CN101432016A - 减毒的分枝杆菌的新引发-加强组合 - Google Patents
减毒的分枝杆菌的新引发-加强组合 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101432016A CN101432016A CNA2006800526025A CN200680052602A CN101432016A CN 101432016 A CN101432016 A CN 101432016A CN A2006800526025 A CNA2006800526025 A CN A2006800526025A CN 200680052602 A CN200680052602 A CN 200680052602A CN 101432016 A CN101432016 A CN 101432016A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- mycobacterium
- mycobacteria
- vaccine
- antigen
- bcg
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 title claims abstract description 63
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 title abstract description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 36
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 78
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 78
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 78
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 54
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 claims description 49
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 claims description 36
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 30
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 23
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 13
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims description 11
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 10
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 9
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 claims description 6
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 241001508003 Mycobacterium abscessus Species 0.000 claims description 4
- 241001502334 Mycobacterium avium complex bacterium Species 0.000 claims description 4
- 241000187478 Mycobacterium chelonae Species 0.000 claims description 4
- 241001147828 Mycobacterium haemophilum Species 0.000 claims description 4
- 241000187492 Mycobacterium marinum Species 0.000 claims description 4
- 241000187489 Mycobacterium simiae Species 0.000 claims description 4
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 3
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 3
- 206010071401 Mycobacterium chelonae infection Diseases 0.000 claims description 2
- 241000186363 Mycobacterium kansasii Species 0.000 claims description 2
- 241000187493 Mycobacterium malmoense Species 0.000 claims description 2
- 241000187490 Mycobacterium scrofulaceum Species 0.000 claims description 2
- 241000187496 Mycobacterium szulgai Species 0.000 claims description 2
- 241000187917 Mycobacterium ulcerans Species 0.000 claims description 2
- 241000187494 Mycobacterium xenopi Species 0.000 claims description 2
- 208000001848 dysentery Diseases 0.000 claims description 2
- 201000007227 lymph node tuberculosis Diseases 0.000 claims description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 119
- 230000036039 immunity Effects 0.000 abstract description 15
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 abstract description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 abstract description 12
- 238000009472 formulation Methods 0.000 abstract description 10
- 230000006698 induction Effects 0.000 abstract 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 105
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 description 84
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 80
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 77
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 75
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 71
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 44
- 238000011160 research Methods 0.000 description 35
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 30
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 28
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 26
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 26
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 22
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 22
- 230000034994 death Effects 0.000 description 21
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 21
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 20
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 20
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 20
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 18
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 17
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 15
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 15
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 15
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 15
- 101150014144 ureC gene Proteins 0.000 description 15
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 14
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 14
- 230000003014 reinforcing effect Effects 0.000 description 14
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 13
- 230000002787 reinforcement Effects 0.000 description 13
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 12
- 230000036541 health Effects 0.000 description 12
- 101150003612 pfo gene Proteins 0.000 description 12
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 12
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 12
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 11
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 11
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 11
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 11
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 11
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 101150073660 glmM gene Proteins 0.000 description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 9
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 9
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 9
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 8
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 8
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 description 8
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- 101100377720 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) fbpA gene Proteins 0.000 description 7
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 241001597008 Nomeidae Species 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 7
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 7
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 7
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 7
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 6
- 108010000449 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Proteins 0.000 description 6
- 102000002259 TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand Receptors Human genes 0.000 description 6
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 6
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 6
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 6
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 6
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 6
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 6
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 6
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 6
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 6
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 6
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 6
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 6
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 6
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 6
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 5
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 5
- -1 G/W Substances 0.000 description 5
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 5
- 230000036783 anaphylactic response Effects 0.000 description 5
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 5
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- 239000003228 hemolysin Substances 0.000 description 5
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 5
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 101710088335 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85A Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 101100377732 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) fbpB gene Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000011554 guinea pig model Methods 0.000 description 4
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 4
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 4
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 229940114179 mycobacterium bovis Drugs 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 4
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 239000003351 stiffener Substances 0.000 description 4
- 238000005728 strengthening Methods 0.000 description 4
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 4
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 101710166488 6 kDa early secretory antigenic target Proteins 0.000 description 3
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 3
- 102000004091 Caspase-8 Human genes 0.000 description 3
- 108090000538 Caspase-8 Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 3
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 3
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 3
- 241000224016 Plasmodium Species 0.000 description 3
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 3
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 3
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 3
- 230000009083 hemolysis by symbiont of host erythrocytes Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 3
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 3
- 239000006201 parenteral dosage form Substances 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000011886 postmortem examination Methods 0.000 description 3
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 3
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 229920001664 tyloxapol Polymers 0.000 description 3
- MDYZKJNTKZIUSK-UHFFFAOYSA-N tyloxapol Chemical compound O=C.C1CO1.CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(O)C=C1 MDYZKJNTKZIUSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960004224 tyloxapol Drugs 0.000 description 3
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 3
- ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 3',5'-cyclic GMP Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=C(NC2=O)N)=C2N=C1 ZOOGRGPOEVQQDX-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012109 Alexa Fluor 568 Substances 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000223836 Babesia Species 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 241000588780 Bordetella parapertussis Species 0.000 description 2
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 2
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 108010065693 Clostridium perfringens theta-toxin Proteins 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 241000224431 Entamoeba Species 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 2
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 2
- 108010006464 Hemolysin Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 102000014158 Interleukin-12 Subunit p40 Human genes 0.000 description 2
- 108010011429 Interleukin-12 Subunit p40 Proteins 0.000 description 2
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 208000022120 Jeavons syndrome Diseases 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- 208000004554 Leishmaniasis Diseases 0.000 description 2
