CN1612753A - 分枝杆菌疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于增强受试者的免疫力或给受试者接种抵抗分枝杆菌感染的疫苗的组合物和方法。本发明提供了含有分枝杆菌，例如牛分枝杆菌(M.bovis)的福尔马林灭活培养物和一种Novasome佐剂的组合物，以及使用这样的组合物的方法。

Description

分枝杆菌疫苗
                 相关申请的交叉引用
本申请要求享受于2001年11月14日提交的US临时申请No.60/335,917的优先权，其全部内容在此引用作为参考。
发明背景
分枝杆菌属比所有其它属的细菌联合起来引起的痛苦还要严重。分枝杆菌分为两个大类。第一类，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)复合体，包括结核分枝杆菌，牛分枝杆菌(M.bovis)，田鼠分枝杆菌(M.microtti)和非洲分枝杆菌(M.africanus)。第二类包括所有其它的种类并被称为非肺结核分枝杆菌(NTM)或除了结核杆菌(tubercule bacilli)之外的分枝杆菌(MOTT)，其中包括堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)，海分枝杆菌(M.marinum)，猿分支杆菌(M.similae)，瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)，斯氏分枝杆菌(M.Szulgai)，戈登分枝杆菌(M.gordonae)，鸟分枝杆菌(M.avium)，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)，偶发分枝杆菌(M.fortuitum)，龟分枝杆菌(M.Chelonae)，蟾分枝杆菌(M xenopi)，和玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)。目前，超过60个分枝杆菌的种已经被确定。在所有可培养的分枝杆菌中，只有结核分枝杆菌是一种专性病原体。
由结核分枝杆菌或牛分枝杆菌感染引起的肺结核(TB)仍然是人和动物[1-3]最严重的疾病之一，且其在人和动物健康和财力方面仍继续给社会带来巨大的代价(4-7)。目前唯一的可有效预防TB的疫苗是活减毒疫苗，卡介菌(BCG)，它获自牛结核杆菌。BCG具有理想疫苗的许多特性：其生产和给药是廉价的，其是安全的并已被证明在许多情况下是有效的，特别是抵抗儿童的严重性和致死性肺结核(8)。然而，卡介菌已被发现在许多临床试验中产生可变化的效力。在英国医学研究委员会进行的试验中，BCG表现出77％的保护(9)，而另一个极端，在印度进行的大量临床试验中其显示出零保护效力(10)。尽管BCG通常在成人中产生很差的抵抗肺结核的保护，但是其仍然保持“黄金-标准”，参照它来测定效力得到改善的候选TB疫苗。随着HIV/AIDS广泛流行的出现，对其的忧虑已经超过了BCG的安全。因为BCG在免疫性降低或有缺陷的免疫中可能是病原体(11)，用BCG接种疫苗对于那些处于感染肺结核的最大危险中的个体来说可能是禁忌的。
围绕BCG的通用效力和安全性缺乏的问题已经使得人们更加努力地来发展新一代的结核菌苗。人们寻求的一种方法是产生需要接种在佐剂中的分枝杆菌的核酸、蛋白质或肽的亚单位疫苗。虽然单独的蛋白质通常仅仅具有临界的效力，然而蛋白质混合物的作用却更好一些(12)，这表明对许多抗原的免疫是完全保护所需要的。这些得到了下列观察的支持：DNA与多价抗原一起接种疫苗对保护效力具有相加效应(13)。另一种方法利用分子遗传工具来产生对免疫能力减小的宿主来说是减毒的和无毒性的TB复合体的突变型(14)。例如，与氨基酸和嘌呤生物合成有关的基因缺失产生了在有免疫能力的(15，16)和免疫能力严重减小的小鼠中均不能长久存留(17)的BCG的营养缺陷型变种。然而突变型能够足够长时间地存留来表达代谢性抗原并产生一定程度的保护性免疫。这已经表明此种突变型可用于接种处于发展成免疫降低或免疫缺陷的个体的危险中(17)，尽管人们仍然指望在人或家畜中应用遗传修饰的活疫苗(14，18)。
