DD294420A5 - Verfahren zur herstellung von lebendimpfstoffen gegen listeriose - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lebendimpfstoffen gegen Listeriose aus stabilen Listeria * monocytogenes Impfstaemmen mit abgestufter Attenuierungshoehe und deren Anwendung bei Nutztieren. Die Stabilitaet (Zwei- und Dreimarker Attenuierung) und schrittweise Virulenzreduktion der L. monocytogenes Serotyp 1/2 a und 4 b Zwei- und Dreimarker Impfstammkandidaten wurde realisiert im ersten Schritt durch die Isolierung von gering bis maeszig attenuierten Streptomycin * (Ribosomenprotein)-Mutanten mit Klon-abhaengiger Anhebung der i.p. LD50 Maus von 105.0cfu bis zu 107.4cfu und im zweiten Schritt durch die Isolierung von zusaetzlich attenuierten Rifampicin (Rif)-Resistenz (RNA-Polymerase) Mutanten aus ausgewaehlten Sm-Klonen (Anhebung der i.p. LD50 Maus von 106.1cfu auf 106.6-107.4cfu). Diese Zweimarker-Impfstammkandidaten schuetzen nach einmaliger Impfung (tolerierte Dosis 1% LD50) ueber 95% der Maeuse gegen die letale (100 LD50) Belastung mit dem homologen Wildstamm. Bei weiterer Anhebung der i.p. LD50 fuer Maeuse auf 108.0cfu mittels einer dritten Fosfomycin-Resistenz (Transportdefekt)-Mutation ueberschreitet die Virulenzreduktion zunehmend den Bereich der UEberattenuierung.{Listeria monocytogenes; Serotyp 1/2 a und 4 b; Stoffwechseldrift; Mutante; abgestufte Attenuierung; Lebendimpfstoff; Vermehrung, intrazellulaer; Immunitaet; Maus; Nutztier}

Description

Sero typ	Listeria monocytogenes Ein- Zwei- Drei- Marker-Stämme	Sm 30	i.p. LD60 Maus cfu±0·4	Hinterlegungsstelle Labor- IMET Nummer Nummer	IMET 11443
	Sm 74	Sm 30 Rif97	1Oe.2	4180	IMET 11444
1/2a	Sm 74 Rif53	Sm 30 Rif97 Fos02	107'2	4185	IMET 11445
	Sm74 Rif53 Fos21	Wildstamm 3192	108·3	4192	-
	Wildstamm D 218/77	104·3	4179	IMET 11440
	loe.i	4195	IMET 11441
4b	107·1	4203	IMET 11442
	108,6	4204	-
	106.0	4193

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Lebendimpfstoffen gegen Listeriose aus stabilen Listeria monocytogenes Impfstämmen mit (für das Mäusemodell) abgestufter Attenuierung,

- deren Stabilität (keine Rückmutation zum Wildstamm unter nichtselektiven Feldbedingungen) durch zwei oder drei unabhängig voneinander virulenzreduzierendne Markern garantiert wird,

- deren abgestufte Gesamt-Attenuierungshöhen (als Set von Impfstamm-Kanditaten mit schrittweise abnehmender Virulenz) aus der gezielten Auswahl von gering bis mäßig virulenzreduzierten Klonen der jeweils verwendeten Marker resultieren,

- deren Attenuierungshöhe (durch Auswahl eines - entsprechend der Empfänglichkeit des Wirtes für den Erreger - geeigneten Zwei- oder Dreimarker-Stammes aus obigem Set) einer für das jeweilige Nutztier optimal eingestellten Virulenzreduktion entspricht, so dab bei einmaliger Impfung eine inapparente Impfstamm-Infektion garantiert wird als Voraussetzung zur Stimulierung einer belastbaren und längerfristigen zellulären Immunität,

die als immunogene Impfstoffe aus lebenden Erregern zur aktiven Immunisierung von Nutztieren geeignet sind.