- 241000186781 Listeria Species 0.000 description 2
- 241000186779 Listeria monocytogenes Species 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186365 Mycobacterium fortuitum Species 0.000 description 2
- 241000186364 Mycobacterium intracellulare Species 0.000 description 2
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 2
- 241000187480 Mycobacterium smegmatis Species 0.000 description 2
- 101100030428 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) PPE18 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000187644 Mycobacterium vaccae Species 0.000 description 2
- 241000231286 Neottia Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 2
- 235000014676 Phragmites communis Nutrition 0.000 description 2
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 2
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 2
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 2
- 102100038567 Properdin Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241000242679 Schistosoma bovis Species 0.000 description 2
- 241000242677 Schistosoma japonicum Species 0.000 description 2
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700012920 TNF Proteins 0.000 description 2
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 2
- 241000244002 Wuchereria Species 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 231100000403 acute toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 2
- 201000008680 babesiosis Diseases 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000011976 chest X-ray Methods 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000003021 clonogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 230000000688 enterotoxigenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 150000008271 glucosaminides Chemical class 0.000 description 2
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 2
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940115931 listeria monocytogenes Drugs 0.000 description 2
- 230000000527 lymphocytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 2
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 2
- 101150025220 sacB gene Proteins 0.000 description 2
- 238000009781 safety test method Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 2
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 2
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N thioglycolic acid Chemical compound OC(=O)CS CWERGRDVMFNCDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000041 toxicology testing Toxicity 0.000 description 2
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 2
- 238000002627 tracheal intubation Methods 0.000 description 2
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N (D)-(+)-Pantothenic acid Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- LAOOXBLMIJHMFO-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(diethylamino)ethylamino]-4-methylthioxanthen-9-one;hydron;chloride Chemical compound Cl.S1C2=CC=CC=C2C(=O)C2=C1C(C)=CC=C2NCCN(CC)CC LAOOXBLMIJHMFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GHKCSRZBNZQHKW-UHFFFAOYSA-N 1-sulfanylethanol Chemical class CC(O)S GHKCSRZBNZQHKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010028984 3-isopropylmalate dehydratase Proteins 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 101710092462 Alpha-hemolysin Proteins 0.000 description 1
- 238000012371 Aseptic Filling Methods 0.000 description 1
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 1
- 208000032116 Autoimmune Experimental Encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241000193738 Bacillus anthracis Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 241000238678 Boophilus Species 0.000 description 1
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 1
- 241000244036 Brugia Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102100035882 Catalase Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 1
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 241000193468 Clostridium perfringens Species 0.000 description 1
- 101100098682 Clostridium perfringens (strain 13 / Type A) pfo gene Proteins 0.000 description 1
- 241000193449 Clostridium tetani Species 0.000 description 1
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 101710088334 Diacylglycerol acyltransferase/mycolyltransferase Ag85B Proteins 0.000 description 1
- 241000243990 Dirofilaria Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 description 1
- 241000223934 Eimeria maxima Species 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101001095863 Enterobacteria phage T4 RNA ligase 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 241000224466 Giardia Species 0.000 description 1
- 241000224467 Giardia intestinalis Species 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101001027128 Homo sapiens Fibronectin Proteins 0.000 description 1
- 101000994375 Homo sapiens Integrin alpha-4 Proteins 0.000 description 1
- 101001033233 Homo sapiens Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000960969 Homo sapiens Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 101001076408 Homo sapiens Interleukin-6 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 description 1
- 101000610604 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Proteins 0.000 description 1
- 241000714260 Human T-lymphotropic virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000714259 Human T-lymphotropic virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000701027 Human herpesvirus 6 Species 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 description 1
- 102000014154 Interleukin-12 Subunit p35 Human genes 0.000 description 1
- 108010011301 Interleukin-12 Subunit p35 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000589248 Legionella Species 0.000 description 1
- 208000007764 Legionnaires' Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000222732 Leishmania major Species 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 208000008771 Lymphadenopathy Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101100038266 Methanothermobacter thermautotrophicus (strain Winter) rpo2N gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012901 Milli-Q water Substances 0.000 description 1
- 241001183012 Modified Vaccinia Ankara virus Species 0.000 description 1
- 206010027906 Monocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010062207 Mycobacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 1
- 241001532526 Mycobacterium gallinarum Species 0.000 description 1
- 101100485740 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) Rv1271c gene Proteins 0.000 description 1
- 101100103958 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) Rv1733c gene Proteins 0.000 description 1
- 101100541856 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) Rv1738 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100374508 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) Rv2627c gene Proteins 0.000 description 1
- 101100389760 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) esxQ gene Proteins 0.000 description 1
- 101100395578 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) hrp1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100178822 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) htrA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100074602 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) leuD gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289411 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) lppO gene Proteins 0.000 description 1
- 101100129641 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) mddA gene Proteins 0.000 description 1
- 101100361225 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) rpfD gene Proteins 0.000 description 1
- 101100481045 Mycobacterium tuberculosis (strain ATCC 25618 / H37Rv) tgs1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001646722 Mycobacterium tuberculosis CDC1551 Species 0.000 description 1
- 241001049988 Mycobacterium tuberculosis H37Ra Species 0.000 description 1
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 1
- 108700035964 Mycobacterium tuberculosis HsaD Proteins 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000243981 Onchocerca Species 0.000 description 1
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 description 1
- 241000282320 Panthera leo Species 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 208000024777 Prion disease Diseases 0.000 description 1
- 102000007066 Prostate-Specific Antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 1
- 241000702263 Reovirus sp. Species 0.000 description 1
- 241000606697 Rickettsia prowazekii Species 0.000 description 1
- 241000606726 Rickettsia typhi Species 0.000 description 1
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 1
- 108700002754 Salmonella SopE Proteins 0.000 description 1
- 241001354013 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis Species 0.000 description 1
- 241000242678 Schistosoma Species 0.000 description 1
- 241000242680 Schistosoma mansoni Species 0.000 description 1
- 241000217239 Schizotrypanum Species 0.000 description 1
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 1
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 1
- 101800001271 Surface protein Proteins 0.000 description 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108091008004 TRAIL-RII Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010055044 Tetanus Toxin Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 101800000385 Transmembrane protein Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 241000243796 Trichostrongylus colubriformis Species 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 241000223104 Trypanosoma Species 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100040112 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10B Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000007059 acute toxicity Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001557 animal structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000002424 anti-apoptotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 1
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 1
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- VQLYBLABXAHUDN-UHFFFAOYSA-N bis(4-fluorophenyl)-methyl-(1,2,4-triazol-1-ylmethyl)silane;methyl n-(1h-benzimidazol-2-yl)carbamate Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1.C=1C=C(F)C=CC=1[Si](C=1C=CC(F)=CC=1)(C)CN1C=NC=N1 VQLYBLABXAHUDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000039 congener Substances 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 101150101102 cyaA gene Proteins 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- XQRLCLUYWUNEEH-UHFFFAOYSA-N diphosphonic acid Chemical compound OP(=O)OP(O)=O XQRLCLUYWUNEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000002651 drug therapy Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 208000012997 experimental autoimmune encephalomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 238000013401 experimental design Methods 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 210000004211 gastric acid Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 229940085435 giardia lamblia Drugs 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004013 groin Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 102000052620 human IL10 Human genes 0.000 description 1
