EA030355B1

EA030355B1 - Получение живых вакцин

Info

Publication number: EA030355B1
Application number: EA201590856A
Authority: EA
Inventors: Клаус Линде; Анке Гроссе-Херрентей
Original assignee: Ломанн Энимал Хелс Гмбх
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2018-07-31
Also published as: AU2017219152A1; PT2929058T; EA201590856A1; CA2901322A1; ES2686325T3; MX2015007195A; US11904008B2; HK1213949A1; NZ709154A; EP3415643B1; PL3415643T3; US20150297705A1; CN104995292A; ES2776429T3; US20240181031A1; PL2929058T3; EP2929058B1; CN112760252A; JP6336461B2; KR101835946B1

Abstract

В изобретении описан способ получения живой вакцины, содержащей стабильную бактерию, несущую по меньшей мере три аттенюирующих мутации, и вакцины, содержащей бактерию, полученную указанным способом.

Description

Настоящее изобретение обеспечивает способ получения живой вакцины, содержащей стабильную бактерию, которая несет по меньшей мере три аттенюирующие мутации, и вакцину, содержащую бактерию, полученную указанным способом.

Многие из живых бактериальных вакцин содержат аттенюированные бактерии, которые были изменены с применением биомолекулярных способов. К сожалению, считается, что большинство из указанных вакцин не в полной мере удовлетворяют потребностям практического применения по следующим причинам:

(a) производство является сложным и требует больших затрат времени, степень аттенюации нельзя контролировать, следовательно, адаптация к восприимчивости хозяина часто неудовлетворительная;

(b) законодательные органы требуют осуществления детализированных способов оценки (клинических исследований);

(c) популяция, которую планируется вакцинировать, ограничена.

В отличие от этого, мутанты, аттенюированные путем метаболического сдвига (МС), характеризуются следующими преимуществами:

(a) стоимость получения низкая, а степень аттенюации путем выбора желательного увеличения времени культивирования и, таким образом, уменьшенного размера колоний соответственно в принципе является почти произвольной;

(b) при применении стабильных специфических штаммов для вакцины, содержащих три аттенюирующих мутации, обеспечивающие МС, для вакцинации сельскохозяйственных животных не требуются сложные способы оценки;

(c) даже партии меньшего размера рентабельны.

Относительно основных данных об эволюционном принципе аттенюации путем МС следует подчеркнуть следующее:

(a) взаимодействие возбудителя заболевания и хозяина основано на взаимной толерантности. Хозяева с высокой восприимчивостью выживают как отдельные индивидуумы, когда их случайно инфицирует аттенюированный мутант высоковирулентного возбудителя заболевания. Популяция хозяина восстанавливается за счет нескольких выживших индивидуумов. Возбудитель заболевания пролиферирует как адаптированный аттенюированный штамм. Типичным примером такого процесса является миксоматоз. Вывод: популяции бактерий (а также популяции грибов и вирусов) всегда включают мутанты с различной степенью аттенюации, в том числе так называемые мутанты МС;

(b) мутанты с МС представляют собой клоны, содержащие мутации в метаболических компонентах, что по определению приводит к дисфункции (т.е. аттенюация = потеря приспособляемости). Как следствие, можно наблюдать постепенное уменьшение размеров колоний (в зависимости от клона) по сравнению с штаммом дикого типа. В норме иммунокомпетентный хозяин устраняет указанных мутантов или, в качестве альтернативы, их подавляет рост адаптированной нормальной флоры;

(c) уменьшенные размеры колоний демонстрируют обратную корреляцию с (длительным) временем удвоения и (увеличенной) степенью аттенюации;

(б) была доказана убедительная эффективность тестовых аттенюированных вакцин с МС.

Мутанты с МС можно отобрать и выделять как:

(a) клоны со спонтанной устойчивостью к антибиотикам в результате МС (МС "гек"), например, в отношении стрептомицина, рифампицина, фосфомицина, фусидовой кислоты, налидиксовой кислоты. Указанные клоны можно выделить с частотой более 1% относительно вирулентных клонов с устойчивостью. МС "гек" и вирулентные клоны с устойчивостью возникают вследствие разных мутаций. Соответственно МС "гек" и аттенюация могут считаться функциональной единицей;

(b) мутанты с повышенной устойчивостью к действию окружающей среды (1е1). которые косвенным образом накапливаются в "отмирающей" культуре;

(c) мутанты со стрептомицин-независимым (8ш-1б) супрессором, полученные из стрептомицинзависимых (8шб) клонов. Указанные два маркерных мутанта состоят из широкого спектра колонов, характеризующихся клон-специфичным постепенным уменьшением размера колоний и увеличением степени аттенюации соответственно от вирулентности почти на уровне дикого типа до гиператтенюации (мини-колонии).

Как правило, рибосомальные мутации увеличивают нормальное неправильное считывание (ошибки трансляции) в большей или меньшей степени, а также аттенюацию вызывает единственная супрессорная мутация.

Например, при иммунизации популяций цыплят живыми вакцинами 8а1шопе11а и Сашру1оЬас!ег основной задачей является прерывание цепи инфицирования людей и, как следствие, снижение числа кишечных бактерий у человека. В норме цыплята являются носителями факультативно патогенной 8а1шопе11а (и, как правило, даже Сашру1оЬас!ег) без проявления клинических симптомов. Таким образом, низкая вирулентность указанных штаммов дикого типа в отношении цыплят требует применения вакцин на основе штаммов, демонстрирующих умеренную степень аттенюации, чтобы с одной стороны обеспечить иммуногенность для цыплят, но с другой стороны исключить вред для человека.

