DE60226175T2

DE60226175T2 - Mycobakterieller impfstoff

Info

Publication number: DE60226175T2
Application number: DE60226175T
Authority: DE
Inventors: Craig D. Pacific Grove WRIGHT; Joan Fort Myers Beach BRISKER; Mark A. London CHAMBERS
Original assignee: Novavax Inc
Current assignee: Novavax Inc
Priority date: 2001-11-14
Filing date: 2002-11-13
Publication date: 2009-07-09
Anticipated expiration: 2022-11-14
Also published as: ATE392216T1; US7393541B2; WO2003051288A2; EP1467771A4; US20050118201A1; AU2002364952B2; CA2467271A1; EP1467771A2; CN1612753A; EP1467771B1; DE60226175D1; AU2002364952A1; KR20040081423A; JP2005538923A; WO2003051288A3

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Gattung der Mykobakterien ist weltweit für mehr Leiden verantwortlich als alle anderen Gattungen an Bakterien zusammen. Mykobakterien sind in zwei große Gruppen klassifiziert. Die erste Gruppe, der Komplex M. Tuberculosis umfasst ein M. Tuberculosis, ein M. Bovis, ein M. Microtti und ein M. Africanus. Die zweite Gruppe umfasst alle anderen Arten und werden als nichttuberkulose Mykobakterien (NTM) oder als andere Mykobakterien als die Tuberkelbazillen (MOTT) bezeichnet, die unter anderem ein M. Kansasii, ein M. Marinum, ein M. Simalae, ein M. Scrofulaceum, ein M. Szulgai, ein M. Gordonae, ein M. Avium, ein M. Intracellulare, ein M. Ulcerans, ein M. Fortuitum, ein M. Chelonae, ein M. Xenopi und ein M. Malmoense. Zur Zeit sind über 60 Arten an Mykobakterien bestimmt worden. Von allen kultivierbaren Mykobakterien ist nur das M. Tuberculosis ein obligates Pathogen.
Die Tuberkulose (TB), die durch eine Infektion mit dem M. Tuberculosis oder dem M. Bovis verursacht wird, bleibt eine der bedeutendsten Krankheiten von Menschen und Tieren (1 bis 3) und sie fährt fort, der Gesellschaft hohe Kosten hinsichtlich der Gesundheit von Menschen und Tieren und der finanziellen Ressourcen aufzuerlegen (4 bis 7). Der einzige Impfstoff, der zur Zeit zur Vermeidung von TB verfügbar ist, ist ein lebender abgeschwächter Impfstoff, Bacille Calmette-Guerin (BOG), der von dem Mycobacterium Bovis gewonnen wird. Das BOG weist viele der Eigenschaften eines idealen Impfstoffes auf: es ist preiswert herzustellen und zu verabreichen, es ist sicher und es hat sich unter vielen Umständen als wirksam erwiesen, insbesondere gegen eine schwere und tödliche Tuberkulose bei Kindern (8).
Allerdings hat sich bei einer Anzahl an klinischen Versuchen gezeigt, dass das BOG eine sich verändernde Wirksamkeit aufweist. Bei den Versuchen des Medical Research Council in dem Vereinigten Königreich gewährte das BOG einen Schutz von 77% (9), wohingegen es an dem anderen Ende des Spektrums bei dem größten klinischen Versuch in Indien eine Schutzwirksamkeit von Null (10) aufwies. Obwohl das BOG im Allgemeinen einen ungenügenden Schutz gegenüber eine die Lunge betreffende Tuberkulose bei Erwachsen bietet, bleibt es der „Goldstandard" gegenüber dem die Kandidaten der TB-Impfstoffe mit verbesserter Wirksamkeit zu messen sind. Mit der Ankunft der Pandemie von HIV/AIDS sind Sorgen über die Sicherheit von dem BOG erhoben worden. Da das BOG in Situationen von beeinträchtigter oder unzureichender Immunität (11) sich pathogen zeigen kann, kann eine Impfung mit dem BOG gerade für die Personen eine Kontraindikation darstellen, die das größte Risiko aufweisen, an der Tuberkulose zu erkranken.
