DE2843295C2 - - Google Patents
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Description
- - einerseits Literaturhinweise existieren, wonach bei Attenuierung durch nur einen Marker (Reversionshäufigkeit ≲ 10-7) keine absolute Sicherheit vor Impfkomplikationen besteht (COLLINS, J. Infect. Dis. 126, 69-76 (1972); SMITH, US-PS 33 64 117; SCHMIDT und KIEFER, Zbl. Bakt. Abt. I Orig. 227, 257-262 (1974)),
- - andererseits jedoch umfangreiche Feldversuche die Stabilität ausgewählter Einmarkerstämme (Reversionshäufigkeit zur Virulenz ≲ -8) bewiesen haben, wie z. B. mit Streptomycin-dependenten (Sm-d) Mutanten von Salmonella dublin bei Kälbern (MEYER und Mitarb., Arch. f. exp. Vet.-Med. 27, 301-320 (1973); 31, 71-93, 95-113, 277-288 (1977)) mit Sm-d Shigellen bei Kindern (DU PONT und Mitarb., J. Inf. Dis. 125, 5-11 sowie 12-16 (1972); MEL, Zschr. f. d. ges. Hyg. 19, 656-857 (1973); SERGEEV und Mitarb., Zschr. f. d. ges. Hyg. 19, 657-658 (1973), Sm-d Salmonelle typhi bei Erwachsenen (MEL, Zschr. f. d. ges. Hyg. 19, 656-657 (1973)) und Sm-d Enteritis-Coli bei Säuglingen (KÖDITZ und BÜRDEL; Zschr. f. d. ges. Hyg. 22, (1976) 1. Beiheft.
- - bei Einmarker-Mutanten, deren Einsatz in endemisch/enzootisch durchsuchten Populationen vertretbar ist, die Reversionshäufigkeit des Attenuierungsmarkers mit direkten hochselektiven Labormethoden erfaßt werden kann und ≦ 10-8 liegt,
- - bei Doppelmarker-Mutanten - als anzustrebende Optimallösung des Problems Stabilität und Sicherheit vor Impfkomplikationen - nach Möglichkeit einer der beiden attenuierenden Marker in seiner Reversionshäufigkeit zur Virulenz mittels direkten hochselektiven Labormethoden erfaßt werden kann und mit ≲ 10-7 siehe unten) festgelegt werden sollte.
- - Mutanten mit vermehrungsbegrenzendem Marker, wie z. B.
- . Streptomycin-dependente Stämme (REITMAN. J. Infect. Dis 117, 101-107 (1967); SHUSTER und Mitarb., Zh, Mikrobiol. (Moskau) 1970/1, 144-145),
- . Temperatur-sensible Mutanten (FAHEY und COOPER, Infect, Immun. 1, 263-270 (1970); 2, 183-191 sowie 192-200 (1970)),
- welche in vivo ihre Vermehrung einstellen und deren Reversionshäufigkeit mit hochselektiven Labormethoden erfaßbar ist (LINDE und Mitarb., Zschr. f. d. ges. Hyg. 22, (1976) 1. Beiheft; LICHODED und SHUSTER, Zschr. f. d. ges. Hyg. 22. (1976) 1. Beiheft). Nachteilig für diese Mutantentypen ist, daß infolge der fehlenden Vermehrung im Wirtsorganismus zur Erzeugung einer belastbaren Immunität mehrfache und hohe Impfstoffdosen notwendig sind.
- - Mutanten mit nichtvermehrungsbegrenzender Attenuierung,
welche die Potenz zur Gewebepersistenz bzw.
in vivo-Vermehrung unterhalb des klinischen Schwellenwertes
besitzen, daher in der Regel bei einmaliger
Immunisierung eine belastbare Immunität auslösen
und deren Reversionshäufigkeit zur Virulenz in Abhängigkeit
vom Mutantentyp entweder mit selektiven
Labormethoden oder lediglich indirekt (siehe oben)
erfaßt werden kann, wie z. B.
