmente und das promotorfreie Plasmidfragment wurden unter optimalen Mengenverhältnissen ligiert (hohe
Transformandenzahl bei gleichzeitig wenig Transformanden mit
Doppelinserts). Die Ligationsansätze wurden in hochkompetente E. coli
(Stamm XL1 0, Stratagene) ohne Restriktionssystem (um
Restriktionsschranken bezüglich der Sa/ oA7e//a-spezifischen DNA-Methylierungsmuster zu verhindern) transformiert, die eine hohe
Diversität der Bank ( > 106) ermöglichen. Es wurden insgesamt Banken erzeugt, die mehr als 2x105 unabhängige Klone mit inserthaltigen
Plasmiden unfassten und somit mehr als 99 % des Sa/monel/a-Genoms abdeckten. Aus dieser Bank wurden die Plasmide isoliert und in Salmonella enterica serovar Typhimurium SL 1344 transformiert. Insgesamt wurden 106
Transformanden erzeugt, um die Diversität der Plasmidbank möglichst weitgehend zu erhalten.
Ein Aliquot der Sa/mone/la-Bank mit 108 CFU wurde in endotoxinfreiem PBS gewaschen und zu einer Zelldichte von 2x108 CFU/ml in PBS resuspendiert. 100 //I dieser Suspension (d.h. 2x107 CFU) wurden in die Schwanzvenen von 8-12 Wochen alten, weiblichen BALB/c-Mäusen injiziert. 16 h nach der Infektion wurden die Mäuse betäubt und getötet. Die Milz wurde steril entnommen und mechanisch zerkleinert. Die resultierende Suspension wurde mit 0, 1 % Triton x-100 in PBS lysiert, um intrazelluläre Salmonellen freizusetzen. Salmonellen mit mehr als 4.500 GFPJDVA-Kopien pro Zelle wurden anhand ihrertypischen grünen und orangen Emission (2-Wellenlängen-Methode) mit FACS (FacsSort, B&D oder Vantage, B&D) aufgereinigt. Die Detektionsschwelle für dieses FACS-Geräte beträgt 500 Kopien pro Zelle. Die Detektionsschwelle bei Gewebeproben mit dem 2-WelIenlängen- Verfahren beträgt etwa 4.500 Kopien/Zelle, bedingt durch die Detektion gegenüber dem Hintergrund. Es wurden etwa 0, 1 -0,3 % der gesamten Klone selektioniert, was der Erwartung entsprach (Valdivia and Ramakrishnan, 2000). Das Fluoreszenzsignal wurde mit Hilfe einer densitometrischen Proteinsbestimmung im SDS-Gel (Coomassie-Färbung) mit Referenzproben verschiedener Konzentrationen kalibriert.
Die erhaltenen 60.000 Klone wurden als Kollektiv in vitro kultiviert. In einem weiteren Schritt wurden Salmonellen, die während eines exponentiellen in vitro Wachstums in LB weniger als 2.000 Kopien GFPJDVA exprimieren, isoliert. Die erhaltenen 75.000 Klone sind hochredundant. Diese wurden kollektiv rekultiviert und für eine erneute intravenöse Infektion von Mäusen verwendet (identisches Vorgehen wie in der ersten Selektionsrunde). Salmonellen, die nach 24 h in der Milz mehr als 25.000 Kopien GFPJDVA pro Zelle enthielten, wurden sortiert und rekultiviert.
Einzelne Klone wurden individuell auf die gewünschten Expressionseigenschaften (hier: Induktion in der Milz) überprüft. Von den bisher getesteten 27 Klonen haben 1 7 eine korrekte GFPJDVA-Expression. Durch PCR mit den Primern "up" 5'-GGCCACGATGCGTC (SEQ ID NO. 42) und "down" 5'-TACTCATATGTATATCTCCTTCTTA (SEQ ID NO. 43) wurde das genomische Plasmid-Insert aus korrekten Klonen amplifiziert und durch Verdau mit Alul und Hpal typisiert.
Bei diesen 17 Klonen wurden 7 nichtredundante Inserts (als 1 c, 1 f, 2a, 3g, 4a, 10g und 1 2b bezeichnet, siehe Abbildung 1 und Tabelle 2) gefunden. Diese wurden mit dem primer "down" (Sequenz s.o.) teilweise sequenziert. Damit wurden durch das Screening-Verfahren 7 regulatorische Sequenzen aufgefunden, die in der Milz als starke Promotoren wirken, jedoch in vitro keine oder nur eine schwache Aktivität zeigen.
Innerhalb der sieben erhaltenen Sequenzen wurden eventuell vorhandene Leseraster (d.h. Sequenzen aus Startkodon mit möglichst vielen folgenden Triplets ohne Stopkodon) identifiziert. Diese Vorhersage wurde durch Vergleich der Sequenzen aus der öffentlich zugänglichen Datenbank GENBANK des NCBI, die auf einem lokalen Blast-Server installiert ist, bestätigt. Insbesondere wurde die vollständige Genomsequenz von Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 (McClelland et al., 2001 ) herangezogen.