-2- 294 Charakteristik des bekannten Standet der Technik

Bei der Listeriose handelt es sich um eine generalisierte Infektion, bei der sich die Erreger fakultativ intrazellulär vermehren (Gaillard, J.-L. et. al: Infect. Immun. 1987,55,2822-2877; Gaillard, J.-L. et. al.: Ann. Inst. Pasteur, Microbiol. 1987,138,259-264; Havell, E.A.: Infect. Immun. 1986,54,787-792; Ralovich, B.: Llsteriösis research. Budapest, Akaderhiai Kiado, 1984) und damit der humoralen Abwehr weitgohend entzogen sind. Für die aktive Immunprophylaxe sind daher Impfstoffe aus inaktivierten Listerien ungeeignet (Wirsing, V. et. al.: Nature, 1982,297,233-234; Hahn, H. and Kaufmann, S. H. E.: Rev. Infect. Dis. 1981,3, 1221-1250; Miki, K. and Mackaness, G.B.: J. Exp. Med. 1964,120,93-104), da durch sie vorwiegend nur eine humorale Immunantwort ausgelöst wird. Ein langanhaltender und belastbarer Schutz setzt eine aktivierte zelluläre Immunität voraus (Mackaness, G.B.: J. Exp. Med. 1962,116,381-406; Kongshavn, P.A.L: Current Topics in Microbiology and Immunology 1986, 124,67-65; Mackaness, G.B. and Hill, W.C: J. Exp. Med. 1969,129,993-1012). Dies wird nur durch solche Lebendimpfstoffe stimuliert, bei denen der auf die jeweilige Wirtsspezies bezogene optimale Attenuierungsgrad, - d. h. die noch verbleibende Rostvirulenz,- eine restliche aber ausreichende in vivo Vermehrung (Baldridge, J. R. et. al.: Infect. Immun. 1983,56,2109-2113; Berche, P. etal.: J. Immunol. 1987,138,2266-2271) im Sinne einer inapparenten Infektion garantiert. Bei avirulenten Listerien ohne meßbare in vivo Vermehrung liegt der i. p. LD_M-Wert für Mäuse bei etwa 10⁹cfu (Baldridge, J. R. et al.: Infect. Immun. 1988, 56,2109-2113; Hof, H.: Med. Microbiol. Immunol. 1984,173,207-219; Pine, L. etal.: J. Clin. Microbiol. 1987,25,2247-2251; Stelma, Jr., G. N. etal.: J. Clin. Microbiol. 1987,25,2085-2089). Solche Stämme sind als Vakzinen ungeeignet: Lediglich bei Immunisierungsdosen in der Größenordnung des LD_M-Wertes zeigen die überlebenden Mäuse einen nur kurzzeitigen Schutz. Bei den bislang beschriebenen Listeria-Lebendimpfstoffen handelt es sich um 1.) Rauhform-Mutanten (Potel, J. and Schulze-Lammers, J.: ZbI. Bakt. Hyg. I.Abt. Orig. A 1985,259,331-340), weiche eine mäßige und gegenüber virulenten Stämmen zeitlich verkürzte Immunisierung vermitteln (Hof, H.: Med. Microbiol. Immunol. 1984,173,207-218); 2.) durch mehrfache Mutagenbehandlung attenuierte Erreger, welche erfolgreich bei Schaflisterioso eingesetzt wurden (Titov, V. V.: Arch, exper. Vet. Med. 1980,34,115-118; und 3.) durch über 800 Passagen gegen steigende Konzentrationen eines „bacteriostatlc agent" erhaltene attenuierte Mutanten, welche mit Saponin als Adjuvans erfolgreich zur Bekämpfung der Schaflisteriose eingesetzt wurden (Ivanov, I. etal.: Proceedings of Listeriosis. Ivanov, I. (ed.), Sofia, National Argo-Industrial Centre for Scientific Informations, 1979,324-329). Andere Autoren berichten jedoch nur über einen partiellen Schutz für Schafe (Gudding, R. etal.: Vet. Rec. 1989,125,111-114). Dieser als Listevac (Bulgarien) kommerziell eingeführte Lebendimpfstoff mit den prädominanten Serotypen 1/2a und 4b besitzt für Mäuse einen i. p. LD_M-Wert von a 10^Mcfu und schützt nach i. p. Immunisierung mit der tolerierten Dosis von 1 % der LD» etwa £60% der Mäuse gegen eine nach 14 Tagen erfolgende letale ~ 100 LD_M-Belastung (siehe Beispiel 2, Tabelle 2).

In Anlehnung an unsere Erfahrungen zur Herstellung von Salmonella-, Shigella-, und Pasteurella-Impfstämmen (mit jeder gewünschten Attenuierungshöhe beim empfänglichen Versuchstier) unter Verwendung von Stoffwechseldrift-Mutationen·, streben wir in Analogie hierzu auch bei Listerien eine stabile abgestufte Attenuierung an mittels zwei oder drei unabhängig voneinander virulenzreduzierenden Mutationen. Der diesbezügliche Stand der Technik ist in den Patentschriften DD-WP155 294; DD-WP 235828; DD-WP 231491; DD-WP 253184; DD-WP 253182

Weitere Einzelheiten zu diesem Stand der Technik finden sich auch in den Publikationen

- Linde, K.: ZbI. Bakt. Hyg. I.Abt. A. 1981,249,350-361

- Linde, K.: Dev. Biol. Standard 1983,53,15-28

- Linde, K.: Arch, exper. Vet. Med. 1982,36,647-656

- Linde,K.: etal.: Arch.exper. Vet. Med. 1983,37,353-360

- Linde, K.: etal.: Vaccine 1990,8,25-29

- Linde, K.: etal.: Vaccine 1990,8,278-282

- Marakusha, B.I. etal.: Z.Microbiol. Epidemiol. Immunol. 1987/4,3-8.