Одним из критериев эффективности штаммов в составе вакцины является, например, поддающееся

- 1 030355

проверке сокращение степени колонизации после контрольного заражения. Аттенюированные живые вакцины с МС, экспрессирующие все компоненты бактерий (например, белки наружной мембраны), можно считать применимым практически вариантом, даже в отношении Сатру1оЬас!ет.

Таким образом, можно разработать эффективные вакцины для факультативно-патогенных бактерий, таких как 8а1тоие11а и Сатру1оЬас!ет, при условии избегания гиператтенюации путем корректировки аттенюации до низкой или умеренной степени. Иными словами, сокращение размеров колоний как эквивалент аттенюации не должно быть менее 25% от размера колонии дикого типа. Кроме того, указанное необходимое условие должно согласовываться с требованиями безопасности ВОЗ: стабильность в связи с наличием двух независимых аттенюирующих мутаций. Частота обратных мутаций составляет 10^-8. Однако есть потребность в разработке вакцин на основе штаммов, демонстрирующих даже большую стабильность, т.е. меньшую частоту обратных мутаций, но не гипеаттенюацию. К сожалению, введение дополнительных мутаций с целью повышения безопасности живой вакцины обычно приводит к излишней аттенюации, что делает вакцину менее эффективной.

Таким образом, техническая проблема, лежащая в основе настоящего изобретения, состоит в том, чтобы обеспечить улучшенные штаммы для живых вакцин на основе, которые характеризуются повышенной стабильностью. Решение указанной технической проблемы достигается путем предоставления вариантов реализации, охарактеризованных в формуле изобретения, т.е. путем предоставления улучшенных штаммов для составления живых вакцин с повышенной стабильностью на основе по меньшей мере трех мутаций, при избежании гиператтенюации и возможности корректировки аттенюации до желаемого уровня. Фактически во время экспериментов, которые привели к настоящему изобретению, удалось показать, что при применении аттенюации за счет МС можно создать вакцины на основе штаммов, характеризуемых тремя (или даже более) независимыми аттенюирующими мутациями, которые демонстрируют повышенную стабильность и степень аттенюации, которая не превышает степень аттенюации штаммов в вакцинах, содержащих две аттенюирующие мутации МС "тек". В экспериментах в рамках настоящего изобретения применяли стрептомицин, однако процедуры, раскрываемые в настоящем изобретении, не ограничиваются только указанным антибиотиком. Эксперименты, описанные ниже, основаны на применении так называемых δτ-ίύ клонов, полученных из мутантов §тб, поскольку указанные мутанты с "двойным маркером" (включая клоны, демонстрирующие все степени аттенюации от колоний, напоминающий колонии дикого типа, до мини-колоний) позволяют создавать вакцины на основе штаммов, демонстрирующих степень аттенюации, соответствующую степени аттенюации у штаммов МС "гек" с одним маркером. Штаммы согласно настоящему изобретению (διη-ίύ/МС "гек") демонстрируют повышенную стабильность приблизительно 10^-24.

До настоящего времени вакцины на основе штаммов διη-ίύ/МС "гек" 8а1тоие11а и Сатру1оЬас!ет не были описаны в предшествующем уровне техники. Кроме того, вакцины на основе штаммов, содержащих четыре, пять или даже шесть аттенюирующих мутаций, полученные посредством постепенного введения двух или трех мутаций διτι-ίύ и дополнительного маркера МС "гек" (А а, Α α) также являются новыми, для стрептомицина: δτύ 1^-διη-ίύ 1^8тб а^-διη-ίύ 11^8т-а^8т-М III (шесть аттенюирующих мутаций) и διτι-ίύ I/ διτι-ίύ II/ МС "гек" (пять аттенюирующих мутаций) соответственно.

Было обнаружено, что конкретный спектр ревертантов - постепенно уменьшающийся размер колоний - мутантов διτι-ίύ с сочетаниями из двух, четырех или шести маркеров, начинается: (а) для 8т- ίύ штаммов с размера колоний как у штамма дикого типа, (Ь) для διτι-ίύ I/ διτι-ίύ II штаммов с размера колоний как у διτι-ίύ I штаммов, и (с) для конструктов διτι-ίύ I/ διτι-ίύ II/ διτι-ίύ III максимальный обнаруживаемый размер колоний, был не более чем у διπ-ίύ [/διπ-ίύ П-подобных клонов. Таким образом, это не ревертанты, подобные штаммам дикого типа.

В принципе, селекция и выделение δτύ мутантов в качестве исходных штаммов для получения δτίύ клонов относится к современному уровню техники.

Приблизительно 10% колоний нормальных δт-устойчивых мутантов, например 81црЬу1оссос1, ЕксНепсЫа сой, ВасШик сегеик, являются δτύ клонами (в соответствии с очевидным биологическим принципом). Однако это не применимо к δа1тоηе11а и Сатру1оЬас!ет. Частота появления δτύ клонов δа1топе11а среди мутантов, демонстрирующих устойчивость, по сообщениям составляет приблизительно 0,1%, или выделения таких штаммов удается достичь только при применении мутагенеза соответственно.