- . Rauhform-Mutanten (SMITH, US-PS 33 64 117; MARTINKOVA und Mitarb., Immunprophylpraxis 1971/2, 12-17),
- . avirulente S-Form-Stämme (SMITH, J. Hyg. (London), 54, 419-432 (1956)),
- . Sekundär-Mutanten von Klonen mit defekter Galaktose-4-Epimerase (GERMANIER, DE-PS 21 69 626),
- . avirulente Coli-Hybriden mit Salmonella typhimurium-O-Antigen von (SCHMIDT und KIEFER, Zbl. Bakt. Hyg. I Abt. Orig. A 227, 257-262 (1974)),
- . Salmonella-Hybride aus avirulenter (Donor) und virulenter (Recipient) Samonella (KRISNAPILIAI und KARTHIGSASU, J. Bacter. 97, 1343-1351 (1969)),
- . Auxotrophie-Phänotypen mit einer zur Attenuierung führenden (Mutagen-induzierten) Ko-Mutation in benachbarten Genen der Zellwandsynthese (BACON und Mitarb., Brit. J. exper. Pathol. 31, 714-724 (1950), 32, 85-96 (1951); GARBER, The American Naturalist XC, 183-194 (1956; LINDE und Mitarb., Acta microbiol, Acad. Sci. Hung. 21, 11-27 (1974)) und
- . Mutanten mit defekter Glycerinkinase (RAVDONIKAS, Zh. Mikrobiol. (Moskau) 1976/12, 29-32).
- a) sich von Wildstämmen nur durch aufwendige Transduktionsanalysen oder die umständliche Bestimmung der verlängerten Generationszeit abtrennen lassen,
- b) infolge offensichtlich nicht identischer Mutationen in den Genen von bestimmten Ribosomenproteinen in ein Spektrum von Klonen mit unterschiedlichen Virulenz- und Immunogenitätsverhalten zerfallen (BLATZ und KNOLL, Leipzig, Karl-Marx-Universität, Diss. (1974), 92. S.),
- c) am Mäusemodell in der Regel eine Immunogenität nur bei relativ hoher Restvirulenz aufweisen (BLATZ und KNOLL, siehe b).
- - bei dem der Phänotyp mit der Attenuierung korreliert,
- - dessen Reversionshäufigkeit zur Virulenz mit direkten Labormethoden hochselektiv erfaßbar ist,
- - welcher sich zur Herstellung von stabilen nichtvermehrungsbegrenzt attenuierten Bakterienmutanten für gut verträglich Lebendimpfstoffe unter Berücksichtigung der großtechnischen Herstellung eignet,
- - bei dem der genetische Defekt eine zeitlich begrenzte Vermehrung im Nutztier bzw. spezifischen Wirt unterhalb des klinischen Schwellenwertes zuläßt, so daß bei Einmarker-Mutanten (siehe unten) durch eine einmalige bzw. bei Doppelmarker-Mutanten (siehe unten) durch eine in der Regel einmalige Impfung die zur Erzeugung einer belastbaren Immunität notwendige Antigenmenge im Wirtsgewebe sowie eine ausreichende aber begrenzte Antigenpersistenz als Voraussetzung für die Auslösung einer zellulären Immunität als Hauptfaktor des Schutzes vor zyklischen Infektionen (COLLINS, Bacteriol, Rev. 38, 371-402 (1974) erreicht wird.
- - der es erlaubt, die damit versehenen Impfstämme jederzeit mit minimalem Aufwand von endemisch/enzootisch oder epidemisch/epizootisch vorkommenden Wildstämmen sicher abzugrenzen.
- -Bakterienmutanten für nichtvermehrungsbegrenzte attenuierte Bakterienmutanten, geeignet für die Herstgellung von Lebendimpfstoffen, welche sich unter nichtselektiven Praxisbedingungen als stabil erweisen, dadurch zu erhalten sind, indem man von Wildstämmen Purin-abhängige Mutanten mit einer Reversionshäufigkeit ≦ 10-8 als Einmarker-Stämme isoliert.
- - stabile, nichtvermehrungsbegrenzte attenuierte Bakterienmutanten mit zwei unabhängig voneinander attenuierenden Markern, geeignet für die Herstellung von Lebendimpfstoffen, dadurch zu erhalten sind, indem man die Purin-Abhängigkeit als nichtvermehrungsbegrenzenden Zweitmarker in eine aus anderen Ursachen nicht vermehrungsbegrenzt attenuierte hochimmunogene Einmarker-Mutante einbaut. Da bei solchen Doppelmarker-Mutanten eine gleichzeitige spontane Reversion in den zwei unabhängig voneinander attenuierten Merkmalen infolge der sich potenzierenden Einzelhäufigkeiten (≲ 10-7 × ≲ 10-7 = ≲ 10-14) ausscheidet, besitzen solche Impfstämme unter den nichtselektiven Feldbedingungen eine volle Stabilität.