Diese angegebene Literatur mit ihrer Secundärliteratur bezieht sich fast ausschließlich auf gramnegative Erreger. Bezüglich grampositiver Bakterien gibt es nur wenige Berichte über ein Zusammenfallen von Antibiotika-Resistenzmuiationen und Attenuierung (sowie Generationszeitverlängerung (Potuinlkovä, B. and Schindler, J.: Microbios. Lett. 1978,8,27-30; Moorman,D.R. and Mandell, G. L.: Antimicrob. Agents Chemother. 1981.20,709-713)], wobei jedoch in all diesen Publikationen keine gesetzmäßigen Zusammenhänge im Sinne der »Stoffswechseldrift" aufgezeigt wurden. Beschrieben wurde dieses Phänomen für Rifampicin bei Staphylokokken (Moorman, D.R. und Mandell, G.L.: Antimicrob. Agents Chemother. 1981,20, 709-713) und Mykobakterien (Manten, A. and van Wijngaarden, L. J.: Chemotherapy 1969,14,93-100; McDermott-Lancester, R. D. and

Hilson, G.R.F.: J. Med. Microbiol. 1987,24,13-15), Penicillin und Clindamycin bei Staphylokokken (Blair, J.E. etal.: J. Immunol. 1946,52,281-292; Marsik, FJ. and Parisi, J.T.: Appl. Microbiol. 1973,25,11-14), sowie Fosfomycin bei Listerien (Potuznikovä, B. and Schindler, J.: Microbios Lett. 1978,8,27-30).

Die oben zitierten drei verschiedenen Listeria· Lebendimpfstoffe weisen zum Stand der Technik sowie ihrer Wirksamkeit folgende Nachteile auf:

1) Stabilität: Aus der Literatur ist nicht ersichtlich, ob die erzielte Attenuierung auf nur eine oder mehreren Mutationen beruht. . Obwohl in der Regel auch Einmarker-Mutanten unter den nicht-selektiven Feldbedingungen stabil sind, setzen die von der WHO empfohlenen Sicherheitsforderungen (Report of a WHO Scientific Group: WId. Hlth. Org. techn. Rep. Ser. 1972 No. 500) zwei unabhängig voneinander virulenzreduzierende Mutationen voraus.

* Der Begriff .Stoffwechseldrift* umfaßt alle durch Mutationen funktionell veränderten essentiellen Enzyme bzw. funktionell wichtigen Zellkompartlmente, wie z. B. RNA-Polymerase, Ribosomeo-Proteine, Permeasen, wobei als Folge dieser Mutation die Genauigkeit der Transkription, Translation oder PermeationsaktivltSt mehr oder weniger ausgeprägt gestört wird. Solche Stoffwecheeldrlft-Mutanten können im Labor als Chromosomale Antiblotlka-Reslstenzmutanten erhalten werden. Jeder dieser Reslstenz-PhSnotypen zerfällt In ein Spektrum von Klonen, von denen bis zu 80% eine verminderte Virulenz (Inclusive verlängerter Generationszeit) aufweisen, weiche In Abhängigkeit vom Genotyp sich zwischen geringer bis hoher Attenuierung bewegt. ,

2) Attenuierungsprinzip: Mehrfache Mutagenbehandlung (Titov, V. V.: Arch, exper. Vet. Mod. 1980,34,116-118) oder mehr als 800 Passagen über einen Nährboden mit steigenden Konzentrationen eines „bacteriostatic agent" (Ivanov, I. etal.: Proceedings of Listeriosis, Ivanov, I. (ed.) Sofia, National Agro-Industrial Centre for Scientific Informations 1979,324-329) führen zu keiner näher definiertei. Mutation als Ursache der Virulenzreduktion und überlassen den Grad der Attenuierung weitgehend dem Zufall.

3) Wirksamkeit: Rauhform-Mutanten und der „mit Adjuvans" gegebene offensichtlich überattenuierte, kommerzielle Impfstoff Listevac (Literatur siehe oben) vermitteln nur einen begrenzten Schutz. Über den Impfstoff aus durch mehrfache Mutagenbehandlung attenuierten Mutanten liegt nur die Publikation (Literatur siehe oben) des Erfinders vor, welcher über sehr gute Ergebnisse bei Schafen berichtet.

4) Methodische Hinweise oder Konzeptionen zur Isolierung von Listeria-Impfstämmen mit ahgsc'ufter Attenuierungshöhe am Mäusemodell, zwecks Auswahl von für die jeweilige Wirtsspezies optimal attenuierten, bei einmaliger Impfung sicher schützenden Impfstamm-Kanditaten, fehlen bislang.

Ziel der Erfindung Ziel der Erfindung ist es, im Gegensatz zu den bisherigen Listeria-Impfstämmen

- mit unbekannter (obz.B. aus Einmarksr, Mehrmarker oder Deletionsmutation resultierender) Stabilität;

- mit einem dem Zufall überlassener. Grad der Attenuierung;

- mit einer im Bereich der Üborattenuierung sich bewegenden Virulenzreduktion und damit wie bei Rauhform-Mutanten nur begrenzten Immunogenität;

eine neue Impfstamm-Generation mit garantierter Stabilität und (am Mäusemodell) abgestufter Virulenzreduktion einzuführen, so daß für die jeweilige Nutztierspezies der jeweilige optimal attenuierte, bei einmaliger Impfung über eine inapparente Infektion den belastbaren Schutz vermittelnde Impfstamm-Kandidat zur Verfügung steht.