Die Probleme, die den Mangel an allgemeiner Wirksamkeit und Sicherheit von dem BOG betreffen, haben zu erhöhten Anstrengungen geführt, um eine neue Generation an Impfstoffen für die Tuberkulose zu entwickeln. Eine Herangehensweise, die verfolgt worden ist, betrifft die Erzeugung von Impfstoffen mit Untereinheiten, die eine Inokulation von mykobakteriellen Nukleinsäuren, von Proteinen oder von Peptiden in einem Adjuvans erfordert. Während individuelle Proteine nur eine geringfügige Wirksamkeit aufweisen, wirken Mischungen von Proteinen sehr viel besser (12), was darauf hindeutet, dass für einen vollständigen Schutz eine Immunität an zahlreichen Antigenen erforderlich ist (13). Dies wird durch die Beobachtung unterstützt, dass eine DNA-Impfung mit vielen Antigenen einen zusätzlichen Effekt auf die Schutzwirkung hat. Eine weitere Herangehensweise hat Werkzeuge der Molekulargenetik verwendet, um Mutanten der Mitglieder des TB-Komplexes zu erzeugen, die abgeschwächt worden sind und die avirulent in einem Wirtskörper mit beeinträchtigter Immunität sind (14). Z. B. ergibt die Zerstörung der Gene, die die Biosynthese von Aminosäuren und Purin betreffen, auxotrophe Mutanten von dem BOG, die unfähig sind, in Mäusen von sowohl normaler Immunität (15, 16) als auch stark beeinträchtigter Immunität (17) bestehen zu bleiben. Allerdings sind diese Mutanten dazu fähig, lange genug bestehen zu bleiben, um metabolische Antigene zu exprimieren und einen Grad an schützender Immunität zu erzeugen. Es ist vorgeschlagen worden, dass diese Mutanten verwendet werden könnten, um die Personen zu impfen, die das Risiko aufweisen, eine beeinträchtigte oder eine unzureichende Immunität zu entwickeln (17), obwohl die Sorgen hinsichtlich einer Verwendung von genetisch modifizierten Lebendimpfstoffen bei sowohl Menschen als auch bei Vieh bestehen bleiben (14, 18).
Die Impfstoffe, die auf den Aufbereitungen von abgetöteten ganzen Zellen von Mykobakterien beruhen, haben herkömmlicherweise nur zu einem geringfügigen bis zu keinem spezifischen Schutz gegenüber nachfolgenden Auseinandersetzungen mit virulenten Mykobakterien beigetragen (19 bis 22), vermutlich weil die wichtigen schützenden Antigene nur exprimiert werden, wenn die Bakterien metabolisch aktiv sind (21, 23, 24). Dazu gibt es Ausnahmen (25, 26) und es ist vorgeschlagen worden, dass hinsichtlich des Erzeugens einer schützenden Immunität die bestimmten Antigene, die vorgelegt werden, weniger wichtig sein könnten, als die Art und Weise, mit der sie vorgelegt werden (27, 28). Die Mehrzahl der Studien mit den Aufbereitungen von abgetöteten Mykobakterien hat Hitze als das Verfahren der Abtötung verwendet. Allerdings kann diese Behandlung wichtige Antigene wesentlich denaturieren und zu den enttäuschenden Ergebnissen beitragen, die im Allgemeinen mit diesen Impfstoffen zu beobachten sind (29). Eine Alternative zur Inaktivierung durch Hitze ist die Behandlung mit einem Formalin. Eine Inaktivierung mit einem Formalin wurde zuerst in den zwanziger Jahren des zwanzigsten Jahrhunderts verwendet, um das Toxin der Diphterie zu entgiften, das aus Kulturen von dem Corynebacterium Diphtheriae isoliert worden ist (30, 31). Dieses Verfahren wird noch für die Herstellung des Impfstoffes (32) verwendet. Die Behandlung mit dem Formalin der gesamten Mykobakterien weist den Vorteil auf, dass der Organismus abgetötet wird, während die antigene Integrität von vielen der vorliegenden Proteine erhalten bleibt (33).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen Adjuvans-Impfstoff bereit, um eine in vivo, über T-Zellen vermittelte Immunantwort auf ein Mykobakterium bei einem Säugetier zu erzeugen, wobei der Impfstoff eine wirksame Menge eines mit Formalin inaktivierten Mykobakteriums und ein Adjuvans enthält, wobei das Adjuvans Öl enthaltende nicht phospholide paucilamellare Lipidvesikel umfasst, die ungefähr 2 bis 8 periphere Doppelschichten einschließlich eines oberflächenaktiven Mittels enthalten, das einen großen unstrukturierten zentralen Hohlraum umgibt, wobei er weiterhin mindestens eins von einem Monophosphoryl Lipid A (MPL) oder einem Batylalkohol aufweist. Es ist herausgefunden worden, dass die mit dem Formalin inaktivierten Aufbereitungen von Mykobakterien, z. B. dem M. Bovis, die mit einer Auswahl von nicht phosphoslipiden, liposomen Adjuvanten (Novasomes^®) gemischt worden sind, zu einem Schutz vor einer tödlichen über die Luft übertragenen Auseinandersetzung mit dem M. Bovis beitragen, wenn sie den Meerschweinchen mit einer subkutanen Inokulation verabreicht worden sind. Es sind Zusammensetzung und Verfahren offenbart worden, die mit dem Formalin inaktivierte Kulturen von Mykobakterien umfassen, z. B. Mykobakterien von dem Komplex M. Tuberculosis oder Mykobakterien von dem Komplex NTM und einem Novasome^® Adjuvans. Die Novasome^® Adjuvanten, wie sie hier definiert sind, sind paucilamellare Liposome, die Nicht-Phospholide, Sterine, Öle und Puffer enthalten und die in dem amerikanischen Patent mit der Nummer 5,474,848 als paucilamellare Lipidvesikel beschrieben sind, die ungefähr 2 bis 8 periphere Doppelschichten einschließlich eines oberflächenaktiven Mittels enthalten, das einen großen unstrukturierten zentralen Hohlraum umgibt. Bei einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist das Novasome^® Adjuvans NAX M687.