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 1
- 102000055228 human IL5 Human genes 0.000 description 1
- 102000052611 human IL6 Human genes 0.000 description 1
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 description 1
- 208000010544 human prion disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000004957 immunoregulator effect Effects 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000001524 infective effect Effects 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009916 joint effect Effects 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 231100001252 long-term toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 210000002200 mouth mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011889 obduction Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000006365 organism survival Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 108010021711 pertactin Proteins 0.000 description 1
- 210000000680 phagosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000013310 pig model Methods 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001084 poly(chloroprene) Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 230000016412 positive regulation of cytokine production Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 150000003141 primary amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000029058 respiratory gaseous exchange Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 208000009146 rhinoscleroma Diseases 0.000 description 1
- 229940046939 rickettsia prowazekii Drugs 0.000 description 1
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 1
- 238000011076 safety test Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000001843 schistosomicidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 101150085476 secA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 101150117326 sigA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 1
- 229940073490 sodium glutamate Drugs 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013599 spices Nutrition 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000004895 subcellular structure Anatomy 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N succinimide Chemical class O=C1CCC(=O)N1 KZNICNPSHKQLFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002344 surface layer Substances 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 101150047061 tag-72 gene Proteins 0.000 description 1
- 229940118376 tetanus toxin Drugs 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000012808 vapor phase Substances 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
- A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
- A61K2039/541—Mucosal route
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6006—Cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了用于有效地诱导针对病原性分枝杆菌的粘膜和全身性免疫的疫苗组合物。提供了预防接种的方法,其中给宿主使用了肠胃外的和粘膜的疫苗剂型。肠胃外的和粘膜的疫苗剂型含有活的、减毒的分枝杆菌。
Description
技术领域
总的来说,本发明涉及了针对病原性分枝杆菌对宿主进行预防接种的方法。具体来说,本发明提供了预防接种的方法,其中给宿主连续使用了活的、减毒的分枝杆菌的肠胃外和粘膜剂型,产生了针对活的、减毒的分枝杆菌的全身性和粘膜性免疫反应。
背景技术
结核病(TB)在发展中国家是巨大的和致死的问题,每年有数以百万计的人在他们生命的早期被杀死。在感染HIV的个体(11,15,16,43,44)和育龄妇女(61,63,65)中它是主要的死亡原因。世界卫生组织(WHO)估计,每年有8百万新增TB病例,有2百万人死于TB(5,24)。在传染病中,只有HIV和腹泻病杀死更多的人。
1993年,WHO指定TB为全球公共卫生突发事件(1,3)。每年估计的2百万TB死亡病例中的99%和新增8百万病例中的95%发生在占世界人口85%的低等和中等收入的国家(5,11,15,16,24,43,44)。尽管广泛使用了DOTs(短期直接观察疗法)和卡介苗(BCG),在发展中国家TB现在仍是严重疾病和死亡的主要原因(2,26,59)。在发展中国家,不受控制的TB流行由于许多原因正被恶化,这些原因包括广泛流行的HIV、战争和政策不稳定性、药物抗性以及不断增加的贫困(5,11,15,16,24,43,44)。
尽管TB可以使用药物进行治疗,但基本的治疗方案需要至少6个月才能完成,并且需要服用多达4种不同的药物。与药物治疗相结合,针对TB的中等有效的疫苗可以显著地降低疾病的负载。目前得到许可的TB疫苗BCG,自从20世纪早期就开始使用,用于全世界数以百万计的新生儿;它被认为在生命的前几年针对严重的TB疾病是有效的。但是TB流行仍然未被遏制的事实(2,26,59)表明迫切需要更好的TB疫苗。
通过使用基因组学(17-19)和蛋白质组学(4,22,51,58,64,66),已经出现了许多通过预防接种提高针对TB的保护作用的策略。这些策略可以被置于三种主要的类别中。
类别1:修饰的重组BCG或活的减毒的Mtb
本类别是基于这样的想法,即BCG是中度有效的,因此可以作为改进TB疫苗的基础。发展了三种方法来改进BCG。第一种方法最初由Horwitz及其同事开发(33,35),需要扩增BCG中免疫原性抗原的所有组成成分。因此,Rv 1886c(也被称为“抗原85B”)在BCG中的增加的表达增加了BCG Tice的保护性质(33,35)。这个观察与其他人报告一致,这些报告显示出在实验动物中,表达被扩增的抗原所有组成成分的重组BCG菌株比相应的亲本BCG菌株提供了更好的保护作用(40,50,53)。
第二种方法是基于这样的想法,即对宿主-BCG的相互作用进行修饰将提高获得的重组BCG所能提供的保护作用。该方法的例子包括具有修饰的sodA表达的重组BCG菌株(25)以及被工程改造以失去了内涵体的菌株(29,31)。在两种情况下,据信获得的菌株都通过交叉呈递途径增加了抗原的运输,从而唤起了针对疫苗抗原的增强的免疫反应(25,29)。此外,,这些策略在小鼠中增强了针对低剂量气溶胶激惹的保护作用(25)。该类别中的第三种方法是基于这样的想法,即牛分枝杆菌的衍生物BCG中不存在结核分枝杆菌(Mtb,TB的病原体)在感染期间所表达的全套抗原,两株细菌共同具有的这些抗原表现出某些等位基因多态性。因此,有讨论认为使用减毒的Mtb,其中将呈递出与在Mtb感染的个体中表达的相同的一套基因,将优于使用BCG(32,56,57)。尽管这种方法已经产生了在动物模型中表现出比BCG更大保护作用的TB疫苗,减毒的Mtb在免疫缺陷的动物模型中已经被证明比BCG更安全(32,56,57)。
类别2:亚基和载体疫苗
第二个类别是源自于这样的发现,即某些TB蛋白当作为亚基疫苗使用时显示出能够在动物模型中唤起保护性免疫。在诱导保护作用的抗原中,ESAT-6和所谓的抗原85复合物受到最大份额的关注(12,36,37,42,47-49,62,67)。最近,有证据表明某些含有两个或多个候选TB疫苗抗原的融合蛋白比单独的成分更为有效。这个类别中的主要候选物是Hybrid-1,含有ESAT6和Rv 1886c的融合蛋白(42,48);Hyvac-4,含有Rv0288和Rv 1886c的融合蛋白(21);以及72f,含有Rv0125和Rv1196的融合蛋白(14,38,60)。这些融合蛋白,当用适合的佐剂配制时,已经在动物模型中被证明能够提供有效的保护作用(12,14,21,37,38,42,47,48,60,62,67)。
类别3:异源的引发-加强疫苗策略
不论是作为单剂使用还是在引发-加强策略中,上述的策略依赖于单个疫苗的状态,其目标是诱导长时间有潜力的Mtb特异性的免疫。但是,已经广泛认可了两剂BCG或减毒Mtb不能使效能提高到超过单剂的这些疫苗所能提供的效能(54),尽管比单剂BCG更安全和更具有免疫原性(6,23)。此外,多剂的亚基或病毒载体疫苗可能太昂贵了,不能在TB流行的发展中国家中得到实用。
因此,第三种策略最近受到了关注,其中使用了异源的加强疫苗来加强由引发疫苗(prime)引发的免疫。事实上,初免BCG的个体在使用含有修饰的为Mtb的抗原85A(在本文中称为“Ag85A”;也被称为Rv 3804c)编码的疫苗Ankara(MVA)的异源性加强疫苗后,发展出了可观的细胞免疫反应(28,45,46);相比之下,未接触抗原的个体对MVA-Ag85A疫苗发展出相对不可观的反应(45,46)。此外,在小鼠中,在提供保护作用方面,BCG初免MVA-Ag85A加强的策略显示出比单独使用BCG更加有效(28)。此外,包含了亚基加强疫苗以加强BCG的异源引发-加强策略也已经被证明比单独使用BCG更为有效(34)。
尽管上面所述的研究没有鉴定出保护作用的相关物,但总体来说,在实验动物中的实验研究表明异源引发-加强策略比单剂或同源引发-加强策略更有优势。但是,尽管有了这些显著的进展,仍继续存在着开发对于最需要的人来说能够负担得起的免疫接种策略的需求。因此,尽管异源引发-加强策略在动物模型中已经被证明有效并值得在临床试验中进一步评估,但从疫苗递送的观点来说,单剂疫苗或两种形式是同样的疫苗比异源的引发-加强策略更加容易。这些疫苗要求cGMP生产、填装、包装、投放、两种不同成分的稳定性测试,这增加了推动这些疫苗进入大规模临床试验和建造大规模生产工厂所需的投资和疫苗策略的成本。此外,活的减毒的分枝杆菌疫苗固有地比现在讨论的加强疫苗的生产成本更低。
既然目前由政府、非盈利的和合作组织进行的投资水平较低,因此只有当低廉的引发-加强策略可以使用时,在发展中国家通过公共卫生疫苗干预计划成功地控制TB才有可能成为现实。因此现有的工艺远远不能提供这种成本效果合算的有效的策略。
发明概述
本发明提供了新的引发-加强策略,用于引发针对病原性分枝杆菌的免疫反应。该策略包括了连续给用两种不同的活的减毒的分枝杆菌疫苗剂型,其中一种被配制成用于肠胃外给用。另一种被配制成用于粘膜给用。使用的第一种剂型是“引发物”,使用的第二种剂型是“加强物”。肠胃外剂型被设计主要用来引发针对剂型中的抗原的全身性免疫反应,而粘膜剂型被设计主要用来引发针对制剂中的活的、减毒的分枝杆菌的粘膜性免疫反应。这两种免疫反应(全身性的和粘膜性的)合在一起,提供了针对带有与剂型中的活的、减毒的分枝杆菌所带有的相同或类似的抗原的分枝杆菌所引起的感染和/或疾病症状的发展的完全的、有效的保护作用。
本发明提供了在宿主中同时引发针对活的、减毒的分枝杆菌或针对分枝杆菌抗原的全身性和粘膜性免疫反应的方法。该方法包括步骤1)给该宿主肠胃外给用第一种抗原性组合物,其含有该活的、减毒的分枝杆菌或该分枝杆菌抗原、或带有为该分枝杆菌抗原编码的核酸的载体或细菌;以及2)给该宿主粘膜给用第二种抗原性组合物,其含有该活的、减毒的分枝杆菌或该分枝杆菌抗原、或带有为该分枝杆菌抗原编码的核酸的载体或细菌;该第二种抗原性组合物与该第一种抗原性组合物不同。肠胃外给用和粘膜给用的步骤导致在该宿主中同时诱导了针对该活的、减毒的分枝杆菌或该分枝杆菌抗原的全身性和粘膜性免疫反应。在本发明的一个实施方案中,活的、减毒的分枝杆菌从含有结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、BCG、鸟分枝杆菌复合物(Mycobacteriumavium complex)、堪萨斯氏分枝杆菌(M.kansasii)、摩尔分枝杆菌(M.malmoense)、猿分枝杆菌(M.simiae)、苏尔加分枝杆菌(M.szulgai)、蟾分枝杆菌(M.xenopi)、瘰痢分枝杆菌(M.scrofulaceum)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)或海分枝杆菌(M.marinum)的组中选择。在本发明的另一个实施方案中,带有为分枝杆菌抗原编码的核酸的细菌是志贺氏菌属细菌。在另一个实施方案中,为该分枝杆菌抗原编码的载体是腺病毒载体。在本发明的其它实施方案中,活的、减毒的分枝杆菌含有为从下面的组中选择的成分编码的DNA:外源免疫原、内源免疫原、佐剂、细胞因子、前凋亡因子和过量表达的Mtb抗原。在本发明的一个实施方案中,口服完成的粘膜给用步骤被用于“引发”,即在肠胃外用药的“加强”步骤之前。
附图说明
图1:疫苗制造方法的示意流程图;
图2:自杀载体pAF102的图谱。每个DNA片段的符号如下:L-flank和R-flank:分别为ureC基因的5’引物和3’引物末端附近的区域;pfoAG137Q编码了突变形式的perfringolysin O(GenBank登记号BAOOOO16),在137位有单个氨基酸取代,用谷氨酰胺代替了甘氨酸(即G137Q);LPPAg85B是为抗原85B(即Rv 1886c)的前导序列编码的DNA序列;PAg85A是抗原85A基因(即Rv 3804c)的启动子序列;aph是氨基葡萄糖苷磷酸转移酶基因(GenBank登记号X06402),赋予质粒卡那霉素抗性;OriE是pUC质粒的复制原点(GenBank登记号AY234331);ble编码Zeocin抗性(GenBank登记号L36850);sacB编码蔗糖6-果糖基转移酶(GenBank登记号Y489048),赋予对蔗糖的敏感性;Phsp60是热休克蛋白基因Rv0440的启动子序列;MCS是用于指示的限制性酶的多克隆位点;
图3:抗原过量表达载体pAF105的图谱。每个DNA片段的符号如下:PRv3130是抗原Rv3130c的启动子序列;PAg85B是Rv1886c的启动子序列。表达盒中的基因是Rv0288(10.4)、Rv1886c和Rv3804c;aph是氨基葡萄糖苷磷酸转移酶基因(GenBank登记号X06402),赋予质粒卡那霉素抗性;OriE是pUC质粒的复制原点(GenBank登记号AY234331);leuD是编码3-异丙基苹果酸脱水酶的基因(即Rv2987c);oriM是分枝杆菌中的复制原点(GenBank登记号M23557);
图4:使用标准BCG疫苗与本发明的双组分TB疫苗进行预防接种的比较。
本发明的优选实施方案的详细描述
本发明是基于这样的认识,即引发针对病原性分枝杆菌的保护性免疫的最佳策略涉及到同时产生针对分枝杆菌的全身性和粘膜性免疫反应。因此,本发明提供了多组分的预防接种方法(系统、策略、方案),其中引发药剂和加强药剂在它们的配方上不同,一种被最优化用于肠胃外给用,另一种用于粘膜给用。两种配方都含有活的、减毒的分枝杆菌。肠胃外剂型被设计主要用来诱导针对剂型中的抗原的全身性免疫反应,而粘膜剂型被设计主要用来引发针对制剂中的活的、减毒的分枝杆菌的粘膜性免疫反应。一旦完成了系统的用药步骤(引发和至少一次加强),就同时发展出了针对活的、减毒的分枝杆菌的全身性和粘膜性免疫反应。这两种反应合在一起,从而提供了针对带有与剂型中存在的抗原、即活的、减毒的分枝杆菌的抗原相同或类似的抗原的病原性分枝杆菌所引起的感染和/或疾病症状的发展的完全的、有效的保护作用。
具体来说,本发明提供了针对结核病(TB)的病原体结核分枝杆菌对宿主预防接种的方法。到目前为止,还没有现有的技术描述了含有一个组分被配制成肠胃外给用、另一个组分被配制成粘膜给用的双组分TB疫苗。本方法的优点在于这种新的疫苗剂型的组合能够同时诱导粘膜和全身免疫。在以前的活的减毒分枝杆菌疫苗用于引发-加强预防接种策略的情况下,引发物和加强物被制备成同样的剂型,通过同样的途径使用(6,23,54)。但是,实验证据表明预先存在的对BCG的免疫干扰了加强物,导致与单独使用引发物所提供的保护水平相比,从加强物没有获得可测量到的益处(13,20)。相反,本发明在引发-加强策略中使用了肠胃外和粘膜剂型的组合。正如在下面的例子中将更详细显示的那样,令人吃惊的是,由引发成分诱导的预先存在的免疫不干扰这种新的双组分TB疫苗的加强成分。不受理论的束缚,据信缺少干扰的基础可能是由于这样的事实,即肠胃外疫苗在粘膜区中仅诱导相对低的T细胞反应,针对粘膜激惹只能够提供部分的甚至可忽略的保护作用(7-10,30,39,41,55)。因此,肠胃外疫苗不诱导粘膜T细胞反应,不干扰随后在粘膜组织中加强疫苗的集群现象。
被使用的制剂含有活的、减毒的分枝杆菌。这些“活的、减毒的分枝杆菌”包括但不限于减毒的菌株例如BCG、重组的遗传修饰的分枝杆菌生物体等。在本发明的某些实施方案中,引发和加强成分含有同样的活的、减毒的分枝杆菌,但是可以进行不同的配制,肠胃外制剂以适合于肠胃外给用的方式配制,粘膜制剂以适合于粘膜给用的方式配制,正如下文描述的那样。但是,在其它的实施方案中使用了异源系统,其中在肠胃外剂型中的某些或全部的减毒分枝杆菌与粘膜制剂中的不同。此外,肠胃外制剂(或粘膜制剂)可以含有一种以上的活的、减毒的分枝杆菌类型或菌株的混合物。此外,在某些情况下,制剂可以含有编码或投送分枝杆菌抗原的实体。例子包括但不限于各种不同质粒、病毒载体(例如腺病毒载体),以及被遗传工程改造以编码分枝杆菌抗原的非分枝杆菌属细菌(例如志贺氏菌)等。这样的实体可以包含在剂型中以代替活的、减毒的分枝杆菌,或者与活的、减毒的分枝杆菌一起包含在剂型中。
一旦使用后,本文描述的制剂引发了针对可能是病原性的分枝杆菌的免疫反应。使用“引发免疫反应”,我们是指抗原(一种或多种类型的活的、减毒的分枝杆菌)的使用导致了抗体的合成和/或CD4+或CD8+T细胞的增殖,和/或通过细胞外细胞因子染色、ELISA或其它本领域的专业技术人员所熟知的方法测定的细胞因子的分泌。制剂也可以用作疫苗。使用“疫苗”我们是指制剂引发了免疫反应,导致在被接种的宿主中针对带有与制剂中的活的、减毒的分枝杆菌的抗原相同或类似的抗原的分枝杆菌(例如病原性菌株)的激惹的保护作用。这种保护作用与没有预防接种(例如只使用佐剂)的对照生物体相比,完全或部分地防止或阻止了与感染相关的症状的发生。
在本发明的实践中使用的制剂可以只含有活的、减毒的分枝杆菌,或者制剂也可以含有不同的抗原性成分的混合物或“鸡尾酒”。例如,活的、减毒的分枝杆菌可以在还含有其它已知的疫苗成分、例如用于针对脊髓灰质炎、白喉、百日咳等的预防接种的成分、的制备物中使用。此外,制剂可以与其它的治疗方式结合使用,例如强化免疫系统的物质、各种不同的化疗药剂、其它的疫苗等。
肠胃外和粘膜给用的制剂的制备对于本领域的专业技术人员来说是众所周知的,其进一步的具体方法将在下面讨论。一般来说,这样的制剂被制备成液体溶液或悬浮于,但是固体形式例如片剂、丸剂、粉末等也可以考虑。也可以制备适合于在使用前溶解或悬浮在液体中的固体形式。制备物也可以被乳化。活性成分可以与可药用的并且与活性成分相容的赋形剂混合。适合的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖水、甘油、乙醇等,或其组合。此外,制剂可以含有少量的辅助物质例如增湿剂或乳化剂、pH缓冲剂等。本发明的疫苗制备物还可以含有佐剂,适合的例子包括但不限于Seppic、Quil A、Alhydrogel等。如果需要服用口服形式的制剂,可以加入各种不同的增稠剂、香料、稀释剂、乳化剂、分散辅助剂或粘合剂等。本发明的制剂可以含有任何这样的辅助成分以便为制剂提供适合于使用的形式。配方中活的、减毒的分枝杆菌的最终量可以变化。但是,总的来说,配方中的量应该为大约0.01-99%重量体积比。
在本发明的某些实施方案中,首先使用肠胃外制剂,而粘膜制剂在后来使用作为加强剂。但是,这个次序可以被颠倒,即可以首先使用粘膜制剂,而肠胃外制剂被用作加强剂。此外,在某些实施方案中,可以进行多次的加强,加强可以是肠胃外的也可以是粘膜的,或者二者同时。每轮用药之间的时间间隔的最优化在下面讨论。
一般来说,本发明的疫苗策略被用于免疫哺乳动物例如人类。但是,兽医应用也可以考虑。
活的减毒的分枝杆菌属菌株
在本发明的一个实施方案中,新的双组分TB疫苗的每个组分都含有活的减毒的分枝杆菌。具体的活的减毒的分枝杆菌属菌株对于本发明来说不是关键的,可以从任何分枝杆菌属的菌株中选择,包括但不限于结核分枝杆菌CDC1551株(参见例如Griffith等,Am.J.Respir.Crit.Care Med.Aug;152(2):808;1995)、结核分枝杆菌北京株(Soolingen等,1995)、结核分枝杆菌H37Ra株(ATCC#:25177)、结核分枝杆菌H37Rv株(ATCC#:25618)、牛分枝杆菌(ATCC#:19211和27291)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)(ATCC#:15073)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)(ATCC#:12051和12549)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)(ATCC#:35772和13209)、堪萨斯氏分枝杆菌(ATCC#:21982和35775)、鸟分枝杆菌(ATCC#:19421和25291)、鸡分枝杆菌(M.gallinarum)(ATCC#:19711)、牝牛分枝杆菌(M.vaccae)(ATCC#:15483和23024)、麻风分枝杆菌(M.leprae)(ATCC#:)、M.marinarum(ATCC#:11566和11567)以及M.microtti(ATCC#:11152)。
减毒的分枝杆菌属菌株的例子包括但不限于结核分枝杆菌泛酸盐营养缺陷型菌株(Sambandamurthy,Nat.Med.2002 8(10):1171;2002)、结核分枝杆菌rpoV突变型菌株(Collins等,Proc Natl Acad Sci USA.92(17):8036;1995)、结核分枝杆菌亮氨酸营养缺陷型菌株(Hondalus等,Infect.Immun.68(5):2888;2000)、BCG丹麦株(ATCC #:35733)、BCG日本株(ATCC #:35737)、BCG芝加哥株(ATCC # 27289)、BCG哥本哈根株(ATCC #:27290)、BCG巴斯德株(ATCC #:35734)、BCG Glaxo株(ATCC #:35741)、BCG Connaught株(ATCC #:35745)、BCG蒙特利尔株(ATCC #:35746)。此外,下面的美国专利,其中每个的全部内容在此因为参考,列出了可以用于本发明的实践的抗原:Andersen等的US 6,991,797;Gennaro等的US 6,596,281;Reed等的US 6,350,456;Reed等的US 6,290,969;Content等的美国专利5,955,356;以及Content等的美国专利US 5,916,558。
