DE102007012824A1 - Impfstämme mit abgestuften Koloniegrößen/Attenuierungen und Verfahren zu deren Isolierung - Google Patents

Impfstämme mit abgestuften Koloniegrößen/Attenuierungen und Verfahren zu deren Isolierung Download PDF

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Abstract

Die Erfindung betrifft Impfstämme mit abgestuften Koloniegrößen/Attenuierungen und eine für alle bakteriellen Seuchen- und Krankheitserreger gleichermaßen geeignete Methode, welche mit geringem Personal-, Material- und Zeitaufwand potentielle Impfstämme für unter Feldbedingungen absolut stabile Lebendvakzinen mit gewünschter Attenuierungshöhe bereitstellt. Die Impfstämme erfüllen die Sicherheitsanforderungen der WHO. Hierbei wird die Stoffwechseldrift(Stwd)-Attenuierung benutzt. Die Impfstämme weisen wenigstens zwei, jedoch als Optimum drei und/oder vier unabhängig voneinander attenuierende Stoffwechselsdrift-Mutationen und eine der Wirtsspezies angepaßte Attenuierungshöhe auf. Hierbei handelt es sich um attenuierende Resistenzmutationen vorzugsweise gegen Antibiotika und/oder toxische Substanzen.

Description

  • Die Erfindung betrifft Impfstämme mit abgestuften Koloniegrößen/Attenuierungen und eine für alle bakteriellen Seuchen- und Krankheitserreger gleichermaßen geeignete Methode, welche mit geringem Personal-, Material- und Zeitaufwand potentielle Impfstämme für unter Feldbedingungen absolut stabile Lebendvakzinen mit gewünschter Attenuierungshöhe bereitstellt. Hierbei wird die Stoffwechseldrift (Stwd)-Attenuierung benutzt.
  • Den Sicherheitsanforderungen der WHO – gefordert werden zwei unabhängig voneinander virulenzreduzierende Attenuierungsmarker – wird mit Stämmen, welche drei bzw. vier (fünf wäre möglich, aber eher akademisch) verschiedene Stwd-Marker besitzen, mehr als entsprochen. Über eine orientierende Koloniegrößen-Bestimmung (Generationszeit(GT)-Verlängerung) im Vergleich zum Wildstamm kann die schrittweise abgestufte Attenuierung (GT als Attenuierungsäquivalent) eingeschätzt werden. Auf Grund der Möglichkeit zur Angleichung des Attenuierungsgrades an die Wirtsempfänglichkeit lassen sich nicht-vertretbare Nebenwirkungen bei Impfungen vermeiden.
  • Unbeschadet der zahlreich vorgestellten potentiellen Impfstämme und der großen Möglichkeiten moderner Gentechnik gibt es noch nicht für alle bakteriellen Seuchen- und Krankheitserreger uneingeschränkt überzeugende Lebendvakzinen. Grund hierfür ist vermutlich der beträchtliche Zeit- und Kostenaufwand für solche Entwicklungen. Hinzu kommt, dass die vielversprechenden Entwicklungen der letzten Jahre oft noch im Versuchsstadium sind. Übersehen wurde bislang die Möglichkeit, kurzfristig mittels Stwd-Auslese Impfstämme bereitstellen zu können, bei denen trotz Markerkopplungen keine Überattenuierung vorliegt. So ist aus der EP 026 352 88 B1 ein Salmonella-Lebendimpfstoff mit Wirtsspezies-angepassten Attenuierungshöhen und antiepidemischer Potenz, aus der DD 294 420 A5 ein Verfahren zur Herstellung von Lebendimpfstoffen gegen Listeriose, aus der US 6,136,325 ein Lebendimpfstoff mit vermindertem Risiko für Menschen und aus der US 5,792,452 ein Salmonella-Lebendimpfstoff mit erhöhter Stabilität bekannt. In den genannten Patentschriften ist auch der bekannte Stand der Technik auf diesem Gebiet ausführlich referiert. Bekannt sind mittels Stwd(Antibiotika-Resistenz)-Mutationen isolierte Ribosomen (Streptomycin), DNA-Replikations(Nalidixinsäure)- sowie RNA-Polymerase (Rifampicin)-Mutanten mit abgestuften Attenuierungshöhen und deren gezielte Kopplung zu Prototyp-Impfstämmen mit zwei unabhängig voneinander virulenzreduzierenden Markern.
  • Die Praxisrelevanz dieser auf einzelne Stämme bezogenen Entwicklung wurde am Beispiel von Salmonellen, Shigellen und Listerien im Tierversuch, durch klinische Prüfung Stufe I, über klinische Erprobung und in zwei Feldversuchen nachgewiesen und inzwischen durch eine über zehnjährige Anwendung der Vakzinen VacT und VacE bestätigt (Linde, K. et al. Vaccine 1991, 9, 101–105; Linde, K. Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A 1981, 249, 350–361; Kirsch, W.D. und Mitarb. Klinische Prüfung Stufe I von Typhus Oral Impfstoff, Leipzig 21.06.1989; Dentchev, V. et al. Vaccine 1990, 8, 30–34; Linde, K. et al. Vaccine 1990, 8, 278–282; Linde, K. et al. Vaccine, 1990, 8, 25–29; Linde, K. et al. Vaccine 1992, 10, 337–340; Linde, K. et al. Vaccine 1995, 13, 923–926; Linde, K. et al. Tierärztl. Umschau 1996, 51, 23–31).