Интересно, что после анализа приблизительно 5000 δт-резистентных мутантов авторы настоящего изобретения не смогли обнаружить ни одного δτύ штамма. Кроме того, следует подчеркнуть, что спектр διτι-ίύ ревертантов варьирует в зависимости от δτύ клона, следовательно, в качестве исходных мутантов требуется брать несколько δτύ клонов. Иными словами, обычная процедура селекции неприменима.

Поскольку рибосомальные δτύ-пути предположительно представляют собой эволюционный принцип адаптации, были проверены два возможных механизма:

(a) δτύ-мутанты входят в фазу гибели сразу же после своего образования. Таким образом, таких мутантов можно выделить только из культур в фазе логарифмического роста, например из культур <18 ч/37°С, но не из культур >48 ч/37°СР;

(b) на стадии зарождения δτύ клоны уязвимы, демонстрируют замедленный рост в виде мини- 2 030355

колоний (которые можно не заметить). Такие мини-колонии адаптируются к "нормальному росту" во время пересева.

Для Сатру1ойас1ег данных относительно Зтб- и Зт-ίά мутантов нет. В литературе есть лишь косвенные упоминания о Зт-резистентных мутантах: клоны, демонстрирующие высокую устойчивость, можно получить только при применении множественных пересевов, а не возрастающей концентрации стрептомицина. Устойчивости к Зт за один шаг можно достичь только путем применения концентрации стрептомицина 20 мкг/мл. Эксперименты, проведенные авторами настоящего изобретения по выделению мутантов, демонстрирующих устойчивость к Зт, и Зтб-мутантов с применением концентрации стрептомицина 100 мкг/мл (путем рассевания на чашки культуры 72 ч/39°С) были неуспешными. Неожиданно, было показано, что несмотря на значимое увеличение количества бактерий, количество жизнеспособных микроорганизмов достоверно снижалось при переходе от культуры 24 ч/39°С к культуре 72 ч/39°С, как показано в следующей таблице.

Сатру1ойас1ег сой и Сатру1ойас1ег )е_]ип1: количество жизнеспособных микроорганизмов на чашках Петри с САЗО-агаром в зависимости от периода инкубации при 39°С

Сатру1оЪас1ег	24ч	48ч	72ч
С. соИ	1хЮ¹⁰	ЗхЮ⁹	7хЮ⁸
С. рерит	ЗхЮ¹⁰	5х10⁹	1хЮ⁹
С. соИ Рте/	ЗхЮ⁹	ЗхЮ⁸	4хЮ⁷

Указанные результаты согласуются с тем наблюдением, что культуры Сатру1ойас1ег способны переходить в жизнеспособное, но не культивируемое состояние.

Следовательно, мутантов, обладающей устойчивостью к Зт, можно получить только путем рассевания на чашки материала из культуры <24 ч/39°С. Однако среди устойчивых колоний, обладающих нормальным размером или слегка уменьшенным размером, Зтб мутантов обнаружить не удалось. Тогда как среди очень маленьких колоний и мини-колоний Сатру1ойас1ег (появляющихся с некоторой задержкой) большинство клонов могли быть охарактеризованы как Зтб клоны.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 - примеры используемых для получения вакцин штаммов За1топе11а, характеризующихся тремя аттенюирующими мутациями. Инкубацию планшетов проводили при 37°С приблизительно в течение 20 ч.

Фиг. 1 (А) - За1топе11а 1п£апйз (штамм дикого типа/Зт-ίά 4.22/Κί£ 2 (и 1е1 4)).

Фиг. 1(В) - За1топе11а ΥιιτΉοχν (штамм дикого типа/Зт-ίά 9.3/К1Г 2).

Фиг. 1 (С) - За1топе11а Набаг (штамм дикого типа/Зт-ίά 4.1/Зт 2 (и К1£ 1).

Фиг. 1(Ό) - За1топе11а Рага1урЫ В, вариант 1ауа 3.2 (штамм дикого типа/Зт-ίά. 1.1/ КИ3 (и Κί£ 2)).

Фиг. 2 - примеры используемых для получения вакцин штаммов Сатру1ойас1ег, характеризующихся тремя аттенюирующими мутациями. Инкубацию планшетов проводили при 39°С приблизительно в течение 48 и 72 ч соответственно.

Фиг. 2(А) - Сатру1ойас1ег сой I (штамм дикого типа/Зт-ίά 5.5/Рйо 1 и Рйо 2).

Фиг. 2(В) - Сатру1ойас1ег сой II (штамм дикого типа/Зт-ίά 18.1/Зт 2).

Фиг. 2(С) - Сатру1ойас1ег )е)ит I (штамм дикого типа/Зт-ίά 2.3/Рйо 1 (и Рйо 2)).

Фиг. 2(Ό) - Сатру1ойас1ег )е)ит II (штамм дикого типа/Зт-ίά 2.1/Зт 2).

Фиг. 3 - примеры используемых для получения вакцин конструктов За1топе11а, характеризующихся (двумя), четырьмя, пятью или шестью аттенюирующими мутациями. Инкубацию планшетов проводили при 37°С приблизительно в течение 20 ч.

Фиг. 3(А) - За1топе11а Υ'п'с1^о\\: штамм дикого типа/Зт-ίά I 1.4/Зт-1б II 0.3/Зт 4; штамм дикого типа/Зт-ίά I 1.4/Зт-1б II 0.3/Зт-1б III 0.x.