Wie in den Studien gezeigt ist, die hier beschrieben worden sind, können die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, um gegen die Infektionen, die durch die Mykobakterien verursacht werden, wie z. B. die Tuberkulose, zu schützen.
Es ist ein Verfahren zur Erhöhung der Immunität eines Versuchsobjektes gegenüber Mykobakterien oder zur Impfung eines Versuchsobjektes gegen Mykobakterien, wie z. B. dem M. Bovis offenbart, indem dem Versuchsobjekt eine Zusammensetzung verabreicht wird, die mit einem Formalin inaktivierte Kulturen von Mykobakterien und ein Novasome^® Adjuvans umfasst.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können dem Versuchsobjekt über jeden geeigneten Verabreichungsweg verabreicht werden. Üblicherweise werden die Zusammensetzungen mittels Injektion mit einem Therapieschema von geeigneter Menge und Dosierung verabreicht, um die therapeutische Wirkung zu erzielen.
Weitere Eigenschaften und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind aus der folgenden detailierten Beschreibung und den Ansprüchen ersichtlich.
Detailierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt einen Adjuvans-Impfstoff bereit, um eine in vivo, über T-Zellen vermittelte Immunantwort auf ein Mykobakterium bei einem Säugetier zu erzeugen, wobei der Impfstoff eine wirksame Menge eines mit einem Formalin inaktivierten Mykobakteriums und ein Adjuvans enthält, wobei das Adjuvans Öl enthaltende nicht-phospholide paucilamellare Lipidvesikel umfasst, die ungefähr 2 bis 8 periphere Doppelschichten einschließlich eines oberflächenaktiven Mittels enthalten, das einen großen unstrukturierten zentralen Hohlraum umgibt, wobei er weiterhin mindestens eins von einem Monophosphoryl Lipid A (MPL) oder einem Batylalkohol aufweist. Die mit dem Formalin inaktivierten Mykobakterien umfassen sowohl Mykobakterien von dem Komplex M. Tuberculosis als auch Mykobakterien von dem Komplex der nicht tuperkulosen Mykobakterien (NTM). Beispiele der Mykobakterien von dem Komplex M. Tuberculosis umfassen ein M. Tuberculosis, ein M. Bovis, ein M. Microtti, ein M. Africans und ein Bacille Calmette-Guerin (BOG). Beispiele der Mykobakterien von dem Komplex NTM umfassen unter anderem ein M. Kansasii, ein M. Marinum, ein M. Similae, ein M. Scrofulaceum, ein M. Szulgai, ein M. Gordonae, ein M. Avium, ein M. Intracellulare, ein M. Ucerans, ein M. Fortuitum, ein M. Chelonae, ein M. Xenopi und ein M. Malnaoense.
Wie in den hier beschriebenen Studien gezeigt worden ist, haben sich die mit dem Formalin inaktivierten Kulturen als vollständig nicht lebensfähig erwiesen, wie durch eine Kultur auf einem Wachstumsmedium und eine Inokulation in schwerwiegend kombiniert immungeschwächten Mäuse bestimmt worden ist. Die mit dem Formalin inaktivierten Aufbereitungen wurden mit einem Bereich von Novasome^® Adjuvanten (paucilamellare Liposomen, die Nicht-Phospholide, Sterine, die und Puffer aufweisen) gemischt und sie wurden Meerschweinchen verabreicht. Die Aufbereitungen riefen keine nachteiligen Reaktionen in den Tieren hervor. Vielmehr wurde eine Anzahl der behandelten Meerschweinchen vor einer Auseinandersetzung mit einer geringen Dosis von dem lebensfähigen M. Bovis geschützt. In einigen Fällen war das Niveau des Schutzes gleich dem, das durch den Goldstandard-Impfstoff des lebenden BOG Pasteur erreicht wird.
Die Impfstoffe, die auf den Aufbereitungen von abgetöteten ganzen Zellen von Mykobakterien beruhen, weisen Vorteile hinsichtlich ihrer Sicherheit und der Tatsache auf, dass sie eine komplexe Mischung der Antigene von Proteinen und Nicht-Proteinen darstellen. Weiterhin ist die Immunantwort auf die Impfstoffe aus den abgetöteten Mykobakterien weniger durch die Genetik des Wirtskörpers als bei dem lebenden BOG begrenzt (26). Allerdings haben diese Impfstoffe aufgrund der zahlreichen Studien, die über deren Unvermögen berichten, zu einer schützenden Immunität beizutragen (19 bis 22), keine breite Anwendung gefunden. Bei den Studien, bei denen sich diese Impfstoffe als wirksam erwiesen hatten, musste ein Öl-Adjuvans verwendet werden oder musste der Impfstoff in mehreren Dosierungen über ungeeignete Wege (z. B. in die freie Bauchhöhle) verabreicht werden, um einen Schutz zu erzielen (27, 38 bis 40). Wenn sie intrakutan verabreicht werden, versagen diese Impfstoffe (41) darin, einen Schutz zu erreichen.