在本发明的另一个优选实施方案中,双组分TB疫苗可以含有携带过客核苷酸序列(“PNS”,即源自另一个生物体的异源的或外源的核苷酸序列)的减毒的分枝杆菌属菌株。PNS可以编码一个或多个内体水解蛋白,例如李斯特菌溶胞素(GenBank登记号CAA59919或CAA42639)、大肠杆菌溶血素(GenBank登记号AAC24352或CAA0535)以及Perfringolysin(GenBank登记号P19995或AAA23271),产生了降解内体的能力,或者部分导致了抗原泄漏到细胞质中,或者达到了内体破裂的程度,使分枝杆菌属逸出该亚细胞结构并驻留在细胞质中(Hess等,Proc Natl Acad Sci.,95:5299-5304;1998;Grode等,Clin Invest.,115:2472-2479;2005)。
在本发明的另一个实施方案中,减毒的分枝杆菌属菌株被修饰以增加凋亡,其中这样的菌株诱导了强烈的细胞免疫反应。凋亡是程序化细胞死亡,在其诱导与结果方面与坏死性细胞死亡有显著的不同。事实上,含有抗原的细胞的凋亡导致诱导了潜在的细胞免疫的过程被称为交叉引发(Heath等,Immunol Rev199;2004;Gallucci等,NatureBiotechnology.5:1249;1999;Albert等,Nature 392:86;1998)。导致增加的抗原特异性的细胞介导的免疫的凋亡的诱导有几种机制。Caspase8介导的凋亡导致了抗原特异性的细胞免疫保护作用(Sheridan等,Science 277:818;1997)。
因此,本发明的另一个实施方案提供了显示出增强的前凋亡性质的减毒的分枝杆菌属菌株,例如但不限于secA1分泌的缺少来自沙门氏杆菌(Salmonella enteriditis)(GenBank登记号1068147)、大肠杆菌(GenBank登记号1250070)或弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)(GenBank登记号1079977)的前导序列的SodA,或者也可以是天然不分泌的SodA蛋白,例如来自单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)EGD-e(GenBank登记号986791)的SodA。这样的减毒的分枝杆菌属菌株不产生细胞外Sod,因此不抑制宿主的免疫反应,而且它们表达细胞内Sod,从而使它们可以存活(Edwards等,Am.J.Respir.Crit.Care Med.164(12):2213-9;2001)。此外,显示出增强的前凋亡性质的减毒的分枝杆菌属菌株还可以携带失活的Rv3238c基因。
此外,Salmonella SopE(GenBank登记号AAD54239、AAB51429或AAC02071)或caspase-8(GenBank登记号AAD24962或AAH06737)被减毒的分枝杆菌在宿主细胞的细胞质中的表达,在该减毒的分枝杆菌表达抗原的情况下是诱导程序化细胞死亡的有力的方法,唤起了高水平的抗原特异性细胞免疫。
死亡受体-5(DR-5)、也被称为TRAIL-R2(TRAIL受体2)和TNFR-SF-10B(肿瘤坏死因子超家族成员10B),也介导caspase 8介导的凋亡(Sheridan等,1997)。呼肠弧病毒诱导的凋亡由TRAIL-DR5介导,导致随后对病毒的清除(Clarke等,J.Virol.74:8135;2000)。DR-5、例如人类的DR-5(GenBank登记号BAA33723)、疱疹病毒-6(HHV-6)的DR-5同源物(GenBank登记号CAA58423)等、在本发明的减毒的分枝杆菌中的表达,为诱导针对Mtb抗原的抗原特异性的细胞免疫提供了有力的辅助效果。
此外,宿主的抗原呈递细胞(例如巨噬细胞和树突状细胞)也能够通过Fas连接被诱导以经历凋亡,Fas连接是诱导抗原特异性细胞免疫反应的一种强的刺激物(Chattergoon等,Nat.Biotechnol.18:974;2000)。因此,表达Fas或Fas细胞质结构域/CD4胞外结构域融合蛋白的减毒的分枝杆菌将诱导凋亡并增强抗原特异性的细胞免疫反应。
概括来说,促进凋亡的诱导的减毒的分枝杆菌属菌株,为导致Mtb感染的细胞的免疫介导的细胞破坏、以及随后的Mtb感染的消除、减缓或防止的细胞反应的诱导,提供了有力的工具。
在本发明的另一个实施方案中,双组分的TB疫苗可以包括过量表达至少一种分枝杆菌抗原的减毒的分枝杆菌属菌株,该抗原包括但不限于Rv0125、Rv0203、Rv0287、Rv0288、Rv0603、Rv1196、Rv1223、Rv1271c、Rv1733c、Rv1738、Rv1804c、Rv1886、Rv2031、Rv2032、Rv2253、Rv2290、Rv2389c、Rv2626c、Rv2627c、Rv2779c、Rv2873、Rv2875、Rv3017c、Rv3407、Rv3804c、Rv3810或Rv3841。此外,过量表达的分枝杆菌抗原可以采用融合蛋白的形式,含有一种或多种该分枝杆菌融合蛋白,例如Mtb72f(14,60)、Hybrid-1(42,48)、Hyvac-4(21)等。
本发明可以应用于针对病原性分枝杆菌的疫苗的开发以及抗原投送疫苗载体的开发中。分枝杆菌载体在本文中被定义为任何被遗传工程改造的能够表达至少一种过客核苷酸序列(本文中称为“PNS”)的分枝杆菌,该PNS含有DNA或RNA,并且为任何下面提出的抗原、免疫调节因子或佐剂的组合编码。可以使用本技术领域现有的制剂和方法(Jacobs等,Nature 327:532-535;1987;Barletta等,ResMicrobiol.141:931-939;1990;Kawahara等,Clin Immunol.105:326-331;2002;Lim等,AIDS Res Hum Retroviruses.13:1573-1581;1997;Chujoh等,Vaccine,20:797-804;2001;Matsumoto等,Vaccine,14:54-60;1996;Haeseleer等,Mol Biochem Parasitol.,57:117-126;1993)将PNS导入染色体中或作为表达载体的一部分。
在本发明中,分枝杆菌载体可以带有为免疫原编码的PNS,该免疫原可以是来自病毒、细菌和寄生病原体的外源免疫原,也可以是内源的免疫原,例如但不限于自身免疫抗原或肿瘤抗原。免疫原可以是全长的天然蛋白、外源免疫原与内源蛋白或模拟物之间的嵌合融合子、来自病毒、细菌和寄生病原体的免疫原的一个或多个片段。
本文中使用的“外源免疫原”是指正常情况下不在受体动物的细胞或组织中表达的蛋白或其片段,例如但不限于病毒蛋白、细菌蛋白、寄生虫蛋白、细胞因子、免疫调节剂或治疗药剂。
“内源免疫原”是指自然情况下存在于受体动物的细胞或组织中的蛋白或其一部分,例如但不限于内源细胞蛋白、免疫调节剂或治疗药剂。可选的或另外的,免疫原可以由合成的基因编码,可以使用本领域的专业技术人员所熟知的常规的重组DNA方法来构建。
外源免疫原可以是任何病毒、细菌或寄生病原体在进入、定居在它们的动物宿主中或在宿主中复制之前或期间所表达的任何分子;分枝杆菌载体可以表达源自于病毒、细菌或寄生病原体的免疫原或其部分。这些病原体在人类、驯养动物或野生动物宿主中可能是有传染性的。
作为病毒抗原的来源的病毒病原体(即它们在天然条件下存在于的以及它们源自于的病原体),包括但不限于正粘病毒例如流感病毒(分类学ID:59771),逆转录病毒例如RSV、HTLV-1(分类ID:39015)、以及HTLV-II(分类学ID:11909),疱疹病毒例如EBV(分类学ID:10295)、CMV(分类学ID:10358)或单纯疱疹病毒(ATCC #:VR-1487),慢病毒例如HIV-1(分类学ID:12721)和HIV-2(分类学ID:11709),杆状病毒例如狂犬病毒,小核糖核酸病毒例如脊髓灰质炎病毒(分类学ID:12080),痘病毒例如痘苗病毒(分类学ID:10245),轮状病毒(分类学ID:10912),以及细小病毒例如腺伴随病毒1(分类学ID:85106)。
病毒抗原的例子可以在包括但不限于下列抗原的组中发现:人类免疫缺陷病毒抗原Nef(国立过敏性和传染性疾病研究所HIV储存目录号183;GenBank登记号AF238278)、Gag、Env(国立过敏性和传染性疾病研究所HIV储存目录号2433;GenBank登记号U39362)、Tat(国立过敏性和传染性疾病研究所HIV储存目录号827;GenBank登记号M13137)、Tat的突变衍生物例如Tat-D31-45(Agwale等,Proc.Natl.Acad.Sci.已付印,7月8日;2002)、Rev(国立过敏性和传染性疾病研究所HIV储存目录号2088;GenBank登记号L14572)、以及Pol(国立过敏性和传染性疾病研究所HIV储存目录号238;GenBank登记号AJ237568),以及T和B细胞抗原决定簇gp120(Hanke和McMichae1,AIDS Immunol Lett.,66:177;1999)(Hanke等,Vaccine,17:589;1999)(Palker等,J.Immunol.,142:3612-3619;1989)、HIV-1Env和gp120的嵌合衍生物例如但不限于gp120与CD4之间的融合(Fouts等,J.Virol.,74:11427-11436;2000)、截短的或修饰的HIV-1env的衍生物例如但不限于gp140(Stamatos等,J Virol,72:9656-9667;1998)或HIV-1 Env和/或gp140的衍生物(Binley等,J Virol,76:2606-2616;2002)(Sanders等,J Virol,74:5091-5100;2000)(Binley等,J Virol,74:627-643;2000)、乙肝表面抗原(GenBank登记号AF043578)(Wu等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,86:4726?4730;1989)、轮状病毒抗原例如VP4(GenBank登记号AJ293721;Mackow等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,87:518-522;1990)和VP7(GenBank登记号AY003871;Green等,J.Virol.,62:1819-1823;1988)、流感病毒抗原例如凝血素(GenBank登记号AJ404627;Pertmer和Robinson,Virology,257:406;1999)或核蛋白(GenBank登记号AJ289872;Lin等,Proc.Natl.Acad.Sci.,97:9654-9658;2000)、单纯疱疹病毒抗原例如胸腺嘧啶激酶(GenBank登记号AB047378;Whitley等,NewGeneration Vaccines,825-854;2004)。
作为细菌抗原的来源的细菌病原体包括但不限于分枝杆菌属菌株、幽门螺旋杆菌、沙门氏菌属菌株、志贺氏菌属菌株、大肠杆菌、立克次氏体属菌株、利斯特氏菌属菌株、嗜肺军团菌、假单胞菌属菌株、弧菌属菌株和博氏疏螺旋体。
细菌病原体的保护性抗原的例子包括产肠毒素大肠杆菌的菌体抗原例如CFA/I伞毛抗原(Yamamoto等,Infect.Immun.,50:925-928;1985)和热不稳定毒素的无毒性的B亚基(Klipstein等,Infect.Immun.,40:888-893;1983)、百日咳杆菌的pertactin(Roberts等,Vacc.,10:43-48;1992)、百日咳杆菌的腺甘酸环化酶-溶血素(Guiso等,Micro.Path.,11:423-431;1991)、破伤风梭菌的破伤风毒素的C片段(Fairweather等,Infect.Immun.,58:1323-1326;1990)、博氏疏螺旋体的OspA(Sikand,等,Pediatrics,108:123-128;2001;Wallich,等,Infect Immun,69:2130-2136;2001)、普氏立克次氏体和斑疹伤寒立克次氏体的保护性的类结晶表面层蛋白(Carl,等,Proc Natl Acad Sci USA,87:8237-8241;1990)、单核细胞增多性利斯特氏菌的李斯特菌溶胞素(也称为“Llo”和“Hly”)和/或超氧化物歧化酶(也称为“SOD”和“p60”)(Hess,等,Infect.Immun.65:1286-92;1997;Hess,等,Proc.Natl.Acad.Sci.93:1458-1463;1996;Bouwer,等,J.Exp.Med.175:1467-71;1992)、幽门螺旋杆菌的脲酶(Gomez-Duarte,等,Vaccine 16,460-71;1998;Corthesy-Theulaz,等,Infection & Immunity 66,581-6;1998)以及炭疽杆菌的致命毒素和/或保护性抗原的受体结合结构域(Price,等,Infect.Immun.69,4509-4515;2001)。
作为寄生虫抗原的来源的寄生虫病原体包括但不限于疟原虫属菌株例如镰状疟原虫(ATCC#:30145)、锥虫属菌株例如克氏锥虫(ATCC#:50797)、贾第鞭毛虫属菌株例如兰氏贾第鞭毛虫(ATCC#:30888D)、方头蜱属菌株、巴贝虫属菌株例如田鼠巴贝虫(ATCC#:30221)、内变形虫属菌株例如痢疾内变形虫(ATCC#:30015)、艾美耳球虫属菌株例如巨型艾美耳球虫(ATCC#40357)、利什曼原虫属菌株(分类学ID:38568)、血吸虫属菌株、布鲁格氏丝虫属菌株、Fascida spp.、恶丝虫属菌株、吴策线虫属菌株和盘尾丝虫属菌株。
寄生虫病原体的保护性抗原的例子包括疟原虫属菌株的环子孢子抗原(Sadoff等,Science 240:336-337;1988)例如P.bergerii的环子孢子抗原或镰状疟原虫的环子孢子抗原、疟原虫属菌株的裂殖性孢子表面抗原(Spetzler等,Int.J.Pept.Prot.Res.,43:351-358;1994)、痢疾内变形虫的半乳糖特异性外源凝集素(Mann等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:3248-3252;1991)、利什曼原虫属菌株的gp63(Russell等,J.Immunol.,140:1274-1278;1988;Xu和Liew,Immunol.,84:173-176;1995)、硕大利什曼原虫的gp46(Handman等,Vaccine,18:3011-3017;2000)、马来丝虫的副肌球蛋白(Li等,Mol.Biochem.Parasitol.,49:315-323;1991)、曼氏血吸虫的磷酸丙糖异构酶(Shoemaker等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:1842-1846;1992)、蛇形毛圆线虫分泌的类似珠蛋白的蛋白(Frenkel等,Mol.Biochem.Parasitol.,50:27-36;1992)、肝片血吸虫(Hillyer等,Exp.Parasitol.,75:176-186;1992)、牛血吸虫和日本血吸虫(Bashir等,Trop.Geog.Med.,46:255-258;1994)的谷胱甘肽-S-转移酶、以及牛血吸虫和日本血吸虫的KLH(Bashir等,同上,1994)。
正如以前提到的那样,分枝杆菌载体可以带有为内源免疫原编码的PNS,内源免疫原可以是任何可以在受体细胞中表达的细胞蛋白、免疫调节剂或治疗药剂或其部分,包括但不限于肿瘤、移植和自身免疫免疫原、或肿瘤、移植和自身免疫免疫原的片段和衍生物。因此,在本发明中,分枝杆菌载体可以带有编码肿瘤、移植或自身免疫免疫原或其部分或片段的PNS。此外,分枝杆菌载体也可以带有编码肿瘤特异性、移植或自身免疫抗原或其部分的合成的PNS(如上所述)。
肿瘤特异性抗原的例子包括前列腺特异性抗原(Gattuso等,HumanPathol.,26:123-126;1995)、TAG-72和CEA(Guadagni等,Int.J.Biol.Markers,9:53-60;1994)、MAGE-1和酪氨酸酶(Coulie等,J.Immunothera.,14:104-109;1993)。最近,在小鼠中已经显示,使用表达肿瘤抗原的非恶性细胞进行预防接种提供了疫苗的效果,也帮助动物建立起免疫反应以清除表达同样抗原的恶性肿瘤细胞(Koeppen等,Anal.N.Y.Acad.Sci.,690:244-255;1993)。
移植抗原的例子包括T细胞上的CD3分子(Alegre等,Digest.Dis.Sci.,40:58-64;1995)。使用针对CD3受体的抗体进行治疗,已经显示出快速地清除了循环系统中的T细胞,并逆转了细胞介导的移植排斥(Alegre等,同上,1995)。
自身免疫抗原的例子包括IAS b链(Topham等,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,91:8005-8009;1994)。用来自IASβ链的18个氨基酸的肽接种小鼠,已经被证实为患有实验性自身免疫脑脊髓炎的小鼠提供了保护和治疗(Topham等,同上,1994)。
表达佐剂的分枝杆菌载体
构建带有为免疫原和佐剂编码的PNS的分枝杆菌载体是可行的,可用于引发增强的针对载体和PNS编码的免疫原的宿主反应。此外,构建带有为佐剂编码的PNS的分枝杆菌“配对”载体也是可行的,该载体与另一个带有为至少一个免疫原编码的PNS的分枝杆菌载体混合在一起使用,以增强对该另一个分枝杆菌载体编码的免疫原的宿主反应。
插入在该分枝杆菌载体中的PNS编码的具体的佐剂对于本发明来说不是关键的,可以是来自任何经典的霍乱弧菌(例如霍乱弧菌菌株395,ATCC # 39541)或El Tor霍乱弧菌(例如霍乱弧菌菌株2125,ATCC#39050)的菌株的霍乱毒素的A亚基(即CtxA;GenBank登记号X00171、AF175708、D30053、D30052)或其部分和/或突变的衍生物(例如Ctx的A亚基的A1结构域(即CtxA1;GenBank登记号K02679))。此外,任何属于细菌腺嘌呤二磷酸核糖基化外毒素家族的成员的细菌毒素,也可以被用来代替CtxA,例如产肠毒素的大肠杆菌的热不稳定的毒素的A亚基(在本文中称为EltA)(GenBank登记号M35581)、百日咳毒素的S1亚基(例如ptxS1,GenBank登记号AJ007364、AJ007363、AJ006159、AJ006157等);作为另一个可选方案,佐剂可以是百日咳博德特氏菌(ATCC # 8467)、支气管炎博德特氏菌(ATCC # 7773)或副百日咳博德特氏菌(ATCC # 15237)的腺苷酸环化酶-溶血素之一,例如百日咳博德特氏菌(GenBank登记号X14199)、副百日咳博德特氏菌(GenBank登记号AJ249835)或百日咳博德特氏菌(GenBank登记号Z37112)的cyaA基因。
表达免疫调节剂的分枝杆菌载体
还有另一种方法需要使用带有至少一个为免疫原和细胞因子编码的PNS的分枝杆菌载体,用来引发增强的对PNS编码的免疫原分枝杆菌载体的宿主反应。此外,构建带有单独为该细胞因子编码的PNS的分枝杆菌载体是可能的,该载体与至少一个带有为免疫原编码的PNS的分枝杆菌载体混合在一起使用,以增加针对配对的分枝杆菌载体表达的PNS编码的免疫原的宿主反应。
分枝杆菌载体编码的具体的细胞因子对于本发明来说不是关键的,包括但不限于白介素-4(在本文中称为“IL-4”;GenBank登记号AF352783(鼠IL-4)或NM_000589(人类IL-4))、IL-5(GenBank登记号NM_010558(鼠IL-5)或NM_000879(人类IL-5))、IL-6(GenBank登记号M20572(鼠IL-6)或M29150(人类IL-6))、IL-10(GenBank登记号NM_010548(鼠IL-10)或AF418271(人类IL-10))、IL-12p40(GenBank登记号NM_008352(鼠IL-12p40)或AY008847(人类IL-12p40))、IL-12p70(GenBank登记号NM_008351/NM_008352(鼠IL-12p35/40)或AF093065/AY008847(人类IL-12p35/40))、TGFb(GenBank登记号NM_011577(鼠TGFb1)或M60316(人类TGFb1))以及TNFa(GenBank登记号X02611(鼠TNFa)或M26331(人类TNFa))。
分枝杆菌菌株的构建与繁殖
上述的分枝杆菌菌株可以使用本技术领域众所周知的标准分子生物学技术来制造例如,限制性内切酶(在本文中称为“REs”;NewEngland Biolabs Beverly,MA)、T4 DNA连接酶(New England Biolabs,Beverly,MA)和Taq聚合酶(Life Technologies,Gaithersburg,MD)按照制造商的说明书使用;质粒DNA使用小规模(Qiagen 试剂盒,Santa Clarita,CA)或大规模(Qiagen 试剂盒,SantaClarita,CA)质粒DNA纯化试剂盒按照制造商的说明书(Qiagen,SantaClarita,CA)制备;无核酸梅的分子生物学级的milli-Q水、Tris-HCl(pH7.5)、EDTA pH 8.0、1M MgCl2、100%(v/v)乙醇、超纯琼脂糖以及琼脂糖凝胶电泳缓冲液从Life Technologies,Gaithersburg,MD购买。RE消化、PCR、DNA连接反应和琼脂糖凝胶电泳按照众所周知的方法进行(Sambrook,等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual.《分子克隆实验指南》1,2,3;1989;Straus等,Proc Natl Acad Sci USA.Mar;87(5):1889-93;1990)。在下面部分中描述的用于证实每个重组质粒的DNA序列的核苷酸测序通过常规的自动化DNA测序技术使用373A型Applied Biosystems自动测序仪来进行。
PCR引物可以从供应商例如Sigma(St.Louis,MO)购买,以及使用Applied Biosystems DNA合成仪(373A型)来合成。PCR引物的使用浓度为150-250mM,PCR反应的退火温度使用克隆管软件4.1版(Scientific and Educational Software Inc.,Durham,NC)来确定。PCRs在400880型Strategene Robocycler(Strategene,La Jolla,CA)中进行。用于扩增的PCR引物使用克隆管软件4.1版(Scientific andEducational Software Inc.,Durham,NC)来设计。该软件能够设计PCR引物,并鉴定与被操作的具体的DNA片段相容的RE位点。PCRs在热循环仪装置例如400880型Strategene Robocycler(Strategene)中进行,在PCRs中引物的退火、延伸和变性的时间按照标准方法来设置(Straus等,同上,1990)。RE消化和PCRs随后通过琼脂糖凝胶电泳使用标准程序进行分析digestions and the PCRs are subsequently analyzed byagarose gel electrophoresis using standard procedures(Straus等,同上,1990;Sambrook等,同上,1989)。阳性克隆被定义为显示出适合的RE图谱和/或PCR图谱的克隆。通过该过程鉴定的质粒可以使用上面描述的标准的DNA测序步骤来进一步评估。
大肠杆菌菌株例如DH5a和Top10,可以从Invitrogen(Gaithersburg,MD)购买,用作在下面的实施例中描述的重组质粒的起始宿主。重组质粒使用高压电脉冲装置例如Gene Pulser(BioRad Laboratories,Hercules,CA)通过电穿孔导入到大肠杆菌中,电脉冲装置正如描述的那样设置为100-200W、15-25mF和1.0-2.5kV(Ausubel等,同上)。通过确定产生每个细菌每毫克DNA的最大转化率时的设置来鉴定最适的电穿孔条件。
实验室细菌菌株生长在胰蛋白酶消化的大豆琼脂培养基(Difco,Detroit,MI)或胰蛋白酶消化的大豆液体培养基(Difco,Detroit,MI)中,这些培养基按照制造商的指导制作。除非说明,否则所有的细菌到生长在37℃在、5% CO2环境中,轻轻摇动。在适当的时候可以在培养基中添加抗生素(Sigma,St.Louis,MO)。细菌菌株以大约每毫升109克隆形成单位(在本文中称为“cfu”)的量悬浮在含有30%甘油(v/v;Sigma,St.Louis,MO)中(Difco),储存在-80℃下。
现有的技术也教授了将改变的等位基因导入分枝杆菌菌株中的方法,本领域的专业技术人员将能够解释和执行该方法(Parish等,Microbiology,146:1969-1975;2000)。一种新的产生等位基因交换质粒的方法需要使用合成的DNA。这种方法的优点是质粒产物具有高度确定的历史,符合21CFR(21CFR207.31,607),而以前使用的方法尽管有效,但具有难以证明的实验室培养记录,因此不可能符合21CFR。如果产品需要获得美国和欧洲管制机构的许可用于人类,则符合该规范是必需的(21CFR 601.2,600-680)。
用于分枝杆菌中进行等位基因交换的自杀载体是能够在大肠杆菌中复制、但是不能在分枝杆菌例如Mtb和BCG中复制的质粒。在本发明的等位基因交换步骤中使用的具体的自杀质粒不是非常重要的,可以从学术(Parish等,同上,2000)和商业来源获得的自杀质粒中选择.优选的用于等位基因交换的自杀质粒的涉及显示在图2中。质粒含有下列的DNA片段:用于质粒在大肠杆菌中的复制的oriE序列(GenBank登记号L09137),用于在大肠杆菌和分枝杆菌中的筛选的卡那霉素抗性序列(GenBank登记号AAM97345)以及其它的抗生素选择标记(例如zeocin抗性基因(GenBank登记号AAU06610)),它在分枝杆菌的启动子(例如hp60启动子)控制之下。第二个抗生素抗性标记不是必需的,但是包含它可以进行双倍选择,以防止在等位基因交换过程中自发的卡那霉素抗性分离株的自然的发生(Garbe等,Microbiology.140:133-138;1994)。