基于灭活的分枝杆菌的全细胞制剂的疫苗在传统上赋予很少的作用，使得对随后的毒性分枝杆菌的攻击没有特定的保护(19-22)，大概因为重要的保护性抗原仅仅当细菌是代谢活性的时候才表达(21，23，24)。对这一点来说有一些例外(25，26)且已经提出，就产生的保护性免疫来说，呈递的特定抗原可能不如它们呈递的方式重要(27，28)。大多数用分枝杆菌的灭活制剂进行的接种疫苗研究采用热作为灭活的方法。然而，这种处理可显著地使重要的抗原变性且可解释此疫苗的通常被观察到的令人失望的结果(29)。
加热灭活的替代方案为用福尔马林处理。福尔马林失活在20世纪20年代首次被用来解毒分离自白喉棒杆菌培养物的白喉毒素(30，31)；该方法仍然被用于疫苗的生产(32)。福尔马林处理整个分枝杆菌具有生物灭活的优点同时保持了所存在的许多蛋白质的抗原完整性(33)。
发明概述
本发明提供了用于增强受试者的免疫性或给受试者接种抵抗分枝杆菌感染的疫苗的组合物和方法。尤其是，作为本发明的一部分，人们发现分枝杆菌例如，福尔马林灭活的牛分枝杆菌制剂，与各种非磷脂脂质体助剂(Novasomes)混合，当通过皮下接种给药于豚鼠时，赋予了对牛分枝杆菌的致死产气攻击的保护。相应地，本发明的组合物和方法包括福尔马林灭活的分枝杆菌的培养物，例如，来自结核分枝杆菌复合体的分枝杆菌或来自NTM复合体的分枝杆菌，和一种Novasome佐剂。Novasome助剂，正如此处所定义的，为含有非磷脂、甾醇、油类和缓冲液的少层的(pauci lamellar)脂质体且被描述在US专利No.5,474,848中，在此全文引用作为参考。在一个优选的实施方案中，Novasome佐剂为NAX M687。
如在此描述的研究所证明的，本发明的组合物可用于保护免受由分枝杆菌，诸如肺结核所引起的感染。因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种含有经福尔马林灭活的分枝杆菌培养物和一种Novasome佐剂的组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种通过给受试者施用一种含有分枝杆菌的福尔马林灭活培养物和Novasome佐剂的组合物，来增强受试者抵抗分枝杆菌的免疫力或给受试者接种抵抗分枝杆菌诸如牛分枝杆菌疫苗的方法。
可利用任意合适的给药途径将本发明的组合物给药于受试者。典型地，通过注射以适当的量和给药方案将该组合物给药来达到一种治疗的效果。
本发明的其它特征和优点显而易见地体现在下面的详细说明和权利要求中。
发明详述
本发明提供了用于增强受试者的免疫力或给受试者接种抵抗分枝杆菌，诸如肺结核感染的疫苗的组合物和方法。本发明的组合物包括一种经福尔马林灭活的分枝杆菌培养物和一种Novasome佐剂。本发明的福尔马林灭活的分枝杆菌包括结核分枝杆菌复合体的分枝杆菌以及非结核分枝杆菌复合体(NTM)的分枝杆菌二者。
来自结核分枝杆菌复合体的分枝杆菌的实例包括结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌、和卡介菌(BCG)。来自NTM复合体的分枝杆菌的实例包括，除了其它的以外，堪萨斯分枝杆菌，海分枝杆菌，猿分枝杆菌，瘰疬分枝杆菌，斯氏分枝杆菌，戈登分枝杆菌，鸟分枝杆菌，胞内分枝杆菌，溃疡分枝杆菌，偶发分枝杆菌，龟分枝杆菌，蟾分枝杆菌，以及玛尔摩分枝杆菌。
如这里描述的研究所证明的，正如通过在生长培养基上培养并接种到严重联合免疫缺陷(SCID)的小鼠中所测定的，发现福尔马林灭活的培养物完全无活力。福尔马林-灭活的制剂与一系列的Novasome助剂(由非磷脂，甾醇，油类和缓冲液组成的少层的脂质体)混合并给药于豚鼠。该制剂在动物中没有产生不良反应。事实上，许多被处理的豚鼠受到保护而免于被小剂量的活牛分枝杆菌的气雾剂的攻击。在某些情况下，保护的水平相当于用黄金-标准疫苗，活的巴氏BCG所达到的保护水平。