Das vorliegende Verfahren verwendet eine sanfte Fixierung mit dem Formalin, um die Antigenität der Aufbereitungen aufrecht zu erhalten, die mit der Verwendung einer neuen Generation von nicht phosphoslipiden, liposomen Adjuvanten (Novasome^®) verbunden ist, bei der vorher gezeigt worden ist, dass sie eine Th1-Antwort anregen (42, 43). Wie in den nachfolgend beschriebenen Studien gezeigt worden ist, stellen diese Rezepturen einen Schutz gegenüber einer über die Luft übertragenen Auseinandersetzung mit Mykobakterien in Meerschweinchen bereit, der gleich dem ist, der mit dem lebenden BOG erreicht wird. Dieser Schutz kann mit einer einzelnen Dosierung des Impfstoffes erreicht werden, der z. B. subkutan verabreicht wird. Wie für das M. Tuberculosis (21) berichtet worden ist, verleihen abgetötete BOG Impfstoffe ohne einen Adjuvans keinen Schutz bei Auseinandersetzungen mit dem M. Bovis. Allerdings verleiht das mit dem Formalin inaktivierte M. Bovis in der Abwesenheit von einem Adjuvans der Lunge einen Schutz, was zeigt, dass dem BOG die vollständige Bandbreite der der Zelle zugeordneten schützenden Antigene fehlt, die potentiell von dem M. Bovis exprimiert werden.
Bei einem bestimmten Ausführungsbeispiel sind die Novasome^® Liposome ausgestaltet, netto eine negative Ladung aufzuweisen. Negativ geladene Liposome werden schneller aus dem Blutkreislauf entfernt, schneller in der Leber, in der Milz und in dem Knochenmark lokalisiert und werden in wirksamerer Weise in den Lungen als neutrale oder positiv geladenen Liposomen (44) gefangen.
Das am wenigsten wirksame Adjuvans war NAX 57, das einzige Novasome^® Adjuvans, das nicht ein MPL (Monophosphoryl Lipid A) aufweist. Das MPL hat schon gezeigt, dass es Eigenschaften eines Adjuvans bei einer Vielzahl von mykobakteriellen Impfstoffen/von Modellen der Auseinandersetzung aufweist, und das Lipid A aktiviert in dem Kontext von Liposomen die Makrophagen für eine Antigendarstellung (48, 49). Die beste Kombination Impfstoff/Adjuvans war ein mit dem Formalin inaktiviertes M. Bovis mit NAX M687. Dies verlieh einen Schutz gegen Tod und Wachstum von dem M. Bovis in den Lungen und in der MHz, der statistisch gleich dem sowohl des lebenden BOG Pasteur als auch des BOG Tokyo ist. NAX M687 enthält sowohl MPL als auch Batylalkohol, wobei der letztere auch Eigenschaften der Aktivierung von Makrophagen aufweist (50). Die Eigenschaften eines Adjuvans von Novasome^®, insbesondere von NAX M687, sind teilweise in ihrer Neigung zu dem anvisierten Lymphgewebe und zu den Lungen begründet, um auch die Makrophagen zu aktivieren. Alle Novasome^® sind biologisch durch die oxidativen metabolischen Prozesse abbaubar, die in den Makrophagen vorliegen (51), obwohl die Fusogenizität der Liposomen beeinflusst, wo deren Nutzlast an der subzellulären Ebene zugeführt wird. Die fusogenen Liposomen sind ausgestaltet, ihre Nutzlast unmittelbar dem Zellplasma zuzuführen, wodurch die Antigene für die Darstellung durch MHC Klasse I Moleküle an die CD8⁺ T-Zellen (52, 53) verfügbar gemacht werden. Wohingegen die nicht fusogenen Liposomen in den endosomalen Weg gelangen, bei dem deren antigene Nutzlast für die Darstellung durch die MHC Klasse II Moleküle an die CD4⁺ T-Zellen (52, 53) degradiert werden. NAX M687 ist das einzige nicht fusogene Novasome^®, das hier beschrieben ist.
Übereinstimmend mit der berichteten Fähigkeit von dem lebenden BOG, gegen eine disseminierte Tuberkulose zu schützen (54, 55), geben einige der Impfstoffe von dem mit dem Formalin inaktivierten BOG einen wesentlichen Schutz für die Milz, obwohl alle bei dem Schutz der Lunge versagen. Das mit dem Formalin inaktivierte M. Bovis mit NAX M687 war der einzige abgetötete Impfstoff, der sowohl die Lunge als auch die Milz vor einer bakteriellen Replikation schützte. Dies liegt teilweise in der Tatsache begründet, dass die verschiedenen der Zellwand zugeordneten Antigene für das gewebespezifische Wachstum und für die Ausbreitung des Komplexes der TB Mykobakterien verantwortlich sind: das Lipid Phthiocerol-Dimycocerosat (PDIM) ist für das Wachstum in der Lunge, aber nicht in der Milz oder in der Leber verantwortlich (56), und das Herapin bindende Haemagglutinin- Adhesin (HBHA) ist erforderlich für eine Ausbreitung außerhalb der Lungen (57). Da das PDIM und das HBHA der mykobakteriellen Zellwand zugeordnet sind, bestimmt eine Immunantwort, die auf diese Moleküle (oder auf andere, die diesen ähnlich sind) gerichtet ist, ob ein Schutz in der Lunge oder in der Milz oder in beiden exprimiert wird. In der Tat vermindert eine Beschichtung von BOG mit Anti-HBHA Antikörpern eine Ausbreitung der Bakterien nach einer intranasalen Infektion (57).