Darlegung des Wesen« der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung von Listeria monocytogenes Lebendimpfstoffen aus stabilen (zwei oder evtl. drei unabhängig voneinander virulenzreduzierende Mutationen besitzenden) und immunoo3nen (eine dem jeweiligen Nutztier angepaßte optimale Attenuierung aufweisenden) Impfstämmen darzulegen, welches

- die Stabilität durch zwei und evtl. drei unabhängig voneinander virulenzreduzierende Marker garantiert (Gesamtstabilität = Produkt der Stabilitäten der einzelnen Marker),

- nicht auf vollständig unbekannte und den Grad der Virulenzreduktion dem Zufall überlassende Mutationen zurückgreift und daher mit einem Attenuierungsprinzip arbeitet, bei dem mit überzufälliger Häufigkeit schwach bis mäßig attenuierte Klone anfallen, und

- insbesondere gestattet, Impfstämme mit abgestufter Attenuierungshöhe (im hochempfänglichen Mäusemodell) bereitzustellen, um aus diesem Set die für die jeweilige Nutztierspezies optimal attenuierten und daher immunogenen Impfstamm-Kandidaten bereitstellen zu können, welche bei einmaliger Impfung - als Resultante aus relativ hoher Impfdosis und erhaltener Invasivität mit begrenzter aber ausreichender in vivo Vermehrung - über eine inapparente Infektion einen sicheren Schutz vermitteln.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß von Listeria monocytogenes Wildstämmen

- im ersten Schritt Stoffwechseldrift-Mutanten eines bestimmten Antibiotika-Resistenz-Phänotyps isoliert werden und Klone mit geringer bis mäßiger Virulenzredul Jon ausgelesen werden,

- im zweiten Schritt von solchen Einmarker-Stämmen mit geringer oder mäßiger Virulenzreduktion erneut Stoffwechseldrift-Mutanten eines anderen Antibiotika-Resistenz-Phänotyps isoliert und von diesen Klonen ausgelesen werden, welche dem jeweiligen Zweimarker-Stamm die gewünschte zusätzliche Virulenzreduktion vermittelt, so daß ein Set von Impfstamm-Kandidaten mit abgestufter Attenuierung zur Verfügung steht, und

- im evtl. dritten Schritt - bei Notwendigkeit zur weiteren Anhebung der Attenuierung - von einem Zweimarkerstamm erneut Stoffwechseldrift-Mutanten eines weiteren Antibiotika-Resistenz-Phänotyps isoliert und von diesen Klonen mit zusätzlicher Virulenzreduktion ausgelesen werden.

Die oben angegebene Reihenfolge kann in beliebiger Weise variiert und hierbei auch auf andere Stoffwechseldrift (chromosomaleAntibiotika-Resistenz)-Marker zurückgegriffen werden.

Offensichtlich ist den meisten Stoffwechseldrift-Mutationen gemeinsam, daß eine signifikante lineare Korrelation zwischen dem Logarithmus der i.p. LD₆₀ und der Generationszeit besteht (Linde, K.: Dev. Biol. Standard 1983,53,15-18 sowie diese Patentschrift unter Beispiel 1, Abbildung 1), so daß über die Vorauswahl von Klonen mit verlängerter Generationszeit bereits eine überzufällige Auswahl von Mutanten mit geringer oder mäßiger bzw. zusätzlicher Virulenzreduktion möglich ist. Anstelle der in den nachfolgenden Beispielen verwendeten gering bis mäßig attenuierten chromosomalen Streptomycin-Resistenz (Ribosomenprotein)-, Refampicin-Resistenz (RNA-Polymerase)· und Fosfomycin-Resistenz (Transportdefekt)-Mutanten können ebenso vorteilhaft andere Antibiotika-Resistenz-Phänotypen (oder auch Noxen-Phänotypen: DD-WP 235828) zur Isolierung virulenzgeminderter Klone herangezogen werden.

Die in den Ansprüchen und nachfolgend aufgeführten und beim IMET hinterlegten (Einmarker), Zweimarker und Dreimarker Impfstamm-Kandidaten der prädominanten Listeria monocytogenes Serotypen 1 /2 a und 4 b-welche als Beispiel stehen für alle nach gleichem Prinzip hergestellten Impfstamm-Kandidaten mit abgestufter Attenuierungshöhe- sind zur Herstellung von immunogenen Impfstoffen nach an sich bekannten Verfahren geeignet.