Фиг. 3(В) - За1топе11а ЫГапйз: штамм дикого типа/Зт-ίά I 4.22/Зт-1б II 0.1/Κί£ 2; штамм дикого типа/Зт-ίά I 4.22/Зт-1б II 0.1/Зт-1б III 1.1.

Фиг. 4 - примеры использующихся для составления вакцин конструктов Сатру1ойас1ег, характеризующихся (двумя), четырьмя, пятью или шестью аттенюирующими мутациями. Инкубацию планшетов проводили при 39°С приблизительно в течение 48 ч.

Фиг. 4(А) - Сатру1ойас1ег сой II штамм дикого типа/Зт-ίά I 18.1/Зт-1б II а.1. Данный штамм характерен тем, что вторая мутация Зт-ίά а. 1 приводит к устойчивости к Зт.

Фиг. 4(В) - Сатру1ойас1ег сой II штамм дикого типа/Зт-ίά I 17.7/Зт-1б II а.1/Рйо1, штамм дикого типа/Зт-ίά I 17.7/Зт-1б II аТ/Зт-ίά III а.1.

- 3 030355

Таким образом, согласно настоящему изобретению предложен способ получения живых бактериальных вакцин, содержащих стабильные бактерии, несущие по меньшей мере три (и до шести или семи) аттенюирующие мутации, причем указанный способ включает следующие этапы:

(a) обеспечение штамма бактерий и выращивание указанного штамма в присутствии первого антибиотика, предпочтительно стрептомицина;

(b) выделение из штамма (а) таких "мини"-колоний, которые соответствуют клонам, зависимым от первого антибиотика;

(c) выращивание клона (Ь) в отсутствии указанного первого антибиотика и выделение аттенюированных ревертантов, характеризующихся размером колонии, который составляет >50% от размера колонии штамма дикого типа;

(б) выращивание клона, полученного на этапе (с) в среде с добавлением второго антибиотика, который отличен от первого антибиотика (например, аминогликозид, такой как стрептомицин, неомицин, канамицин, спектиномицин, гентамицин, амикацин и тобрамицин; рифампицин, фусидовая кислота, налидиксовая кислота, фосфомицин) в подходящей концентрации, предпочтительно приблизительно в 10 раз превышающей М1С (минимальную ингибирующую концентрацию);

(е) выделение и осуществление последовательного пересева колоний, демонтирующих уменьшенный размер колоний (МС А "тек");

(ί) выделение клонов, которые имеют постепенное уменьшение размера колонии в качестве стабильного признака.

Штамм бактерий для этапа (а) предпочтительно получают из "диких" вирулентных штаммов. Указанные штаммы можно получить у больных животных (например, цыплят). Исходные природные штаммы, которые применяются, должны обладать определенной степенью вирулентности.

При выборе антибиотика для селекции мутантов на этапе (а) руководствуются практическими соображениями. Например, известно, что стрептомицин быстро приводит к образованию устойчивых и зависимых штаммов среди микроорганизмов.

Таким образом, согласно предпочтительным вариантам реализации способа согласно настоящему изобретению антибиотиком на этапе (а) является стрептомицин. Однако в качестве антибиотика на этапе (а) могут подойти другие аминогликозиды, такие как неомицин, канамицин, спектиномицин, гентамицин, амикацин и тобрамицин, а также рифампицин, фусидовая кислота и налидиксовая кислота.

Известно, что устойчивость к антибиотику может возникать в результате других механизмов модификации. В частности, генетическая модификация может влиять на хромосому бактерии. Хромосомная модификация является редким явлением, которое, будучи проведено, обеспечивает стабильность приобретенных свойств.

Термин "мини-колонии" в настоящей заявке относится к бактериальным колониям, характеризующимся уменьшенным размером. Предпочтительно они характеризуются размером <10% от размера колоний штамма дикого типа.

Селекция аттенюированных штаммов бактерий как функции критерия роста на среде, содержащей антибиотик, представляет собой операцию, которую применяли для разных видов, например, с целью появления штаммов, отличающихся пониженной вирулентностью.

Штаммы бактерий согласно настоящему изобретению, характеризующиеся по меньшей мере тремя (и до шести или семи) аттенюирующими мутациями, являются, во-первых, невирулентными штаммами, полученными в результате селекции из природных вирулентных штаммов, для их способности к росту на среде с высоким содержанием такого антибиотика, как стрептомицин, и, кроме того, которые могут развиваться удовлетворительно только в присутствии антибиотика (этап (Ь)). По указанной причине говорят, что такие штаммы зависимы, например, от стрептомицина (§тб мутанты).

Во-вторых, штаммы на стадии (с) представляют собой мутанты, отобранные из зависимых от антибиотика штаммов, и которые, в частности, обладают способностью к развитию в отсутствии стрептомицина в связи с введением второй аттенюирующей мутации или маркера. Указанные штаммы называют §т-1б штаммами. Предпочтительно между этапами (Ь) и (с) проводят этап отмывки. Предпочтительной средой для этапа (с) является среда 8а1топе11а СА8О (8С) (например, для 8а1топе11а) или среда СА8О (например, для Сатру1оЬас!ег).