这样的自杀载体的构建可以使用本文描述的标准的重组DNA技术来进行。但是,现有的管理标准(例如21CFR)提高了人们对引入从暴露于含有传染性海绵状脑病(BSE)朊粒的牛产品的材料获得的朊粒的恐惧。因此,为了避免将材料(例如DNA序列)引入未知来源的靶菌株,优选情况下所有自杀载体中的DNA都是通过商业来源(例如Picoscript,Inc.)合成制造的。因此,构建自杀载体的优选方法是使用DNA软件(例如Clone Manager)汇集出DNA序列的蓝图,然后在付费服务的基础上通过任何提供这种服务的商业化供应者(例如Picoscript,Inc.)合成DNA。
自杀载体带有为至少一个用于部分二倍体的阳性选择的抗生素选择标记编码的序列。为了在等位基因交换的移除期中进行阴性筛选,包含了赋予蔗糖敏感性表现型的sacB基因(GenBank登记号AAA22724或AAA72302),以富集含有经历了最后的DNA重组步骤并完成了等位基因交换的菌株的培养物。
分枝杆菌菌株的培养
将选出的分枝杆菌菌株培养在液体培养基中,例如Middlebrook7H9或Saulton合成培养基中,优选在37℃下。菌株可以被维持作为静止或搅拌培养物。此外,BCG的生长速度可以通过加入油酸(0.06%v/v;Research Diagnostics,目录号01257)和去污剂例如Tyloxapol(0.05%v/v;Research Diagnostics,目录号70400)来增加。分枝杆菌培养物的纯度可以通过在3.5英寸的含有25-30ml的固体培养基例如Middlebrook 7H10培养基的平板上,均匀地涂布100mcl用磷酸盐缓冲液(在本文中称为PBS)稀释的分枝杆菌培养物无菌稀释液(例如每个步骤稀释10倍,到10-8)的等份试样来评估。此外,培养物的纯度还可以使用在21CFR610.12中描述的可商购的培养基例如硫代乙醇酸培养基(www.sciencelab.com,目录号1891)和大豆-酪蛋白培养基(BD,目录号211768)来进一步评估。
分枝杆菌种子以0.1-2 x 107cfu/ml的密度储存在-80℃。液体培养物一般在相对无菌对照的光密度(600nm处)为0.2-4.0时收获;将培养物放置在适当大小的离心管中,菌体在8,000xg离心5-10min。丢弃上清液,将菌体以0.1-2 x 107cfu/ml的密度重新悬浮在由含有10-30%甘油的Middlebrook 7H9构成的储存溶液中。将这些悬浮液分装到无菌的1.5ml的硼硅酸盐冷冻管中,每个含有1ml等份试样,然后放置在-80℃。
双组分TB疫苗的生产
i)主培养前种子的定性
在生产主培养种子库(被定义为来自在液氮的液体或蒸汽相中冷冻保存的等份试样中的单个组织或细胞的组分一致的细胞集合体)之前,通过在8.75cm的含有25-30ml的固体培养基(Middlebrook 7H10)的平板上均匀地涂布100mcl用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的培养物无菌稀释液(例如每个步骤稀释10倍,到10-8)的等份试样来重新评估分枝杆菌疫苗的纯度。培养物的纯度也可以使用商业化购买的试剂盒来评估。PCR、质粒DNA的限制性内切酶分析以及DNA杂交被用于证实在每个分枝杆菌分离株中所需的基因型的存在。所有的PCR产生的DNA片段都将通过自动化的双脱氧核苷酸测序技术进行测序,以证实全长基因的存在。
候选的分枝杆菌属菌株过量表达TB抗原或表达外源抗原的能力按照下面的描述进行检测。菌株按照上面的描述进行培养。当培养物达到对数期中期-静止期时,按照以前的描述(31)制备全细胞裂解液,将培养上清液通过0.2-mm的膜过滤器进行过滤。将全细胞裂解液和培养物滤液蛋白(CFPs)在10-15% SDS-PAGE凝胶上分离,转移到尼龙滤膜上,用PfoA特异性兔血清(在PBS中稀释1000到5000倍)染色,使用化学发光的免疫检测技术来显示。通过在10-15% SDS-PAGE凝胶上分离全细胞裂解液和CFPs、转移到尼龙滤膜上、用特异性针对所需蛋白的mAbs进行染色、然后使用化学发光的免疫检测技术进行显示,来评估抗原的表达。
为了评估候选的分枝杆菌疫苗菌株的内体水解蛋白例如Llo和PfoA的分泌,按照上面的描述挑取菌落并培养到对数期中期。按照描述制备全细胞裂解液(Anacker等,J.Immunol.,98:1265-73;1967;Calaco等,Biochem Soc Trans.,32:626-8;2004),然后按照以前的描述(31)收集这些培养物的培养上清液,并通过0.2mm的膜过滤器进行过滤。将全细胞裂解液和培养物滤液蛋白在10-15% SDS-PAGE凝胶上分离,转移到尼龙滤膜上,用PfoA特异性兔血清(在PBS中稀释1000到5000倍)染色,使用化学发光的免疫检测技术进行显示。PfoA蛋白为大约56kDa,在来自rBCG-Pfo+菌株的培养物的上清液中可以检测到。此外,rBCG-Pfo+上清液和全细胞悬浮液在含有0.1% BSA的PBS中的连续稀释液中的溶血活性,使用绵羊红细胞按照以前的描述(27)进行证实。该分析中的阳性结果与内体泄漏的表现型相关(27,52)。
ii)主培养种子的制备
主培养种子在C级洁净室中生产。所有将用于生产主培养种子的设备将被批准。小瓶、摇瓶等的开关在生物安全柜(级别100)中操作。被批准的蒸汽灭菌器(高压蒸汽灭菌器)被用于培养基、摇瓶和发酵罐部件的灭菌。主培养前种子的等份试样被用于接种5个每个含有500ml修改的Middlebrook培养基的2升摇瓶。在转速设置为120rpm的回转摇床中在37℃下进行培养。在完成主培养种子的生长之后,加入甘油至终浓度为10%(v/v),1ml的等份试样置于冷冻管中于-80℃储存。
iii)主培养种子的定性
用于定性和QC主培养种子的分析方法显示在下表中。
表1.rBCG-HIV主培养种子的QC和交付
测试/研究 | 测试方法 | 类型 |
抗生素敏感性 | 临床筛选 | 交付 |
缓冲液组成,渗透压 | 生物分析仪 | 交付 |
特征,菌落形态学 | 固体培养基平板培养 | 交付 |
特征,基因型和表现型 | 微阵列与蛋白质组分析 | QC |
HIV抗原表达 | 定量PAGE或Western印迹 | 交付 |
HIV基因稳定性 | PCR | QC |
表达,pfo | SRBC溶血分析 | 交付 |
效价,CFU | 平板稀释 | QC |
稳定性/效价 | 固体培养基平板培养 | QC |
无菌性/生物载荷 | 直接接种 | 交付 |
iv)临床实验材料的cGMP生产
双组分TB疫苗制造工艺的概要显示在图1中。厂房设备的设计符合从I期临床到产品下线的所有管制要求。换衣间和气锁为人员进入厂房和将设备移进和移出划定的区域提供了关卡。制造厂房中的生物安全柜(级别100)被用于在制造厂房的级别100000的房间中无菌转移接种物。小瓶、摇瓶等的开关在生物安全柜(级别100)中操作。被批准的蒸汽灭菌器(高压蒸汽灭菌器)被用于培养基、摇瓶和发酵罐部件的灭菌。厂房和环境监控系统被证实有效。
在制造I期临床实验材料之前,环境监控以及卫生标准操作步骤(SOPs)被证实有效。此外,通过在疫苗生产过程的模拟无菌生产操作的不同阶段使用胰蛋白酶水解的酪蛋白-大豆液体培养基作为转移液体进行了三份平行试验,来证实无菌过程是有效的。
接种物在C级洁净室中中制备,在接种物制备期间培养物的接种在级别100的生物安全柜中进行。为了制备接种物,将细菌主培养种子在37℃的摇床中从1ml扩增到50ml,然后到500ml。然后将500ml的培养物用于接种20L发酵罐。发酵在10L培养基(参见上面)中进行,该培养基在接种前在被批准的高压蒸汽灭菌器中于121℃灭菌1小时。在发酵过程中温度被控制在37℃,通过以100-300rpm运行的带有两个6个扁平叶片的搅拌器来进行混合,搅拌以及适当的通气速度用于将发酵罐中的细菌培养物中的溶解氧比率维持在20%。发酵罐中培养液的pH使用无菌的pH电极来监控,该电极与pH控制器相连,设置点的范围为pH6.8-7.2。通过外周泵的开-关/PID激活通过加入HCl或NaOH来自动控制pH。为了监控生物量,在发酵运行过程中每天取样,通过在540nm测量光密度来确定生物量。在无细胞细菌培养基中的甘油、葡萄糖和其它成分的水平通过Biolyzer测定。
v)收获
完成发酵罐中的生产之后,将培养液无菌收集在无菌的离心管中,并离心收集生物体。将生物体重新悬浮在清洗缓冲液中,然后通过离心收获。将一部分洗过的细菌以5 x 105cfu/ml的浓度重新悬浮在制剂溶液中。剩余部分作为大批材料储存在含有10%(v/v)甘油的培养基中。
vi)产品的无菌填充和冷冻干燥
双组分TB疫苗被配制(参见下面的详细情况)并进行QC测试,然后无菌填充和冷冻干燥。使用被批准的填充方法和质量控制,将悬浮在制剂溶液中的含有一剂人用疫苗的1ml等份试样人工转移到2mLI型琥珀色玻璃管中。冷冻干燥按照描述单批制作(Hubeau等,Clin.Exp.Allergy,33:386-93;2003;Kawahara等,Clin.Immunol.,105:326-31;2002;Gheorghiu等,Dev Biol Stand.,87:251-261;1996)。密封使用带槽的氯丁橡胶塞,用20mm的中心可沿虚线撕开的铝密封盖加固。每个小瓶含有可抽取的单剂产品。
vii)候选疫苗的质量控制和交付
用于分枝杆菌疫苗的基本实验要求由美国FDA、欧洲国家(EMEA)规定,并进一步按照世界卫生组织的指南进行国际化指导。希望双组分TB疫苗能够进行目前所有对BCG疫苗来说所要求的实验。。也希望双组分TB疫苗能够进行对于疫苗表达的抗原来说规定需要进行的功能性实验。此外,双组分TB疫苗还应该能够进行美国FDA和EMEA目前要求的研究性安全性实验。
在双组分TB疫苗的生产中建议的实验计划被设计用于满足目前对于下述方面的良好的生产实践的要求:1)质量控制;2)对于BCG疫苗的管制实验要求;3)其它的对于表达的酶/抗原的实验要求;以及满足4)对于I期临床实验的所有研究性药物安全性实验的要求。
表2.冷冻的大批产品的交付测试
测试/研究 | 测试方法 | 类型 |
缓冲液成分,渗透压,pH | 生物分析仪 | 交付 |
甘油含量 | 生物分析仪 | 交付 |
一致性 | 稀释涂板 | 交付 |
效价,CFU | 稀释涂板 | 交付 |
表3.最终产品的交付测试
测试/研究 | 测试方法 | 类型 |
内毒素 | 生色LAL分析 | 交付 |
无菌性 | 直接接种 | 交付 |
缓冲液成分,渗透压 | 生物分析仪 | 交付 |
特征,菌落形态 | 固体培养基平板培养 | 交付 |
特征,基因型和表现型 | 微阵列和蛋白质组分析 | 交付 |
表达,抗原 | 定量PAGE或Western印迹 | 交付 |
残留细胞溶素,(pfo) | SRBC溶血分析 | 交付 |
效价,CFU | 平板稀释 | QC |
稳定性/效价 | 固体培养基平板培养 | QC |
填充体积(靶体积0.5mL) | 称量 | 交付 |
残留水分(冷冻干燥制备物) | Karl-Fischer | QC |
外观 | 目测检查 | 交付 |
标签检查 | 目测检查 | 交付 |
豚鼠皮肤测试 | FDA要求 | 交付 |
表4.临床实验材料的交付测试
测试/研究 | 测试方法 | 规格 | 类型 |
修改的总的安全性 | FDA | 标明 | 安全性 |
免于毒性Mtb的豚鼠 | FDA要求 | 标明 | 交付 |
急性毒性 | EU | 标明 | 安全性 |
急性与长期毒性 | FDA | 标明 | 安全性 |
配制策略
i)肠胃外制剂
本文使用的“肠胃外制剂”是指适合用于例如皮下、真皮内或肌肉内给药的制剂。这样的给药可以通过本领域的专业技术人员所熟知的任何方法来进行,例如使用针头、气枪、旋转刺血针、“Mono-vacc”类型的装置或任何其它适合的装置等注射。疫苗配制的策略是在对生产过程中的存活率和稳定性进行确定的研究的基础上建立的。这包括使用各种通常用于培养分枝杆菌的培养基、该培养基中添加了甘油、糖、氨基酸和去污剂或盐、来确定在培养过程中最大的生物体存活率(活的比死的)。培养后通过离心或切向流过滤收获细胞,然后将细胞重新悬浮在使得细胞在冷冻、冷冻干燥或泡沫干燥过程中得到保护的稳定化的培养基中。常用的稳定剂包括谷氨酸钠、或氨基酸或氨基酸衍生物、甘油、糖或常用的盐。最终的制剂将提供足够的活的生物体用于通过真皮内、皮下或肌肉内投送,具有足够的稳定性以维持足够的储存期限用于分发和使用。
ii)粘膜制剂
本文使用的“粘膜制剂”是指适合用于口部(例如通过口摄取液体或固体形式、或者通过摄取含有抗原性成分的食物制品)、鼻部(例如通过吸入或滴加)、直肠(例如通过栓剂或液体)等给药的制剂。粘膜制剂的配制依赖于靶粘膜给药路线。粘膜制剂一般情况下与可药用的载体或稀释剂一起使用。具体的使用的可药用的载体或稀释剂对本发明来说不是关键的。稀释剂的例子包括磷酸盐缓冲液、用于缓冲胃中的胃酸的缓冲液、例如含有蔗糖的柠檬酸缓冲液(pH7.0)、单独的碳酸氢盐缓冲液(pH7.0)(Levine等,J.Clin.Invest.,79:888-902;1987;Black等,J.Infect.Dis.,155:1260-1265;1987)、或含有抗坏血酸、乳糖和可选的阿斯巴甜的碳酸氢盐缓冲液(pH 7.0)(Levine等。Lancet,II:467-470;1988)。载体的例子包括蛋白例如在脱脂奶中发现的蛋白、糖例如蔗糖、或聚乙烯吡咯烷酮。典型情况下这些载体的使用浓度为大约0.1-90%(w/v),但是优选在1-10%(w/v)的范围内。此外,口服制剂可以包含可商购的产品,例如CeraVacx(Cera Inc,BaltimoreMaryland),它已知可以增加活的口服细菌疫苗在口服后的存活力(Cohen等,Infect.Immun.,70:1965-1970;2002;Sack等,Infect Immun.,65:2107-2111;1997)。此外,口服制剂可以在肠包被胶囊中投送以通过胃部。
TB疫苗制剂的临床前评估
i)通用安全性试验
使用2 x 106CFU的所需的分枝杆菌属菌株和类似的父本菌株腹膜内感染每组6只BALB/c小鼠。在感染后14天监控动物的总的健康状况和体重。接受了分枝杆菌的动物保持了健康,在观察期间即没有体重减轻也没有显示出疾病的明显的征兆。
ii)新的分枝杆菌属菌株在具有免疫能力的小鼠中的毒力
每组15只具有免疫能力的BALB/c小鼠用2 x 106cfu分枝杆菌属菌株进行静脉内接种。在感染后第一天,每组中的3只小鼠被处死,分析脾脏、肺脏和肝脏中的CFU以确保每只动物具有相等的感染剂量。在感染后4、8、12和16周,每组3只小时被处死,并获得脾脏、肺脏和肝脏中的CFU以评估分枝杆菌属菌株与父本分枝杆菌属菌株相比的体内生长。预期分枝杆菌属菌株将显示出比野生型分枝杆菌降低的毒力。
iii)在无免疫应答的小鼠中的严格安全性试验
每组10只具有SCID(重度联合免疫缺损)的无免疫应答的小鼠分别用2 x 106CFU的分枝杆菌属菌株和野生型分枝杆菌属菌株进行静脉内感染。在感染后第一天,每组中的3只小鼠被处死,评估脾脏、肝脏和肺脏中的CFU以证实接种剂量。每个组中剩余的7只小鼠被监测总的健康情况和体重。这些小鼠的存活被跟踪,如果分枝杆菌感染的小鼠的存活期被延长超过了野生型菌株接种的小鼠的存活期,则证实了毒力的降低。
iv)豚鼠安全性试验
减毒的分枝杆菌属菌株的安全性也在豚鼠模型中与BCG(例如BCG哥本哈根株)相比进行了评估,后者在人类中已经具有建立好的安全性轮廓。首先,研究了疫苗对动物的总的健康状况、包括体重增加的影响。使用107(100倍的预防接种剂量)cfu的重组和父本菌株肌肉内免疫豚鼠,在6周内监测动物的总的健康状况和体重。对于在6周的时间结束之前死亡的动物进行了尸体解剖。在感染后6周结束的时候将所有的动物处死,进行宏观病理学检验。在6周的尸体检验时没有体重减轻、没有异常的行为,所有的器官表现正常。分枝杆菌属菌株被认为是减毒的,因为在用该减毒的分枝杆菌属菌株接种的动物中没有观察到对健康不利的效应,并且动物与用对照的BCG菌株接种的动物相比,以正常的速度增加体重。
同时,监测了在动物器官中的活的细菌的数量。豚鼠用BCG或减毒的分枝杆菌属菌株免疫接种。在接种后2、4、6、8和10周,每组5只动物被安乐死,收获组织包括区域性(腹股沟)淋巴结、肺脏、脾脏和肝脏,匀浆,通过以前描述的(Turner等,Infect.Immun.,68:3674-3679;2000;McMurray等,Infect.Immun.50:555-559;1985;Wiegeshaus等,Am.Rev.Respir.Dis.,102:422-429;1970)平板计数来确定活的BCG或减毒的分枝杆菌的数量。
v)毒性试验
为了评估减毒的分枝杆菌属菌株的毒性,每组12只豚鼠分别用一剂4倍高于、一剂等于、以及一剂4倍低于单剂人类剂量的减毒的分枝杆菌属菌株、BCG或盐水进行内皮内预防接种。接种后3天,每组6只动物被处死,以评估减毒的分枝杆菌对这些动物的急性影响。在接种后28天,每组中剩余的6只动物被处死,以评估减毒的分枝杆菌对动物的慢性影响。在两个时间点,获得了每只动物的体重;并检验了宏观病理学和注射位点的外观。取血用于血液化学,并进行内部器官和注射位点的组织病理学检验。如果减毒的分枝杆菌属菌株的毒性等于或小于BCG的毒性,则该菌株被视为安全的。
疫苗效价的定性
i)皮肤延迟类型的超敏性(DTH)的诱导
不含特定病原体(SPF)的豚鼠用103减毒的分枝杆菌或BCG进行真皮内预防接种。接种后9周,将动物背部的毛剃掉,真皮内注射溶于100μl磷酸盐缓冲液的10μg PPD。24小时后,测量硬结的直径。减毒的分枝杆菌属菌株被预计能够诱导与参比的BCG菌株诱导的相比相等的或更多的DTH。
ii)鼠保护研究
为了确定新的双组分TB疫苗针对Mtb激惹的效价,每组13只C57B1/6小鼠(雌性,5-6周龄)用双组分TB疫苗的引发组分、BCG或盐水进行预防接种。典型情况下,106cfu的引发组分和BCG对照被真皮内给药。但是,引发组分也可以通过粘膜接种途径进行给药,优选口服,剂量为104-109cfu,优选106-107cfu。口服引发组分的配方在上面和别处有描述(Adwell等,Vaccine,22:70-76;2003;Buddle等,Vaccine,23:3581-3589;2005)。
引发后6到24周、优选10到17周、最优选17周后,用双组分TB疫苗的引发组分接种的小鼠用双组分TB疫苗的加强组分进行加强。接受肠胃外引发的动物通过粘膜途径、优选口服途径进行加强;而接受粘膜引发的动物通过肠胃外途径进行加强。肠胃外加强组分通过皮下、真皮内或肌肉内给药,优选真皮内给药,剂量为106cfu。粘膜加强组分通过粘膜接种途径给药,优选为口服途径,剂量为104-109cfu,优选106-107cfu。
最后一次接种后10周,小鼠用Mtb Erdman菌株(或H37Rv卡那霉素抗性菌株)激惹,激惹用从10ml含有总共107cfu的激惹菌株的单细胞悬浮液产生的气溶胶进行,该剂量给每个动物的肺部投送100个活的细菌,正如以前描述的那样(Turner等,Infect.Immun.,68:3674-3679;2000;McMurray等,Infect.Immun.50:555-559;1985;Wiegeshaus等,Am.Rev.Respir.Dis.,102:422-429;1970)。试验动物与未激惹的动物一起被监测存活。在激惹之后,也监测动物的体重减轻和总体健康。在激惹后第一天,每组3只小鼠被处死,检测肺部cfu以证实激惹剂量,1只被处死,用于脾脏和肺部组织病理学检测。然后在激惹5周后,每组9只动物被处死,进行动物的组织病理学和微生物学分析。对来自6只小鼠的肺脏和脾脏组织进行cfu计数评估(带有选择添加物的平板被用于辨别疫苗菌株和激惹菌株)。如果用H37Rv-kan抗性菌株激惹,Kan或TCH被用于辨别激惹菌株与疫苗菌株。如果用Mtb Erdman菌株激惹,TCH被用于辨别疫苗菌株与激惹菌株(BCG是易感的,但是Mtb天然具有抗性)。
iii)豚鼠激惹研究
为了进一步对减毒的分枝杆菌疫苗针对Mtb激惹的效价进行定性,每组12只豚鼠(年轻的成年SPF Hartley,250-300克,雄性)用双组分TB疫苗的引发组分、BCG或盐水进行预防接种。典型情况下,106cfu的引发组分和BCG对照被真皮内给药。但是,引发组分也可以通过粘膜接种途径进行给药,优选口服,剂量为104-109cfu,优选106-107cfu。口服引发组分的配方在上面和别处有描述(Adwell等,Vaccine,22:70-76;2003;Buddle等,Vaccine,23:3581-3589;2005)。
引发后6到24周、优选10到17周、最优选17周后,用双组分TB疫苗的引发组分接种的豚鼠用双组分TB疫苗的加强组分进行加强。接受肠胃外引发的动物通过粘膜途径、优选口服途径进行加强;而接受粘膜引发的动物通过肠胃外途径进行加强。肠胃外加强组分通过皮下、真皮内或肌肉内给药,优选真皮内给药,剂量为106cfu。粘膜加强组分通过粘膜接种途径给药,优选为口服途径,剂量为104-109cfu,优选106-107cfu。
最后一次接种后10周,小鼠用Mtb Erdman菌株(或H37Rv卡那霉素抗性菌株)激惹,激惹用从10ml含有总共107cfu的激惹菌株的单细胞悬浮液产生的气溶胶进行,该步骤给每个动物的肺部投送100个活的细菌,正如以前描述的那样(Brodin等,2004)。激惹之后,动物与健康组的为接种、未激惹的动物一起被监测存活。在激惹之后,也监测动物的体重减轻和总体健康。在激惹后10天每组6只动物被处死,每组的剩余6只动物在激惹后70周被处死,用于长期评估。在两个时间点都进行动物的组织病理学和微生物学分析。对肺脏和脾脏组织进行组织病理学和cfu计数评估(带有选择添加物的平板被用于辨别疫苗菌株和激惹菌株)。如果用H37Rv-kan抗性菌株激惹,Kan或TCH被用于辨别激惹菌株与疫苗菌株。如果用Mtb Erdman菌株激惹,TCH被用于辨别疫苗菌株与激惹菌株(BCG是易感的,但是Mtb天然具有抗性)。假免疫的动物预计在激惹后将死得最快。相反,用新的双组分TB疫苗接种的动物比用BCG接种的动物存活得更长。
iv)灵长类安全性和激惹研究
恒河猴可以用作有用的模型以评估针对Mtb的疫苗。人类与非人类灵长动物之间的遗传相似性、以及TB在这些物种中相似的临床和病理学表现,使得该模型对于TB疾病和疫苗效能的实验研究来说更具有吸引力。
该模型、其特点是肺部空泡的发生、表现出适用于人类TB。感染的疾病的过程通过X-射线和体重减轻、以及各种溶血测试来跟踪,溶血测试包括红细胞沉降速度(ESR)、外周血单核细胞(PBMC)增殖和细胞因子的产生、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性以及抗体反应。用Mtb感染后,猴子发展出具有特征性损伤的肺部病理学,并且依赖于激惹的剂量,死于在感染后4到6个月内发生的急性呼吸系统感染。
本研究的目的是评估BCG标准疫苗与本发明的双组分TB疫苗的效能的比较。本研究包括了3个组,每组10只动物,设计如下:使用BCG、双组分TB疫苗和盐水各一组。
106cfu的双组分TB疫苗的引发组分和BCG对照的接种物进行肠胃外给药,给药通过肌肉内、皮下或真皮内,优选真皮内。但是,引发组分也可以通过粘膜接种途径给药,优选为口服,剂量为104-109cfu,优选106-107cfu。口服引发组分的配方在上面和别处有描述(Adwell等,Vaccine,22:70-76;2003;Buddle等,Vaccine,23:3581-3589;2005)。
引发后6到24周、优选10到17周、最优选17周后,用双组分TB疫苗的引发组分接种的恒河猴用双组分TB疫苗的加强组分进行加强。接受肠胃外引发的动物通过粘膜途径、优选口服途径进行加强;而接受粘膜引发的动物通过肠胃外途径进行加强。肠胃外加强组分通过皮下、真皮内或肌肉内给药,优选真皮内给药,剂量为106cfu。粘膜加强组分通过粘膜接种途径给药,优选为口服途径,剂量为104-109cfu,优选106-107cfu。
加强后10周,每组动物用含有低剂量的Mtb Erdman菌株的气溶胶激惹,通过测量激惹后16周或动物死亡时细菌载荷的减少了测量保护作用。操作和激惹恒河猴的方法在别处有记载(Capuano等,Infect.Immun.,71:5831-5844;2003)。
通过在淋巴细胞刺激试验中测量增殖和IFN-γ的分泌来评估抗原特异性免疫。产生IFN-γ的淋巴细胞的频率通过酶联免疫吸附分析(ELISPOT)来确定,使用Versteegen等的方法(J.Immunol.Methods111:25-29;1988),进行了Miyahira等的修改(J.Immunol.Methods181:45-54;1995),或按照描述通过细胞内细胞因子染色已经荧光激活的细胞分拣(FACS)来确定(Chattopadhyay等,Nature Medicine 11,1113-1117;2005;Tritel等,J.Immunol.,171:2538-47;2003;Hanekom等,J.Immunol.Methods.,291:185-95;2004;Berhanu等,J.Immunol.Methods 279,199-207;2003;DeRosa等,Nature Medicine 7,245-248;2001)。在相对于最初的接种的第0、4、8、12、16、20和24周时抽取血样。
在最后一次免疫后10周,动物通过气管内安装结核分枝杆菌Erdman株进行激惹(在3ml PBS中含有1,000cfu)。所有的动物在同一天用同样的制备物进行激惹。感染的过程通过监测体重、直肠温度和ESR来评估。在激惹后每隔1个月以及在激惹后26周时的最后的尸体检验中,进行胸部X-射线以检测与肺部TB相符的异常。
TB载体和疫苗的临床评估
i)安全性和毒性研究
美国食品和药品联合会准则和CFR21要求的临床安全性和毒性研究,按照上面的描述进行。在这些研究之后,进行了人类安全性研究。这些研究首先在健康的TB阴性成年人中进行,然后将年龄降低到儿童和新生儿。
使用本发明的肠胃外组分进行的人类肠胃外预防接种,是通过皮下注射含有3 x 104到3 x 107cfu,、优选1 x 105到1 x 106的减毒的分枝杆菌属菌株例如减毒的Mtb、BCG或重组BCG来进行的。
使用本发明的粘膜组分进行的人类口服预防接种,可以通过使用以前描述的方法来进行(Miller等,Can Med Assoc J.121(1):45-54;1979)。本发明的口服使用的活的、减毒的分枝杆菌属菌株的量依赖于接受者的物种以及正被治疗的疾病或症状而变化。一般来说,使用的剂量大约为103到1011活生物体,优选大约105到109或生物体。