Ungeachtet dessen, ob ein lebender oder ein mit Formalin inaktivierter Stamm vorliegt, wurde kein Unterschied in der Wirksamkeit der beiden BOG Stämme gegen eine Auseinandersetzung mit dem M. Bovis gefunden. Dies steht in einem Gegensatz zu den vorhergehenden Studien, die an Menschen und Mäusen durchgeführt worden sind, bei denen das BOG Pasteur ein höheres Schutzniveau als das BOG Tokyo gegenüber dem M. Tuberculosis (58, 59) verlieh. Das BOG Pasteur und das BOG Tokyo exprimieren verschiedene Mengen des der Zellwand zugeordneten Antigens MPB83 (60). Obwohl dieses Antigen bei einer natürlichen Infektion mit dem M. Bovis immunodominant ist (61, 62) und es ein schützendes Antigen bei Mäusen (63) ist, zeigen die hier beschriebenen Ergebnisse, dass es nicht das dominante schützende Antigen der BOG Impfstoffe ist.
Die Impfstoffrezepturen der vorliegenden Erfindung sind preiswert und sicher herzustellen (wenigstens im Vergleich zu den BOG Rezepturen) und sie weisen keine Reaktogenizität bei natürlichen Meerschweinchen auf.
Die vorliegende Erfindung wird ferner durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, die nicht als begrenzend aufgefasst werden sollen.
Beispiele
Materialien und Verfahren
Bakterienstämme und Behandlung mit Formalin: die Stämme BOG und Tokyo wurden von dem Statens Serum Institut, Kobenhagen in Dänemark erhalten. Der Stamm von dem M. Bovis, der in dieser Studie (2122/97) verwendet worden ist, wurde aus einer Bioreaktorkuh einer Tuberkulinprüfung 1997 isoliert und bei VLA Weybridge vermehrt. Vier Wochen alte Kulturen von allen Stämme, die in einer M-ADC-TW Brühe gewachsen sind (34), der 0,2% (v/v) Glyzerin (BOG) oder 4,16 mg/ml Natriumpyruvat (M. Bovis) zugefügt worden ist, sind durch Zentrifugieren geerntet worden. Die bakteriellen Zellen sind in 1,5% (v/v) Formalin in PBS auf eine Konzentration von 0,25 g Nassgewicht der bakteriellen Zellen pro ml resuspendiert worden. Die Kulturen wurden bei 4°C für 96 Stunden gerührt und dann durch Zentrifugieren bei 4°C geerntet. Die mit dem Formalin behandelten Zellen wurden einmal mit dem PBS gewaschen und dann bei 4°C bis zum Gebrauch gelagert.
Bestätigung der Inaktivierung mit Formalin: eine Teilprobe von jeder Präparation der mit Formalin behandelten Zellen, die ungefähr 2,5 × 10⁷ CFU darstellen, wurden auf einem Agar der Art Middlebrook 7H 10 mit 10% (v/v) einer OADC-Anreicherung der Art Middlebrook aufgebracht und für sechs Wochen bebrütet. Eine weitere Teilprobe von identischer Größe wurde bei drei Gruppen von beigefarbenen Mäusen (die von CAMR erhalten wurden) mit einem schweren kombinierten Immundefekt (SCID) subkutan in den Nacken injiziert. Die Mäuse wurden auf klinische Zeichen der Krankheit über 12 Wochen überwacht, wobei sie zu dem Zeitpunkt abgetötet wurden und auf das Vorliegen von Läsionen der Tuberkel in den inneren Organen untersucht worden sind.
Rezeptur mit Adjuvanten: eine Aufbereitung von mit Formalin behandelten Zellen wurde jeweils mit den folgenden negativ geladenen Novasome^® (nicht phospholide Liposome) Adjuvanten gemischt: NAX 57 (fusogen, aus einem Polyoxyethylen-2-Cetyl-Ether hergestellt, z. B. Brij 56), NAX M57 (fusogen, aus einem Polyoxyethylen-2-Cetyl-Ether mit einem Monophosphoryl Lipid A hergestellt (MPL)), NAX M77 (fusogen, aus einem Polyoxyethylen-2-Stearylether, z. B. Brij 71, plus MPL hergestellt), NAX M687 (nicht fusogen, aus einem Glyzerolmonostearat und einem Batylalkohol plus MPL hergestellt). Die Zellen wurden in dem Adjuvans mittels einer Tuberkulinspritze mit einer Kanüle Nr. 18 resuspendiert und dann vollständig homogenisiert, indem die Suspension zwischen zwei Tuberkulinspritzen vierzig Mal hin und her bewegt worden ist. Eine Kontrollaufbereitung von jedem Mykobakterium ist auf dieselbe Weise hergestellt worden, wobei allerdings anstelle des Adjuvans steriles Wasser verwendet worden ist.