- - sich derartige Mutanten auf Grund ihrer Übereinstimmung von phänotypisch erkennbaren und genetisch attenuierenden Markern mittels Routineverfahren der Serologie, Biochemie und Lysotypie hinreichend sicher von virulenten Feldstämmen in vitro abgrenzen lassen.
- - derartige Mutanten fermentiert anzüchtbar und mittels Lyophilisation ausreichend lange konservierbar sind,
- - aus derartigen Mutanten hergestellte Lebendimpfstoffe in großen Nutztierpopulationen ohne epidemiologisches und epizootiologisches Risiko einsetzbar und immunogen sind.
- . Salmonella dublin met- 91 pur ade- 23 AF 24 23 26
hergestellt durch Selektion eines Purin-abhängigen
Klons aus der
Einmarker-Mutante S. dublin S-Form met- 91;
Attenuierung durch Ko-Mutation,
i. p. LD₅₀ Maus ∼ 106,5 Einmarker-Mutantenkeime,
Reversionshäufigkeit zur Virulenz ≲ 10-7 (s. u.) - . Salmonella typhi-murium his- 155 pur (ade-) 4
AF 22 10 52 (siehe Tabelle 7,
hergestellt durch Selektion eines Purin-abhängigen Klons aus der Einmarker-Mutante S. typhi-murium S-Form his- 155;
Attenuierung durch Ko-Mutation,
i. p. LD₅₀ Maus ∼ 106,7 Einmarker-Mutantenkeime,
Reversionshäufigkeit zur Virulenz ≲ 10-7 (s. u.) - . Salmonella cholerae-suis R-Dessau pur ade- 4
AF 23 20 10 bzw. 431/261,
hergestellt durch Selektion eines Purin-abhängigen Klons aus der Einmarker-Mutante S. cholerae-suis R-Dessau 431/256;
Attenuierung durch R-Form Antigen,
i. p. LD₅₀ Maus 105,2 R-Mutantenkeime,
Reversionshäufigkeit zur virulenten S-Form ≲ 10-10.
- . Korrelation zwischen phänotypischem Erscheinungsbild und Attenuierung.
- . Reversionshäufigkeit zur Virulenz mit direkten Labormethoden hochselektiv erfaßbar.
- . Potenz zur Vermehrung im spezifischen Wirt unterhalb des klinischen Schwellenwertes und zeitlich begrenzte Antigenpersistenz im Gewebe als Voraussetzung für die Auslösung einer belastbaren Immunität.
- . Eignung zur Herstellung von stabil attenuierten Mutanten für hochimmunogene Lebendimpfstoffe.
- - Purin-abhängige Mutanten lassen auf mit 10% Mäuseserum substituiertem Minimalmedium eine Spur von Wachstum erkennen.
- - Die in Tabelle 1 zusammengestellten Daten über die Immunogenität von Purin-abhängigen Salmonella-Mutanten für Mäuse beweisen indirekt die in vivo-Vermehrung und in vivo-Persistenz.
Reversionshäufigkeit 1/108
Summe aus 6-8 Einzelversuchen am Mäusemodell.
- - Der direkte Nachweis einer in vivo-Vermehrung und Gewebepersistenz von Purin-abhängigen Salmonella-Mutanten in Mäusen als Voraussetzung für die hohe Immunogenität dieses Mutantentyps (siehe oben) wird durch den nachfolgenden Versuch mit dem potentiellen Impfstamm Salmonella dublin pur (ade-) 16 erbracht: Von 18-20 Gramm schweren ICR-Mäusen, welche i. p. 10⁵ Mutantenkeime erhielten, wurden sofort nach der Immunisierung sowie täglich über 10 Tage je 3 Mäuse getötet, Leber und Milz steril entnommen, zusammen im Mörser zerreiben und in 2 ml physiologischer Kochsalzlösung suspendiert. Von diesen Stammsuspensionen wurden die log.-Verdünnungsreihen 10-1, 10-2, 10-3 mit physiologischer Kochsalzlösung hergestellt und 0,1 ml der Suspension 100 bis 10-4 auf Nähragar gespatelt. Nach 24 Stunden 37°C Bebrütung wurde die Zahl der Salmonella-Kolonien bestimmt und der Mittelwert gebildet. Die nach dem Versuchtstag aufgeschlüsselten interpolierten Keimzahlen aus Leber und Milz sind in Tabelle 2 festgehalten.