基于灭活的全分枝杆菌细胞制剂的疫苗具有其安全方面的优点且事实上它们表现为蛋白和非蛋白抗原的复合体混合物。同样，对灭活的分枝杆菌疫苗的免疫应答与用活的BCG相比较小地受到宿主遗传学的限制(26)。然而，这种疫苗由于大量的研究报道了它们不能赋予保护性免疫(19-22)而没有被广泛地应用。当在研究中发现此种疫苗是有效的时，不得不应用油佐剂或通过不恰当的途径(例如腹膜内)以多剂量服用该疫苗来达到保护(27，38-40)。当皮内给药时，这样的疫苗不能产生保护(41)。
本发明利用适度的福尔马林固定结合利用新一代非磷脂脂质体助剂(Novasomes)来保持制剂的抗原性，该助剂先前已表明能引起Th1应答(42，43)。如下述研究所证明的，这些制剂提供了相当于用活的BCG达到的抵抗豚鼠中产气的分枝杆菌攻击的保护。可用单剂量的疫苗给药例如皮下给药，来达到这样的保护。如对于结核分枝杆菌的报道(21)，灭活的无佐剂的卡介苗没有赋予抵抗牛分枝杆菌攻击的保护。然而，福尔马林-灭活的牛分枝杆菌在没有佐剂存在时赋予对肺的保护，其表明BCG缺乏可能由牛分枝杆菌表达的与细胞相关联的保护性抗原的全部组成成份。
在一个特定的实施方案中，Novasome脂质体被设计成具有净负电荷。带负电荷的脂质体比中性的或带正电荷的脂质体被更迅速地从循环中除去，更快速地在肝脏、脾和骨髓中定位，以及在肺中更有效地被捕获(44)。
效力最小的佐剂是NAX 57，其仅仅只有Novasome佐剂而不包括MPL(单磷酰基脂质A)。已经显示MPL在各种分枝杆菌疫苗/攻击模型中具有佐剂的特性(45-47)且脂质体中的脂质A激活巨噬细胞的抗原呈递(48，49)。最好的疫苗/佐剂组合是福尔马林-灭活的牛分枝杆菌加上NAXM687。这些赋予了在统计学上与活巴氏BCG或东京BCG相当的抵抗肺和脾中牛分枝杆菌的死亡和生长的保护。NAX M687含有MPL和鲨肝醇，后者同样具有巨噬细胞激活特性(50)。Novasomes，尤其是NAX M687的佐剂活性，部分归因于它们的靶向淋巴组织和肺，以及激活巨噬细胞的倾向。所有的Novasomes可通过存在于巨噬细胞中的氧化代谢过程而发生生物降解(51)，尽管脂质体的融合性影响到在亚细胞的水平上它们的货物被运载到何处。融合性脂质体直接将它们的货物呈递到胞质液，使得抗原能有效地通过MHC I类分子呈递到CD8+T细胞(52，53)。相比之下，非融合性脂质体将进入内体途径，其中它们的抗原货物将被降解，由MHC II类分子呈递到CD4+T细胞(52，53)。NAX M687是此处描述的唯一的非融合性Novasome。
与所报道的活BCG的抵抗传播性肺结核的保护能力相一致(54，55)，一些福尔马林-灭活的BCG疫苗对脾产生显著的保护，尽管所有的都不能保护肺。福尔马林-灭活的牛分枝杆菌加NAX M687是唯一保护肺和脾二者免受细菌复制的灭活疫苗。这部分归因于这样的事实，不同的与细胞壁相关联的抗原负责TB复合体分枝杆菌的组织特异性生长和传播：脂质结核菌醇dimycocerosate(PDIM)是在肺中而不是在脾或肝脏中生长所需要的(56)；且与肝素-结合的血细胞凝集素粘附素(HBHA)是膈肺外传播所需要的(57)。因为PDIM和HBHA与分枝杆菌的细胞壁相关，针对这些分子(或其它类似的)的免疫应答决定了是否在肺或脾或二者中表现出保护。事实上，用抗HBHA的抗体包被的BCG削弱了鼻内感染之后的细菌的传播(57)。
无论活的或福尔马林-灭活的，两个BCG菌株在抵抗牛分枝杆菌攻击的效力方面没有发现差异。这与早先在小鼠和人中进行的研究相反，巴氏BCG赋予的抵抗结核分枝杆菌的保护水平高于东京BCG(58，59)。巴氏BCG和东京BCG表达了不同量的细胞壁-相关联的抗原，MPB83(60)。尽管这种抗原在天然的牛分枝杆菌感染中是免疫显性的(61，62)且在小鼠中是一种保护性抗原，但是在此处所述的结果表明它不是BCG疫苗的显性保护性抗原。
本发明的疫苗制剂在生产上是廉价和安全的(至少与BCG制剂相比)且在幼稚豚鼠中没有反应原性。