Impfung und Aussetzung der Meerschweinchen: weibliche Meerscheinchen (Dunkin-Hartley), die zwischen 350 g bis 350 g wogen und die frei von interkurrenten Infektionen waren, wurden von Charles River UK Ltd., Margate, UK erhalten. Gruppen von sechs Meerschweinchen wurden mit 100 μl von jedem mit dem Formalin behandelten Impfstoff/jeder Rezeptur mit einem Adjuvans subkutan in den Nacken immunisiert und weitere sechs wurden mit einer lebenden Suspension von 5 × 10⁴ CFU BOG Tokyo behandelt. Zwei weitere Kontrollgruppen wurden mit 5 × 10⁴ CFU lebendes BOG Pasteur oder dem PBS alleine geimpft. Fünf Wochen nach der Impfung wurden alle Meerschweinchen einer durch die Luft übertragenen lebenden Suspension von dem M. Bovis 2122/97 ausgesetzt, um eine eingeatmete zurückgehaltene Dosierung in den Lungen von ungefähr zehn Organismen zu erreichen (35). Zwei zusätzliche Meerscheinchen wurden mit der mit dem Formalin behandelten Wasseraufbereitung geimpft, aber sie wurden den Krankheitserregern nicht ausgesetzt, um die Sterilität des Impfstoffes zu bestätigen.
Obduktionsuntersuchung der Meerschweinchen: die Tiere wurden durch eine peritoneale Überdosis an Natriumpentobarbiton zehn Wochen nachdem sie den Krankheitserregen ausgesetzt worden waren abgetötet oder wenn ein Einzeltier 20% seines maximalen Körpergewichtes (der menschliche Endpunkt) verloren hatte, je nachdem was früher eintrat. Die Untersuchungen wurden unmittelbar nach dem Tode durchgeführt. Einer äußeren Abschätzung des Körperzustandes folgte eine grobe innere Untersuchung des Nackenbereiches, der Brusthöhle und der Bauchhöhle. Die Lungen wurden entlang der medialen Linie geschnitten, die linke Lunge wurde in 5 ml steriles Wasser für eine Bakteriologie eingebracht und die rechte Lunge wurde in 10% formal gepufferte Salzlösung für eine spätere grobe Untersuchung eingebracht. Die gesamte Milz wurde aseptisch entfernt und in 5 ml steriles destilliertes Wasser für eine Bakteriologie eingebracht.
Bakterielle Auszählung: die Lungen und die Milz wurden in 5 ml sterilem Wasser mittels eines Zerkleinerungssystems mit rotierenden Schneiden homogenisiert. Lebendzählungen wurden an fortlaufenden Verdünnungen der Zerkleinerungen durchgeführt und nach 4 Wochen Bebrütung bei 37°C auf Wachstum von Mykobakterien untersucht.
Statistische Analysen: geeignete statistische Untersuchungen wurden ausgewählt und alle Daten mit dem Programm InStat (Version 3.00, GraphPad, San Diego, CA) analysiert. Die Überlebensdaten wurden mit dem exakten Fisher-Test analysiert. Der unpaarige t-Test wurde auf die Bakteriologiedaten angewandt, da jeder Datensatz unter der Analyse geprüft worden ist, und es hat sich ergeben, das es von einer Population kommt, die der Gaußschen Verteilung folgt.
Beispiel 1: Behandlung mit Formalin macht die Kulturen nicht lebensfähig
Eine 100 μl Teilprobe, die ungefähr 2,5 × 10⁷ CFU von den mit dem Formalin behandelten BOG Pasteur, BOG Tokyo und M. Bovis 2122/97 darstellt, wurde auf ein festes Medium aufgebracht und in beigefarbene Mäuse mit einem schweren kombinierten Immundefekt (SCID) injiziert, um zu prüfen, ob die Behandlung mit dem Formalin die Mykobakterien abgetötet hat. Keine Bakterien sind kultiviert worden und alle der Teilprobe ausgesetzten Mäuse überlebten zwölf Wochen ohne klinische Zeichen der Krankheit. Bei Obduktionsuntersuchungen wurden bei keiner Maus Läsionen in den inneren Organen gefunden.
Zwei Mäuse wurden mit dem M. Bovis geimpft, das mit dem Formalin in Wasser behandelt worden ist, aber sie wurden keinen Krankheitserregern ausgesetzt. Fünfzehn Wochen später wurden die Mäuse abgetötet und auf Zeichen von Tuberkulose untersucht. Keine Läsionen wurden in den inneren Organen bei den beiden Mäuse beobachtet und keine Bakterien wurden aus der Milz und den Lungen kultiviert.