Das Beispiel könnte mit folgenden Modifikationen nachgearbeitet werden: Statt Alul und Hpal können auch andere Restriktionsenzyme verwendet werden, die im PCR-Puffer einsetzbar sind und deren Schnittstellen im Genom üblicherweise häufig auftreten, z.B. Mspl. Wird eine Umpufferung vorgenommen, können alle Restriktionsenzyme verwendet werden.
Beispiel 3
Optimierung der Antigenexpression in Salmonellen durch Mutation der
Shine-Dalgarno-Sequenz
Um die optimale Expressionsstärke für ein fremdes Antigen in rekombinanten Sa/monella-V akzinen zu bestimmen, die einerseits hoch genug für eine potente Immunreaktion ist und andererseits niedrig genug ist, um die Salmonellen-Kolonisierung kaum zu erschweren, wurde die Antigenexpression von einem starken in vivo induzierten Promotor durch mutierte, suboptimale Shine-Dalgarno-Sequenzen abgeschwächt. Diese Mutanten wurden durch PCR mit entsprechend ausgewählten Oligoprimem synthetisiert. Die verschiedenen Shine-Dalgarno-Sequenzen wurden hinter dem starken in vivo induzierbaren PpagC Promotor unmittelbar stromaufwärts vor das Modellantigen GFPJDVA kloniert, das ein T-Zellepitop des Ovalbumin trägt. Wir verfolgten in vivo die Aktivierung und die Blastenbildung der ovalbuminspezifischen T-Zellen als Maß für die Immunreaktion in Abhängigkeit von der Expressionsstärke.
Mutierte Versionen der effizienten Shine-Dalgamo-Sequenz von Gen 10 des Phagen T7 (Sequenz 5'-TTTAAGAAGGAGATATACAT; SEQ ID NO. 44), die als eine der am effizientesten bekannten Sequenzen am meisten verwendet wird, wurden durch PCR mit Primern "mutl , mut2, mut3, mut4, mutδ" (siehe Tabelle 3) und "mut_down" AGTGACAAGTGTTGGCC (SEQ ID NO. 45) mit pGO WT (entspricht pPpagCGO, Bumann, 2001 b) als Template erzeugt. In den Mutanten wurde jeweils eine Base im zur 1 6S RNA komplementären Tetranukleotid GGAG inklusive der angrenzenden Basen verändert. Die entstehenden 214 bp langen Fragmente wurden mit Xbal (Schnittstelle Tj CTAGA) und Ncol (Schnittstelle C | CATGG) verdaut (ergibt ein 1 91 bp langes Fragment) und gegen das entsprechende Fragment in pGO WT ausgetauscht. Die entsprechenden Plasmide pGO_mut1 , pGO_mut2, pGO_mut3, pGO_mut4 und pGOjnutδ wurden in abgeschwächte Salmonella enterica serovar Typhimurium aroA SL3261 transformiert. Weibliche 8-1 2 Wochen alte BALB/c Mäuse erhielten 4x1 06 tg T-Zellen aus Do1 1 .10 Mäusen (Murphy et al., 1 990), die transgen für einen T-Zellrezeptor sind, der ein dominantes Epitope aus Ovalbumin erkennt. Die Mäuse wurden einen Tag später ( =Tag 0) oral mit 5x108 CFU der verschiedenen Saimonellenstämme immunisiert. Für die einzelnen Stämme wurde die in vivo Expression von GFPJDVA am Tag 5 aus Homogenaten von Peyer'schen Plaques mit 2-Wellenlängen-FACS bestimmt. Die Immunigenität der einzelnen Stämme wurde anhand der ovalbuminspezifischen T-Zell-Blasten am Tag 7 bestimmt.
Durch den Einsatz der sechs ausgewählten Sequenzen als Shine- Dalgarno-Sequenzen kann das Expressionsniveau von 225.000 Kopien pro Zelle (unter den gegebenen Bedingungen, insbesondere bei dem gegebenen Promotor) auf 3.500 (ca. 2 %) gesenkt werden (Tabelle 3). Damit kann der gesamte für die Antigenexpression sinnvolle Bereich abgedeckt werden. Eine Erhöhung der Expression durch Modifikation der Shine-Dalgarno- Sequenzen bringt keinen weiteren Vorteil, da die Immunantwort hier schon sättigend ist.
Die Auswahl aus diesen sechs Sequenzen genügt, um das Expressionsniveau über einen Bereich von knapp 2 Zehnerpotenzen abgestuft zu verringern. Durch Nacharbeiten des Beispiels mit anderen Sequenzen lässt sich die Tabelle 3 ergänzen. Damit könnte die Abstufung verfeinert werden.