Этап (б) позволяет ввести дополнительную мутацию устойчивости к антибиотику на основе МС ("гек") (в качестве третьего аттенюирующего маркера). Предпочтительно указанным антибиотиком является стрептомицин, рифампицин или фосфомицин. Концентрацию антибиотика на этапе (б) специалист в данной области техники может определить в соответствии со стандартными процедурами. Предпочтительно для 8а1топе11а концентрация рифампицина, стрептомицина (примечание: большинство §тчб мутантов чувствительны к стрептомицину и, следовательно, подходят для введения дополнительного маркера МС 8т "гек") и фосфамицина соответствует приблизительно десятикратному значению М1С, а для фусидовой кислоты - приблизительно четырехкратному значению М1С.

Предпочтительно для Сатру1оЬас!ег применяют по меньшей мере 200 мкг/мл фосфамицина и по меньшей мере 100 мкг/мл стрептомицина соответственно.

- 4 030355

На этапе (е) штаммы Зтчб/устойчивые к антибиотику на основе МС из предыдущего этапа, характеризуемые дополнительным небольшим сокращением размеров колонии, выделяют и последовательно пересевают с целью проверить стабильность. Предпочтительно проводят по меньшей мере 30 последовательных пересевов.

В заключение, на этапе (ί) получают клоны, выделенные на этапе (е), демонстрирующие постепенное уменьшение размеров колоний как стабильное свойство.

Согласно предпочтительным вариантам реализации способа согласно настоящему изобретению этапы (а)-(с) повторяют по меньшей мере один раз для получения бактерии, несущей по меньшей мере четыре аттенюирующих мутации. Данный способ позволяет получать новых аттенюированных мутантов, например, в соответствии со следующими схемами (показано для Зт):

(a) 8тс1 1 —> 8ηι-ίά I —> 8тс1 а —> 8ηι-ίά II;

(b) 8тс1 1 —> 8ηι-ίά I —> 8тс1 а —> 8ηι-ίά II —> 8тс1 α —> 8ηι-ίά III;

(c) 8тс1 1 —> 8ηι-ίά I —> 8тс1 а —> 8ηι-ίά II —> 8тс1 α —> 8ηι-ίά III —> МС «гез»

к антибиотику.

Неожиданно было показано, что штаммы, происходящие от Зт-ίά мутантов, несущие четыре или даже шесть мутаций, не демонстрируют более высокой степени аттенюации, по сравнению со штаммами, содержащими три аттенюирующих мутации, но демонстрируют даже более высокую стабильность.

Выбор антибиотика для селекции штаммов мутантов с устойчивостью к антибиотику на основе МС согласно настоящему изобретению основывается на практических соображениях и, в принципе, в целях настоящего изобретения можно применять любой антибиотик, способный вызывать мутации метаболического дрейфа (МС), например стрептомицин (примечание: большинство Зт-ίά мутантов чувствительны к стрептомицину и, следовательно, подходят для дополнительного маркера МС Зт "гез"), рифампицин, фосфомицин, фусидовая кислота или налидиксовая кислота.

Способ согласно настоящему изобретению не ограничивается конкретными бактериями. Помимо видов За1топе11а и видов Сатру1ойас!ег для получения живых бактериальных вакцин, содержащих стабильные бактерии согласно способам настоящего изобретения можно применять другие бактерии, такие как З1арйу1ососсиз аигеиз, ЕзсйепсЫа сой, ВасШиз сегеиз (Рзеибоап!йгах), виды Уегз1ша, такие как Υ. рез118, виды К1ейз1е11а, виды Й1з1епа, виды Аеготопаз, виды ЗЫдейа, виды Раз1еиге11а/Ау1Йас1епит, виды Ктетегейа, Огпййойас1егшт гйто!гасйеа1е, виды Вогбе!е11а и виды Рзеиботопаз.

Однако предпочтительные бактерии включают За1топе11а и/или Сатру1ойас!ег, особенно За1топе11а Ьоп§ог1, З. еШепса подвидов еШепса, ап/опае, б1ап7опае, за1атае, йои!епае и тбша, предпочтительно З. еШепса подвида еШепса, такие как следующие серотипы: ОиЫт, СаШпагит (биовары СаШпагит и Ри11огит), Сйо1егаезшз, ТурЫзшз, ТурЫ, Рага!урЫ А,В,С, АйогЫзерш, Айог1изоу1з, Айопу, ЕЫепйЫз, ТурЫтигшт, Сорепйадеп, 1пГапИз, Уйсйо\, Набаг, Адона, \е\\роП, АпаЫт, Не1бе1йег§, Рапата, 1пб1апа, Зат1раи1, Вгапбепйигд, а также Сатру1ойас!ег сой, Сатру1ойас!ег щ|шн и Сатру1ойас!ег £е!из.

Согласно предпочтительному варианту реализации способа согласно настоящему изобретению на этапах (а) и (й) мутанты За1топе11а выделяют из культур в логарифмической фазе роста и в виде миниколоний, которые начинают появляться по меньшей мере через 48 или более часов инкубации при 37°С.

Согласно еще одному предпочтительному варианту реализации способа согласно настоящему изобретению на этапах (а) и (й) мутанты Сатру1ойас!ег выделяют из мини-колоний, которые начинают появляться после инкубации по меньшей мере в течение 72 или более часов при 39°С.