Sero typ	*	4b	Listeria monocytogenes Ein- Zwei- Marker-Stämme	Rif53	Drei-	. i.p.LDM Maus . cfu±0·4	Hinterlegungsstelle Labor- IMET Nummer Nummer	IMET 11443
			Sm 74	Rif53		10»·2	4180	IMET 11444
1/2a		Sm74	Wildstamm D 218/77		107·2	4185	IMET11445
	Sm 74		Fos21	108.3	4192	-
	Rif97		104·3	4179	IMET 11440
Sm 30	Rif97		108·'	4195	IMET 11441
Sm 30	Wildstamm 3192		107·'	4203	IMET 11442
Sm30	Fos02	1Ο8.β	4204	-
		106.0	4195

Auiführungsbelsplele

Material und Methoden Wildstimme:

- L. monocytogenes D 218/77, Serotyp 1/2a; Lp. LD₆₀ Maus 10°cfu (Prof. Selbltz, Sektion Tierproduktion und Veterinärmedizin, Karl-Marx-Universität, Leipzig)

- L. monlocytogenes, 3192, Serotyp 4b; i.p. LD₆₀ Maus 10^wcfu (Prof. Sandow, Institut für Medizinische Mikrobiologie, Martin-Luther-Universität, Halle)

Impfstemme zum Immunogenltätsverglelch

Liste vac: Kommerzielle Mischvakzine der Serotypen 1/2a und 4b (Veterinary Institute of Immunology, Sofia, Bulgarien)

Nährmedien

- Nähragar (SIFIN, Berlin-Weißensee, DDR) mit 5% Schafblut

- Tryptose phosphate broth (Difco, USA)

Antibiotika

- Streptomycin (Jenapharm), MHK der Wildstämme S8 Mg/ml;

- Rifampicin (UMB, Bukarest, MHK der Wildstämme <0,1 μς/πιΙ;

- Fosfomycin (Boehringer), MHK der Wildstämme s 5mg/ml.

Isolierung von spontanen chromosomalen Antlblotika-Reststenzklonen

10" (10¹⁰) cfu wurden auf Nähragar mit 5% Schafblut und 400pg Streptomycin (Smj/ml; 100pg Rifampicin (Rif)/ml oder 10mg Fosfomycin (Fos)/ml gespatelt und bis zu 3 Tragen bei 37⁰C inkubiert. Die Rasistenzklone wurden über 2:10 Blutagarpassagen geführt und bei erhaltener Resistenz von 2:400 Mg SmVmI, alOOpg Rif/ml oder a 10mf Fos/ml weiter bearbeitet.

Bestim nung der Generationszeit von Wildstämmen und Mutanten

Die Wachstumskurven wurden bei 37⁰C in Tryptose phosphate broth mit Hilfe des Bioscreen Analyser (Labsystoms Oy, Finnland) aufgenommen. Die Generationszeiten in der exponentiell Wachstumsphase wurden über lineare Regressionsanalysen berechnet und der Mittelwert aus drei getrennten Ansätzen gebildet.

Bestimmung der LD_M bzw. des Attenuierungsgrades für Mäuse

Jeweils zehn 20-25g schwere ICR-Mäuse (Tierzuchtproduktion Berlin-Schönwalde, DDR) wurden L p. mit logarithmisch abgestuften Konzentrationen der Wildstämme oder Mutanten infiziert und die Absterberate Ober 14 Tage verfolgt.

Schrittwelse Isolierung von Ein·, Zwei· und Drelmarker-Mutanten mit abgestufter Attenuierung

- Erster Schritt: Isolierung von Sm-Resistenz (Stoffwechseldrift)-Klonen. Von diesen wurden insbesondere solche mit unterschiedlich stark verlängerter Generationszeit auf ihre I. p. LD₆₀ getestet.

- Zweiter Schritt: Von einem Sm-Resistenzklon mit etwas über einer Zehnerpotenz erhöhter i. p. LD₆₀ wurden Rif-Resistenz (Stoffwechseldrift)-Klone isoliert und die Sm/Rif-Klone mit verlängerter Generationszeit auf ihre L p. LDf₀ getestet.

- Dritter Schritt: Von einem Sm/Rif-Zweimarker-Impfstammkandidaten mit einer etwa eine weitere Zehnerpotenz erhöhter I. p. LD₆₀ wurden Fos-Resistenz (Stoffwechseldrift)-Klone isoliert und sinngemäß wie beschrieben weiter untersucht.

Bestimmung der Immunogenltät der Ein·, Zwei- und Drelmarker Impfstand-Kandldaten Im Vergleich zum kommerziellen Impfstoff Llstevac

Die ICR-Mäuse wurden I. p. mit der voll tolerierten Dosis von s 1 % der LDw immunisiert. Nach 14 Tagen erfolgte die letale i. p.-Belastune mit ~ 100 LD₆₀ des homologen Wildstammes.

siehe Fußnote Seite 4.

Beispiel 1

Herstellung von potentiellen Impfstämmen über die schrittweise Isolierung von geeigneten Ein-, Zwei- und Drelmarker-Stoffwachseldrift-Mutanten:

- Erster Schritt: Isolierung von Streptomycin (Sm)-Reslstenz Phänotypen aus den L. monocytogenes Wildstämmen mit anschließender Auslese derjenigen Sm-Klone, welche eine mehr oder weniger ausgeprägte Virulenzreduktion zeigen. Dies erfolgt über die Vorauswahl von Klonen mit verlängerter Generationszeit und der nachfolgenden Bestimmung der Lp. LD₆O-WeHe dieser Klone am Mäusemodell (Methoden siehe oben).