Die Daten zeigen, dass für GFPJDVA eine Expressionsstärke von ca. 75.000 Kopien pro Zelle (siehe pGO_mut4) ausreichend für eine sättigende
Immunreaktion ist (ca. 40 % der tg T-Zellen bilden Blasten am Tag 7). Da auch 225.000 Kopien pro Zelle die Kolonisierung der Salmonellen " gegenüber einem Stamm ohne Plasmid kaum beeinträchtigen (siehe Beispiel
1 ), liegt die notwendige Konzentration zur sättigenden Immunantwort im sehr gut verträglichen Bereich.
Sind die Eigenschaften des Promotors in einem gegebenen Zielgewebe bekannt, so kann das GFPJDVA durch beliebige andere Antigene ersetzt werden. Mit einer Auswahl aus dem Satz der originalen Shine-Dalgarno- Sequenz und der fünf mutierten Sequenzen sechs mutierten Shine-Dalgarno-Sequenzen (z.B. Originalsequenz, mutl , mut4, mutδ) kann für beliebige Antigene schnell das relative Expressionsniveau bestimmt werden, das eine gerade maximale Immunreaktion bewirkt, indem entsprechend diesem Beispiel die Kolonisierung und Immunreaktion parallel für entsprechende Konstrukte bestimmt werden. Eine absolute Bestimmung des Antigens als Kopien/Zelle ist für diesen Zweck nicht mehr notwendig, so dass die Notwendigkeit des Reportergens entfällt. Beispiel 4
Weitere differentiell regulierte Promotoren aus Salmonella enterica serovar
Typhimurium SL 1344
Ein Aliquot mit 108 CFU einer Sa/mone/la-Bank, hergestellt entsprechend Beispiel 2, wurde in endotoxinfreiem PBS gewaschen und zu einer Zelldichte von 2x108 CFU/ml in PBS resuspendiert. 1 00 μ\ dieser Suspension (d.h. 2x1 07 CFU) wurden in die Schwanzvenen von 8-1 2 Wochen alten, weiblichen BALB/c-Mäusen injiziert. 1 6 h nach der Infektion wurden die Mäuse betäubt und getötet. Die Milz wurde steril entnommen und mechanisch zerkleinert. Die resultierende Suspension wurde mit 0, 1 % Triton x-100 in PBS lysiert, um intrazelluläre Salmonellen freizusetzen.
Salmonellen mit mehr als 4.500 GFPJDVA-Kopien pro Zelle wurden anhand ihrer typischen grünen und orangen Emission (2-Wellenlängen-Methode) mit
FACS (FacsSort, B&D oder Vantage, B&D) aufgereinigt. Die
Detektionsschwelle für dieses FACS-Geräte beträgt 500 Kopien pro Zelle.
Die Detektionsschwelle bei Gewebeproben mit dem 2-Wellenlängen-
Verfahren beträgt etwa 4.500 Kopien/Zelle, bedingt durch die Detektion gegenüber dem Hintergrund. Es wurden etwa 0, 1 -0,3 % der gesamten
Klone selektioniert, was der Erwartung entsprach (Valdivia and
Ramakrishnan, 2000).
Die erhaltenen 60.000 Klone wurden als Kollektiv in vitro (Plattenkultur in LB-Medium mit einem auf 4 g statt 10 g pro I erniedrigten NaCI-Gehalt) kultiviert. In einem weiteren Schritt wurden Salmonellen, die während eines exponentiellen in v/z o-Wachstums in LB weniger als 2.000 Kopien GFPJDVA exprimieren, isoliert. Die erhaltenen 75.000 Klone sind hochredundant. Diese wurden kollektiv rekultiviert und für eine erneute intravenöse Infektion von Mäusen verwendet (identisches Vorgehen wie in der ersten Selektionsrunde). Salmonellen, die nach 24 h in der Milz mehr als 25.000 Kopien GFPJDVA pro Zelle enthielten, wurden sortiert und rekultiviert.
Bei 95 einzelnen Klonen wurde durch PCR mit den Primern "up" δ'-GGCC ACGATGCGTC (SEQ ID NO. 46) und "down" 5'-TACTCATATGTATATCT CCTTCTTA (SEQ ID NO. 47) das genomische Plasmid-Insert amplifiziert und durch Verdau mit Alul und Hpal typisiert. Die dadurch identifizierten 61 nicht-redundanten Klone wurden individuell auf die gewünschten Expressionseigenschaften (hier: Induktion in der Milz) überprüft, wobei 58 eine korrekte GFPJDVA- Expression haben (siehe Tabelle 4).
Die Inserts der 58 Klone wurden mit dem primer "down" (Sequenz s. o.) teilweise sequenziert. Damit wurden durch das Screening-Verfahren regulatorische Sequenzen aufgefunden, die in der Milz als starke Promotoren wirken, jedoch in vitro keine oder nur eine schwache Aktivität zeigen.