Согласно настоящему изобретению также предложены живые бактериальные штаммы, которые можно получить посредством способа согласно настоящему изобретению, а также вакцина, содержащая живые бактериальные штаммы согласно настоящему изобретению и биологические приемлемый носитель. Композиции для вакцинации, конечно, можно составить с применением свежекультивированных бактерий.

Предпочтительно композиция вакцины согласно настоящему изобретению лиофилизирована.

Для введения вакцинирующих бактерий среда, в которой они суспендированы, не критична. Конечно, данная среда не должна препятствовать хорошей жизнеспособности содержащихся в ней бактерий.

Вакцины согласно настоящему изобретению вводят в количестве, подходящем для иммунизации индивидуума, и они могут дополнительно содержать один или более общепринятых вспомогательных агентов. Применяемый термин "количество, подходящее для иммунизации индивидуума" включает любое количество бактерий, при помощи которого можно иммунизировать индивидуума. "Количество, подходящее для иммунизации индивидуума" можно определить при помощи способов, известных специалистам в данной области техники. Термин "индивидуум" в настоящей заявке включает индивидуума любого типа. Примерами таких индивидуумов являются животные (и люди).

Введение вакцины предпочтительно проводят пероральным путем, но также можно проводить инъекции в разные участки тела индивидуума - внутримышечно, подкожно, внутрикожно или в любой другой форме введения. Также может быть предпочтительно проводить одну или более "инъекций бустердоз", включающих приблизительно равные количества.

- 5 030355

Вакцина согласно настоящему изобретению может быть профилактической, т.е. соединения вводят для предупреждения или отсрочки развития инфекции или колонизации, например инфекции/колонизации, вызываемой 8а1шопе11а или СашруюЪаШег.

Следующие штаммы были сохранены в Коллекции типовых культур Германии (ОеШзсйе 8ашш1ип§ νοη 25 М1кгог§ап18шеп ипб Хе11ки11игеп (Ό8ΜΖ), Брауншвейг) 27 ноября 2012 г. в соответствии с Будапештским договором:

Название Номер доступа

8а1топе11а степса подвида егйепса Серотип IηΓαηΙίκ δηιίά4-22/Κί£2 = ΌδΜ 26682

Сатру1оЪас1ег соИ К2848/11 διηκΗ 8/διη2 = ΌδΜ 26683

Сатру1оЪас1ег]ерт К2963/12 διηιΗ2.1/8ш2 = ΌδΜ 26684

Представленные далее примеры объясняют изобретение более подробно.

Пример 1. Материалы.

(A) Штаммы.

8а1шопе11а еШепса подвида еШепса, серотип \лгс1ю\у,

8а1шопе11а еШепса подвида еШепса, серотип 1п£апЙ8,

8а1шопе11а еШепса подвида еШепса, серотип Набат,

8а1шопе11а рага!урЫ В (вариант Ь-Таг1га1+, ранее .кпл),

Сашру1оЪас1ег сой, Сашру1оЪас1ег |е_|нш (предоставленный компанией 'Тойтапп Ашша1 Неайй", Куксхавен, Германия).

(B) Среды.

1000 мл среды для Сашру1оЪас1ег (среда СА8О) содержит 35 г СА8О-агара (81йп), 3 г экстракта дрожжей, 3 г гидролизата казеина, 4 г активированного угля, 0,25 г Бе8О₄, 0,25 г пирувата натрия, 5 г агара Кобе ("КШй").

1000 мл среды для 8а1шопе11а (среда 8С) содержит 35 г СА8О-агара (81йп), 3 г экстракта дрожжей, 1 г глюкозы, 5 г агара Кобе ("Кшй").

(C) Антибиотики.

Стрептомицин (8ш) ("КШй", № 0236.2), фосфомицин (Р1о) ("81§ша", № Р5396), рифампицин (Κι£) ("Ктешзег Лг/пепш11е1 АС", Ра1о1 Егеш£а1 600 мг).

(Ό) Значения М1С для штаммов дикого типа.

Штамм	Стрептомици	рифампицин	фосфомицин
8а1топе11а етеггса подвид степса, серотип (кгсксм	12,5	12,5	н.д.
8а1топе11а етеггса подвид етеггса, серотип Ιη(αηίί8	12,5	12,5	н.д.
8а1топе11а етеггса подвид етеггса, серотип Ηαάατ	25	12,5	н.д.
8а1топе11а ραταΐνρίν В (вар. Ь1апга1е)	30	12,5	н.д.
Сатру1оЪас1ег соИ (¥81	1	н.д.	25
Сатру1оЪас1ег соИ (¥811	1	н.д.	25
Сатру1оЪас(ег ]е]ит (¥81	2	н.д.	25
Сатру1оЪас1ег (е(ипг (¥8II	2	н.д.	25

н.д.: не определялось.

Пример 2. Селекция и выделение 8шб мутантов.

(а) Ориентированное на практику выделение 8шб мутантов 8а1шопе11а.