Jeweils ein Sm-Klon, welcher nach über 20 Blutagar-Passagen hinsichtlich Streptomycin-Resistenz* und Virulenzreduktion (im vorliegenden Fall: etwas über eine Zehnerpotenz erhöhte LD₆₀) stabil war, diente als Einmarker (Impf- bzw.) Ausgangsstamm für die Herstellung von Zweimarker-Impfstamm-Kandidaten.

- Zweiter Schritt: Isolierung von Rifampicin (Rif)-Resistenz-Phänotypen aus stabil (mehr oder wenger) attenuierten Sm-Klonen, mit anschießender Auslese derjenigen Sm/Rif-Klone, welche gegenüber dem Sm-Einmarkerstamm eine mehr oder weniger ausgeprägte zusätzliche Virulenzreduktion zeigen. Dies erfolgt wiederum über die Vorauswahl von Klonen mit verlängerter Generationszeit (gegenüber dem jeweiligen Sm-Einmarkerstamm) und der nachfolgenden Bestimmung der L p. LD₆₀-We(Ie dieser Sm/Rif-Klone am Mäusemodell (Methode: siehe oben).

Solche Srv/Rif-Klone, welche nach über 20 Blutagar-Passagen hinsichtlich Rifampicin-Resistenz und zusätzlicher Virulenzreduktion gegenüber dem Sm-Einmarker-Ausgangsstamm stabil waren, (im vorliegenden Fall bewegt sich die Gesamtettenuierung in Abhängigkeit vom jeweiligen Sm/Rif^-Klon zwischen Lp. LD₆₀-MaUs von 10^Mbis 10^7>4cfu), sind als Zweimarker-Impfstammkandidaten geeignet (bzw. stehen bei Notwendigkeit für den Einbau einer dritten virulenzreduzierenden Stoffwechseldrift-Mutation zur Verfügung

- Eventueller dritter Schritt: Die Isolierung von Fosfomycin (Fos⁺) Resistenz-Phänotypen aus stabil (mehr oder weniger) attenuierten Sm/Rif-Klonen erfolgt sinngemäß wie unter .Erster Schritt" und .Zweiter Schritt" beschrieben.

Aus Tabelle 1 ist ersichtlich, daß die angeführten Sm- und Sm/Rif-Resistenzphänotypen in Klone (Genotypen) mit unverändertem Virulenzverhalten sowie in solche mit den gewünscht unterschiedlichen Attenuierungsgraden zerfallen. Letztere Klone sind nach Kontrolle der Stabilität als Einmarker-Ausgangs (Lzw. lmpf)-stämme oderZweimarker-lmpfstamm-Kandidaten geelgn6.. Wie außerdem die Abbildung 1 für den jeweiligen Resistenz-Phänotyp des Serotyps 1 /2 a am I. p.-Mäusemodell ausweist, korreliert linear der ansteigende Logarithmus der LD₆₀ mit der Generationszeit (g). Die Regressionsgeraden wurden für beide Resistenz-Phänotypen getrennt und berechnet und die Signifikanz der Korrelationskoeffizienten (r) mit Hilfe des t-Testes überprüft. Die Regressionsgeraden lauten für Sm-Klone: log LD₆₀ = 0.04 + 2.6 (n = 35, r = 0,423, ρ <0,02) und für (die Sm/)Rif-Klone/ log LD₆₀ = 0,01 g+5,6 (n = 27, r = 0,489, ρ < 0,01). Diese Daten etwa entsprechende Korrelationen wurden auch für den Serotyp 4 b gefunden.

Beispiel 2

Bestimmung der Immunogenität der Einmarker, Zweimarker und Dreimarker-Impfstammkandidaten im Vergleich zum mitgeführten kommerziellen Listevac (Bulgarien)-Impfstoff.

Von ausgewählten (entsprechend Beispiel 1 hergestellten) Sm-Einmarkerstämmen, Sm/Rif-Zweimarkerstämmen und Sm/Rif/ Fos-Dreimarkeretämmen erhielten Mäuse die einmalige voll tolerierte I. p.lmmunls.erungsdosis von ώ 1 % der LD₆₀ und wurden nach 14 Tagen L p. mit der letalen -100 LD_M-Dosis des jeweiligen homologen Wildstammes belastet.

Aus der zusammenfassenden Tabelle 2 ist ersichtlich, daß alle Einmarker- und Zweimarker-Impfstämme 295% der Mäuse

gegen die letale Belastung schützen. Ab Lp. LD_M-Werten von 10"-⁰CfU beginnt jedoch der Bereich der Überattenuierung. Dies ist aus dem stufenweise abnehmenden Schutz ersichtlich, welcher aus der Immunisierung mit der Sm/Rif/Fos-Dreimarkerstämmen, Lp. LDmIO⁸-³ und 10⁸⁶CfU, und dem Listevac-Impfstamm, Lp. LD₆₀ a 10^wcfu resultiert.