实施例
实施例1.过量表达TB抗原并逸出内体的重组BCG菌株的构建
为了产生逸出内体的菌株,我们开发了表达perfringolysin O(Pfo)的BCG1331衍生株,这是通常情况下由产气荚膜梭菌分泌的细胞溶素,由pfoA基因编码(GenBank登记号CPE0163)。PfoA在梭菌中以及在枯草芽孢杆菌中表达时介导了从吞噬体的逸出(52)。但是,与Llo不同,PfoA在pH 5.0和pH 7.0下都具有活性(52)。为了限制Pfo的细胞毒性,使用了带有G137Q取代(PfoAG137Q)的该蛋白的突变形式,因为该菌株在宿主细胞细胞液中具有短的半衰期,并且也能在宽的pH范围内介导内体的逸出(52)。
为了研究PfoAG137Q的用处,我们构建了分泌该蛋白的重组的BCG,命名为AFV102(即BCG1331 ureC::pfoAG137Q)。该菌株通过与ureC基因进行等位基因交换而构建。结果,在Rv1886c启动子控制之下的pfoAG137Q基因表达盒取代了ureC,使得PfoA能够在染色体上稳定地表达。等位基因交换质粒被命名为pAF102(图2),含有下列的DNA片段:1)用于质粒在大肠杆菌中复制的oriE序列;2)用于在大肠杆菌和靶BCG菌株中进行选择的卡那霉素抗性基因序列;3)ureC上游1kb(L-flank)和下游1kb(R-flank)附近的序列;以及4)在插入到ureC邻近序列基因之间的Rv1886c启动子控制之下的pfoAG137Q。值得注意的是,Rv1886的前导肽序列被用来代替了野生型的PfoA的信号序列,用于使重组BCG分泌PfoA。所有这些成分由Picoscript Inc(Houston,TX)合成和装配,产生了质粒pAF102(图2)。pAF102的序列按照上面的描述通过自动化双脱氧核苷酸测序进行证实。
为了制备靶菌株,将BCG丹麦株1331(BCG1331)在添加有10%w/v油酸-白蛋白-葡萄糖-过氧化氢酶(OADC;BD Gibco)和0.05%(v/v)的Tyloxapol(Research and Diagnostic Lab Inc.)的7H9培养基中进行培养。当培养物达到对数期时(550nm处光密度为4-5),将细菌收集,按照以前的描述制备用于电穿孔(Sun等,Mol.Microbiol.52:25-38;2004)。为了产生部分二倍体,使用标准的方法(Sun等,2004)将5个微生物的纯化的pAF102DNA导入新鲜制备的BCG1331电穿孔感受态细胞。电穿孔后,将细胞在添加有10%(v/v)OADC和0.05%(v/v)的Tyloxapol的7H9培养基中培养过夜,然后将细胞在添加了50mcg/ml卡那霉素的7H10平板上、在37℃和5%v/v CO2的条件下培养30天。将获得的部分二倍体菌落转移到含有10%(w/v)蔗糖(Sigma,St LouisMO)的7H9培养基中,在37℃和5% v/v CO2的条件下继续培养30天。
一个在蔗糖平板上生长起来的菌落、被命名为AFV102,被发现是脲酶阴性的,表明ureC基因已经被PfoA表达盒代替。进行了下面的试验以证实AFV102是UreC阴性和PfoA阳性的。
首先,使用脲酶测试试剂盒按照制造商的说明书(Difco)筛选菌株AFV102缺少脲酶活性。简单来说,将1mm接种环满环的AFV102细菌(大约105cfu)重新悬浮在透明管中的制造商提供的测试缓冲液中。同样量的BCG1331被用作脲酶阳性对照,只含有缓冲液的管被用作阴性对照。反应混合物在室温保温30分钟,根据制造商的说明书来判断结果。该分析显示AFV102不具有脲酶活性,证实了PfoA表达盒已经替换了该等位基因的假设。
其次,使用PCR来证实AVF102中的ureC::pfoA基因型。在标准的PCR分析中使用了200mM的PCR正向引物[acggctaccgtctggacat](SEQ ID NO:1)和反向引物[cgatggcttcttcgatgc](SEQ ID NO:2),以通过在ureC基因邻近的序列中起始PCR来扩增pfoA等位基因。PCR的参数如下:步骤1:95℃ 4分钟,1个循环;步骤2:95℃ 1分钟、60℃1分钟、然后72℃ 1分钟,总共30个循环;步骤3:72℃ 10分钟,1个循环;步骤4:4℃储存。获得的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分析,使用自动化的双脱氧核苷酸测序技术进行测序,这证实了在AFV102中全长的pfoA基因代替了ureC基因(即ureC::pfoA)的存在。因此,PCR的结果显示出AFV102产生了重组的ureC::pfoA等位基因的预计分子量2180bp的DNA条带,而父本菌株BCG1331在同样的PCR条件下产生1967bp的条带。AFV102的PCR产物被凝胶纯化,并由约翰霍普金斯大学(Baltimore,MD)的商业化测序机构进行测序。测序结果证实了重组的ureC::pfoA等位基因的存在。此外,定向扩增AFV102菌株的卡那霉素抗性基因和sacB基因的PCR不能产生PCR产物(数据未显示),表明AFV102已经经历了最后的等位基因交换步骤。
为了评估PfoAG137Q的分泌,将AFV102和BCG1331按照上面的描述培养到对数期中期,通过离心移除细菌后收集培养上清液。为了测试上清液中PfoA的活性,将体积100mcl的不同稀释度的培养上清液在96孔板中与100mcl 1%(v/v)的绵羊红细胞合并,轻轻混合。将板在37℃摇动保温1小时。为了产生标准曲线,将溶血素活性已知的α-溶血素(Sigma)连续稀释液加到同样的板中,如上进行保温。在保温结束时,将板在500xg离心15分钟。将从V形底的板获得的上清液转移到无菌的平底96孔板的同样位置中,测量光密度(450nm处的吸收值减去540nm处的吸收值)。PfoA分子的溶血素活性通过测量光密度来定量,被测量的颜色强度与红细胞裂解的量成正比,因此与溶血素的量成正比。使用标准曲线通过内推计算样品中的溶血素单位值。溶血素单位被定义为50%的绵羊红细胞被裂解的样品的稀释度。该分析的结果显示出AFV102在每105个细菌中产生2-10个单位的溶血素活性。与PCR数据合在一起,我们得出结论,AFV102在ureC位置带有pfoA基因,能够分泌PfoA作为有功能的溶血素。
此外,荧光显微镜显示出PfoAG137Q能够使重组的BCG菌株AFV102逸出内体。首先,按照描述(Sun等,2004)通过测定被感染的巨噬细胞中的分枝杆菌克隆形成单位(cfu)测试了重组BCG菌株AFV102在J774A.1巨噬细胞类的细胞中的原位生长,感染时的重复数为10个AFV102 cfu对1个J774A.1巨噬细胞。通过在J774A.1细胞感染后3小时测试细胞内cfu的计数,确定了细胞吞噬作用的效率。随后按照以前的描述(Sun等,2004)通过裂解细胞释放出细胞内细菌以进行计数,确定了长期的细胞内存活率。结果显示,AFV102和BCG1331在J774.1细胞中显示出难以辨别的摄入和存活率,表明PfoAG137Q的表达没有明显改变在巨噬细胞中的短期细胞内存活率。
此外,按照制造商的说明书使用“96孔水相细胞滴定板单溶液细胞增殖分析”试剂盒(Promega,目录号G3580)通过测量感染的细胞释放的乳酸脱氢酶(LDH),确定了重组菌株对J774A.1巨噬细胞(ATCCNo.A TIB-67)的细胞毒性。因此,在J774.1细胞感染后的不同时间,测量上清液中释放的LDH的量。未感染的正常细胞被用作阴性对照。根据感染的细胞与阴性对照细胞(100%的细胞存活率)释放的LDH的量的比值计算出活细胞的百分率。结果显示AFV102与BCG1331的细胞毒性不能区别。
最后,使用了荧光显微镜来确定AFV102驻留的细胞内区室,这使用了与以前描述的类似的方法(Armstrong和Hart,J.Exp.Med.,134:713-40;1971;Hasan等,Mol Microbiol25:427;1997;Via等,J BiolChem.,272:13326-13331;1997;Sun等,Mol.Microbiol.52:25-38;2004)。在感染前,按照制造商的说明书将细菌细胞与PBS中的Alexa Fluor 568琥珀酰亚胺酯(Molecular Probes,Eugene,OR)在室温保温1-1.5小时。该染料与位于细菌表面上的一级胺形成稳定的酰胺键。因此,将10ml的AFV102和BCG1331培养物收集沉淀,重新悬浮在25mls 0.625ug/ml溶于PBS(pH7.2)的Alexa Fluor 568中,在室温保温1-1.5小时以标记细菌。然后将标记的细菌用PBS洗3次,重新悬浮在7H9生长培养基中,在冰箱中储存过夜。J774A.1细胞在6孔细胞培养板中在人类纤连蛋白包被的盖玻片上按照以前的描述在DMEM培养基中进行培养(Sun等,2004)。细胞以3 x 106个细胞/孔的密度接于板中,在37℃温箱中在5% CO2和加湿条件下培养2天。在感染过程中,标记的细菌被收集,重新悬浮在DMEM+10% FBS培养基中,以每个孔为10的感染重复数(MOI)直接加入到J774A.1细胞中。20分钟、8小时和24小时后,细胞用室温(RT)的磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.2)清洗。然后用溶于PBS(pH7.2)的2%的多聚甲醛将细胞在室温固定20分钟。然后将固定的细胞用溶于PBS(pH7.2)的0.1% Triton X-100在室温通透处理10分钟,然后用PBS(pH7.2)洗两次。阻断在室温进行至少2小时或在4℃进行过夜,使用溶于PBS(pH7.2)的3%牛血清白蛋白(BSA)、5%正常山羊血清(NGS)和0.5%叠氮化钠。除去阻断缓冲液,然后加入用含有1%的BSA、3%的NGS和0.5%叠氮化钠的PBS(pH7.2)稀释50倍的大鼠抗小鼠转移受体-FITC(US Biological,Swampscott,MA),然后在室温保温至少1小时。然后将细胞用PBS洗2-3次,用vectsheild固定介质固定在玻璃载玻片上,使用NikonTE2000倒置显微镜以1500倍的放大倍数进行分析,该显微镜装备有Retiga EXI单色、12bit冷光、IR过滤的数字相机用于成像。
结果显示,在J744.1巨噬细胞(ATCC no.TIB-67)感染后24小时,75%的AFV102细菌被观察到位于内体之外,而只有少部分的BCG细菌被观察到在内体外的区室中。这些数据表明AFV102以及该菌株的衍生株将比BCG和重组的BCG-Llo+(Hess等,Proc Natl Acad Sci.,95:5299-5304;1998;Grode等,Clin Invest.,115:2472-2479;2005)诱导更强的CD8+T细胞反应。
为了在重组BCG菌株AFV102中过量表达TB抗原,与编码Rv3804c(也称为Ag85A)、Rv1886(也称为Ag85B)和Rv0288(也称为TB10.4)的序列功能上连接的为Rv3031启动子编码的序列被插入到pAF100的PacI位点中。获得的质粒pAF105(图3)然后用限制性内切酶NdeI消化以除去大肠杆菌复制子和卡那霉素抗性基因,用T4连接酶连接重新环化。该DNA(1-2mg)通过电穿孔导入到重组BCG菌株AFV102中。细菌在含有25-30ml固体培养基(Middlebrook 7H10)的8.75cm平板上培养。在用PCR预筛以检测带有抗原表达质粒的菌落之后,PfoA阳性并带有TB抗原表达盒的选出的重组BCG菌落,被命名为AFRO-1,并在37℃下在摇动的液体培养基(Middlebrook 7H9)中扩增到500ml。一旦培养达到对数后期,在500ml培养物中加入甘油到终浓度为10%(v/v),主培养前的种子以5ml的等份试样储存在-80℃。
BCG和重组BCG培养物的纯度可以通过在8.75cm的含有25-30ml的固体培养基(Middlebrook 7H10)的平板上,均匀地涂布100mcl用磷酸盐缓冲液(PBS)稀释的BCG培养物无菌稀释液(例如每个步骤稀释10倍,到10-8)的等份试样来评估。质粒DNA的PCR和限制性内切酶分析被用于证实所需的基因型存在于每个重组BCG分离株中。此外,PCR产生的DNA片段通过自动化的双脱氧核苷酸测序技术来测序,以证实全长基因的存在。
为了评估带有TB抗原表达质粒的AFV102和AFRO-1的PfoA分泌,按照上面的描述将两个菌株培养到对数期中期。按照以前的描述(Hess等,Proc.Natl.Acad.Sci.,95:5299-304;1998)收集这些培养物的培养上清液,通过0.2mm的膜过滤器进行过滤。然后按照上面的描述评估培养液滤液蛋白的溶血活性。结果显示AFV102和AFRO-1显示出相同水平的溶血活性,AFRO-1保有ureC::pfoAG137Q等位基因并表达功能性PfoA蛋白。
最后,评估了在10-15%的SDS-PAGE凝胶上分离的培养物上清液蛋白中的TB抗原的表达。结果显示出Rv3804c和Rv1886的增加的表达。因为Rv0288预计不会在培养上清液中过量表达,该与Rv3804c和Rv1886在同样的mRNA上表达的10kDa蛋白的过量表达是从Rv3804c和Rv1886被过量表达的现象中推断出来的。
作为一个整体,本实施例证明了产生既表达PfoA又过量表达TB抗原的重组BCG菌株是可能的。这样的菌株具有用作第二代TB疫苗的潜能。
实施例2.口服重组BCG疫苗配方和剂量的最优化
在测试新的双组分TB疫苗之前,进行了研究以确定最适的口服制剂和剂量。含有16只BALB/c小鼠的组通过胃部插管进行接种,如表5中所示。接种后72小时,每组3只小鼠被处死,通过上述的直接平板计数法对肠、集合淋巴小结、肺和脾中的活的AFV102细菌的数量进行计数。该实验显示,含有包括了胃部中和成分的Cera Vacx的口服制剂比不含有它们的制剂在投送活的生物体到粘膜性组织的能力方面更加有效。
接种后6周,每组中的5只动物被处死,通过流式细胞分析测量了对Rv3804c、Rv1886和Rv0288的免疫反应。简单来说,小鼠通过颈部错位处死,在无菌条件下通过用无菌镊子仔细地除去附着的脂类组织收集脾脏。将脾脏在含有10mL完全RPMI培养基(R10;含有10%FBS(HyClone)、55μM 2-巯基乙醇、10mM HEPES、2mM L-谷氨酰胺和1x青霉素-链霉素溶液(都来自Gibco)的RPMI 1640)的15ml锥形纸管中清洗,通过将脾脏压过70μm的细胞滤器(Falcon)制备单细胞悬浮液。将细胞重新悬浮在15ml不完全RPMI中,以520 rcf在4℃离心5分钟。剩余的红细胞使用每个脾脏1ml ACK裂解缓冲液(BioWhittacker)在室温裂解2分钟。在用9mL R10培养基再次清洗之后,细胞被重新悬浮在3ml R10中,再次通过70μm的细胞滤器过滤到新的15ml管中。细胞被计数,然后以15 x 106个细胞/ml的浓度重新悬浮在R10培养基中。
用于评估细胞因子生产的刺激如下进行:二甲亚砜(DMSO,Sigma)作为阴性对照,肽储存库在含有1μg/mL CD28和CD49d的R10培养基(Life Technologies)中预先稀释。终浓度为2μg肽/mL。佛波醇-12-豆蔻酸-13-乙酸(0.1μg/mL)/离子霉素(4μg/mL)(PMA/I;都从Sigma购买)被用作阳性对照。在替换了96孔圆底细胞培养板的适当孔中的100μl溶液后,加入100μl细胞悬浮液,在37℃和5% CO2下保温1小时。加入25μl Golgi-Plug(在R10培养基中1:25稀释)后,板再保温4-5小时。保温之后,将板在4℃储存过夜,直到进行细胞内细胞因子染色。板在4℃以350xg离心3分钟。丢弃上清液,重新悬浮细胞,用100μl PBS/孔清洗,在4℃以350xg离心3分钟。在丢弃上清液并通过仔细地涡旋振荡板来重新悬浮细胞后,在所有的孔中加入50μl含有1 1FcR阻断物(BD)的PBF(即PBS+0.5% FBS),在冰上保温10分钟。用50μl含有预先滴定的抗CD4-PC5或抗CD8-PC5(BD)抗体的PBF缓冲液在4℃于暗处将细胞染色30分钟。保温后,细胞用150μl PBF缓冲液洗两次。为了使细胞通透化,在每个样品孔中加入100μl Cytofix/Cytoperm缓冲液(BD),在4℃于暗处保温20分钟。然后将板离心,用150ml Perm/清洗缓冲液(BD)清洗细胞。为了进行细胞内细胞因子染色,将抗IFN-γ(Alexa Fluor 488)、抗TNF-α-PE和抗IL-2-APC(都来自BD)预先在Perm/清洗缓冲液中稀释40倍,每个孔中加入50ml,在4℃于暗处保温30分钟。保温后,用150μl 1x Perm/清洗缓冲液将细胞清洗2次,在4℃以350xg离心3分钟。丢弃上清液后,通过加入220ml含有1%甲醛(Sigma)的PBS将细胞固定。为了分析,在CyFlow ML(Partec,Germany)流式细胞仪上从每个样品收集100,000个靶细胞事件。所有的样品分析使用FlowJo软件TreeStar Inc.,USA)进行,统计学使用Prism软件(GraphPad,USA.)确定。
每个组中剩下的8只动物在接种10周后用Mtb Erdman菌株激惹,激惹通过从总共含有107cfu的激惹菌株的10ml单细胞悬浮液制成的气溶胶来进行。这导致了每个动物的肺部100个活细菌的剂量(Turner等,Infect.Immun.,68:3674-3679;2000;McMurray等,Infect.Immun.50:555-559;1985;Wiegeshaus等,Am.Rev.Respir.Dis.,102:422-429;1970)。激惹后,动物与未激惹的对照动物一起监测存活率。动物也被监测体重减轻和总体健康。
激惹后5周,每组中的动物被处死用于组织病理学和微生物学分析。来自小鼠的肺和脾脏组织通过cfu计数进行评估。因为Mtb Erdman菌株被用于激惹,在培养基中加入TCH以辨别对TCH敏感的的疫苗菌株与激惹菌株。该实验的结果证明了含有CeraVacx的口服制剂能够有效提供针对Mtb激惹的保护作用。
成功完成本研究之后,使用最少的疫苗生物体就能诱导相同的或更好的很对Mtb的免疫反应和保护作用的疫苗被选做最适的配方和剂量。
表5.实验设计
组 | 疫苗配方 | 剂量 |
1 | 在10%甘油中口服使用的AFRO-1 | 109 |
2 | 在10%甘油中口服使用的AFRO-1+0.2ml CeraVacx | 109 |
3 | 在10%甘油中口服使用的AFRO-1+0.2ml CeraVacx | 108 |
4 | 在10%甘油中口服使用的AFRO-1+0.2ml CeraVacx | 107 |
5 | 在10%甘油中口服使用的AFRO-1+0.2ml CeraVacx | 105 |
6 | 在10%甘油中口服使用的AFRO-1+0.2ml CeraVacx | 104 |
7 | 在10%甘油中口服使用的AFRO-1+0.2ml CeraVacx | 103 |
8 | AFRO-1(皮下) | 3 x 105 |
实施例3.预防接种策略的最优化
本实验的目的是最优化候选的减毒的分枝杆菌疫苗菌株AFRO-1(实施例1)在SPF雄性Hartley豚鼠(250-300克)中的引发-加强策略。因此,每组10只动物按照图6中的显示进行预防接种,以便评估10、14和17周的引发-加强间隔。
表6.豚鼠策略研究设计
组 | 引发I(第1天) | 引发II(第3周) | 引发III(第7周) | 加强(第17周) |
1 | 盐水(id) | - | - | |
3 | AFRO-1(id) | - | - | AFRO-1(po) |
4 | - | AFRO-1(id) | - | AFRO-1(po) |
5 | - | - | AFRO-1(id) | AFRO-1(po) |
6 | - | - | - | AFRO-1(po) |
引发以0.1ml 10%甘油中含有106cfu的剂量通过真皮内给药来进行。对照小鼠只真皮内给药0.1ml 10%甘油。引发14周后,用双组分TB疫苗的加强组分加强豚鼠。在第5组中,加强以0.1ml 10%甘油中含有106cfu的剂量通过真皮内给药来进行。在第4和第6组中,加强以0.5ml 10%(v/v)甘油中悬浮有107cfu并含有50%(v/v)Cera Vacx的剂量通过胃内插管来进行。
在最后一次接种后10周,动物用Mtb Erdman菌株的气溶胶进行激惹,激惹通过从总共含有107cfu的Mtb的10ml单细胞悬浮液制成的气溶胶来进行。该步骤象以前描述的那样在每个动物的肺部投送了大约100个活细菌(Brodin等,2004)。激惹后5周,每个组中的动物被处死,收集肺和脾脏进行组织学和微生物学分析。在后一种情况下,对来自豚鼠的肺和脾脏组织通过cfu计数进行评估。因为MtbErdman菌株被用于激惹,在培养基中加入TCH以辨别对TCH敏感的的疫苗菌株与激惹菌株。
该研究的结果鉴定了双组分TB疫苗的引发和加强组分之间的时间间隔。
实施例4.在豚鼠中诱导保护作用
为了测定候选的减毒的分枝杆菌疫苗菌株AFRO-1(实施例1)针对Mtb激惹的效能,每组8只年轻到成年的SPF Hartley豚鼠(250-300克)使用表7中显示的双组分TB疫苗的引发成分、BCG或盐水进行预防接种。
表7.豚鼠激惹研究设计
组 | 引发(第1天) | 加强(第14周) | 激惹(第28周) |
1 | Saline(id) | CeraVacx | 100cfu Erdman |
3 | AFRO-1(id) | CeraVacx | 100cfu Erdman |
4 | Saline(id) | AFRO-1(po) | 100cfu Erdman |
5 | AFRO-1(id) | AFRO-1(id) | 100cfu Erdman |
6 | AFRO-1(id) | AFRO-1(po) | 100cfu Erdman |
引发以0.1ml 10%甘油中含有106cfu的剂量通过真皮内给药来进行。对照小鼠只真皮内给药0.1ml 10%甘油。引发14周后,用双组分TB疫苗的加强组分加强豚鼠。在第5组中,加强以0.1ml 10%甘油中含有106cfu的剂量通过真皮内给药来进行。在第4和第6组中,加强以0.5ml 10%(v/v)甘油中悬浮有107cfu并含有50%(v/v)CeraVacx的剂量通过胃内插管来进行。
在最后一次接种后14周,动物用Mtb气溶胶进行激惹,激惹通过从总共含有107cfu的Mtb的10ml单细胞悬浮液制成的气溶胶来进行;该步骤象以前描述的那样在每个动物的肺部投送了大约100个活细菌(Brodin等,2004)。激惹后,动物与未接种的未激惹的健康动物组一起监测存活率。动物也被监测体重减轻和总体健康。
本研究的结果证实了假接种的动物在激惹后最快死亡,用BCG真皮内接种但没有加强的动物显示出中等的平均死亡时间,用新的双组分TB疫苗接种的动物存活时间最长。
实施例5.在非人类灵长动物中的保护作用
正如以前讨论的那样,恒河猴被用作有用的模型来评估针对Mtb的疫苗。为了证实肠胃外引发之后粘膜(口服)加强疫苗的用处,评估了在BCG接种的非人类灵长动物中通过用口胃管投送志贺氏菌来加强所引发的免疫反应,该志贺氏菌带有为Ag85A-Ag85B-TB10.4(MSTBS3)融合蛋白编码的重组核衣壳。恒河猴通过真皮内使用2 x 105CFU的BCG来引发,通过胃内使用1 x 1010CFU的MSTBS3来加强。在加强后2周抽取血液,用肝素处理,与特异性肽储存库(Ag85A/B和TB10.4)保温7天。保温后,细胞用针对CD4和CD8的表面特异性抗体来染色,固定在1% PFA中,用于流式细胞仪分析。样品分析使用FlowJo软件(TreeStar Inc.,USA)进行。刺激后成淋巴细胞与淋巴细胞的比率使用Prism软件(GraphPad,USA.)进行计算和分析。结果显示在图4中,表明BCG/MSTBS3预防接种的猴子发展除了针对Ag85A/B和TB10.4肽储存库和志贺氏菌全细胞裂解物(SWCL)的特异性CD8+和CD4+T细胞反应,而没有预防接种的动物没有发展出可测量到的T细胞反应。
实施例6.标准的BCG与双组分疫苗的比较
下面描述的研究的目的是证实标准的BCG疫苗与本发明的双组分TB疫苗的效能的比较。研究包括了表8中显示的6个组,每组10只动物。
表8.非人类灵长动物中的研究
组 | 引发 | 加强(第17周) |
1 | 无 | 无 |
2 | AFRO-1(105cfu,皮下给药) | AFRO-1(105cfu,皮下给药) |
3 | AFRO-1(105cfu,口服给药) | AFRO-1(105cfu,皮下给药) |
4 | AFRO-1(105cfu,皮下给药) | AFRO-1(105cfu,口服给药) |
5 | Shigella MSTBS3(105cfu,口服给药) | Shigella MSTBS3(105cfu,口服给药) |
6 | AFRO-1(105cfu,皮下给药) | Shigella MSTBS3(105cfu,口服给药) |
口服引发组分的配方在别处描述了(Adwell等,Vaccine,22:70-76;2003;Buddle等,Vaccine,23:3581-3589;2005)。加强在引发后17周进行。肠胃外加强组分通过皮下、真皮内或肌肉内给药,优选真皮内给药,剂量为106cfu。粘膜加强组分通过粘膜接种途径给药,优选为口服,剂量为104-109cfu,,优选为106-107cfu。
加强后10周,每个组中的动物用低剂量的结核分枝杆菌Erdman菌株进行气溶胶激惹,通过测量在激惹后16周或动物死亡时细菌载荷的减少了测量保护作用。操作和激惹恒河猴的方法在别处有记载(Capuano等,Infect.Immun.,71:5831-5844;2003)。
最后一次接种后10周,通过气管内安置结核分枝杆菌Erdman菌株(在3ml PBS中含有1,000cfu)来激惹动物。所有的动物在同一天用同样的制备物进行激惹。感染的过程通过监测体重、直肠温度和ESR来评估。在激惹后每隔1个月以及在激惹后26周时的最后的尸体检验中,进行胸部X-射线以检测与肺部TB相符的异常。
本研究的结果证实了假免疫的动物发展出了肺部TB(组1),用BCG真皮内接种两次的动物(组2)显示出了肺部TB的严重性的中等的降低,用新的双组分TB疫苗接种的动物(组3)存活时间最长。
参考文献
1.1993.Tuberculosis:a global emergency.(结核病:全球的紧急事件)World Health Forum 14:438.
