CN114107162A - 诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种简单在实验室诱导细菌形成SCVs的制备方法,诱导成功率高,并解决诱导SCVs工作量大、且易被野生菌株覆盖而难以分离纯化的问题。该方法可大大简化细菌SCVs诱导和纯化的程序,提高诱导筛选效率。本发明制备方法利用在固体培养基上形成以滤纸片为中心的连续药物梯度浓度,且同一固体培养基上可放置多种抗生素滤纸片,从而实现同时使用多种抗生素对同一菌株进行诱导筛选的目的,大大提高工作效率。SCVs对抗菌药物的抗性增加提高了临床抗菌药物的选择难度。本发明成功分离并鉴定出大肠杆菌SCVs,为开展SCVs相关疾病的研究提供了生物学材料,也为大肠杆菌SCVs相关疾病的诊断、治疗和预防提供了依据。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域,涉及一种诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法。
背景技术
小菌落变异体(Small Colony Variants,SCVs)是多种细菌在应对环境压力或宿主压力时的一种特殊存在形式。SCVs是细菌正常生长周期的一部分,在恶劣的生存条件下选择成为高度动态或静态,并对多种抗生素表现出耐药性,是在宿主体内持续存在的重要方式,可以使细菌隐藏在宿主细胞内而不引起强烈的宿主反应,从而逃避抗菌药物和宿主免疫反应,造成持续性复发感染,给临床治疗带来很大困难。甚至隐匿在宿主细胞内的SCVs,在抗生素治疗结束以后或者宿主免疫反应降低时恢复毒力,迅速生长杀死宿主细胞。
通常细菌的SCVs因生长缓慢、糖酵解反应迟缓等与野生株不同的生理生化特性,因此易被生长迅速的野生株覆盖或被当作其他细菌而忽视。并且在环境压力消失或减轻后SCVs又可恢复成野生株状态。因此直接从临床病例中分离得到SCVs仍很困难。
为了进一步深入探索细菌SCVs的形成机制、生理生化特点、致病性以及发掘新的抗生素作用位点等,需要在实验室建立诱导SCVs形成的方法。目前关于SCVs的诱导方法只有零星报道,且通常是在液体培养基中添加特定浓度的抗生素进行诱导培养,然后划线分离纯化。通过观察菌落特征选择符合要求的菌落再进行传代培养与鉴定。此方法的弊端在于:一是液体培养基中的抗生素浓度均一,为恒定值,不易诱导出SCVs,而为了选择最适的诱导浓度,需要同时设置很多不同浓度进行诱导,工作量较大;二是SCVs在划线分离纯化过程中,易被生长迅速的野生型菌株覆盖,不易得到SCVs。SCVs特殊的表型和生理生化特征使其分离、鉴定及药敏试验变得尤为困难,也给微生物研究及医务工作者带来了严重挑战。SCVs菌落形态异常,生化反应丧失或降低,传统的实验室技术对SCVs的诱导筛选与获得效果很不理想。因而探索SCVs诱导筛选与获得技术势在必行。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的就在于提供一种简单在实验室诱导细菌形成SCVs的制备方法,诱导成功率高,并解决诱导SCVs工作量大、且易被野生菌株覆盖而难以分离纯化的问题。该方法可大大简化细菌SCVs诱导和纯化的程序,提高诱导筛选效率。
为达到上述目的,本发明通过以下技术方案实现:
将K-B纸片法改良后应用于诱导大肠杆菌形成SCVs,可成功诱导、筛选出SCVs并且可简化诱导流程,提高效率。
1.诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法,具体包括以下步骤:
a.将细菌在TSB中37℃条件下恒温培养6-8h的细菌混悬液,用无菌生理盐水稀释后均匀涂布于TSA平皿上,将含有抗生素的无菌滤纸片贴于TSA平皿表面,然后在37℃恒温下培养18-24h,得到F1代;
b.取F1代抑菌圈边缘或抑菌圈内的单菌落/菌苔于TSB中,在37℃下,180rpm培养24-56h,得到F1代细菌混悬液;若有细菌生长,则将F1代细菌混悬液接种于血平板和/或NA平板上37℃恒温培养24-48h,观察和野生株相比,诱导株是否生长缓慢、有明显的菌落变化,挑取特征性菌落划线纯化;同时将F1代细菌混悬液用无菌生理盐水稀释后均匀涂布于TSA上,将含有60μɡ卡那霉素和/或10μɡ庆大霉素的无菌滤纸片贴于平皿表面;然后放入37℃恒温培养18-24h,得到F2代,并观察有无特征菌落;