Beispiel 3

Abrennung der Impfstämme von Wildstämmen:

Die Abtrennung von den Wildstämmen erf jlgt bei den

- Sm-Einmarkerstämmen durch den Nachweis der Resistenz gegen 100μρ Streptomycin/ml

- Sm/Rif-Zweimarkerstämme durch den Nachweis der Resistenz gegen 100Mg Streptomycin/ml und 100μς Rifampicin/ml

- Sm/Rif/Fos-Dreimarkerstämmedurch den Nachweis der Resistenz gegen 100pg Streptomycin/ml, 100pg Rifampicin/ml und 10mg Fosfomycin/ml.

Beispiel 4

Massenkultur, Präparation und Anwendung der Impfstämme:

Zur Herstellung des Lebendimpfstoffes werden die (Einmarker-), Zweimarker- oder Dreimarker-Impfstämme In einem geeigneten Vollmedium als Flüssigkultur bis zum Ende der Logarithmischen Phase gezüchtet. Die Bakteriensuspensionen werden zu gleichen Teilen als Misch-Lyophilisat präpariert. Der so erhaltene Impfstoff wird in der Regel als einmalige Dosis an entsprechnede Nutztiere (z. B. Lämmer) vorzugsweise eubcutan, in einer Dosis von ~ 10⁹ Lebendkeime verabreicht.

Einzelne Streptomycln-Reslstenz-Klone (Genotypen) zeigen nach mehreren Passagen Ober Blutagar eine gering verminderte und dann auf diesem Niveau stabil verbleibende Streptomycin-Resistenz ohne Änderung der Virulenzreduktion.

Einzelne von Stroptomycln-Resistenz-Klonen abgeleitete Rifampicin· und Fosfomycln-Reslstenz-Klone (Genotypen) zeigen - außer der zusätzlichen Virulenzreduktion -eine gering verminderte oder erhöhte Streptomyclnm-Reslstenz als zusätzlichen plelotropen Effekt.

Die mittels Stoffwechseldrlft-Mutatlonen hergestellten, hinterlegten sowie auszugsweise in Tabelle 2 ausgeführten Listeria monocytogenes-lmpfttf mme besitzen folgende Vorteile:

- Garantierte Stabilität (unter den Bedingungen des Impfstoff-Einsatzes), realisiert über zwei (oder drei} unabhängig voneinander virulenzreduzierende Mutationen

- Abgestufte Attenulerungsgrade (bezogen auf die LD_M-Werte am hochempfänglichen Mäusemodell) bei den Zwei- und Dreimarker-Impfstämmen, reguliert durch die gezielte Auswahl von Klonen mit geringer oder mäßiger Virulenzreduktion. Das heißt, falls durch eine (von Mäusen) abweichende Empfänglichkeit des Nutztieres der orientierend getestete Impfstamm-Kandidat sich als zu hoch oder zu gering attenuiort erweisen sollte, kann - aus dem Set von Impfstämmen mit abgestufter Viru lenzreduktion - auf einen geeigneten Impfstamm mit geringerer oder höherer Gesamtattenuierung zurückgegriffen werden.

- Einmalige Impfung fuhrt zur Immunität, da solche für die jeweilige Wirtspezies optimal attenuierten Impfstämme (als Resultante aus relativ hoher Impfdosis sowie erhaltener Invasivität mit begrenzter, aber ausreichender in vivo Vermehrung) eine inapparente Infektion mit entsprechender Erregerresistenz im Gewebe auslösen, wodurch die belastbare und dauerhafte zelluläre Abwehr stimuliert wird.

Tabelle 1

L. monocytogenes Stoffwechseldrift-Mutanten:

Aufspaltung der Resistenzphänotypen in Klone mit unterschiedlichem Virulenzverhalten

Serotyp1/2a:vom	abgeleitete	36Sm	Sm74+-	mit	WiId"-	Serotyp4b:vom	abgeleitete	57Rif
Wild·-	Klone	Stamm	i. p. LD60	Stamm	Sm-30++-	Klone K! ..ie
Stamm	9				Stamm
4	27Rif	Maus	6Sm
1	Klone	10"1014CfU
5		4,3·-4,5
1		4,6-4,90		33
9		5,0"-5,3		13
3		5,4-5,7	4	6
3		5,8-6,1++	2	5
12	6,2+-6,5
10	6,6-6,9
5	7t0-7,4

* und ··: zum Jeweiligen Wildstamm gehörender LD_M-Wert + und ++: zum Jeweiligen Sm-Stamm gehörender LD₆₀-WeIi.