2.2004.WHO and UNAIDS call for joint HIV-tuberculosis action.(WHO和UNAIDS呼吁HIV-肺结核的联合行动)Bull World HealthOrgan 82:810.
3.1993.WHO declares tuberculosis a global emergency.(WHO宣布肺结核为全球紧急事件)Soz Praventivmed 38:251-2.
4.Arthur,J.W.,and M.R.Wilkins.2004.Using proteomics tomine genome sequences.(使用蛋白质组学探测基因组序列)J ProteomeRes 3:393-402.
5.Aziz,M.A.,and A.Wright.2005.The World HealthOrganization/International Union Against Tuberculosis and Lung DiseaseGlobal Project on Surveillance for Anti-Tuberculosis Drug Resistance:amodel for other infectious diseases.(世界卫生组织/国际反结核病和肺部疾病联盟监督抗结核病药物抗性的全球计划:其它传染性疾病的模型)Clin Infect Dis 41 Suppl 4:S258-62.
6.Barbosa,T.,S.Arruda,B.D.Fernandes,L.P.Carvalho,S.Cardoso,S.Cunha,M.L.Barreto,S.M.Pereira,L.C.Rodrigues,and M.Barral-Netto.2003.BCG(Bacille of Calmette-Guerin)revaccination leadsto improved in vitro IFN-gamma response to mycobacterial antigenindependent of tuberculin sensitization in Brazilian school-age children.(在巴西的学龄儿童中BCG(卡介苗)的再次接种导致了不依赖于结核菌素敏化的体外针对分枝杆菌抗原的IFN-γ反应的增强)Vaccine21:2152-60.
7.Belyakov,I.M.,J.D.Ahlers,B.Y.Brandwein,P.Earl,B.L.Kelsall,B.Moss,W.Strober,and J.A.Berzofsky.1998.The importanceof local mucosal HIV-specific CD8(+)cytotoxic T lymphocytes forresistance to mucosal viral transmission in mice and enhancement ofresistance by local administration of IL-12.(局部的粘膜的HIV特异性的CD8(+)细胞毒性T淋巴细胞对于小鼠中对粘膜性病毒传播的抗性和通过局部使用IL-12增强抗性的重要性)J.Clin.Invest.102:2072-2081.
8.Belyakov,I.M.,M.A.Derby,J.D.Ahlers,B.L.Kelsall,P.Earl,B.Moss,W.Strober,and J.A.Berzofsky.1998.Mucosal immunizationwith HIV-1 peptide vaccine induces mucosal and systemic cytotoxic Tlymphocytes and protective immunity in mice against intrarectalrecombinant HIV-vaccinia challenge.(使用HIV-1肽疫苗进行粘膜接种在小鼠中诱导了粘膜和全身性细胞毒性T淋巴细胞和针对直肠内用重组HIV-牛痘进行的激惹的保护性免疫)Proc.Natl.Acad.Sci.95:1709-1714.
9.Belyakov,I.M.,Z.Hel,B.Kelsall,V.A.Kuznetsov,J.D.Ahlers,J.Nacsa,D.I.Watkins,T.M.Allen,A.Sette,J.Altman,R.Woodward,P.D.Markham,J.D.Clements,G.Franchini,W.Strober,andJ.A.Berzofsky.2001.Mucosal AIDS vaccine reduces disease and viralload in gut reservoir and blood after mucosal infection of macaques.(粘膜AIDS疫苗在粘膜感染恒河猴后减轻了疾病并降低了内脏储存库和血液中的病毒载荷)Nat.Med.7:1320-1326.
10.Belyakov,I.M.,B.Moss,W.Strober,and J.A.Berzofsky.1999.Mucosal vaccination overcomes the barrier to recombinant vacciniaimmunization caused by preexisting poxvirus immunity.(粘膜预防接种克服了由预先存在的痘病毒免疫所引起的重组牛痘免疫接种的障碍)Proc Natl Acad Sci USA 96:4512-7.
11.Boyton,R.J.2005.Infectious lung complications in patientswith HIV/AIDS.(在患有HIV/AIDS的病人中的传染性肺部并发症)Curr Opin Pulm Med 11:203-7.
12.Brandt,L.,M.Elhay,I.Rosenkrands,E.B.Lindblad,and P.Andersen.2000.ESAT-6 subunit vaccination against Mycobacteriumtuberculosis.(ESAT—针对结核分枝杆菌的6个亚基的疫苗)InfectImmun 68:791-5.
13.Brandt,L.,J.Feino Cunha,A.Weinreich Olsen,B.Chilima,P.Hirsch,R.Appelberg,and P.Andersen.2002.Failure of theMycobacterium bovis BCG vaccine:some species of environmentalmycobacteria block multiplication of BCG and induction of protectiveimmunity to tuberculosis.(牛分枝杆菌BCG疫苗的失败:环境中的分枝杆菌的某些种类阻断了BCG的繁殖和对结核病的保护性免疫的诱导)Infect Immun 70:672-8.
14.Brandt,L.,Y.A.Skeiky,M.R.Alderson,Y.Lobet,W.Dalemans,O.C.Turner,R.J.Basaraba,A.A.Izzo,T.M.Lasco,P.L.Chapman,S.G.Reed,and I.M.Orme.2004.The protective effect of theMycobacterium bovis BCG vaccine is increased by coadministration withthe Mycobacterium tuberculosis 72-kilodalton fusion polyprotein Mtb72Fin M.tuberculosis-infected guinea pigs.(在结核病感染的豚鼠中牛分枝杆菌BCG疫苗的保护性效果被同时给药结核分枝杆菌的72Kda的融合同基因多蛋白Mtb72F所增强)Infect Immun 72:6622-32.
15.Chadha,V.K.2005.Tuberculosis epidemiology in India:areview.(印度的结核病流行病学:综述)Int J Tuberc Lung Dis9:1072-82.
16.Chintu,C.,and P.Mwaba.2005.Tuberculosis in children withhuman immunodeficiency virus infection.(患有人类免疫缺陷病毒感染的儿童中的结核病)Int J Tuberc Lung Dis 9:477-84.
17.Cole,S.T.2002.Comparative mycobacterial genomics as a toolfor drug target and antigen discovery.(分枝杆菌的比较基因组学作为药物靶和抗原发现的工具)Eur Respir J Suppl 36:78s-86s.
18.Cole,S.T.,R.Brosch,J.Parkhill,T.Garnier,C.Churcher,D.Harris,S.V.Gordon,K.Eiglmeier,S.Gas,C.E.Barry,3rd,F.Tekaia,K.Badcock,D.Basham,D.Brown,T.Chillingworth,R.Connor,R.Davies,K.Devlin,T.Feltwell,S.Gentles,N.Hamlin,S.Holroyd,T.Hornsby,K.Jagels,A.Krogh,J.McLean,S.Moule,L.Murphy,K.Oliver,J.Osborne,M.A.Quail,M.A.Rajandream,J.Rogers,S.Rutter,K.Seeger,J.Skelton,R.Squares,S.Squares,J.E.Sulston,K.Taylor,S.Whitehead,and B.G.Barrell.1998.Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosisfrom the complete genome sequence.(从全基因组序列解译结核分枝杆菌的生物学)Nature 393:537-44.
19.de Jonge,M.I.,R.Brosch,P.Brodin,C.Demangel,and S.T.Cole.2005.Tuberculosis:from genome to vaccine.(结核病:从基因组到疫苗)Expert Rev Vaccines 4:541-51.
20.Demangel,C.,T.Garnier,I.Rosenkrands,and S.T.Cole.2005.Differential effects of prior exposure to environmental mycobacteria onvaccination with Mycobacterium bovis BCG or a recombinant BCG strainexpressing RD1 antigens.(预先暴露于环境分枝杆菌对牛分枝杆菌BCG或表达RD1抗原的重组BCG菌株的预防接种的不同的影响)InfectImmun 73:2190-6.
21.Dietrich,J.,C.Aagaard,R.Leah,A.W.Olsen,A.Stryhn,T.M.Doherty,and P.Andersen.2005.Exchanging ESAT6 with TB10.4 in anAg85B fusion molecule-based tuberculosis subunit vaccine:efficientprotection and ESAT6-based sensitive monitoring of vaccine efficacy.(在基于Ag85B融合分子的结核病亚基疫苗中用TB10.4交换ESAT6:有效的保护作用和对于疫苗效能的基于ESAT6的敏感性监测)JImmunol 174:6332-9.
22.Dobos,K.M.,J.S.Spencer,I.M.Orme,and J.T.Belisle.2004.Proteomic approaches to antigen discovery.(抗原发现的蛋白质组学方法)Methods Mol Med 94:3-17.
23.Dourado,I.,M.H.Rios,S.M.Pereira,S.S.Cunha,M.Y.Ichihara,J.C.Goes,L.C.Rodrigues,A.L.Bierrenbach,and M.L.Barreto.2003.Rates of adverse reactions to first and second doses of BCGvaccination:results of a large community trial in Brazilian schoolchildren.(第一和第二剂BCG预防接种的负反应比率:在巴西学龄儿童中的大社区试验的结果)Int J Tuberc Lung Dis 7:399-402.
24.Dye,C.,C.J.Watt,D.M.Bleed,S.M.Hosseini,and M.C.Raviglione.2005.Evolution of tuberculosis control and prospects forreducing tuberculosis incidence,prevalence,and deaths globally.(结核病控制的演进以及全球性降低结核病发病率、流行性和死亡率的前景)Jama 293:2767-75.
25.Edwards,K.M.,M.H.Cynamon,R.K.Voladri,C.C.Hager,M.S.DeStefano,K.T.Tham,D.L.Lakey,M.R.Bochan,and D.S.Kernodle.2001.Iron-cofactored superoxide dismutase inhibits host responses toMycobacterium tuberculosis.(铁作为辅助因子的超氧化物歧化酶抑制宿主对结核分枝杆菌的反应)Am J Respir Crit Care Med 164:2213-9.
26.Elzinga,G.,M.C.Raviglione,and D.Maher.2004.Scale up:meeting targets in global tuberculosis control.(规模放大:在全球结核病控制中遇到了目标)Lancet 363:814-9.
27.Gentschev,I.,Z.Sokolovic,H.J.Mollenkopf,J.Hess,S.H.Kaufmann,M.Kuhn,G.F.Krohne,and W.Goebel.1995.Salmonellastrain secreting active listeriolysin changes its intracellular localization.(沙门氏菌属菌株分泌的活性李斯特菌溶胞素改变了它的细胞内定位)Infect.Immun.63:4202-4205.
28.Goonetilleke,N.P.,H.McShane,C.M.Hannan,R.J.Anderson,R.H.Brookes,and A.V.Hill.2003.Enhanced immunogenicity andprotective efficacy against Mycobacterium tuberculosis of bacilleCalmette-Guerin vaccine using mucosal administration and boosting with arecombinant modified vaccinia virus Ankara.(使用重组修改的牛痘病毒安卡拉株进行粘膜给药和加强增加了针对卡介苗疫苗的结核分枝杆菌的免疫原性和保护性效能)J Immunol 171:1602-9.
29.Grode,L.,M.Kursar,J.Fensterle,S.H.Kaufmann,and J.Hess.2002.Cell-mediated immunity induced by recombinant Mycobacteriumbovis Bacille Calmette-Guerin strains against an intracellular bacterialpathogen:importance of antigen secretion or membrane-targeted antigendisplay as lipoprotein for vaccine efficacy.(重组牛分枝杆菌卡介苗菌株诱导的针对细胞内细菌病原体的细胞介导的免疫:抗原分泌或膜定位的抗原展示作为脂蛋白对于疫苗效能的重要性)J Immunol168:1869-76.
30.Herremans,T.M.,J.H.Reimerink,A.M.Buisman,T.G.Kimman,and M.P.Koopmans.1999.Induction of mucosal immunity byinactivated poliovirus vaccine is dependent on previous mucosal contactwith live virus.(通过失活的痘病毒疫苗诱导粘膜免疫依赖于以前与活的病毒的粘膜接触)J.Immunol.162:5011-5018.
31.Hess,J.,D.Miko,A.Catic,V.Lehmensiek,D.G.Russell,and S.H.Kaufmann.1998.Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin strainssecreting listeriolysin of Listeria monocytogenes.(分泌单核细胞增多性李斯特杆菌的李斯特菌溶胞素的牛分枝杆菌卡介苗菌株)Proc NatlAcad Sci USA 95:5299-304.
32.Hondalus,M.K.,S.Bardarov,R.Russell,J.Chan,W.R.Jacobs,Jr.,and B.R.Bloom.2000.Attenuation of and protection induced by aleucine auxotroph of Mycobacterium tuberculosis.(结核分枝杆菌的亮氨酸营养缺陷型的减毒作用和诱导的保护作用)Infect Immun 68:2888-98.
33.Horwitz,M.A.,and G.Harth.2003.A new vaccine againsttuberculosis affords greater survival after challenge than the currentvaccine in the guinea pig model of pulmonary tuberculosis.(针对结核病的新疫苗在肺结核豚鼠模型中比现有疫苗在激惹后提供了更高的存活率)Infect Immun 71:1672-9.
34.Horwitz,M.A.,G.Harth,B.J.Dillon,and S.Maslesa-Galic.2005.Enhancing the protective efficacy of Mycobacterium bovis BCGvaccination against tuberculosis by boosting with the Mycobacteriumtuberculosis major secretory protein.(通过用结核分枝杆菌的主要分泌蛋白进行加强来增加牛分枝杆菌BCG预防接种对结核病的保护性效能)Infect Immun 73:4676-83.
35.Horwitz,M.A.,G.Harth,B.J.Dillon,and S.Maslesa-Galic.2000.Recombinant bacillus calmette-guerin(BCG)vaccines expressingthe Mycobacterium tuberculosis 30-kDa major secretory protein inducegreater protective immunity against tuberculosis than conventional BCGvaccines in a highly susceptible animal model.(表达结核分枝杆菌的30kDa的主要分泌蛋白的重组卡介苗(BCG)疫苗在高度易感的动物模型中诱导了比常规的BCG疫苗更高的针对结核病的保护性免疫)ProcNatl Acad Sci U S A 97:13853-8.
36.Horwitz,M.A.,B.W.Lee,B.J.Dillon,and G.Harth.1995.Protective immunity against tuberculosis induced by vaccination withmajor extracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis.(使用结核分枝杆菌的主要细胞外蛋白进行预防接种诱导的针对结核病的保护性免疫)Proc Natl Acad Sci U S A 92:1530-4.
37.Huygen,K.,J.Content,O.Denis,D.L.Montgomery,A.M.Yawman,R.R.Deck,C.M.DeWitt,I.M.Orme,S.Baldwin,C.D′Souza,A.Drowart,E.Lozes,P.Vandenbussche,J.P.Van Vooren,M.A.Liu,andJ.B.Ulmer.1996.Immunogenicity and protective efficacy of atuberculosis DNA vaccine.(结核病DNA疫苗的免疫原性和保护性效能)Nat Med 2:893-8.
38.Irwin,S.M.,A.A.Izzo,S.W.Dow,Y.A.Skeiky,S.G.Reed,M.R.Alderson,and I.M.Orme.2005.Tracking antigen-specific CD8 Tlymphocytes in the lungs of mice vaccinated with the Mtb72F polyprotein.(在用Mtb72F同基因多蛋白预防接种的小鼠的肺中跟踪抗原特异性CD8T淋巴细胞)Infect Immun 73:5809-16.
39.Kantele,A.,M.Hakkinen,Z.Moldoveanu,A.Lu,E.Savilahti,R.D.Alvarez,S.Michalek,and J.Mestecky.1998.Differences in immuneresponses induced by oral and rectal immunizations with Salmonella typhiTy21a:evidence for compartmentalization within the common mucosalimmune system in humans.(用伤寒沙门氏菌Ty21a进行口部和直肠接种诱导的免疫反应的差别:人类中共同粘膜免疫系统中的区域化的证据)Infect.Immun.66:5630-5635.
40.Kita,Y.,T.Tanaka,S.Yoshida,N.Ohara,Y.Kaneda,S.Kuwayama,Y.Muraki,N.Kanamaru,S.Hashimoto,H.Takai,C.Okada,Y.Fukunaga,Y.Sakaguchi,I.Furukawa,K.Yamada,Y.Inoue,Y.Takemoto,M.Naito,T.Yamada,M.Matsumoto,D.N.McMurray,E.C.Cruz,E.V.Tan,R.M.Abalos,J.A.Burgos,R.Gelber,Y.Skeiky,S.Reed,M.Sakatani,and M.Okada.2005.Novel recombinant BCG andDNA-vaccination against tuberculosis in a cynomolgus monkey model.(在食蟹猴模型中针对结核病的新的重组BCG和DNA疫苗接种)Vaccine23:2132-5.