通过下面的实施例对本发明进行进一步的说明，其不应被理解为是进一步的限制。本申请中引用的所有附图和所有参考文献、专利和公开的专利申请的内容被通过参考文献引用作为参考。本领域的技术人员应理解，或仅仅利用常规的试验能够确定与本发明此处描述的特定实施方案等价的方案。目的是此等价的方案被通过以下的实施例和权利要求所包含。
                       实施例
材料和方法
细菌菌株和福尔马林处理：巴氏BCG和东京BCG菌株获自国家血清研究所，哥本哈根，丹麦。用于此研究的牛分枝杆菌菌株(2122/97)在1997年用结核菌素试验反应器从母牛中分离出来且在VLAWeybridge进行增殖。通过离心来收集培养在添加了0.2％(v/v)甘油(BCG)或4.6mg/ml丙酮酸钠(牛分枝杆菌)的M-ADC-TW肉汤中的所有菌株的4周龄培养物。以每毫升0.25g湿重的细菌细胞的浓度重新将细菌细胞悬浮在PBS中的1.5％(v/v)福尔马林中。在4℃搅拌培养物96小时，然后通过在4℃下离心来进行收集。用PBS洗涤福尔马林-处理的细胞一次并在4℃下保存直到需要使用时。
福尔马林-失活的确认：福尔马林-处理的细胞的各制剂的等分试样，代表大约2.5×107个CFU，被置于Middlebrook H10琼脂+10％(v/v)Middlebrook OADC富集培养基上并培养6个星期。将另外的等量的等分试样通过后颈皮下注射到3组5个SCID浅褐色小鼠(维持在CAMR)中。将小鼠监控12周以观察其疾病的临床病征，在第12周时将它们杀死并检查内脏中的结核损伤的存在。
含有助剂的制剂：将各福尔马林-处理的细胞的制剂与下列的带负电的Novasome(非磷脂脂质体)助剂混合：NAX 57(融合剂；用聚氧乙烯-2-鲸蜡基醚，例如，Brij 56制备)；NAX M57(融合剂；用聚氧乙烯-2-鲸蜡基醚加单磷酰基脂质A(MPL)制备)；NAX M77(融合剂；用聚氧乙烯-2-硬脂酰基醚，例如，Brij71，加MPL制备)；NAX M687(非融合性；用单硬脂酸甘油酯和鲨肝醇加MPL来制备)。利用装有18规格针的结核菌素注射器把细胞重新悬浮在佐剂中，然后通过将悬浮液在两个结核菌素注射器之间来回传递40次使细胞完全地均化。以同样的方式生产各分枝杆菌的对照制剂，但使用无菌水来代替佐剂。
给豚鼠接种疫苗并进行攻击：重量在350-450g之间且无间发感染的雌性Dunkin Hartley豚鼠获自Charles River UK Ltd，Margate，UK。将6个豚鼠的组用100μl的各种福尔马林-处理的疫苗/佐剂制剂在后颈皮下注射免疫，另外6个豚鼠用5×104CFU东京BCG的活的悬浮液免疫。将另外两个对照组的18只豚鼠单独用5×104CFU活巴氏BCG或PBS接种。接种疫苗5周后，将所有豚鼠用活的牛分枝杆菌2122/97的悬浮液进行产气攻击来达到在大约10个生物体的肺中的吸入保持剂量(35)。用福尔马林-处理的/水制剂接种给两个其他的豚鼠疫苗但未攻击以确定疫苗的无菌性。
豚鼠的尸体解剖：在攻击动物十周后或当个体的最大体重减少20％(人道的端点)时，通过腹膜给动物施用过量戊巴比妥钠来杀死它，越早越好。死后立即进行检查。身体状况的外部评价之后进行颈部，和胸部的以及腹腔的大致的内部检查。肺被沿着中线切割；将左肺置于5ml的无菌水中用于细菌学研究，将右肺置入到10％克式量浓度的缓冲盐水中用于随后的一般检查。全部脾脏被无菌切掉并置于5ml的无菌蒸馏水中用于细菌学研究。
细菌计数：使用转动叶片浸渍机系统在5ml无菌蒸馏水中将肺和脾脏均质化。对浸泡物质的系列稀释物进行活菌计数并37℃温育4周后测定分枝杆菌的生长。
统计学分析：选择适当的统计学试验并使用InStat软件包(版本3.00，GraphPad，San Diego，CA)分析所有的数据。费希尔精确检验对生存物的数据进行分析。由于经检验并发现所分析的各组数据来自符合正态分布的群体，因此将不成对的t检验用于细菌学数据。
实施例1：福尔马林处理致使培养物无活力。