Beispiel 2: mit Formalin inaktivierte Novasome^® Adjuvans-Impfstoffe schützen Meerschweinchen vor einer Auseinandersetzung mit dem M. Bovis Nachdem herausgefunden worden ist, dass die mit dem Formalin behandelten Impfstoffe nicht lebensfähig sind, ist deren Schutzwirksamkeit überprüft worden, indem das früher beschriebene Model (35) verwendet wird, bei dem die Meerschweinchen einer geringen durch die Luft übertragenen Dosierung von dem M. Bovis ausgesetzt werden. Es wurden keine ungünstigen Reaktionen an der Impfstelle bei einem der Tiere während der gesamten Experimente beobachtet. Nachdem sie dem M. Bovis ausgesetzt worden sind, musste eine variierende Anzahl an Meerschweinchen in jeder Gruppe vor dem Ende der Experimente abgetötet werden, da sie den menschlichen Endpunkt erreicht hatten. Die Tabelle 1 zeigt die Anzahl der Tiere für jede Behandlung, die bis zu dem Ende der Experimente überlebt hatte. Eine Rezeptur mit mindestens einem Adjuvans für jeden Stamm der Impfstoffe verlieh der Gruppe im Vergleich mit der PBS Kontrollgruppe ein wesentliches Überleben. Eine Impfung mit einer lebenden Aufbereitung von dem BCG Pasteur und dem BCG Tokyo verlieh auch ein wesentliches Überleben. Tabelle 1: Vermögen der Impfstoffe die Meerschweinchen gegen tödliche über die Luft übertragene Infektionen mit dem M. Bovis zu schützen Anzahl der Tiere, die bis zu dem Ende der Experimente überlebten

Kombination Impfstoff/Adjuvans	Ohne Adjuvans	NAX 57	NAX M57	NAX M77	NAX M687
PBS	3(18)	ND	ND	ND	ND
lebendes BCG Pasteur	15(18)***	ND	ND	ND	ND
lebendes BCG Tokyo	5(6)**	ND	ND	ND	ND
mit Formalin inaktiviertes M. Bovis	1(6)	1(6)	1(6)	1(6)	4(6)*
mit Formalin inaktiviertes BCG Pasteur	2(6)	2(6)	3(6)	3(6)	5(6)**
mit Formalin inaktiviertes BCG Tokyo	1(6)	5(6)**	4(6)*	0(6)	1(6)
Die Anzahl der Tiere pro Gruppe ist in Klammern angezeigt. P < 0,05, *P < 0, 01, P < 0.001 (im Vergleich mit der PBS Gruppe, wenn der exakte Fisher-Test verwendet wird). ND, nicht durchgeführt.

Die Homogenste von der Lunge und von der Milz sind von jedem Meerschweinchen zum Zeitpunkt des Todes für die Auszählung von dem M. Bovis aufgebracht worden. Die Tabelle 2 und die Tabelle 3 zeigen jeweils die Ausbeute an dem M. Bovis aus den Lungen und der Milz der geimpften Meerschweinchen nach zehn Wochen nach der über die Luft übertragenen Infektion mit dem M. Bovis. Nur die mit dem Formalin inaktivierten Rezepturen, die auf dem M. Bovis basieren, verliehen einen wesentlichen Schutz gegen eine bakterielle Replikation in den Lungen (Tabelle 2). Eine dieser Rezepturen (M. Bovis NAX M687) verlieh auch einen wesentlichen Schutz für die Milz (Tabelle 3). Wohingegen vier der mit dem Formalin inaktivierten BCG Impfstoffe der Milz einen wesentlichen Schutz verliehen, aber nicht der Lunge. Eine Impfung mit lebenden Aufbereitungen von dem BCG Pasteur und von dem BCG Tokyo verringerte wesentlich die Bakterienlast in sowohl der Lunge als auch in der Milz. Keiner der mit Formalin inaktivierten Impfstoffe zeigte bei Abwesenheit eines Adjuvans eine wesentliche Schutzwirkung mit der Ausnahme, dass das im Wasser mit Formalin Inaktivierte eine geringfügige (0,58 log₁₀) aber wesentliche (p < 0,05, t-Test) Verringerung in der Anzahl der Bakterien ergab, die aus der Lunge kultiviert worden sind. Tabelle 2: Ausbeute an dem M. Bovis aus der Lunge von den geimpften Meerschweinchen zehn Wochen nach einer über die Luft übertragenen Infektion mit dem M. Bovis Log₁₀ CFU ± SE

Kombination Impfstoff/Adjuvans	ohne Adjuvans	NAX 57	NAX M57	NAX M77	NAX M687
PBS	6,34 ± 0,17	ND	ND	ND	ND
lebendes BCG	4,99 ± 0,24	ND	ND	ND	ND
Pasteur	(1,34)***
lebendes BCG	4,92 ± 0,25	ND	ND	ND	ND
Tokyo	(1,42)***
mit Formalin	5,76 ± 0,08	5,70 ± 0,02	5,51 ± 0,24	5,52 ± 0,05	4,97 ± 0,25
inaktiviertes M.	(0,58)*	(0,64)	(0,83)*	(0,82)*	(1,37)**
Bovis
mit Formalin	6,50 ± 0,19	6,07 ± 0,31	6,05 ± 0,10	5,73 ± 0,14	5,68 ± 0,32
inaktiviertes	(–0,16)	(0,27)	(0,29)	(0,60)	(0,66)
BCG Pasteur
mit Formalin	5,61 ± 0,32	5,90 ± 0,18	5,58 ± 0,30	6,32 ± 0,10	6,33 ± 0,16
inaktiviertes	(0,73)	(0,43)	(0,76)	(0,02)	(0,01)
BCG Tokyo
Der Log₁₀ Schutz im Vergleich mit der PBS Gruppe ist in Klammern gezeigt. P < 0,05, P < 0,01, **P < 0,001 (im Vergleich mit der PBS Gruppe, wenn der t-Test durchgeführt wird). ND, nicht durchgeführt.