- - Das angeführte Labortierergebnis wird durch prinzipiell gleiche Aussagen aus den vorklinischen und klinischen Erprobungen an Nutztieren erhärtet: So wurden von 35 im Alter von 3 Wochen oral mit je 5 × 10⁸ Lebendkeimen des potentiellen Impfstammes Salmonella cholerae-suis R (ade-) 4 immunisierten Saugferkeln täglich Rektaltupferproben entnommen, welche nach STELLMACHER-SCHÖLL (STELLMACHER, W. in BEER, J. "Infektionskrankheiten der Haustiere", Fischer-Verlag Jena (1972); SCHÖLL, W. Fortschrittsberichte für die Land- und Nahrungsgüterwirtschaft 16/3, Berlin (1978)) aufgearbeitet wurden. Die Ausscheidung des Impfstammes konnte in unregelmäßiger Folge bis zum 35. Tag post immunisationem nachgewiesen werden. Mit der Methodik nach SCHÖLL (1978) gelang der Nachweis des Impfstammes aus den Organen von 172 bis zu 26 Wochen post immunisationem untersuchter Schweine bis zu 38 Tagen nach der Immunisierung.
- Salmonella typhi-murium 415 (Moskau), i. p. LD₅₀ Maus 10¹ Keime
- Salmonella dublin 81 (ITFJ), i. p. LD₅₀ Maus 10⁵ Keime
- Salmonella cholerae-suis 431/031 (Dessau) i. p. LD₅₀ 10³ Keime
- Salmonella typhi-murium his- 155 (Leipzig) i. p. LD₅₀ Maus 106,7 Keime
- Salmonella dublin met- 91 (Leipzig) i. p. LD₅₀ Maus 106,5 Keime
- Salmonella cholerae-suis R 431/256 (Dessau) i. p. LD₅₀ Maus 105,2 Keime
16-18 Gramm schwere ICR-Mäuse
Nähragar und Nährbouillon (Trockenmedium) SIFIN
Modifizierte (FALKOW und Mitarb., J. Bakteriol. 84, 1303-1312 (1962)) M9-Salzlösung (DAVIS und MINGIOLI, J. Bacteriol. 60, 17-23 (1950)) mit bzw. ohne 2,5% gewässertem Agar und 0,5% Dextrose. Das Minimalmedium wird als solches zur Vermehrung des Salmonella typhi-nurium-Wildstammes eingesetzt, für den Salmonella dublin-Wildstamm ist eine Supplementierung mit 20 µg Nikotinsäureamid/ml bzw. für den Samonella cholerae-suis-Wildstamm mit 20 µg Thiamin/ml notwendig.
Für den Ausgangsstamm spezifisch ergänztes Minimalmedium plus 20 µg Aminosäure/ml. D. h. für den Salmonella cholerae-suis R-Stamm Dessau 431/256 also ohne Aminosäure; für Salmonella dublin-Stamm met- 91 also mit Methionin; für Salmonella typhi-murium-Stamm his- 155 also mit Histidin.
Wie teilsubstituiertes Minimalmedium mit zusätzlich 20 µg/ml Purin bzw. ein anderes Purin-Derivat, wie beispielsweise Guanin, Hypoxanthin, Xanthin, Inosin usw.
- - solche Impfstämme in ohnedies mit Salmonella Wildstämmen verseuchten Tierbeständen eingesetzt werden,
- - diese einzelnen Keime mit Sicherheit auf dem Populationsniveau eliminiert werden.
- - Purin-abhängigen Mutanten (i. p. LD₅₀ ≲ 108 Keime) letztmalig einzelne Mäuse bei Keimzahlen von 10⁷ und resultiert aus der i. p. Immunizierung mit den
- - Einmarker-Purin-abhängigen Mutanten für ≳ 95% der die Immunisierung überlebenden Mäusen eine volle Immunität gegen die ≳ 100 LD₅₀ Wildstamm-Infektion.
- - Methionin- oder Histidin-Auxotrophiemutanten mit durch Ko-Mutation bedingter Attenuierung. Reversion zur Virulenz ≲ 10-7 nachgewiesen durch stabile Attenuierung < 20 Nähragarpassagen und den alleinigen Nachweis der attenuierten Mutante bei i. p. mit 10⁵ und 10⁷ Mutantenkeimen geimpften Mäusen, von denen einzelne Tiere intercurrent bzw. an der Belastung durch den Impfstamm sterben (Wildstamm i. p. LD₅₀ 106,5 Keime).