Приблизительно 10¹⁰ КОЕ (колониеобразующих единиц) из культуры 18 ч/37°С 8а1шопе11а рассевали на чашки Петри, содержащие агар 8С с добавлением 500 мкг/мл стрептомицина. Помимо колоний с нормальными размерами и единичных колоний с несколько уменьшенным размером (вирулентные 8шустойчивые клоны и МС 8ш "тез" клоны) удается выявить "мини-колонии" (преимущественное варианты с маленькими колониями = зус) с разной частотой - в зависимости от штамма. После инкубации приблизительно в течение >48 ч (при 37°С) удается выявить 1-2 дополнительных колонии (приблизительно на 30 колоний с нормальным размером и колоний с несколько уменьшенным размером), которые неотличимы от §ν^ В зависимости от частоты появления фенотипа δον, можно показать, что 3-20% указанных мини-колоний представляют собой 8шб мутанты.

Расчетная частота 8шб клонов относительно устойчивых мутантов составила >1%.

Примечание: выделения 8шб клонов достигают путем применения 8ш-чувствительных штаммов дикого типа в качестве исходного сырья. Штаммы, как правило, проявляют низкое значение М1С.

- 6 030355

(Ь) Ориентированное на практику выделение 8тк мутантов Сатру1оЬас!ет.

Бактериальный материал, полученный из культуры в чашке Петри с СЛ§О-агаром (24 ч/39°С; приблизительно 10¹⁰ КОЕ), которую засеяли таким способом, что была покрыта вся поверхность диска, засевали на 1 или 2 чашки Петри с СЛ§О-агаром с добавлением 100 мкг/мл стрептомицина и инкубировали в течение 72 ч при 39°С. В зависимости от штамма выявляли <10 колоний/чашку (среднее значение) с нормальными размерами и колоний с несколько уменьшенным размером (стрептомицин-устойчивые и МС δτ "тек" клоны). Кроме того, можно было обнаружить колонии с явно уменьшенным размером (диаметр <25% от нормального размера) с частотой приблизительно 20% по сравнению с колониями с нормальным размером и с колониями с несколько уменьшенным размером. Приблизительно одна треть указанных колоний представляла собой §тк клоны.

Расчетная частота клонов δτά по отношению к устойчивым мутантам составила >5%.

Пример 3. Селекция и выделение διτι-ίά мутантов.

(a) Выделение διτι-ίά мутантов 8а1топе11а διτι-ίά из клонов §тк.

Приблизительно 10⁹ КОЕ (на чашку Петри) отмытого 8тк мутанта рассевали на чашки Петри, содержащие среду 8С и инкубировали в течение 48 ч при 37°С. Из полученных аттенюированных ревертантов далее работали только с такими мутантами, которые демонстрировали размер колоний приблизительно >50% по сравнению с колониями штамма дикого типа (в соответствии с целью получить Зт-ίά клоны, демонстрирующие только низкую аттенюацию).

(b) Выделение διτι-ίά мутантов Сатру1оЬас!ет из клонов §тк.

Бактериальный материал, полученный из культур на чашках Петри с СЛ§О-агаром (с добавлением 100 мкг/мл стрептомицина) (24 ч/39°С), на которые засевали бактерии так, чтобы была покрыта вся поверхность диска, подвергали одному этапу отмывки, рассевали на чашках Петри с СЛ§О-агаром в соотношении 1:1 (приблизительно 3х10⁹ КОЕ) - 1:4 и затем инкубировали в течение 72 ч при 39°С. При указанных условиях инкубирования большинство δτά клонов демонстрировали развитие <10 аттенюированных ревертантов (в среднем). Большинство из указанных аттенюированных ревертантов были чувствительны к διτι. Как правило, дальнейшей обработке подвергали διτι-ίά клоны, которые демонстрировали уменьшенные размеры колоний приблизительно по меньшей мере на 50% больше по сравнению с колониями штамма дикого типа.

Некоторые штаммы, например Сатру1оЬас!ет |С|ип1. допускали выделение только из διτι-ίά с размером колоний по меньшей мере на 50% меньше по сравнению со штаммом дикого типа.

Примечание: не все штаммы Сатру1оЬас!ет и §тк мутанты, полученные из них, допускают выделение διτι-ίά ревертантов без каких-либо проблем. Однако возможно выделять Зт-ίά ревертанты также из проблематичных штаммов, например, с применением нескольких независимых δτά мутантов.

Пример 4. Выделение дополнительного мутанта с устойчивостью к антибиотику на основе МС.

Включение дополнительной мутации устойчивости к антибиотику на основе МС в избранные διτι-ίά мутанты в качестве третьего маркера аттенюации и распознавание проводили так же, как было описано выше.

Если кратко:

(a) δа1тоηе11а: 10^9-10 КОЕ выбранных διτι-ίά клонов инкубировали на среде δС с добавлением рифампицина или стрептомицина в концентрации, приблизительно в десять раз превышающей М1С (что касается фусидовой кислоты - в концентрации, приблизительно в четыре раза превышающей М1С) соответственно, и инкубировали в течение 48 ч при 37°С;

(b) Сатру1оЬас!ет: материал из культуры в чашке Петри (среда с СΑδО-агаром), которая была засеяна διτι-ίά мутантом так, чтобы он покрывал всю поверхность, и которую инкубировали в течение 24 ч при 39°С, засевали на чашки в соотношении 1:4-1:8 на среду с СΑδО-агаром с добавлением 200 мкг/мл фосфомицина или 100 мкг/мл стрептомицина и инкубировали в течение >72 ч при 39°С.

Колонии, демонстрирующие (более или менее) уменьшенный размер колоний, выделяли и подвергали последовательным пересевам. Приблизительно 20% указанных клонов сохраняли клоноспецифичное постепенное сокращение размеров колонии в качестве стабильного свойства.