Tabelle 3: Ausbeute an dem M. Bovis aus der Milz von den geimpften Meerschweinchen zehn Wochen nach einer über die Luft übertragenen Infektion mit dem M. Bovis Log₁₀ CFU ± SE

Kombination Impfstoff/Adjuvans	ohne Adjuvans	NAX 57	NAX M57	NAX M77	NAX M687
PBS	5,32 ± 0,20	ND	ND	ND	ND
lebendes BCG	3,38 ± 0,24	ND	ND	ND	ND
Pasteur	(1,94)***
lebendes BCG	3,87 ± 0,38	ND	ND	ND	ND
Tokyo	(1,45)**
mit Formalin	4,67 ± 0,12	5,19 ± 0,17	5,29 ± 0,18	5,04 ± 0,25	4,27 ± 0,38
inaktiviertes	(0,65)	(0,13)	(0,04)	(0,28)	(1,05)*
M. Bovis	4,73 ± 0,26	5,63 ± 0,21	4,74 ± 0,05	3,85 ± 0,17	4,20 ± 0,32
mit Formalin	(0.,59)	(–0,31)	(0,58)	(1,47)***	(1,12)*
inaktiviertes
BCG Pasteur	4,51 ± 0,33	4,65 ± 0,19	3,81 ± 0,41	4,95 ± 0,15	3,97 ± 0,45
mit Formalin	(0,81)	(0,67)	(1,51)**	(0,37)	(1,35)*
inaktiviertes
BCG Tokyo
Der Log₁₀ Schutz im Vergleich mit der PBS Gruppe ist in Klammern gezeigt. P < 0,05, P < 0,01, P < 0,001, **P < 0,0001 (im Vergleich mit der PBS Gruppe, wenn der t-Test durchgeführt wird). ND, nicht durchgeführt.

Das Ausmaß der groben die Lunge betreffenden Tuberkulose in der rechten Lunge von jedem Tier wurde über das Gewicht (Vorausfestsetzung) abgeschätzt, indem die Anzahl der Läsionen abgezählt worden ist, die auf der Oberfläche der Lunge sichtbar waren, und eine Punktzahl zugewiesen worden ist, die auf der Größe der Läsionen und deren Schwere basiert (Nachfestsetzung) (36). Nach diesen Kriterien beeinflusst kein Impfstoff die grobe die Lunge betreffende Tuberkulose einschließlich der zwei lebenden BCG Impfstoffe (Daten sind nicht gezeigt).
Dementsprechend verlieh eine mit mindestens einem Formalin inaktivierte Rezeptur, die auf dem M. Bovis basiert, einen wesentlichen Schutz gegen eine bakterielle Replikation sowohl in der Lunge als auch in der Milz.
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Claims

Adjuvans-Impfstoff zum Erzeugen einer in vivo, über T-Zellen vermittelten Immunantwort auf ein Mykobakterium bei einem Säugetier, wobei der Impfstoff eine wirksame Menge eines mit Formalin inaktivierten Mykobakteriums und ein Adjuvans enthält, wobei das Adjuvans Öl enthaltende nicht-phospholide paucilamellare Lipidvesikel umfasst, die ungefähr 2 bis 8 periphere Doppelschichten einschließlich eines oberflächenaktiven Mittels enthalten, das einen großen unstrukturierten zentralen Hohlraum umgibt, wobei er weiterhin mindestens eins von einem Monophosphoryl Lipid A (MPL) oder einem Batylalkohol aufweist.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei das Mykobakterium aus der Gruppe ausgewählt wird, die einen M. Tuberculosis Komplex und einen nicht-tuperkulosen Mykobakterium Komplex (NTM) umfasst.
Impfstoff nach Anspruch 2, wobei das M. Tuberculosis Mykobakterium aus der Gruppe ausgewählt wird, die ein M. Tuberculosis, ein M. Bovis, ein M. Microtti, ein M. Africans und die Bakterienstämme Bacille Calmette-Guerin (BOG) Pasteur und BOG Tokyo aufweisen.
Impfstoff nach Anspruch 2, wobei das NTM Mykobakterium aus der Gruppe ausgewählt wird, die ein M. Kansasii, ein M. Marinum, ein M. Similae, ein M. Scrofulaceum, ein M. Szulgai, ein M. Gordonae, ein M. Avium, ein M. Intracellulare, ein M. Ucerans, ein M. Fortuitum, ein M. Chelonae, ein M. Xenopi, und ein M. Malnaoense aufweisen.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Lipidvesikel negativ geladen sind.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Lipidvesikel Monophosphoryl Lipid A (MPL) enthalten.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Lipidvesikel Batylalkohol enthalten.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei die Lipidvesikel nicht-fusogen sind.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei Ziele des Impfstoffes Lymphgewebe oder Lungen des Säugetieres sind.
Impfstoff nach Anspruch 1, wobei der Impfstoff Makrophagen in dem Säugetier aktiviert.
Impfstoff nach Anspruch 7, wobei die Lipidvesikel weiterhin MPL enthalten.
Impfstoff nach Anspruch 1 mit MPL und Batylalkohol, wobei das oberflächenaktive Material ein Glyzerinmonostearat ist.