  • Ferner wurde am Beispiel von Salmonella Typhimurium mittels Transduktion gezeigt, dass bei der Stwd die „Resistenz und Attenuierung" eine funktionelle Einheit bilden (Linde, K. et al. Vet. Microbiol 1998, 62, 121–134). Außerdem von Bedeutung ist, dass in Bouillonkultur-Passagen von VacT und VacE sich anreichernde Revertanten mit verkürzten GT, die zwischen Originalimpfstamm und Wildstamm liegen, unvermindert attenuiert sind ( US 5,792,452 ).
  • Ferner ist erwähnenswert, dass unter Resistenzmutanten gegen toxische Substanzen ebenfalls attenuierte Stwd-Klone auftreten (Linde, K und Mitarb. Zbl Bakt. Hyg. I Abt. Orig. A 1981, 250, 478–489).
  • Die damit verbundene theoretische Vorstellung zur Stwd war, dass die attenuierenden Antibiotika Resistenzmutationen – im Vergleich zur klinisch problematischen chromosalen Resistenz – andere Sequenzen im entsprechenden Gen betreffen. Zwischenzeitlich berichteten mehrere Autoren, dass Antibiotika-Resistenzmutationen generell einen Fitnessverlust bedingen, welcher in der Regel über eine Zweitmutation kompensiert wird (Andersson, D.I. Current Opinion in Microbiology 2003, 6, 452–456; Björkmann, J. et al. Science 2000, 287, 1479–1482; Gillepsi, St. H. and McHugh, T.D. Trends Microbiol. 1997, 5, 337–339; Spratt, B.G. Curr. Biol. 1996, 6, 1219–1221).
  • Einzelne Klone behalten jedoch eine mehr oder weniger ausgeprägte Attenuierung (Andersson, D.I. et al. In: Antibiotic Development and Resistence, ed. Hughes, D. and Andersson, D.I.; Taylor and Francis, London 2001, 155–162; Andersson, D.I. and Levin, B.R. Curr. Opin. Microbiol 1999, 2, 489–493; Björkmann, J. and Andersson, D.I. Drug Resistance Updates 2000, 3, 237–245; Giraud, E. et al. Journ. of Medical Microbiol. 2003, 52, 697–703; Gustafsson, I. et al. Journ. of Antimicrob. Chemother. 2003, 52, 258–263) und entsprechen somit der sogenannten Stwd-Definition.
  • Diese neueren und ergänzenden Fakten in Verbindung mit
    • – Einsichten zu evolutionären Vorgängen (Bayliss, Ch.D. and Moxon, E.R. SAM Neves 2002, 68, 549–555; Lenski, R.E. and Travisano, M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 6808–6814; Levin, B.R. Genetics 2000, 154, 985–997; Müller, H.E. Mikrobiologe 1997, 7, 204–208; Wolf-Watz, H. and Miller, V.L. Curr. Opinion in Microbiol 2003, 6, 3–6),
    • – dem nur in vitro möglichen Nachweis von spontan auftretenden attenuierten Klonen (Linde, K. et al. Vet. Microbiol. 1998, 62, 121–134; Giraud, E. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 1999, 43, 2131–2137; Nilsson, A.I. et al. Antimicrob. Agents Chemother. 2003, 47, 2850–2858),
    • – der auf beiderseitiges Überleben orientierenden Erreger-Wirt-Wechselwirkung (Fenner, F. and Racliffe, F.N. Myxomatosis, Cambridge, University Press 1965; Myers, K. et al. J. Hyg. (Camb) 1954, 52, 337–360) und
    • – der etwa im Ein-Promille-Bereich liegenden Häufigkeit von Mutanten mit vermutlich evolutionärem Vorteil (Hofemeister, J. und Böhme, H. Wissenschaft und Fortschritt 1982, 32, 90–94)
    haben zu neuen Erkenntnissen beigetragen, die zu einem umfassenderen, mithin neuen Verständnis der biologisch vorprogrammierten Stwd führen.
  • Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, dass mittels eines mit Stwd-Mutationen arbeitenden Verfahrens (Zwei-), Drei- und Viermarker-Mutanten isoliert werden, wobei jede Einzelmutation eine zusätzlich geringe Attenuierung aufweist, so dass Mehrmarker-Impfstämme ohne Überattenuierung entstehen. Diese sind als potentielle Impfstämme zur Herstellung von Lebendvakzinen einsetzbar.
  • Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die im Anspruch 1 beanspruchten Impfstämme und durch das im Anspruch 5 beanspruchte Verfahren zu deren Isolierung. Impfstämme und Verfahren werden in weiteren Ansprüchen vorteilhaft ausgestaltet. Wesentliches Merkmal ist, dass mittels eines mit Stwd-Mutationen arbeitenden Verfahrens (Zwei-), Drei- und Viermarker-Mutanten isoliert werden, welche eine gewünschte Attenuierungshöhe besitzen und als potentielle Impfstämme zur Herstellung von Lebendvakzinen eingesetzt werden.
  • Der Erfindung liegt die Erkenntnis über ein neues Verständnis der biologisch vorprogrammierten Stwd zu Grunde, das nachfolgend beschrieben wird:
    • • Ribosomen und essentielle Enzyme realisieren (u. a.) mittels Drift die Wirts-/bzw. Umweltanpassung.
    • • Antibiotika – Nährböden simulieren gleichzeitig – eine toxisch veränderte, für noxenresistente Mutanten aber geeignete Umwelt, – einen hochempfänglichen Wirt, der attenuierte (Resistenz-)Klone nicht eliminiert.
    • • Antibiotika, wie z. B. Sm, Rif, Fusidinsäure (Fus) und Fosfomycin (Pho), erweisen sich unter diesem Blickwinkel als Werkzeuge der Molekularbiologie und sind – bezogen auf den speziellen Stwd-Klon – praxisrelevante Attenuierungsmarker (Linde, K. et al. Vet. Microbiol. 1998, 62, 121–134).