Innerhalb der erhaltenen Sequenzen wurden eventuell vorhandene Leseraster (d.h. Sequenzen aus Startkodon mit möglichst vielen folgenden Triplets ohne Stopkodon) identifiziert. Diese Vorhersage wurde durch Vergleich der Sequenzen aus der öffentlich zugänglichen Datenbank GENBANK des NCBI, die auf einem lokalen Blast-Server installiert ist, bestätigt. Insbesondere wurde die vollständige Genomsequenz von Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 (McClelland et al., 2001 ) herangezogen. Die Sequenzen vor dem Startkodon (die intergenen Regionen) wurden auf putative Promotoren (Transkriptionsstarts) untersucht. Hierzu wurden die Algorithmen von Reese (1 994), Reese und Eeckman (1 995) und Reese et al. (1 996) verwendet.
Die Ergebnisse sind für 58 erhaltene Klone in Tabelle 4 und Tabelle δ zusammengefasst. Die Daten sind nach dem Verhältnis der Expressionsstärke in vivo/in vitro sortiert. Dreizehn der δ8 Klone erfüllen die bevorzugten Selektionskriterien exakt (CLII.4C, CLI1.1 1 C, A.1 1 H, A.1 2A, 2.4A, A.1 2G, A.9D, A.7A, 3.4F, 3.2E, 3.9A, 3.9E, 3.6B) mit einem Verhältnis der Expressionsstärke von mindestens 1 2,5, wie durch die Selektionskriterien (25.000/2.000) vorgegeben; weitere sechs erfüllen die Kriterien annähernd (Abweichungen bezüglich der / - f/O-Schwelle: A.1 1 B, CLII.9B, CLII.1 2C, A.2A, 2.1 F, 1 .3G). Das Verhältnis der Expressionsstärken ist in diesen Fällen mindestens etwa 8. In weiteren fünf Klonen wurde die in vitro-Sc welle teilweise stark überschritten (Klone A.1 0F, CLII.3A, 2.2A, 4.5G, A.8H), jedoch war das Verhältnis der Expressionsstärken ebenfalls größer als 8, weil die /77-v/Vσ-Expression entsprechend stärker war.
Somit enthalten insgesamt 24 der δ8 Klone regulatorische Sequenzen aus Salmonella, die eine differentielle Proteinexpression in vivo und in vitro bewirken können, wobei die Expression in vivo mindestens um das achtfache stärker ist als in vitro. Der Befund, dass nur fünf dieser 24 Klone den bevorzugten Selektionskriterien nicht genügen, zeigt, dass das Verfahren mit großer Sicherheit erfolgreich durchgeführt werden kann. Im Übrigen eignen sich auch Klone mit einer starken in vitro und in vivo Expression zur Herstellung von Lebendimpfstoffen, weil sie in der Lage sind, eine verbesserte zweiphasige Immunantwort auszulösen.
Die regulatorischen Sequenzen der Gene sifA (Klon 3.6B) , pipB (Klon 3.4F) und aroQ (Klon A.2A) wurden schon in Beispiel 2 (dort Klone 1 2b, 10g und 1 c) identifiziert, jedoch mit leicht abweichenden Sequenzen. Die drei Klone dieses Beispiels liefern im Vergleich zu Beispiel 2 deutlich größere Expressionsstärken. Die Abbildungen 30-32 enthalten eine Gegenüberstellung der jeweiligen Sequenzen. Die Lage der intergenen Regionen, der putativen Promotoren (soweit in beiden vorhergesagt) und der Startkodons stimmt weitgehend überein. Lediglich die intergene Region von Klon 3.4F bzw. 10g scheint zwei putative Promotoren zu enthalten (je einer in jedem Klon vorhergesagt). Die Klone 10g und 1 2b unterscheiden sich von ihren stärker GFP exprimierenden Homologen 3.4F und 3.6B durch ein Teilstück des autologen Gens, das in 3.4F und 3.6B fehlt. Damit entsteht in 10g und 12b ein Fusionsprotein, das anders gefaltet sein kann und damit schneller abgebaut werden könnte. Außerdem können an der Fusionsstelle seltene Codons entstehen, die teilweise wesentlich schlechter translatiert werden, und die Reste des autologen Gens können die GFP-Translation behindern, wenn beide Gene nicht im selben Leseraster sind, da GFP über ein eigenes Startcodon verfügt.
Ein Fusionsprotein entsteht auch bei Expression in den Klonen 1 c und A.2A, das allerdings im Falle von 1 c einen deutlich größeren Anteil des autologen Proteins enthält, was die schwächere Expression von 1 c erklärt. Für eine optimale Expression sollten die regulatorischen Sequenzen daher vor dem Startcodon abgeschnitten werden.
Die regulatorischen Sequenzen der Gene pagD (Klon 2.4A), phoN (2.2A), sifB (Klon 2.1 F) und die Sequenz des Klons 3G (1.3G) sind bereits in Beispiel 2 beschrieben (dort als Klone 4a, 2a, 1 f und 3g bezeichnet).
Die anderen 20 Sequenzen sind in den Abbildungen 10-29 dargestellt.