- - Rauhform-Mutanten mit einer Rerversionshäufigkeit ≲ 10-8.
- - Purin-Abhängigkeit mit einer Reversionshäufigkeit bis ≲ 10-7 garantiert infolge der unter Praxisbedingungen nicht realisierbaren Gesamtreversionshäufigkeit von ≲ 10-14 eine volle Stabilität (s. Seite 7).
Doppelmutante S. dublin (81) pur (ade-) thia- i. p. LD₅₀ Maus 109,7 Keime
(Wildstamm S. dublin (81) i. p. LD₅₀ Maus 101,2 Keime).
Die gleichzeitige Rückmutantenhäufigkeit beider Marker des Impfstammes S. dublin (81) pur (ade-) thia- liegt theoretisch somit in der Größenordnung von ≲ 10-16.
- - S-Form-Mutante his- 155 (LD₅₀ ∼ 106,7 Keime) nur noch einzelne Tiere bei Keimzahlen von 10⁵ Keimen,
- - Doppelmutante his- 155 pur (ade-) 4 (LD₅₀ < 10⁸ Keimen) letztmalig Mäuse der Keimzahlen von 10⁸ Keimen und resultiert aus der i. p. Immunisierung eine volle Immunität gegen die ≳ 100 LD₅₀ Wildstamm-Infektion durch die
- - S-Form-Mutante his- 155 für ≳ 95% der überlebenden Mäuse
- - Doppelmutante his- 155 pur (ade-) 4 für ebenfalls ≳ 90% der bis zur Keimzahl von 10⁵ Keimen immunisierten Tiere.
Das ist Mutation zur R-Form - i. p. Maus ∼ 105,2 - des somatischen Antigens mit einer Reversionshäufigkeit von < 10-10. Die eingesetzte R-Mutante besitzt die Potenz zur Gewebepersistenz beim Nutztier Schwein und zeichnet sich durch ausreichende Immunogenität und stark verminderte Virulenz für Ferkel aus.
Zu Marker 2:
Das ist die Abhängigkeit gegenüber Purin mit einer Reversionshäufigkeit von ∼ 1/10⁸.
Die gekoppelte (R-Form plus Purin-Abhängigkeit) i. p. LD₅₀ Maus beträgt ∼ 10⁹ Keime.
Die gleichzeitige Reversionshäufigkeit beider Marker des Impfstammes S. cholerae-suis R-Dessau 431/256 pur (ade)- 4 bzw. 431/261 liegt theoretisch in der Größenordnung von < 10-18.
- - durch die Ausgangsmutante 431/256 mit einer LD₅₀ ∼ 105,2 bei i. p. Keimzahlen von 10⁴ noch ein Drittel der Mäuse verendet und etwa 45% der die "Immunisierung überlebenden Mäuse" gegen die ≳ 100 LD₅₀ Wildstamm-Belastung geschützt ist.
- - der Impfstamm 431/261 mit einer LD₅₀ ∼ 10⁹ letztmalig bei i. p. 10⁸ Keimen einzelne Tiere durch Toxoinfektion tötet und die einmalige "Immunisierung im Grenzbereich zur Toxoinfektion" erwartungsgemäß über 50% der überlebenden Mäuse gegen die letale Wildstammbelastung schützt, während bei i. p. Immunisierung mit ≲ 107 Keimen keine ausreichende Abwehr gegen den homologen S-Form-Wildstamm aufgebaut wird.
- - welche für Einmarker-Mutanten mit ≲ 10-8 festgelegt werden sollte (siehe oben),
- - welche für Doppelmarker-Mutanten mit ≲ 10-7 festgelegt werden sollte (siehe oben)
Claims (4)
- a) aus Wildstämmen oder
- b) aus hochimmunogenen Einmarkerstämmen, die aus anderer Ursache nicht vermehrungsbegrenzt attenuiert sind,
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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GB1085956A (en) * | 1963-09-10 | 1967-10-04 | Nat Res Dev | Improvements relating to vaccines |
-
1978
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- 1978-10-06 AT AT0720178A patent/AT363591B/de not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
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AT363591B (de) | 1981-08-10 |
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