  • Daraus ergibt sich:
    • 1. Eignung der Stwd-Attenuierung für alle Bakterien Über Stwd-Mutanten und Impfstämme von Salmonellen, Shigellen und Listerien liegen, wie bereits offenbart, praxisrelevante Erfahrungen vor. Die problemlose Stwd-Attenuierung nunmehr auch bei E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus und Clostridium perfringens ermöglicht die Aussage: Die Stwd als Methode zur Attenuierung eignet sich für alle Bakterien.
    • 2. Eignung der Sm-id Zweimarker-Klone von aerob wachsenden Bakterien als Ausgangsstämme für den Einbau von Rif- und/oder Fus- und/oder Pho-Stwd-Markern Die dadurch entstehenden Drei- und Viermarker-Impfstämme sind unter Feldbedingungen absolut stabil. Zu den Sm-id Stämmen sind erläuternde Hinweise angebracht: Die Proteinsynthese am Ribosom zeigt in Größenordnungen ein misreading mit Einbau falscher Aminosäuren. Dieses misreading kann durch Mutationen erhöht oder gesenkt werden. (Acken, U. Mol. Gen. Genet. 1975, 140, 61–68; Bjare, U. and Gorini, L. J. Mol. Biol. 1971, 57, 423–435; Björkmann, J. et al. Mol. Microbiol. 1999, 31, 53–58; Hasenbank, R. et al. Mol. Gen. Genet. 1973, 127, 1–18; Jorgensen, F. and Kurland, G. J. Mol. Biol. 1990, 215, 511–521; Hill, W.E. et al. The Ribosome: structure, function & evolution, Washington, D.C.: American Society for Microbiology 1990). Ein Sonderfall mutativ veränderter Ribosomenproteine ist die Sm-Dependenz (Sm-d: Wachstum nur mit Sm) und deren Mutation zur Sm-Independenz (Sm-id). Letztere Mutanten mit zwei unabhängig voneinander attenuierenden Mutationen (Likhoded, V.G. and Shuster, B. Yu. Zh. Microbiol (Moscow) 1976, 3, 23–28 (in Russian); Shuster, B.Y. et al. Zh. Microbiol (Moscow) 1971, 12, 58–42 (in Russian)) zerfallen in ein Spektrum von Klonen mit unterschiedlich verlängerten Generationszeiten (GT) bzw. verminderten Koloniegrößen und entsprechend korrelierendem Attenuierungsgrad (Blatz, R. und Knoll, E. Promotion A. Medizinische Fakultät, Universität Leipzig 1974; Linde, K. und Keller, H.P. Arch exper. Vet. Med. Leipzig 1976, 30, 845–851; Linde, K. und Keller, H.P. Zschr. f. ges. Hyg. und Grenzgebiete 1978, 24, 6, 452–458). Diese an sich idealen Impfstämme, welche den Sicherheitskriterien der WHO vollauf entsprechen (WHO 1972, World Health Org., Tech. Rep. Ser. 500, p. 25), wurden in den 60 er und 70 er Jahren von den damaligen Experten irrtümlich sowie pauschal als virulente Rückmutanten verworfen. Diese Fehleinschätzung bewirkte offensichtlich, dass sich die Etablierung der Stwd als Methode um etwa 25 Jahre verzögerte. Als Folge dessen ist in dem 1990 erschienenen Standardwerk zum Ribosom kein Kapitel zu Sm-d und Sm-id Mutanten enthalten (Rill, W.E. et al. The Ribosome: structure, function & evolution, Washington, D.C.: American Society for Microbiology 1990) und die Sm-id Attenuierung eines Brucella melitensis-Lebendimpfstoffes nur aus der Erstpublikation ersichtlich (Elberg, S.S. and Faunce, K. J. Bacteriol. 1957, 73, 211–220). Spätere Publikationen und Lehrbücher bezeichnen ohne weitere Erklärung diese Vakzine nur mit Rev 1.
    • 3. Einbau einer dritten Sm-Stwd-Attenuierung in ausgewählte Sm-id Klone Die Mehrzahl der Sm-id Mutanten verliert das Merkmal Sm-Resistenz und hat gegenüber dem Wildstamm einen nur um etwa den Faktor 2 erhöhte MIC für Sm. Überraschenderweise konnten wir feststellen, dass sich in diese Sm-id Klone vorteilhaft eine weitere Sm-Stwd-Mutation einführen lässt, so dass dann Mutanten mit drei Ribosomen-Mutationen vorliegen. Anmerkung: In diese Sm-id/Sm-Stwd Klone können außerdem anschließend – entsprechend 2. vorstehend – wahlweise Rif-, Fus- und/oder Pho-Stwd Mutationen als vierter (und akademisch fünfter) Marker eingeführt werden.
    • 4. Eignung der Fus(Elongationsfaktor G) – und Pho(Zellwandveränderungen)-Resistenzmutation zur Gewinnung von Stwd-Mutanten mit abgestuften Koloniegrößen/Attenuierungsgraden Erläuterung zur Problematik: Clostridien und Anaerobier generell sind absolut Sm-resistent (Fehlen eines Transportsystems durch die Zellwand: Bryan, L.E.et al. Antimicrob. Agents Chemother. 1979, 15, 7–13), so dass eine Sm- und Sm-id Stwd entfällt. Für eine wenigstens Zweimarker-Attenuierung war zumindest ein zusätzlicher Stwd-Marker notwendig. Überraschenderweise erwies sich die Fus- und Pho-Stwd-Resistenzmutation als gut geeignet, so dass sich von Clostridium perfringens problemlos Rif-, Fus- und Pho-Stwd-Klone mit abgestuften Koloniegrößen herstellen ließen. Sinnvolles Einsatzgebiet wären z. B. Hochleistungskühe und ihre Kälber, die bei starker Kontamination des Futters mit Clostridium perfringens deutliche Leistungseinbussen, verminderte Käsereitauglichkeit der Milch sowie Durchfälle zeigen. Eine orale Impfung mit attenuierten Stämmen lässt eine antitoxische Grundimmunität und damit die Problemlösung erwarten.