Die 24 regulatorischen Sequenzen (Tabelle δ, Nr. 3δ-δ8) sind also geeignet, auch andere heterologe Proteine als GFP selektiv in der Milz zu exprimieren, insbesondere heterologe Antigene. Damit sind diese Sequenzen zur Herstellung eines Lebendimpfstoffes geeignet. Am besten geeignet ist der Klon 3.6B (sifA), der zum einen eine sehr geringe / 7-v/-7O-Aktivität zeigt, zum anderen mit die höchste /7- Vo-Aktivität.
In weiteren δ Klonen (A.1 1 A, A.8B, CLI.δA, 4.4G, A.1 A, dargestellt in Abbildung 33-37, Tabelle 4, Nr. 18, 19, 20, 28, 29) bewirkt die regulatorische Sequenz eine starke Expression in vivo (96.000 bis 222.000
Kopien/Zelle), die mit einer ebenfalls starken Expression in vitro (36.000 bis 69.000 Kopien/Zelle) verbunden ist. Das Verhältnis der in vivo/in vitro Expression liegt bei mindestens 2 und maximal 6. Wegen der starken Expression in vivo sind auch diese Sequenzen geeignet, andere heterologe Proteine als GFP in Geweben, z.B. in der Milz, in großer Menge zu exprimieren, insbesondere heterologe Antigene. Damit sind die ebenfalls zur Verwendung in Lebendimpfstoffen geeignet.
Legenden
Abbildung 1 :
Schematische Darstellung der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen 7 Inserts, die regulatorische Sequenzen aus Salmonella enthalten.
Abbildung 2:
Nukleotidsequenz des Expressionsvektors pGFPJDVA (SEQ ID NO. 3)
Abbildungen 3-9:
Nukleotidsequenzen der Insertionen 1 c, 1 f, 2a, 3g, 4a, 1 0g und 12b (SEQ ID NO. 4-10)
Abbildungen 10-29:
Nukleotidsequenzen der Insertionen A.2A, A.7A, A.8H, A.9D, A.10F, A.1 1 B, A.1 1 H, A.1 2A, A.1 2G, CLII.3A, CLII.4C, CLII.9B, CLII.1 1 C, CLII.1 2C, 3.2E, 3.4F, 3.6B, 3.9A, 3.9E und 4.δG (SEQ ID NO. 1 1 -30)
Abbildungen 30-32:
Die Abbildungen zeigen die Gegenüberstellung der Sequenzen A.2A mit 1 c, 3.4F mit 10g und 3.6B mit 1 2b. Die Unterstreichungen markieren die intergenen Regionen, die ersten Basenpaare putativer Promotoren sind fett gekennzeichnet, und Startkodons sind durch einen Kasten markiert. Abbildungen 33-37:
Nukleotidsequenzen der Insertionen A.1 1 A, A.8B, CLI.δA, 4.4G, A1 .A (SEQ ID NO. 31 -35)
Tabelle 1
Übersicht über die Expression von Reporterproteinen (GFP) in ex vivo isolierten Salmonellen (aus den Peyer'schen Plaques) und die Anzahlen der isolierten CFUs.
Tabelle 2
Übersicht über die isolierten regulatorischen Sequenzen aus Salmonella.
Tabelle 3
Übersicht über die verwendeten Mutanten der Shine-Dalgamo-Sequenz. Mutationen gegenüber pGO WT sind fett gekennzeichnet (SEQ ID NO. 36- 41 ).
Tabelle 4
Die Tabelle fasst die Daten von 58 Klonen aus Beispiel 4 zusammen, sortiert nach dem Verhältnis der in Vo-Expression zur in v/fro-Expression.
Spalte 1 : Bezeichnung des Klons/des Inserts
Spalte 2: Symbol entsprechend Nomenklatur von McClelland et al.
(2001 ) Spalte 3: Genlokus entsprechend der Nomenklatur von McClelland et al.
(2001 ) bzw. www.TIGR.org Spalte 4: Funktion entsprechend der Annotation aus Nomenklatur von
McCIeland et al. 2001 Spalte 5: Spezies/Stamm, in dem die Sequenz entdeckt wurde: STM (S. typhimurium), STY (S. typhi), SPA (S. paratyphi A), SPB (S. paratyphi B), SAR (S. arizonae), SBO (S. bongori), ECO (£. coli K1 2), ECH (E. coli O1 δ7:H7), KPN (Klebsiella pneumoniae)
Spalte 6 in ro-Expression, angegeben als Kopien pro Zelle Spalte 7 in wVσ-Expression in der Milz, angegeben als Kopien pro Zelle Spalte 8 Verhältnis des Expression in vivo/in vitro Spalte 9 Anmerkungen: 1 ) erfüllt die Selektionskriterien exakt, 2) erfüllt die Selektionskriterien annähernd
Tabelle 5 Übersicht über die Eigenschaften der am besten zur differentiellen Expression geeigneten regulatorischen Sequenzen aus Tabelle 4 (siehe auch Tabelle 2)
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Tabelle 1
Konstrukt CFU % CFU GFP-Expression
(± Standardabw.) Kontrolle (± Standardabw.)