Tabelle 2

Potentielle L. monocytogenes Zwei- und Dreimarker-Impfstämme mit abgestufter Attenuierung und deren Schutzwirkung nach i. p. Immunisierung mit s 1 % der LD_Mcfu und homologer Belastung nach 14 Tagen (im Vergleich zu Listevac) am

i.p.-Mäusemodell

Minimale Hemmkonzentration dieser Stämme auf Nähragar mit 5% Schafblut gegen die verwendeten Antibiotika

Sero-	Stoffwechseldrift-Mutai iten	Zweiter	Dritter	LD«,	Belastung	Strepto	Rifam-	Fosfo-
typ	Erster	Marker	Marker	cfu	-LD60	mycin	picin	mycin
	Marker			-If/*«.«	Schutz %	Mg/ml	pg/ml	mg/ml
	Sm82			5,8	295	>400	<0,1	25
	Sm 74			6,2	295	>400	<0,1	25
	Sm 29	Rif16		6,3	295	>400	<0,1	25
	Sm 74	Rif56		6,8	295	>400	>100	25
1/2a	Sm 74	Rif53		7,0	295	>400	>100	25
	Sm 74	Rif57		7,2	295	>400	>100	25
	Sm 74	7,4	295	2400	>100	>5

Sm74 Sm74

Rif53 Rif53

Fos21 Fosf

-90 -90

300 400

>1C0 >100

Listevac (Bulgarian)

260

Wildstamm	4,3	0	2	0,1	25
nichiimmunisierte Kontrolle		295 295 295	-	-	-
Sm 167 Sm 50 Sm30	5 7 5,8 6,1	>400 >400 300	<0,1 <0,1 <0,1	cn οι cn

Sm 30	Rif67
Sm 30	Rif69
Sm 30	Rif78
Sm 30	Rif97
Sm 30	Rif82

6,6	295	>400	>100	5
6,9	?J5	300	>100	5
7,0	i:r 95	300	>10ϋ	5
7,1	2t95	400	>100	5
7,3	295	300	>100	5

Potentielle L. monocytogenes Zwei- und Dreimarker-Impfstämme mit abgestufter Attenuierung und deren Schutzwirkung nach i. p. Immunisierung mit S1 % der LD_ucfu und homologer Belastung nach 14 Tagen (im Vergleich zu Listevac) am i.p.-Mäusemodell

Minimale Hemmkonzentration dieser Stämme auf Nahragar mit 5 % Schafblut gegen die verwendeten Antibiotika

Sero typ	Stoffwechseldrift-Mutanten Erster Zweiter Dritter Marker Marker Marker	LD60 cfu 10X±0.4	Belastung -LD60 Schutz %	Strepto mycin Mg/ml	Rifam- picin Mg/ml	Fosfo- mycin mg/ml
	Sm 30 Rif97 Fos2	8,5	-75	100	>100	2:10
	Listevac (Bulgarien	8,5	£60	-	-	-
	Wildstamm	5,0		8	<0,1	5
	nichtimmunisierte Kontrolle		0	-	-	-

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung von Lebendimpfstoffen gegen Listeriose, gekennzeichnet dadurch, daß aus Listeria monocytogenes Wildstämmen unter Verwendung des Prinzips der Stoffwechseldrift, insbesondere mittels chromosomaler Antibiotika-Resistenz-Mutationen, über die schrittweise Isolierung Ein-, Zwei- und ggf. Dreimarker-Impfstämme mit abgestufter Attenuierungshöhe hergestellt und diese zur Gewinnung des Impfstoffes in an sich bekannter Weise kultiviert werden.

2. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß als einer der Marker ein gering bis mäßig attenuierter Ribosomenprotein (chromosomaler Streptomycin-Resistenz)-Kion verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch !,gekennzeichnet dadurch, daß als einer der Marker ein gering bis mäßig attenuierter RNA-Polymerase (Rifampicin-Resistenz)-Klon verwendet wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß als einer der Markerein gering bis mäßig attenuierter Transportdefekt (Fosfomycin-Resistenz)-Klon verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß die aus den Wildstämmen (i. p. LD₆O Maus S 10⁶cfu) unter Verwendung der Marker hergestellten Ein-, Zwei- und ggf. Dreimarker Impfstämme auf eine abgestufte Gesamtattenuierung von i.p. LD₅₀ Maus 10.⁶⁶cfu bis 10^8>3cfu eingestellt werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, gekennzeichnet dadurch, daß als erster Marker ein gering bis mäßig attenuierier Ribosomenprotein (chromosomaler Streptomycin-Resistenz)-Klon verwendet und als zweiter Marker ein gering bis mäßig attenuierter RNA-Polymerase (Rifampicin-Resistenz)-Klon verwendet sowie erforderlichenfalls als dritter Marker ein gering bis mäßig attenuierter Transportdefekt (Fosfomycin-Restistenz)-Klon verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet dadurch, daß die nachfolgend angegebenen Einmarkerstämme und Zwei- sowie Dreimarker-Impfstammkandidaten der Serotypen 1 /2 a und 4b als Beispiel stehen für alle nach gleichem Prinzip hergestellten potentiellen Listeria-Impfstämme mit gleicher, geringerer (oder evtl. höherer) Attenuierung und zur Impfstoffherstellung verwendet werden.