  • Bei jedem neu vorgestellten Attenuierungprinzip sowie dessen angestrebter Nutzung für die Herstellung von Lebendimpfstoffen wird von Experten und Rezensenten automatisch die Frage nach der Stabilität dieser Stwd-Marker gestellt: Eine absolute genetische Stabilität gibt es nicht, gefordert ist unter Feldbedingungen das Fehlen von Rückmutanten zum Wildtyp. Für spontane Mutationen wird eine Reversion zur vollen Virulenz mit etwa 10–8 angenommen. Daher fordern die WHO-Security-Demands bezogen auf solche Vakzinen zwei unabhängig voneinander attenuierende Mutationen (WHO, 1972 World Health Org. Tech. Rep. Ser. 500, p. 25). Die vorgestellte erfindungsgemäße Lösung ermöglicht problemlos den Einbau von drei bis vier virulenzreduzierenden Mutationen. Dies ergibt eine Gesamtstabilität von etwa 10–24 bzw. 10–32, womit sich Diskussionen über Stabilität erübrigen. Voraussetzung ist natürlich, dass solche Klone über mindestens zehn Passagen geführt werden und hierbei unvermindert die volle Wachstumsrestriktion aufweisen. Diese Stabilität war bei unseren Untersuchungen die Regel.
  • In diesem Kontext sind zwei Hinweise bedeutsam:
    • • Die Reversion einer spontan attenuierten Shigella-Mutante zur Virulenz erfolgte bei Probanden im Bereich von 109 bis 1010 oral verabreichten Keimen (DuPont, H.L. et al. Symp. Series immunobiol. Standard 1971, 15, 213–218, Karger, Basel/München/New York; Formal, S.B. et al. ebenda p.73–8), ein in-vivo-Genrepair am Beispiel der Enterotoxin-A-Subunit von Vibrio cholerae liegt bei ≤ 10–10, falls nicht als seltenes Ereignis ein P-Fertilitätsfaktor vorkommt. (Kaper, J.B. et al. Infect. Immun 1994, 62, 1480–1483). Hieraus kann abgeleitet werden, dass unter Praxisbedingungen bereits Dreimarker-Stwd-Mutanten hinsichtlich ihrer Stabilität vergleichbar sind mit Stämmen, die zwei Deletionen aufweisen. Für die ubiquitär verbreiteten Clostridien dürfte, bei eventueller prophylaktischer oraler Gabe an Hochleistungskühe, eine Zweimarker-Attenuierung voll ausreichen.
    • • Ein weiterer Diskussionspunkt ist die Antibiotikaresistenz der Stämme, zumal das Robert Koch Institut (RKI) solche Resistenzen als Erkennungsmarker ablehnt (Aktuell: RKI fordert Verzicht auf Antibiotikaresistenz-Marker: Hyg. Med. 1999, 24, 273–274). Wie bereits ausgeführt, besteht – nachgewiesen am Beispiel Salmonella Typhimurium (Linde, K. et al. Vet. Microbiol 1998, 62, 121–134) – bei der Stwd eine funktionelle Einheit von Resistenz und Attenuierung, so dass hier der klinisch geprägte Begriff „Resistenz" im eigentlichen Sinne nicht zutrifft.
  • Aus dieser Darstellung der erfindungsgemäßen Lösung lassen sich die methodischen Vorteile der Stwd und die sich hieraus ergebende potentielle Praxisrelevanz wie folgt zusammenfassen:
    • • anwendbar bei allen Bakterienspezies
    • • abgestufte Attenuierung möglich
    • • garantierte Stabilität durch (Zwei-), Drei- oder Viermarker-Attenuierung
    • • einfache klassische Arbeitsmethoden
    • • geringer Personalaufwand (ein erfahrener Mikrobiologe oder eine versierte technische Kraft genügen)
    • • geringer Materialaufwand/eng begrenzter Geräteaufwand
    • • geringer Zeitaufwand (potentielle Mehrmarker-Impfstämme binnen etwa drei Monaten)
  • Aus diesen Verfahrensvereinfachungen ergibt sich eine Vielfalt möglicher Anwendungskonzeptionen, von denen hier nur einige angeführt werden sollen:
    • • Lebendimpfstoffe, wo wünschenswerte Vakzinen fehlen oder nicht überzeugen
    • • Austausch inaktivierter Autovakzinen gegen (hoch?) attenuierte Stämme, zur denkbaren Bekämpfung von z. B. Staphylokokken-Rezidiven durch intrazellulär persistierende small colony variants Stwd-Mutanten und die für Rezidive verantwortlichen small colony variants (Proctor, R.A. et al. Nature Reviews/Microbiology 2006, 4, 295–305; Maloin, F. et al. FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005, 45, 245–252) haben offensichtlich differente Überlebensstrategien: – Mutation zur Attenuierung zwecks Anpassung an hochempfängliche Tierspezies bzw. – temporär latente intrazelluläre Persistenz als Stressantwort des Erregers im immunkompetenten Wirt.