将100μl等分试样，代表大约2.5×107CFU的福尔马林处理的巴氏BCG，东京BCG和牛分枝杆菌2122/97，置于固体培养基上并注射到SCID浅褐色小鼠中以检验是否福尔马林处理杀死了分枝杆菌。没有培养出细菌且所有受攻击的小鼠存活了12周并且没有得病的临床病征。通过尸体解剖，没有在任何小鼠的内脏中观察到损伤。
将两个小鼠用福尔马林-处理的在水中的牛分枝杆菌接种但不进行攻击。15周后小鼠被杀死并检查肺结核的病征。在任一动物的内脏中没有观察到损伤并且脾和肺中没有培养出细菌。
实施例2：福尔马林灭活的Novasome佐剂疫苗保护豚鼠免受牛分枝杆菌的攻击
在已经确定福尔马林灭活疫苗无存活力以后，利用先前描述的豚鼠低剂量牛分枝杆菌气雾剂攻击模型来测试它们的保护效力(35)。在整个实验期间在任何动物的接种位点都没有观察到不良反应。用牛分枝杆菌攻击以后，在实验结束之前各组中有不同数目的豚鼠不得不被杀死，因为它们已经到达了人道的终点。表1显示了各处理组中能幸存到实验结束的动物数目。用于每种疫苗菌株的至少一个佐剂制剂与PBS对照组相比赋予了该组显著多的幸存者。用巴氏BCG和东京BCG的活制剂接种也同样带来了显著多的幸存者。
表1.疫苗保护豚鼠抵抗牛分枝杆菌的致死产气感染的能力
    疫苗/佐剂组合  幸存到实验结束的数目
 无佐剂     NAX       NAX     NAX     NAX57        M57     M77     M687
    PBS活的巴氏BCG活的东京BCG福尔马林-灭活的牛分枝杆菌福尔马林-灭活的巴氏BCG福尔马林-灭活的东京BCG   3(18)     ND        ND      ND      ND15(18)***ND        ND      ND      ND5(6)**   ND        ND      ND      ND1(6)      1(6)      1(6)    1(6)    4(6)*2(6)      2(6)      (6)     3(6)    5(6)**1(6)      5(6)**   4(6)*  0(6)    1(6)
每组动物的数目显示在括号中。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
(与PBS组相比较，利用费希尔精确检验)。ND，没有进行。将来自每一豚鼠在死亡时的肺和脾脏的均浆进行平板培养，用于牛分枝杆菌的计数。表2和表3显示了分别来自经牛分枝杆菌产气感染10周后的接种豚鼠的肺和脾的牛分枝杆菌的产量。只有基于牛分枝杆菌的福尔马林灭活的制剂赋予了显著地抵抗肺中的细菌复制保护作用(表2)。这些制剂中的一个(牛分枝杆菌-NAX M687)同样赋予了对脾的显著的保护作用(表3)。相比之下，4种福尔马林-灭活的BCG疫苗赋予了对脾的显著保护作用，尽管对肺没有保护作用。用巴氏BCG和东京BCG的活制剂接种显著地减少了在肺和脾脏二者中的细菌载荷。缺少佐剂的福尔马林灭活疫苗没有任何显著的保护作用，但福尔马林灭活的在水中的牛分枝杆菌产生小的(0.8log10)但显著的(p＜0.05，t检验)从肺培养的细菌数目的减少，这是个例外。
表2.来自用牛分枝杆菌产气感染10周后的接种豚鼠的肺的牛分枝杆菌的产量
                           Log10 CFU±SE
疫苗/佐剂组合              没有佐剂       NAX57        NAXM57      NAXM77      NAXM687
PBS                        6.34±0.17     ND           ND          ND          ND
活的巴氏BCG                4.99±0.24     ND           ND          ND          ND
                           (1.34)***
活的东京BCG                4.92±0.25     ND           ND          ND          ND