Пример 5. Получение штаммов для составления вакцины, содержащих 4 или 6 аттенюирующих мутаций.

Получение штаммов для составления вакцины, содержащих 4 или 6 аттенюирующих мутаций достигали путем последовательного включения второй и, необязательно, третей супрессорной διτι-ίά мутации в основной клон διτι-ίά I: διτι-ίά Ι/διιτ-ίά Π/διττ-ίά III.

(а) δа1тоηе11а. Приблизительно 10¹⁰ КОЕ мутанта διιτ-ίά I (или исходного штамма διτι-ίά II) засевали на чашки со средой δС с добавлением 500 мкг/мл стрептомицина и инкубировали в течение 48 ч при 37°С. Приблизительно 5% δт-устойчивых колоний являются διττά мутантами (теперь растущими преимущественно в виде колоний с "нормальным размером"). В результате применения διττά клонов, полученных из штаммов διιτ-ίά I и штаммов διτι-ίά II соответственно, διτι-ίά мутантов снова выделяли в соответствии с тем же подходом, который был описан в примере 3(а). Дальнейшей обработке подвергали клоны с желаемым сокращением размера колоний.

- 7 030355

(Ь) Сашру1оЬас1ег. Материал из культуры в чашке Петри со средой с СА8О-агаром, которая была засеяна 8ш-Ы мутантом так, чтобы он покрывал всю поверхность, и которую инкубировали в течение 24 ч при 39°С, засевали на чашки в соотношении 1:4 на среду с СА8О-агаром с добавлением 100 мкг/мл стрептомицина и инкубировали в течение 72 ч при 39°С. Помимо приблизительно 15 8ш-устойчивых колоний с "нормальным размером", удавалось выявить 2-3 маленькие колонии. 50% указанных колоний были 8шб клонами. Указанные 8шб клоны (полученные из штаммов 8ш-Ы I и штаммов 8ш-Ы II соответственно) применяли в качестве исходных клонов - в соответствии с примером 3(Ь) - для повторного выделения 8ш-Ы мутантов. Дальнейшей обработке подвергали клоны, демонстрирующие желаемое сокращение размера колоний.

Пример 6. Выделение мутанта с устойчивостью к антибиотику на основе МС из избранных мутантов 8ш-Ы II.

(a) 8а1шопе11а: Введение полезной мутации устойчивости к антибиотику на основе МС в избранные мутанты 8ш-Ы ЕЗш-Ы II в качестве дополнительного 5-го аттенюирующего и облегчающего распознавание маркера проводили аналогично тому, как описано в примере 4(а).

(b) Сашру1оЬас1ег: Введение полезной мутации устойчивости к антибиотику на основе МС в избранные мутанты 8ш-Ы ЕЗш-Ы II в качестве дополнительного 5-го аттенюирующего и облегчающего распознавание маркера проводили аналогично тому, как описано в примере 4(Ь).

Примечание: подход, описанный выше, можно применять также для дополнительного введения мутации устойчивости к антибиотику на основе МС в избранные мутанты 8ш-Ы III (содержащие шесть аттенюирующих мутаций) в качестве 7-го маркера аттенюации и распознавания. Однако это может приводить к гиператтенюации, которое может быть помехой для значимости в плане практического применения.

Пример 7. Размеры колоний, представленные в виде столбчатых диаграмм, для ориентированной на перспективу оценки возможной степени аттенюации.

Суспензии соответствующих штаммов дикого типа и мутантов с МС, полученных из указанных штаммов, разводили в логарифмическом соотношении и рассевали на питательную среду так, чтобы можно было получить на 1 чашке Петри от 10 до 50 достоверно определяемых отдельных колоний. Чтобы скомпенсировать различия в росте, связанные со средой, готовили по меньшей мере 5 чашек Петри на одну степень разведения. Отдельные колонии, выращенные при стандартизированных условиях (например, одинаковое время инкубации, одинаковая толщина слоя среды), фотографировали. Цифровые фотографии обрабатывали в программе Се11Ргой1ег ("Вгоаб ^зШЩе"): определяли и сохраняли диаметр отдельных колоний. После усреднения значений на основе данных построили график в виде столбчатой диаграммы относительно размеров колоний штамма дикого типа (взятых за 100%).

Пример 8. Получение вакцин из подходящих штаммов для получения вакцин и применение при вакцинации цыплят/молодых куриц и последующих хозяев, которым требуется защита соответственно.

Для приготовления живых вакцин штаммы для получения вакцин, несущие три (четыре, пять и шесть соответственно) аттенюирующих мутаций, выращивали на обычной жидкой среде до фазы логарифмического роста. В суспензии вакцин и осадки вакцин добавляли соответствующий стабилизатор соответственно и затем лиофилизировали. Полученные вакцины вводили (в соответствии с типом показаний - одну, две или три дозы) пероральным или парентеральным путем.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Устойчивый к антибиотику штамм 8а1шопе11а еп1епса И8М 26682.
2. Вакцина для лечения или профилактики бактериальной инфекции, вызванной 8а1шопе11а, содержащая штамм 8а1шопе11а по п.1.
3. Применение штамма 8а1шопе11а по п. 1 для изготовления вакцины для лечения или профилактики бактериальной инфекции, вызванной 8а1шопе11а.