    • • Mischvakzinen aus enterotoxischen u. a. E. coli: z. B. zweimalige Gabe vor Reiseantritt in Problemländer zwecks Grundimmunität gegen Kolonisationsfaktoren und L-Enterotoxin
    • • Attenuierte Clostridien: Antitoxische Grundimmunität bei Hochleistungs-Nutztieren
    • • Sanierung von Tierbeständen als Reservoir von Zooanthroponosen, z. B. EHEC, Campylobacter; sinngemäß wie Einsatz von VacT und VacE zur Eliminierung von Salmonellen in Hühnerbeständen
  • Das Verfahren zur Herstellung von Impfstämmen gestaltet sich für Sm-sensible (bzw. in vitro durch Sm hemmbare) aerob wachsende Keime und die absolut Sm (und Chinolonderivat)- resistenten Anaerobier unterschiedlich.
    • • Aerob wachsende Bakterien Zweckmäßig als erster Schritt ist die Isolierung von Sm-d Mutanten und deren Reversion zu Sm-id Stämmen, welche in ein Spektrum von Klonen mit unterschiedlich abgestufter Virulenzreduktion aufspalten. Von diesen Zweimarker-Mutanten (an sich bereits geeignete Impfstämme) werden Klone mit gering bis moderater Koloniegrößen-Reduktion/Attenuierung ausgewählt und vorteilhaft als Ausgangsstämme für den weiteren Einbau von Rif-, Fus- und Pho-Stwd-Markern mit jeweils schrittweise gering verminderten Koloniegrößen/zunehmender Attenuierung verwendet. Die so entstandenen Drei- und Viermarker-Mutanten sind unter Feldbedingungen absolut stabil. Sonderfall: In Sm-id Stämme mit weitgehend restaurierter Sm-Sensibilität kann vorteilhaft eine Sm-Stwd als dritter (oder vierter) attenuierender Marker eingebaut werden. Diese Stämme besitzen drei ribosomale Mutationen. Ferner ist bei Verzicht auf Sm-id Ausgangsstämme die Isolierung von Dreimarker- und Viermarker-Mutanten möglich unter Verwendung der Rif-, Fus-, Pho- und Sm-Stwd-Mutationen. Die Reihenfolge der Marker-Einführung ist beliebig.
    • • Strikt anaerob wachsende Bakterien Infolge der absoluten Sm-Resistenz werden zur Herstellung von Zweimarker-Mutanten (Stabilität unter Praxisbedingungen gewährleistet) vorteilhaft die Rif-, Fus- und Pho-Stwd-Mutationen verwendet. Auch hier kann die Reihenfolge des Marker-Einbaus beliebig gewählt werden.
  • In der vorteilhaften Gestaltung des Verfahrens wird an den Beispielen von Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus aureus (rinderpathogen), Bacillus cereus und E. coli O:157 die generell auf alle pathogenen Erreger übertragbare Prinziplösung „Stwd" mit ihren Markerkombinationen demonstriert (Eignung der Stwd-Attenuierung für Salmonellen, Shigellen und Listerien: siehe oben)
  • Anmerkung: Zwecks überzeugender Demonstration des Anliegens werden im folgenden eindeutige Koloniegrößen-Unterschiede ausgewählt. Für die Isolierung von Impfstämmen zur Herstellung von Lebendvakzinen, welche zur Anwendung bei Menschen und Nutztieren vorgesehen sind, ist eine exakte automatische GT-Bestimmung angezeigt (GT als Attenuierungäquivalent: Linde, K. et al. Vaccine 1990, 8, 278–282; ebenda 1991, 9, 101–105). Diese erfasst auch geringe – mit bloßem Auge nicht sicher als Koloniegrößen-Differenzen erkennbare – Anhebungen der Attenuierung. Mittels solcher GT-Bestimmung sind Drei- und Viermarker-Impfstämme herstellbar, welche in der Größe/Attenuierung etwa den Werten der in den Tabellen/Abbildungen gezeigten Sm-id Zweimarker-Basisstämmen entsprechen.
  • Die demonstrierten Viermarker-Klone dürften, übertragen auf pathogene Erreger, vermutlich überattenuiert sein.
  • Im Folgenden werden an acht Beispielen Mutanten mit abgestuften Koloniegrößen demonstriert, welche durch die schrittweise Isolierung von (einem), zwei (vorzugsweise Sm-id), drei und vier unabhängig voneinander attenuierenden Stwd-Markern erhalten wurden.
    • 1: Clostridium perfringens: Zweimarker-Mutante Rif 7/Fus1
    • 2: Staphylococcus aureus ATCC 25923: Dreimarker-Mutante Smi-id3/Fusll
    • 3: Staphylococcus aureus (rinderpathogen): Dreimarker-Mutante Sm-id2/Pho1
    • 4: Bacillus cereus: Dreimarker-Mutante Sm-id2/Fus4
    • 5: Staphylococcus aureus ATCC 25923: Viermarker-Mutante Sm-id3/Rif1/Fus1
    • 6: Bacillus cereus: Viermarker-Mutante Sm-id1/Fusk/Rif1
    • 7: Bacillus cereus: Viermarker-Mutante Sm-id2/Rif2/Pho5
    • 8: Escherichia coli O 157: Viermarker-Mutante Sm-id5/Sm2/Fus4
  • Hinweis: Die jeweiligen Nummer bzw. Markierung des Stwd-Markers bezeichnen den ausgewählten Klon.
  • Durchschnittliche Koloniegrößen der verwendeten Wildstämme und ihrer Einmarker(I)-, Zweimarker(II)-, Dreimarker(III)- und Viermarker(IV)-Stwd-Mutanten: Angegeben sind die Mittelwerte(Mw) in Millimetern und die Standardabweichung (StAbw) (n = 10) der Koloniegrößen nach 20/48h Bebrütungsdauer bei 37°C.
  • Figure 00110001
  • Im folgenden werden die erfindungsgemäßen Impfstämme und das Verfahren zu deren Herstellung in Ausführungsbeispielen näher beschrieben.