                           (1.42)***
福尔马林-灭活的牛分枝杆菌  5.76±0.08     5.70±0.02   5.51±0.24  5.52±0.05  4.97±0.25
                           (0.58)*      (0.64)       (0.83)*    (0.82)*    (1.37)**
福尔马林-灭活的巴氏BCG     6.50±0.19     6.07±0.31   6.05±0.10  5.73±0.14  5.68±0.32
                           (-0.16)        (0.27)       (0.29)      (0.60)      (0.66)
福尔马林-灭活的东京BCG      5.61±0.32    5.90±0.18   5.58±0.30  6.32±0.10  6.33±0.16
                           (0.73)         (0.43)       (0.76)      (0.02)      (0.01)
与PBS组比较的Log10保护显示在括号中。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001(与PBS组相比较，利用t检验)。ND，没有进行。
表3.来自用牛分枝杆菌产气感染10周后的接种豚鼠的的脾的牛分枝杆菌的产量
                            Log10 CFU±SE
疫苗/佐剂组合               没有佐剂      NAX 57        NAX M57       NAX M77       NAX M687
PBS                         5.32±0.20    ND            ND            ND            ND
活的巴氏BCG                 3.38±0.24    ND            ND            ND            ND
                            (1.94)****
活的东京BCG                 3.87±0.38    ND            ND            ND            ND
                            (1.45)**
福尔马林-灭活的牛分枝杆菌   4.67±0.12    5.19±0.17    5.29±0.18    5.04±0.25    4.27±0.38
                            (0.65)        (0.13)        (0.04)*      (0.28)        (1.05)*
福尔马林-灭活的巴氏BCG      4.37±0.26    5.63±0.21    4.74±0.05    3.85±0.17    4.20±0.32
                            (0.59)        (-0.38)       (0.58)        (1.47)***    (1.12)*
福尔马林-灭活的东京BCG      4.51±0.33    4.65±0.19    3.81±0.41    4.95±0.15    3.97±0.45
                            (0.81)        (0.67)        (1.51)**     (0.37)        (1.35)*
与PBS组比较的Log10保护显示在括号中。*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，****P＜0.0001(与PBS组相比较，利用t检验)。ND，没有进行。