Ppagc-GFP.mut3 400 ± 300 <1 2.000.000 + 200.000
PpagC-GFP_OVA 90.000 + 30.000 86 237.000 + 30.000
PpagC-GFP_ASV 25.000 ± 10.000 24 : 385.000 + 40.000
|
PpagC-GFP_LVA 80.000 + 20.000 76 179.000 + 20.000
PspvA-GFP.mut3 90.000 + 30.000 86 56.000 + 6.000
PSPVA-GFP_OVA 100.000 + 30.000 95 < 4.000 (zu gering)
sPvA-GFP_ASV 120.000 + 30.000 114 < 4.000 (zu gering)
Kontrolle SL1344 105.000 + 30.000 100 keine
Tabelle 2
* dieser Promotor liegt nicht in der intergenen Region; a: Größe abgeschätzt anhand von PCR- Produkten, außer bei 1f, für das die komplette Sequenz vorliegt; b: bp Positionen beziehen sich auf die bisher bekannte Teilsequenz des Inserts, wie sie im Anhang angegeben ist; c: das Startkodon von sifB liegt 31 bp stromabwärts vom Insertende.
Tabelle 3
Plasmid Sequenz im Bereich der Shine-Dalgarno- in vivo Expression T-Zel Sequenz (Primer) Kopien pro Zelle % Blast
% pGO_WT GCTCTAGATTTAAGAAGGAGATATACATATG 225.000 + 12.000 100 40 + pGO_mut1 GCTCTAGATTTAAGAAAGAGATATACATATG 33.000 + 12.000 15 22 + pGO_mut2 GCTCTAGATTTAAGAAGCAGATATACATATG 3.500 + 12.0001 Υ 16 + pGO_mut3 GCTCTAGATTTAAGAGGGAGATATACATATG 103.000 + 12.000 46 39 + pGO_mut4 GCTCTAGATTTAAGAAGGGGATATACATATG 78.000 + 12.000 35 41 + pGO_mut5 GCTCTAGATTTAAGAAGGAAATATACATATGl 125.000 + 12.000 56 42 +
: Meßwerte unter der in vivo-Nachweisgrenze, Werte beruhen auf Schätzungen anhand von in vitro-Daten.
7
8 9
1
Tabelle 4
Tabelle 4 (Fortsetzung)
Tabelle 4 (Fortsetzung)
Tabelle 4 (Fortsetzung)
Tabelle 4 (Fortsetzung)
Tabelle 4 (Fortsetzung)
Tabelle 5
co

Claims

Ansprüche
1 . In vivo aktiver Promotor enthalten in den Insertionen 4.5G, A.8H, 1 f, 3g, 1 c, 2a, 4a, 10g, 1 2b A.2A, A.7A, A.9D, A.10F, A.1 1 B,
A.1 1 H, A.1 2A, A.1 2G, CLII.3A, CLII.4C, CLII.9B, CLII.1 1 C,
CLII.1 2C, 3.2E, 3.4F, 3.6B, 3.9A, 3.9E, A.1 1 A, A8.B, CLI.5A, 4.4G oder A.1 A sowie ein davon durch Mutation abgeleiteter Promotor.
2. Promotor nach Anspruch 1 enthalten in Insertion 4.5G, A.8H, 1 f, 3g, 3.6B oder 1 2b sowie ein davon durch Mutation abgeleiteter Promotor.
3. Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 2 in operativer Verknüpfung mit einer dazu heterologen Nukleinsäuresequenz.
4. Verwendung von Promotoren nach einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Herstellung von Lebendimpfstoffen.
5. Verwendung nach Anspruch 4 zur Expression von rekombinanten Antigenen.
6. Verwendung nach Anspruch 1 , bei der die Nukleinsäure, die für das rekombinante Antigen kodiert, in das Genom der Wirtszelle inseriert wird.
7. Verwendung nach Anspruch 1 , bei der die Nukleinsäure, die für das rekombinante Antigen kodiert, auf einem Expressionsvektor in die Wirtszelle eingebracht wird.
8. Nukleinsäure, enthaltend eine Sequenz ausgewählt aus den Sequenzen, die in den Abbildungen 3-29 und 33-37 dargestellt sind, oder eine Teilsequenz davon.
9. Nukleinsäure nach Anspruch 8, enthaltend eine Sequenz ausgewählt aus den Sequenzen der Insertionen 4.5G, A.8H, 1 f, 3g, 3.6B oder 1 2b, oder eine Teilsequenz hiervon.
1 0. Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Teilsequenz eine Länge von mindestens 40, vorzugsweise mindestens 50, und bis zu 200 Nukleotiden aufweist.
1 1 . Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 8 bis 10, umfassend die Teilsequenzen der Insertionen beginnend 200 bp vor Beginn des putativen Promotors nach Tabelle 2 bzw. 5 bis zum proximalen Startkodon nach Tabelle 2 bzw. 5 sowie ein davon durch Mutation abgeleiteter Promotor.