  • Ausführungsbeispiele
  • 1. Bearbeitete Bakterien und Material 1.1. Wildstämme und Herkunft
    Escherichia coli O:157 Friedrich Löffler Institut Wusterhausen
    Staphylococcus aureus ATCC 25923
    Staphylococcus aureus (rinderpathogen) Stammsammlung Dr. Felgenträger und Co. Rodleben
    Bacillus cereus Stammsammlung des Institutes für Bakteriologie und Mykologie Vet. med. Fakultät der Universität Leipzig
    Clostridium perfringens ebenda
    1.2. MIC-Werte
    Spezies Streptomycin Rifampicin Fusidinsäure Fosfomycin (ohne Glukose-6-Phosphat)
    E. coli O: 157 8 8 200 ≈10
    Staphylococcus aureus ATCC 25923 8 < 0,25 0,25 ≈10
    Staphylococcus aureus (rinderpathogen) 16 0,25 0,25 ≈10
    Bacillus cereus 8 0,5 0,5 ≈10
    Clostridium perfringens ⌀ ≤ 0,25 ≤ 0,25 ≈5
  • 1.3. Nährmedien
    • • Nähragar I/SIFIN mit 0,1% Glucose (NA): E. coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus
    • • Clostridial medium nach EP (RCM, SIFIN) mit 19,5 g/l Agar (RCA): Clostridium perfringens
  • 1.4. Verwendete Antibiotika, deren Konzentrationen und Hersteller
    Streptomycin (Sm) 400 μg/ml: E. coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus Streptomycinsulfat (Roth, Germany)
    Rifampicin (Rif) 200 μg/ml: E. coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus 50 μg/ml: Clostridium perfringens Rifampicin (Fluka, Switzerland)
    Fusidinsäure (Fus) 1600 μg/ml: E. coli 50 μg/ml: Clostridium perfringens 12,5 μg/ml: Bacillus cereus, Staphylococcus aureus Natriumfusidat (Fagron, Germany)
    Fosfomycin (Pho) (ohne Giukose-6-Phosphat) 200 μg/ml: E. coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus 50 μg/ml: Clostridium perfringens Fosfomycin (InfektoPharm, Germany)
  • 2. Beispiel 1
  • Isolierung von Sm-, Rif-, Fus-, Pho-Stwd-(Ribosomen-, RNA-Polymerase-, Elongationsfaktor G-, Zellwand-)Mutanten mit abgestuften Koloniegrößen/Attenuierungen
  • Das Material einer 24h/37°C Petrischalen-Kultur (48h/37°C bei Clostridium perfringens) wird in 1 ml PBS suspendiert und hiervon 0,1 ml pro Petrischale mit dem jeweiligen Antibiotika-Medium (Clostridium perfringens siehe Beispiel 6) gespatelt. Bei Fosfomycin ist die ≥ 10fach höhere Mutationsrate zu berücksichtigen. Die aerobe Bebrütung erfolgt für 24 bis 36h/37°C (für Nachbeurteilungen erfolgt die Aufbewahrung bei Zimmertemperatur) bzw. anaerob für 48 bis 72h/37°C. Koloniezahlen zwischen 30 und 70 pro Platte sind für die Auswertung optimal. In Einzelfällen ist eine Wiederholung des oben beschriebenen Verfahrens mit einer entsprechend verdünnten bzw. konzentrierteren Suspension angezeigt.
  • Anmerkung: Das Restwachstum bei zu hohen Konzentrationen kann die Mutanten unterdrücken, die Kompensation erfolgte wie z. B. bei Bacillus cereus/Fusidinsäure dann mittels höherer Plattenzahl.
  • Die zwischen den „normal großen" Resistenz-Kolonien aufgetretenen dwarf-like Mutanten werden mittels Verdünnungs-Impfstrich auf dem jeweiligen Antibiotika-Medium isoliert. Etwa 50% dieser Klone wachsen jetzt als „normal große" Kolonien und werden verworfen. Die verbleibenden Klone werden nochmals auf Selektivmedium und viermal auf NA bzw. RCA passagiert. Die überwiegende Mehrzahl dieser Stwd-Mutanten erweist sich auch bei weiteren Passagen als stabil kleiner wachsende Kolonien. Diese werden nunmehr grob orientierend hinsichtlich der Größendifferenzen zum Wildstamm (= 100) unterteilt: Groß (G) ≈75, Mittel (M) ≈50, Klein (K) ≈25, Z (Zwerg) ≤ 10. Eventuell erst nach 48 Stunden (Aufbewahrung unter Zimmertemperatur) auftretende und nur mit der Lupe deutlich erkennbare Kolonien werden als Mini (MI) klassifiziert.
  • 3. Beispiel 2
  • Isolierung von Sm-d Mutanten als Ausgangsstämme zur Isolierung von Sm-id Doppelmarker-Mutanten
  • Die Überimpfung aller Sm-resistenten Kolonien (nach ein- bis zweimaligen Sm-Medium-Passagen) parallel auf Sm-NA und NA zeigt bei Salmonellen Ausbeuten von 1 Sm-d-Klon auf etwa 1000 Sm-r-Kolonien (Blatz, R. und Knoll, E. Prom. A, Medizinische Fakultät der Universität Leipzig, 1974). Das gleiche Verfahren ergab bei den von uns bearbeiteten E. coli und Staphylokokken ebenfalls nur 1 Sm-d-Stamm auf ≥ 500 Sm-r-Mutanten.