通过称重(固定之前)，通过计算肺的表面上的明显可见的损害的数目并基于损害大小和严重性指定一个值(固定后)来评价每一动物右肺中的大致的肺结核的程度(36)。通过这些标准，没有疫苗影响了大致的肺结核，包括两个活的BCG疫苗(数据未显示)在内。
相应的，至少一种基于牛分枝杆菌的福尔马林灭活制剂赋予一种抵抗肺和脾二者中的细菌复制的保护作用。
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通过参考文献引入
在这里引用的所有专利、悬而未决的专利申请及其它的出版物被通过参考文献整体引入作为参考。
等价的方案
本领域的技术人员将会认识到，或仅仅利用常规的试验就能够确定本发明此处描述的特定实施方案的许多等价的方案。目的是这样的等价方案被包含在下列的权利要求中。

Claims (17)

1.一种用于在哺乳动物中产生对分枝杆菌的体内T细胞-介导的免疫应答的加有佐剂的疫苗，所述疫苗包含有效量的福尔马林灭活的分枝杆菌和一种佐剂，所述佐剂包括含油的非磷脂的少层的脂囊泡。
2.根据权利要求1的疫苗，其中所述的分枝杆菌选自结核分枝杆菌复合体和非结核分枝杆菌复合体(NTM)。
3.权利要求2的疫苗，其中所述的结核分枝杆菌选自结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌和卡介菌(BCG)。
4.权利要求2的疫苗，其中所述的NTM分枝杆菌选自堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌、斯氏分枝杆菌、戈登分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、蟾分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌。
5.根据前述任意一项权利要求的疫苗，其中所述的脂囊泡是带负电荷的。
6.根据前述任意一项权利要求的疫苗，其中所述的脂囊泡进一步地包括MPL。
7.根据前述任意一项权利要求的疫苗，其中所述的脂囊泡进一步地包括鲨肝醇。
8.根据前述任意一项权利要求的疫苗，其中所述的脂囊泡是非融合性的。
9.根据前述任意一项权利要求的疫苗，其中所述的疫苗靶向受试者的淋巴组织或肺。
10.根据前述任意一项权利要求的疫苗，其中所述的疫苗激活受试者的巨噬细胞。
11.根据前述任意一项权利要求的疫苗，其中所述的疫苗启动受试者体内的Thl免疫应答。
12.一种用于给受试者接种抵抗肺结核疫苗的方法，包括用前述任意一项权利要求的疫苗进行给药。
13.根据权利要求12的方法，其中用气雾剂形式的活分枝杆菌攻击受试者。
14.根据权利要求13的方法，其中所述的分枝杆菌选自结核分枝杆菌复合体和非结核分枝杆菌复合体(NTM)。
15.根据权利要求14的方法，其中所述的结核分枝杆菌选自结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、非洲分枝杆菌和卡介菌(BCG)。
16.根据权利要求14的方法，其中所述的NTM分枝杆菌选自堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌、猿分枝杆菌、瘰疡分枝杆菌、斯氏分枝杆菌、戈登分枝杆菌、鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、溃疡分枝杆菌、偶发分枝杆菌、龟分枝杆菌、蟾分枝杆菌和玛尔摩分枝杆菌。
17.根据权利要求12的方法，其中所述的给药步骤保护了肺和脾免遭肺结核复制。
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Lysine Long-Term Protection against Tuberculosis
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