41.Kutteh,W.H.,A.Kantele,Z.Moldoveanu,P.A.Crowley-Nowick,and J.Mestecky.2001.Induction of specific immuneresponses in the genital tract of women after oral or rectal immunizationand rectal boosting with Salmonella typhi Ty 21a vaccine.(在用伤寒沙门氏菌Ty21a疫苗口部和直肠免疫和直肠加强后在妇女的生殖道中特异性免疫反应的诱导)J Reprod Immunol 52:61-75.
42.Langermans,J.A.,T.M.Doherty,R.A.Vervenne,T.van derLaan,K.Lyashchenko,R.Greenwald,E.M.Agger,C.Aagaard,H.Weiler,D.van Soolingen,W.Dalemans,A.W.Thomas,and P.Andersen.2005.Protection of macaques against Mycobacterium tuberculosis infection by asubunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85B and ESAT-6.(基于抗原85B和ESAT-6的融合蛋白的亚基疫苗对恒河猴针对结核分枝杆菌感染的保护作用)Vaccine 23:2740-50.
43.Maher,D.,A.Harries,and H.Getahun.2005.Tuberculosis andHIV interaction in sub-Saharan Africa:impact on patients and programmes;implications for policies.(撒哈拉以南非洲的结核病与HIV的相互作用:对病人和计划的影响;对政策的暗示)Trop Med Int Health 10:734-42.
44.Maher,D.,and M.Raviglione.2005.Global epidemiology oftuberculosis.(结核病的全球流行病学)Clin Chest Med 26:167-82,v.
45.McShane,H.,A.A.Pathan,C.R.Sander,N.P.Goonetilleke,H.A.Fletcher,and A.V.Hill.2005.Boosting BCG with MVA85A:the firstcandidate subunit vaccine for tuberculosis in clinical trials.(用MVA85A加强BCG:临床实验中的第一个用于结核病的候选亚基疫苗)Tuberculosis(Edinb)85:47-52.
46.McShane,H.,A.A.Pathan,C.R.Sander,S.M.Keating,S.C.Gilbert,K.Huygen,H.A.Fletcher,and A.V.Hill.2004.Recombinantmodified vaccinia virus Ankara expressing antigen 85A boostsBCG-primed and naturally acquired antimycobacterial immunity inhumans.(表达抗原85A的重组修改的牛痘病毒安卡拉株在人类中加强了BCG引发的和天然获得的抗分枝杆菌免疫)Nat Med 10:1240-4.
47.Olsen,A.W.,P.R.Hansen,A.Holm,and P.Andersen.2000.Efficient protection against Mycobacterium tuberculosis by vaccinationwith a single subdominant epitope from the ESAT-6 antigen.(使用来自ESAT-6抗原的单一亚显性抗原决定簇进行预防接种产生的针对结核分枝杆菌的有效的保护作用)Eur J Immunol 30:1724-32.
48.Olsen,A.W.,A.Williams,L.M.Okkels,G.Hatch,and P.Andersen.2004.Protective effect of a tuberculosis subunit vaccine basedon a fusion of antigen 85B and ESAT-6 in the aerosol guinea pig model.(基于抗原85B和ESAT-6的融合蛋白的结核病亚基疫苗在气溶胶豚鼠模型中的保护性效果)Infect Immun 72:6148-50.
49.Pal,P.G.,and M.A.Horwitz.1992.Immunization withextracellular proteins of Mycobacterium tuberculosis inducescell-mediated immune responses and substantial protective immunity in aguinea pig model of pulmonary tuberculosis.(使用结核分枝杆菌的细胞外蛋白进行预防接种在肺结核豚鼠模型中诱导了细胞介导的免疫反应和基本上保护性的免疫)Infect Immun 60:4781-92.
50.Palendira,U.,J.M.Spratt,W.J.Britton,and J.A.Triccas.2005.Expanding the antigenic repertoire of BCG improves protective efficacyagainst aerosol Mycobacterium tuberculosis infection.(扩增BCG的抗原储存库增加了针对气溶胶结核分枝杆菌感染的保护性效能)Vaccine23:1680-5.
51.Park,H.D.,K.M.Guinn,M.I.Harrell,R.Liao,M.I.Voskuil,M.Tompa,G.K.Schoolnik,and D.R.Sherman.2003.Rv3133c/dosR is atranscription factor that mediates the hypoxic response of Mycobacteriumtuberculosis.(Rv3133c/dosR是介导结核分枝杆菌的低氧反应的转录因子)Mol Microbiol 48:833-43.
52.Portnoy,D.A.,R.K.Tweten,M.Kehoe,and J.Bielecki.1992.Capacity of listeriolysin O,streptolysin O,and perfringolysin O to mediategrowth of Bacillus subtilis within mammalian cells.(李斯特菌溶胞素O、链球菌溶血素O和perfringolysin O介导哺乳动物细胞中枯草芽孢杆菌的生长的能力)Infect Immun 60:2710-7.
53.Pym,A.S.,P.Brodin,L.Majlessi,R.Brosch,C.Demangel,A.Williams,K.E.Griffiths,G.Marchal,C.Leclerc,and S.T.Cole.2003.Recombinant BCG exporting ESAT-6 confers enhanced protection againsttuberculosis.(输出ESAT-6的重组BCG赋予了针对结核病的增强的保护作用)Nat Med 9:533-9.
54.Rodrigues,L.C.,S.M.Pereira,S.S.Cunha,B.Genser,M.Y.Ichihara,S.C.de Brito,M.A.Hijjar,I.Dourado,A.A.Cruz,C.Sant′Anna,A.L.Bierrenbach,and M.L.Barreto.2005.Effect of BCGrevaccination on incidence of tuberculosis in school-aged children inBrazil:the BCG-REVAC cluster-randomised trial.(BCG重新接种在巴西学龄儿童中对结核病发病率的影响:BCG-REVAC的分组随机化试验)Lancet 366:1290-5.
55.Russell,M.W.,Z.Moldoveanu,P.L.White,G.J.Sibert,J.Mestecky,and S.M.Michalek.1996.Salivary,nasal,genital,and systemicantibody responses in monkeys immunized intranasally with a bacterialprotein antigen and the Cholera toxin B subunit.(在用细菌蛋白抗原和霍乱毒素B亚基进行鼻内接种的猴子中的唾液、鼻、生殖道和全身性抗体反应)Infect Immun 64:1272-83.
56.Sambandamurthy,V.K.,X.Wang,B.Chen,R.G.Russell,S.Derrick,F.M.Collins,S.L.Morris,and W.R.Jacobs,Jr.2002.Apantothenate auxotroph of Mycobacterium tuberculosis is highlyattenuated and protects mice against tuberculosis.(泛酸盐营养缺陷型结核分枝杆菌是高度减毒的并针对结核病保护小鼠)Nat Med 8:1171-4.
57.Sampson,S.L.,C.C.Dascher,V.K.Sambandamurthy,R.G.Russell,W.R.Jacobs,Jr.,B.R.Bloom,and M.K.Hondalus.2004.Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph ofMycobacterium tuberculosis in guinea pigs.(结核分枝杆菌的亮氨酸和泛酸盐双重营养缺陷型在豚鼠中引发的保护作用)Infect Immun72:3031-7.
58.Schnappinger,D.,S.Ehrt,M.I.Voskuil,Y.Liu,J.A.Mangan,I.M.Monahan,G.Dolganov,B.Efron,P.D.Butcher,C.Nathan,and G.K.Schoolnik.2003.Transcriptional Adaptation of Mycobacteriumtuberculosis within Macrophages:Insights into the PhagosomalEnvironment.(结核分枝杆菌在巨噬细胞中的转录适应性:对吞噬体环境的了解)J Exp Med 198:693-704.
59.Sharma,D.C.2004.Tuberculosis control goals unlikely to bemet by 2005.(到2005年不可能达到结核病的控制目标)Lancet363:1122.
60.Skeiky,Y.A.,M.R.Alderson,P.J.Ovendale,J.A.Guderian,L.Brandt,D.C.Dillon,A.Campos-Neto,Y.Lobet,W.Dalemans,I.M.Orme,and S.G.Reed.2004.Differential immune responses and protectiveefficacy induced by components of a tuberculosis polyprotein vaccine,Mtb72F,delivered as naked DNA or recombinant protein.(以裸露的DNA或重组蛋白的形式投送的结核病同基因多蛋白疫苗Mtb72F的组分诱导的不同的免疫反应和保护性效能)J Immunol 172:7618-28.
61.Taelman,H.,J.Batungwanayo,J.Clerinx,A.Kagame,J.Bogaerts,S.Allen,and P.Van de Perre.1991.Risk of tuberculosis amongwomen of childbearing age with HIV infection in Zaire.(扎伊尔被HIV感染的育龄妇女中结核病的风险)Am Rev Respir Dis 144:1219-20.
62.Tanghe,A.,S.D′Souza,V.Rosseels,O.Denis,T.H.Ottenhoff,W.Dalemans,C.Wheeler,and K.Huygen.2001.Improvedimmunogenicity and protective efficacy of a tuberculosis DNA vaccineencoding Ag85 by protein boosting.Infect Immun 69:3041-7.
63.Thillagavathie,P.2000.Current issues in maternal and perinataltuberculosis:impact of the HIV-1 epidemic.(母亲和围产期结核病中的当前问题:HIV-1流行的影响)Semin Neonatol 5:189-96.
64.Urquhart,B.L.,T.E.Atsalos,D.Roach,D.J.Basseal,B.Bjellqvist,W.L.Britton,and I.Humphery-Smith.1997.′Proteomiccontigs′of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis(BCG)using novel immobilised pH gradients.(使用新的固定的pH梯度的结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(BCG)的“蛋白质组毗连序列群”)Electrophoresis 18:1384-92.
65.Vallejo,J.G.,and J.R.Starke.1992.Tuberculosis andpregnancy.(结核病与妊娠)Clin Chest Med 13:693-707.
66.Voskuil,M.I.,D.Schnappinger,R.Rutherford,Y.Liu,and G.K.Schoolnik.2004.Regulation of the Mycobacterium tuberculosisPE/PPE genes.(结核分枝杆菌的PE/PPE基因的调控)Tuberculosis(Edinb)84:256-62.
67.Weinrich Olsen,A.,L.A.van Pinxteren,L.Meng Okkels,P.Birk Rasmussen,and P.Andersen.2001.Protection of mice with atuberculosis subunit vaccine based on a fusion protein of antigen 85b andesat-6.(基于抗原85b和esat-6的融合蛋白的结核病亚基疫苗对小鼠的保护作用)Infect Immun 69:2773-8.
尽管已经根据优选的实施方案对本发明进行了描述,本领域的专业技术人员将会意识到,本发明可以在权利要求的精神和范围内进行修改而仍然能够实现。因此,本发明不应该被限制于上述的实施方案,而应该进一步包括在本文提供的描述的精神和范围内的所有修改及其等效物。
Claims (6)
1.在宿主中引发针对活的、减毒的分枝杆菌或分枝杆菌抗原的全身性和粘膜性免疫反应的方法,包括下列步骤:
给该宿主肠胃外给用第一种抗原性组合物,其含有该活的、减毒的分枝杆菌或该分枝杆菌抗原、或带有为该分枝杆菌抗原编码的核酸的载体或细菌;以及
给该宿主粘膜给用第二种抗原性组合物,其含有该活的、减毒的分枝杆菌或该分枝杆菌抗原、或带有为该分枝杆菌抗原编码的核酸的载体或细菌,该第二种抗原性组合物与该第一种抗原性组合物不同;
其中该肠胃外给用和粘膜给用的步骤导致在该宿主中同时诱导了针对该活的、减毒的分枝杆菌或该分枝杆菌抗原的全身性和粘膜性免疫反应。
2.权利要求1中的方法,其中该活的、减毒的分枝杆菌选自:牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、BCG、鸟分枝杆菌复合物(Mycobacterium avium complex)、堪萨斯氏分枝杆菌(M.kansasii)、摩尔分枝杆菌(M.malmoense)、猿分枝杆菌(M.simiae)、苏尔加分枝杆菌(M.szulgai)、蟾分枝杆菌(M.xenopi)、瘰痢分枝杆菌(M.scrofulaceum)、脓肿分枝杆菌(M.abscessus)、龟分枝杆菌(M.chelonae)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans),和海分枝杆菌(M.marinum)。
3.权利要求1中的方法,其中该带有为该分枝杆菌抗原编码的核酸的细菌是志贺氏菌属细菌。
4.权利要求1中的方法,其中该为该分枝杆菌抗原编码的载体是腺病毒载体。
5.权利要求1中的方法,其中该活的、减毒的分枝杆菌含有为选自以下的部分编码的DNA:外源免疫原,内源免疫原,佐剂,细胞因子,前凋亡剂,和过量表达的Mtb抗原。
6.权利要求1中的方法,其中该粘膜给用的步骤是在该肠胃外给用的步骤之前通过口服完成的。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US75034805P | 2005-12-15 | 2005-12-15 | |
US60/750,348 | 2005-12-15 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN101432016A true CN101432016A (zh) | 2009-05-13 |
Family
ID=38228924
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNA2006800526025A Pending CN101432016A (zh) | 2005-12-15 | 2006-12-15 | 减毒的分枝杆菌的新引发-加强组合 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20090304750A1 (zh) |
EP (1) | EP1962910A4 (zh) |
CN (1) | CN101432016A (zh) |
BR (1) | BRPI0620693A2 (zh) |
WO (1) | WO2007079351A2 (zh) |
ZA (1) | ZA200805395B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102441162A (zh) * | 2010-10-04 | 2012-05-09 | 免疫产品美国股份有限公司 | 结核病的治疗和预防 |
CN103214582A (zh) * | 2013-04-02 | 2013-07-24 | 扬州大学 | 一种针对结核病具有免疫原性的融合蛋白及其应用 |
CN104151433A (zh) * | 2014-08-11 | 2014-11-19 | 兰州大学 | 一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US7670609B2 (en) * | 2007-11-27 | 2010-03-02 | Aeras Global Tb Vaccine Foundation | Recombinant BCG tuberculosis vaccine designed to elicit immune responses to Mycobacterium tuberculosis in all physiological stages of infection and disease |
AU2008339980A1 (en) * | 2007-12-21 | 2009-07-02 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Vaccines for malaria |
JP6554095B2 (ja) | 2013-06-25 | 2019-07-31 | アエラス グローバル ティービー ワクチン ファウンデーション | 結核組成物及びそれを使用する方法 |
CN109890411A (zh) | 2016-06-16 | 2019-06-14 | 国际艾滋病疫苗行动组织公司 | 结核病组合物和治疗或预防结核病的方法 |
US11091775B2 (en) * | 2016-06-22 | 2021-08-17 | Oregon Health And Science University | Recombinant cytomegalovirus vectors as vaccines for tuberculosis |
EP3697806A4 (en) | 2017-10-17 | 2021-10-27 | International AIDS Vaccine Initiative, Inc. | TUBERCULOSIS ANTIGEN CASSETTES |
US10973908B1 (en) | 2020-05-14 | 2021-04-13 | David Gordon Bermudes | Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6190657B1 (en) * | 1995-06-07 | 2001-02-20 | Yale University | Vectors for the diagnosis and treatment of solid tumors including melanoma |
US7045336B1 (en) * | 1995-09-06 | 2006-05-16 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Bacterial delivery system |
US6210663B1 (en) * | 1998-08-20 | 2001-04-03 | The Wistar Institute Of Anatomy And Biology | Methods of augmenting mucosal immunity through systemic priming and mucosal boosting |
US20040009936A1 (en) * | 1999-05-03 | 2004-01-15 | Tang De-Chu C. | Vaccine and drug delivery by topical application of vectors and vector extracts |
ES2370885T3 (es) * | 2004-12-01 | 2011-12-23 | Aeras Global Tuberculosis Vaccine Foundation | Electroporación de mycobacterium y sobreexpresión de antígenos en micobacterias. |
-
2006
- 2006-12-15 CN CNA2006800526025A patent/CN101432016A/zh active Pending
- 2006-12-15 BR BRPI0620693A patent/BRPI0620693A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2006-12-15 US US12/097,146 patent/US20090304750A1/en not_active Abandoned
- 2006-12-15 WO PCT/US2006/062143 patent/WO2007079351A2/en active Application Filing
- 2006-12-15 EP EP06849031A patent/EP1962910A4/en not_active Withdrawn
-
2008
- 2008-12-15 ZA ZA200805395A patent/ZA200805395B/xx unknown
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102441162A (zh) * | 2010-10-04 | 2012-05-09 | 免疫产品美国股份有限公司 | 结核病的治疗和预防 |
CN103214582A (zh) * | 2013-04-02 | 2013-07-24 | 扬州大学 | 一种针对结核病具有免疫原性的融合蛋白及其应用 |
CN103214582B (zh) * | 2013-04-02 | 2015-04-08 | 扬州大学 | 一种针对结核病具有免疫原性的融合蛋白及其应用 |
CN104151433A (zh) * | 2014-08-11 | 2014-11-19 | 兰州大学 | 一种结核分枝杆菌融合蛋白及其制备方法和应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US20090304750A1 (en) | 2009-12-10 |
ZA200805395B (en) | 2009-10-28 |
WO2007079351A2 (en) | 2007-07-12 |
EP1962910A2 (en) | 2008-09-03 |
WO2007079351A3 (en) | 2008-08-14 |
BRPI0620693A2 (pt) | 2016-12-13 |
EP1962910A4 (en) | 2010-03-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN101432016A (zh) | 减毒的分枝杆菌的新引发-加强组合 | |
CN101198358B (zh) | 具有增强的逃出内体能力的重组bcg菌株 | |
Ding et al. | Live bacterial vaccine vector and delivery strategies of heterologous antigen: a review | |
US7691393B2 (en) | Listeria attenuated for entry into non-phagocytic cells, vaccines comprising the Listeria, and methods of use thereof | |
Collins | The immunology of tuberculosis | |
US7625572B2 (en) | Transformed bacterium lacking selectable marker and overexpression of antigens in mycobacteria | |
US7829104B2 (en) | Electroporation of Mycobacterium and overexpression of antigens in mycobacteria | |
AU2002364952B2 (en) | Mycobacterial vaccine | |
Badell et al. | Protection against tuberculosis induced by oral prime with Mycobacterium bovis BCG and intranasal subunit boost based on the vaccine candidate Ag85B-ESAT-6 does not correlate with circulating IFN-γ producing T-cells | |
Yin et al. | Attenuated Listeria monocytogenes, a Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 antigen expression and delivery vector for inducing an immune response | |
CN1758923B (zh) | 进入非吞噬细胞被衰减的利斯特氏菌、含有该利斯特氏菌的疫苗 | |
World Health Organization | The development of new/improved brucellosis vaccines: report of a WHO meeting, Geneva, Switzerland, 11-12 December 1997 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090513 |