  • Bei einer unter Zeitlimit stehenden Bearbeitung ist dieses Vorgehen wenig relevant. Überraschenderweise erwiesen sich etwa ein Drittel der K- und MI-Klone (neben den gesuchten Stwd-Mutanten) als Sm-d Stämme, welche nach weiteren Sm-NA-Passagen analog zu den klassisch isolierten Sm-d-Mutanten etwa 75% der Wildstammgröße erreichten. Bei Bacillus cereus wuchsen auf Sm-Selektionsmedium nur wenige Kolonien, etwa ein Drittel erwiesen sich als Sm-d-Mutanten.
  • Anmerkung: Unsere Sm-d Mutanten zeigen beginnendes Wachstum erst bei 50 μg Sm/ml, das Optimum liegt bei 400/800 μg Sm/ml. Laut Literatur (Plunkett, G.E. Gen. Microbiol. 1965, 38, 189–195) variiert bei Zugabe diverser Salze die Wachstumsförderung/Wachstumshemmung durch Sm von bis zu extrem niedrigen bis zu extrem hohen Werten. Ob durch Salzsubstituierung eine Optimierung der Sm-d-Isolierung möglich ist, war für uns ohne Relevanz.
  • 4. Beispiel 3
  • Isolierung der Sm-id Stämme von Sm-d Mutanten
  • Das Material einer 24h/37°C-Petrischalen-Kultur (NA mit 400 μg Sm/ml) wird auf NA-Platten gespatelt. Als zweite vereinfachte Variante wird mittels Impföse oder Glasstab eine Materialmenge von Hirse- bis Linsengröße je Petrischale mit NA homogen ausgebreitet. Die nach 24h bis 48h/37°C-Bebrütung auftretenden Kolonien werden auf NA passagiert und nach der dritten Passage dann die Koloniegrößen/Attenuierungsgrade – wie in Beispiel 1 beschrieben – ermittelt. Mutanten mit den Größen G bis M werden als Ausgangsstämme für den Einbau eines dritten und vierten Stwd-Marker verwendet.
  • 5. Beispiel 4
  • Unterteilung der Sm-id Mutanten hinsichtlich ihrer Sm-Resistenz zwecks Auswahl von Klonen, deren MIC-Werte gegenüber dem Wildstamm nur um etwa den Faktor 2 erhöht sind, und die sich für den Einbau einer zusätzlichen Sm-Stwd-Mutation eignen
  • In Übereinstimmung mit der Literatur (Blatz, R. und Knoll, E. Prom A Medizinische Fakultät der Universität Leipzig, 1974) zeigen etwa zwei Drittel der Sm-id Mutanten diese nur moderate Sm-Resistenz. Von solchen Sm-id Mutanten mit MIC-Werten ≤ 25 μg Sm/ml lassen sich überraschenderweise erneut auf Selektionsplatten mit 400 μg Sm/ml Sm-Stwd-Klone isolieren, wodurch Mutanten mit drei Ribosomen-Mutationen entstehen. Diese Sm-id Mutanten mit weitgehend restaurierter Sm-Sensibilität erweisen sich dann als vorteilhaft für eine weiterführende Mehrmarker-Attenuierung, welche sogar den (allerdings akademischen) Einbau von fünf unabhängig voneinander attenuierenden Stwd-Mutationen ermöglichen würde.
  • 6. Beispiel 5
  • Isolierung von (Zwei-), Drei- und Viermarker Stwd-Mutanten mit abgestuften Koloniegrößen/Attenuierungen
  • Ausgehend von Stwd-Klonen, die sich als Ein-, Zwei- (insbesondere Sm-id) oder Dreimarker-Mutanten hinsichtlich der Koloniegrößen eben noch eindeutig vom Wildstamm bzw. von der jeweiligen Stwd-Ausgangsmutante abgrenzen lassen, wird sinngemäß wie unter Beispiel 1 beschrieben, der zusätzliche Rif-, Fus-, Pho- bzw. Sm-Stwd-Marker eingebaut. Die Reihenfolge des zusätzlichen Stwd-Marker-Einbaues ist beliebig.
  • Bei potentiellen Impfstämmen mit drei (bzw. vier) unabhängig voneinander attenuierenden Markern können Erörterungen zur Stabilität unter Feldbedingungen entfallen.
  • 7. Beispiel 6
  • Isolierung von Clostridium perfringens-Zweimarker-Mutanten mit abgestuften Koloniegrößen/Attenuierungen
  • Infolge der absoluten Sm-Resistenz der anaeroben Toxinbildner wurden nur Rif-, Fus- und Pho-Stwd-Attenuierungsmarker getestet. Der Einbau der Rif-, Fus- und Pho-Stwd-Marker erfolgt wie in den Beispielen 1 und 5 aufgeführt. Bei Einsatz solcher Doppelmarker-Stämme, z. B. als orale Applikation bei Hochleistungskühen zwecks Stimulierung einer antitoxischen Grundimmunität, dürfte bereits die Zweimarker-Attenuierung eine hinreichende Stabilität vermitteln (zumal die Wildstämme ubiquitär im Boden vorkommen).
  • 8. Beispiel 7
  • Abtrennung der Impfstämme von Wildstämmen
  • Die Abtrennung erfolgt über die jeweiligen Sm-, Rif-, Fus- und/oder Pho-Resistenzmarker.
  • Anmerkung: Hierbei ist jedoch zu beachten, dass in Einzelfällen bei den Drei- und Viermarkern Dwarf-Stämme die Resistenzwerte sich etwa um den Faktor 2 reduzieren können. Sinngemäß erfolgt eine geringgradige Resistenzreduktion auch bei Clostridium perfringens. Für eine Abtrennung von den Wildstämmen ist dies ohne Relevanz.