1 2. Nukleinsäure nach Anspruch 1 1 , umfassend die Teilsequenzen der Insertionen beginnend 1 50 bp vor Beginn des putativen Promotors nach Tabelle 2 bzw. 5 bis zum proximalen Startkodon nach Tabelle 2 bzw. 5 sowie ein davon durch Mutation abgeleiteter Promotor.
1 3. Nukleinsäure nach Anspruch 12, umfassend die Teilsequenzen der Insertionen beginnend 100 bp vor Beginn des putativen Promotors nach Tabelle 2 bzw. 5 bis zum proximalen Startkodon nach Tabelle 2 bzw. 5 sowie ein davon durch Mutation abgeleiteter Promotor.
4. Nukleinsäure nach Anspruch 1 3, umfassend die Teilsequenzen der Insertionen beginnend 50 bp vor Beginn des putativen Promotors nach Tabelle 2 bzw. 5 bis zum proximalen Startkodon nach Tabelle 2 bzw. 5 sowie ein davon durch Mutation abgeleiteter Promotor.
5. Nukleinsäure nach Anspruch 14, umfassend die Teilsequenzen der Insertionen beginnend 40 bp vor Beginn des putativen Promotors nach Tabelle 2 bzw. 5 bis zum proximalen Startkodon nach Tabelle 2 bzw. 5 sowie ein davon durch Mutation abgeleiteter Promotor.
6. Rekombinantes Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Promotor nach einem der Ansprüche 1 bis 3 in operativer Verknüpfung mit einer dazu heterologen Nukleinsäuresequenz enthält.
7. Bakterium nach Anspruch 1 6, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleinsäuresequenz direkt am proximalen Startkodon des Promotors anschließt.
8. Bakterium nach Anspruch 1 6 oder 1 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz für ein rekombinantes Antigen kodiert.
9. Lebendimpfstoffzusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium nach Anspruch 1 8 sowie gegebenenfalls pharmazeutisch übliche Träger- oder Hilfsstoffe enthält.
20. Lebendimpfstoffzusammensetzung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium ausgewählt ist aus Salmonella typhimurium, S. typhi, S. paratyphi A oder S. paratyphi B und der Promotor zu dem Bakterium autolog ist.
21 . Shine-Dalgamo-Sequenz erhältlich durch mindestens eine Mutation der Sequenz TTTAAGAAGGAGATATACAT.
22. Sequenz nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass eine Base durch eine andere Base substituiert ist.
23. Sequenz nach Anspruch 22, ausgewählt aus den in Tabelle 3 gezeigten Sequenzen.
24. Sequenz nach einem der Ansprüche 21 bis 23 in operativer Verknüpfung mit einem rekombinanten Antigen.
25. Verwendung einer mutierten Shine-Dalgamo-Sequenz nach einem der Ansprüche 21 bis 24 zur Modulation der Genexpression.
26. Verwendung nach Anspruch 25 zur Modulation der Expression von rekombinanten Antigenen in Lebendimpfstoffen.
27. Rekombinantes Bakterium, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Shine-Dalgamo-Sequenz nach einem der Ansprüche 21 bis 24 in operativer Verknüpfung mit einer dazu heterologen Nukleinsäuresequenz enthält,
28. Bakterium nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass die heterologe Nukleinsäuresequenz direkt am proximalen Startkodon des Promotors anschließt.
29. Bakterium nach Anspruch 27 oder 28, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäuresequenz für ein rekombinantes Antigen kodiert.
30. Lebendimpf stoff Zusammensetzung dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium nach Anspruch 29 sowie gegebenenfalls pharmazeutisch übliche Träger- oder Hilfsstoffe enthält.
31 . Lebendimpfstoffzusammensetzung nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass das Bakterium ausgewählt wird aus Salmonella typhimurium, S. typhi, S. paratyphi A oder S. paratyphi B und der Promotor zu dem Bakterium autolog ist.
32. Ve rf a h re n z u r I d e nti f i zi e ru n g vo n reg u l ato ri s c h e n Nukleinsäuresequenzen im Genom eines bakteriellen Zielorganismus, umfassend die Schritte:
(a) Einbringen von jeweils unterschiedlichen Teilsequenzen aus dem Genom des Zielorganismus in eine Vielzahl von Vektoren, wobei die bakteriellen Sequenzen in operativer Verknüpfung mit einem Reportergen inseriert werden,
(b) Transformieren von Wirtsbakterien mit den Vektoren aus (a), wobei eine Genombank des bakteriellen Zielorganismus in einem Wirtsbakterium erhalten wird,
(c) Vergleichen der Expressionsstärke des Reportergens in einzelnen Bakterienzellen in vivo und in vitro, (d) Identifizieren von Bakterienzellen, die eine vorbestimmte erste Expressionsstärke in vivo und eine vorbestimmte zweite Expressionsstärke in vitro aufweisen und
(e) gegebenenfalls Isolieren von einzelnen Bakterienzellen aus Schritt (d).
33. Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (c) mindestens einen der folgenden Teilschritte umfasst: (ci) Verabreichen von Aliquots der Genombank an mindestens ein
Versuchstier, (cii) Gewinnen von Bakterienzellen aus dem mindestens einen
Versuchstier nach einer vorbestimmten Infektionsdauer, (ciii) Bestimmen der Expressionsstärke des Reportergens in vivo in den in (cii) gewonnenen Bakterienzellen,
(civ) Kultivieren von Bakterienzellen in vitro, die in Schritt (ciii) eine vorbestimmte erste Expressionsstärke des Reportergens in vivo aufweisen, und (cv) Bestimmen der Expressionsstärke des Reportergens in vitro in den in (civ) kultivierten Bakterienzellen.
34. Verfahren nach Anspruch 32 oder 33, umfassend weiterhin:
(f) gemeinsames in vitro Kultivieren von mindestens einem Teil der in Schritt (d) identifizierten Bakterienzellen, (g) Verabreichen von in Schritt (f) kultivierten Bakterienzellen an mindestens ein Versuchstier und (h) Wiederholen der Schritte (c) bis (d) oder (c) bis (e) mit den in Schritt (g) infizierten Versuchstieren.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 34, umfassend weiterhin:
(i) in vitro Kultivieren eines einzelnen Klons von in Schritt (e) oder (h) isolierten Bakterienzellen, (j) Verabreichen von in Schritt (i) kultivierten Bakterienzellen an mindestens ein Versuchstier und (k) Wiederholen der Schritte (c) bis (d) oder (c) bis (e) mit den in Schritt (j) infizierten Versuchstieren.
36. Verfahren nach einem-der Ansprüche 32 bis 35, dadurch gekennzeichnet, dass die bakteriellen Sequenzen stromaufwärts des Reportergens inseriert werden.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 36, dadurch gekennzeichnet, dass die regulatorischen Sequenzen aus Promotoren und die Aktivität eines Promotors beeinflussenden regulatorischen Nukleinsäuresequenzen ausgewählt werden.
38. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Identifizierung von Promotoren einen Vektor verwendet, aus dem die zur Initiation der Transkription des Reportergens notwendigen Sequenzen entfernt worden sind.
39. Verfahren nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Identifizierung von die Aktivität von Promotoren beeinflussenden regulatorischen Sequenzen einen Vektor verwendet, der einen konstitutiven Promotor zur Expression des Reportergens enthält.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 39, dadurch gekennzeichnet, dass man Zielbakterien verwendet, die als Träger von Lebendimpfstoffen geeignet sind.
41 . Verfahren nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, dass man als Zielbakterien Salmonellen oder probiotische Bakterien verwendet.
42. Verfahren nach- einem der Ansprüche 32 bis 41 , dadurch gekennzeichnet, dass man die Genombank zunächst in einem Zwischenwirt anlegt, daraus isoliert und dann zur Transformation des Wirtsbakteriums verwendet.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 42, dadurch gekennzeichnet, dass man ein für ein fluoreszierendes Protein kodierendes Reportergen verwendet.
44. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 43, dadurch gekennzeichnet, dass man als Versuchstier ein nichthumanes Säugetier verwendet.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 44, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterienzellen auswählt, die eine erste Expressionsstärke in vivo von mindestens 4.500 Kopien pro Zelle aufweisen.
46. Verfahren nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterienzellen auswählt, die eine erste Expressionsstärke in vivo von 4.500 bis 25.000 Kopien pro Zelle ausweisen.
47. Verfahren nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterienzellen auswählt, die eine erste Expressionsstärke in vivo von 25.000 bis 250.000 Kopien pro Zelle ausweisen.
48. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 47, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterienzellen auswählt, die eine zweite Expressionsstärke in vitro von weniger als 4.500 Kopien pro Zelle aufweisen.
49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass man Bakterienzellen auswählt, die eine zweite Expressionsstärke in vitro von weniger als 2.000 Kopien pro Zelle aufweisen.
50. Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 49, dadurch gekennzeichnet, dass man die identifizierten Sequenzen weiter eingrenzt.
51 . Verwendung der durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 32 bis 50 erhaltenen regulatorischen Sequenzen zur Herstellung von Lebendimpfstoffen.
52. Verwendung nach Anspruch 51 zur Expression von rekombinanten Antigenen.
53. Verwendung nach Anspruch 52, bei der die Nukleinsäure, die für das rekombinante Antigen kodiert, in das Genom der Wirtszelle inseriert wird.
54. Verwendung nach Anspruch 52, bei der die Nukleinsäure, die für das rekombinante Antigen kodiert, auf einem Expressionsvektor in die Wirtszelle eingebracht wird.
55. Verwendung nach einem der Ansprüche 50 bis 54, dadurch gekennzeichnet, dass man die Expressionsstärke der regulatorischen Sequenzen moduliert.
56. Verwendung nach Anspruch 55, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation durch Mutationen in der Shine-Dalgamo- Sequenz erfolgt.
57. Verwendung nach Anspruch 55 oder 56, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation eine Verringerung der Expressionsstärke auf bis zum 2 % des Ausgangswerts umfasst.
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