  • 9. Beispiel 8
  • Massenkultur, Präparation und Anwendung der Impfstämme
  • Zur Herstellung der Lebendimpfstoffe werden die Zweimarker(Clostridien)-, Dreimarker- und Viermarker-Impfstämme in einem geeigneten, an sich bekannten Vollmedium als Flüssigkultur bis zum Ende der logarithmischen Phase gezüchtet. Die Bakteriensuspensionen werden mit einem üblichen Stabilisator versetzt und lyophilisiert. Die so erhaltenen Impfstoffe werden entsprechend dem Indikationsgebiet ein- bis zweimal parenteral mit Keimzahlen um 107 Kolonie-bildende Einheiten (KBE) (oral ein bis zwei log.- Stufen höher) verabreicht.
  • Anmerkung: Wahlweise ist die Primärimpfung mit einem hochattenuierten, die Boosterung mit einem moderat attenuierten Impfstamm zu erwägen.
  • ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Claims (11)

  1. Impfstämme mit abgestuften Koloniegrößen/Attenuierungen, gekennzeichnet dadurch, dass die Impfstämme wenigstens zwei jedoch als Optimum drei und/oder vier unabhängig voneinander attenuierende Stoffwechseldrift-Mutationen aufweisen, wobei es sich um attenuierende Resistenzmutationen vorzugsweise gegen Antibiotika und/oder toxische Substanzen handelt.
  2. Impfstämme nach Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, dass die Koloniegrößen-reduzierenden/attenuierenden Stoffwechseldrift-Mutationen – als spontane Antibiotika-Resistenzen, z. B. als Ribosomen-(Streptomycin), RNA-Polymerase-(Rifampicin), Elongationsfaktor G-(Fusidinsäure) und/oder Zellwand-(Fosfomycin) Mutationen – in beliebiger Kombination und Reihenfolge verwendet werden.
  3. Impfstämme nach Anspruch 1 und 2, gekennzeichnet dadurch, dass die universelle Anwendbarkeit für alle Bakterien am Beispiel von E. coli, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus und Clostridium perfringens belegt und weiterhin durch bereits an sich bekannte Impfstämme von Salmonellen, Shigellen und Listerien gezeigt wird.
  4. Impfstämme nach Anspruch 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, dass die Impfstämme zur Herstellung von Impfstoffen zur parenteralen und/oder oralen Anwendung bei Menschen und Nutztieren eingesetzt werden.
  5. Verfahren zur Isolierung von Impfstämmen mit abgestuften Koloniegrößen/Attenuierungen, gekennzeichnet dadurch, dass man Resistenzmutanten, beispielsweise von Streptomycin, Rifampicin, Fusidinsäure und/oder Fosfomycin, herstellt, unter denen reproduzierbar mit Promille- bis Prozenthäufigkeiten Klone mit abgestuften Koloniegrößen und somit verlängerten Generationszeiten (GT als Attenuierungsäquivalent) vorkommen und diese Klone/Stämme als Mehrmarker-Impfstämme zur Impfstoffherstellung benutzt.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, dass man von Wildstämmen im ersten Schritt Stwd-Klone mit geringer Koloniegrößenreduktion (Attenuierungsgrad) isoliert und dann schrittweise in die Stwd-Ausgangsmutante(n) eine zweite, dritte, eventuell vierte (akademisch auch fünfte) Stwd-Mutation einbaut, welche jeweils geringgradig (zur Vermeidung einer Überattenuierung) die Koloniegrößen stufenweise reduziert/den Attenuierungsgrad schrittweise erhöht, so dass Impfstämme mit unter Praxisbedingungen absoluter Stabilität und einer der Wirtsempfänglichkeit angepassten Attenuierung entstehen.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 und 6, gekennzeichnet dadurch, dass man von Streptomycin(Sm)sensiblen Bakterien Sm-dependente (Sm-d) Mutanten herstellt, von diesen Sm-independente (Sm-id) Revertanten isoliert und aus dem hierbei anfallenden Klonspektrum mit abgestuften Koloniegrößen/Attenuierungsgraden gewünscht attenuierte Doppelmarker(Impf)Stämme auswählt und diese für den Einbau weiterer Stwd-Mutationen verwendet.
  8. Verfahren nach Anspruch 5 bis 7, gekennzeichnet dadurch, dass man in Sm-id-Stämme mit weitgehend restaurierter Sm-Sensibilität vorteilhaft erneut eine Sm-Stwd-Mutation sowie weitere Stwd-Mutationen einbaut.
  9. Verfahren nach Anspruch 5 bis 8, gekennzeichnet dadurch, dass man in Aminoglykosid(und Chinolon)-resistente Anaerobier vorteilhaft mittels z. B. Rifampicin-, Fusidinsäure- und Fosfomycin-Stwd-Mutationen die Doppel- und gegebenenfalls Dreimarkerattenuierung realisiert.
  10. Verwendung der Impfstämme gemäß Anspruch 1 bis 4 zur Herstellung von Lebendvakzinen gegen alle bakteriellen Seuchen und Krankheitserreger.
  11. Verwendung der Impfstämme gemäß Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, dass die Impfstämme mit Stwd-Attenuierung für neue Anwendungsgebiete (Prophylaxe, Therapie, Reservoirsanierung) eingesetzt werden, wie z. B. – Lebendvakzinen gegen Reisediarrhoe – Austausch von inaktivierten Patienten-/stallspezifischen Vakzinen gegen attenuierte Erreger – orale Gabe von „attenuierten" Clostridien an Hochleistungsnutztiere zwecks Stimulierung einer antitoxischen Grundimmunität – Unterbrechung der Infektionsketten zwischen Tieren und von Tieren zu Menschen durch Einsatz z. B. attenuierter Salmonellen, Campylobacter (wie bereits mit Salmonella-typhimurium- und Salmonella-enteritidis-Impfstoffen bei Hühnern erprobt wurde)
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