若无细菌生长,则重复取F1代抑菌圈边缘或抑菌圈内的单菌落/菌苔于TSB中,在37℃下,180rpm培养24-56h,直到若有细菌生长,再重复上述有细菌生长的后续步骤;
c.重复上述步骤b操作,不同的是,随着重复次数的增加,无菌滤纸片所含抗生素浓度也依次增加,直到出现特征菌落或抗生素增加至最高浓度。
进一步,诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法中,细菌混悬液用无菌生理盐水稀释至1×108CFU/mL-2×108CFU/mL。
本发明所使用抗生素为氨基糖苷类抗生素;
进一步,所述氨基糖苷类抗生素为卡那霉素和庆大霉素。
进一步,诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法中,步骤a中含有抗生素的无菌滤纸片上含有30μɡ卡那霉素和/或5μɡ庆大霉素。
进一步,诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法中,所述菌落变化具体为菌落呈无色透明或半透明的小菌落。
进一步,诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法中,步骤c中无菌滤纸片所含抗生素浓度也依次增加具体为120μɡ卡那霉素、240μɡ卡那霉素和/或20μɡ庆大霉素、40μɡ庆大霉素。
进一步,诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法中,所述细菌为大肠杆菌。
进一步,诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法中,所述制备方法还包括SCVs稳定性检验。
进一步,诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法中,所述SCVs稳定性检验为将特征菌落标记为第1代SCVs菌株,在TSA和/或NA平板上进行传代培养10次及以上,经10次及以上传代稳定的SCVs作为稳定SCVs。
进一步,诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法中,所述制备方法还包括SCVs的特异性基因检测。
进一步,诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法中,所述制备方法还包括SCVs的特异性基因检测,所述特异性基因为phoA,所述检测为PCR检测,所述PCR检测的引物序列如下所示:
5'-CGATTCTGGAAATGGCAAAAG-3'SEQ ID No.1;
5'-CGTGATCAGCGGTGACTATGAC-3'SEQ ID No.2。
本发明的有益效果在于:本发明所用诱导大肠杆菌形成小菌落变异体(SCVs)的制备方法,无需大型或精密仪器设备即可操作完成,流程简便,诱导效率大大提高。在固体培养基上使用载有不同药量抗生素的滤纸片,使其在以滤纸片为中心的固体培养基上形成由高到低的不同药物浓度以诱导野生株菌形成SCVs。发明人发现传统的SCVs诱导方法均为在液体培养基中添加特定浓度的抗生素对野生菌株进行诱导,抗生素浓度均一恒定,诱导率低。且不同菌株诱导产生SCVs的抗生素浓度不同,所以传统的诱导方法在诱导某种细菌的SCVs时,需要同时设置多种抗生素浓度,以提高诱导成功率,因此程序繁琐、工作量大。而本发明制备方法利用在固体培养基上形成以滤纸片为中心的连续药物梯度浓度,且同一固体培养基上可放置多种抗生素滤纸片,从而实现同时使用多种抗生素对同一菌株进行诱导筛选的目的,大大提高工作效率。SCVs是具有特殊表型的细菌亚群,可能导致隐形感染或反复感染,为临床治疗造成诸多困扰。SCVs对抗菌药物的抗性增加提高了临床抗菌药物的选择难度。本发明成功分离并鉴定出大肠杆菌SCVs,为开展SCVs相关疾病的研究提供了生物学材料,也为大肠杆菌SCVs相关疾病的诊断、治疗和预防提供了依据。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚,本发明提供如下附图进行说明:
图1是部分大肠杆菌SCVs的诱导及培养特性图。
图2是部分大肠杆菌及其SCVs特异性基因检测电泳图。
图3是大肠杆菌及其SCVs的部分生化试验结果图部分。
图4是大肠杆菌及其SCVs的生长曲线比较图。
图5是大肠杆菌SCVs营养缺陷型检测结果图。
图6是其余部分大肠杆菌SCVs的诱导及培养特性图。
图7是部分大肠杆菌及其SCVs特异性基因phoA检测电泳图。
具体实施方式
下面将结合附图,对本发明的优选实施例进行详细的描述。显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
本发明提供的K-B纸片法诱导大肠杆菌形成SCVs的试验方法,用到以下试剂:
分别含有30μɡ、60μɡ、120μɡ和240μɡ卡那霉素的无菌滤纸片;
分别含有5μɡ、10μɡ、20μɡ和40μɡ庆大霉素的无菌滤纸片;
胰酪大豆琼脂培养基(TSA)、胰酪大豆肉汤培养基(TSB)和哥伦比亚血琼脂培养基(简称血平板)、营养琼脂(NA)。
胰酪大豆琼脂培养基主要成分:酪蛋白胰酶水解物15.0g/L、大豆粉木瓜蛋白酶水解物5.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L,pH值7.3±0.2。
胰酪大豆肉汤培养基主要成分:酪蛋白胰酶水解物15.0g/L、大豆粉木瓜蛋白酶水解物5.0g/L、氯化钠5.0g/L,pH值7.3±0.2。
哥伦比亚血琼脂培养基主要成分:在TSA的基础上加入5-10%的无菌绵羊全血。
营养琼脂主要成分:蛋白胨10.0g/L、牛肉粉3.0g/L、氯化钠5.0g/L,pH值7.3±0.2。
K-B纸片法诱导大肠杆菌形成SCVs的试验方法,具体包括以下步骤:
1.大肠杆菌SCVs的诱导、分离与纯化
将大肠杆菌在TSB中37℃条件下恒温培养6-8h的细菌混悬液,用无菌生理盐水稀释至0.5个麦氏标准(细菌浓度范围为1×108CFU/mL-2×108CFU/mL均可),然后使用无菌棉签蘸取菌液均匀涂布于TSA平皿上,将含有30μɡ卡那霉素和5μɡ庆大霉素的无菌滤纸片分别贴于TSA平皿表面(两种滤纸放置于不同平皿中),然后放入37℃恒温培养箱中培养18-24h,得到F1代。滤纸片的大小对SCVs的形成无影响,按常规设置即可。
挑取/蘸取F1代抑菌圈边缘或抑菌圈内的单菌落/菌苔于TSB中,在37℃下摇床(180rpm)培养24-56h。若有细菌生长,则将菌液接种于血平板和/或NA平板上37℃恒温培养24-48h,观察和野生株相比,诱导株是否生长缓慢、有明显的菌落变化(特征性菌落:菌落呈无色透明或半透明的小菌落),挑取特征性菌落划线纯化。同时将细菌混悬液用无菌生理盐水稀释至0.5个麦氏标准(同前,细菌浓度范围为1×108CFU/mL-2×108CFU/mL均可),然后使用无菌棉签蘸取菌液均匀涂布于TSA上,将含有60μɡ卡那霉素/10μɡ庆大霉素的无菌滤纸片贴于平皿表面。然后放入37℃恒温培养箱中培养18-24h,得到F2代,并观察有无特征菌落。若无细菌生长,则重复挑取/蘸取F1代抑菌圈边缘或抑菌圈内的单菌落/菌苔于TSB中,在37℃下摇床(180rpm)培养24-56h,再重复上述有细菌生长步骤。
重复上述操作。不同的是,随着重复次数的增加,抗生素药物浓度也依次增加(120μɡ卡那霉素、240μɡ卡那霉素或20μɡ庆大霉素、40μɡ庆大霉素,卡那霉素和庆大霉素分别各自进行诱导,不组合使用),直到第一次出现特征菌落或抗生素增加至最高浓度即可。
本发明也测试过其他卡那霉素和庆大霉素浓度,比如300μɡ和600μɡ卡那霉素、100μɡ和200μɡ庆大霉素或其他等不同浓度的诱导,均未获得EC-SCVs。首先要说明的是,目前常用的细菌SCVs诱导方法均为液体培养法,即在液体培养基中添加一定浓度的抗生素进行诱导,此时诱导SCVs产生的抗生素是均一的单一浓度。目前均未有使用K-B纸片法诱导细菌SCVs的相关报道,此为本发明的改进之一。第二,在发明人使用K-B纸片法进行细菌SCVs诱导时,对比于普通K-B纸片法诱导,无法得到SCVs,经大量实验后进行了改良,在本发明中使用营养更为丰富的TSA培养基代替普通K-B纸片法中的MHA培养基,这是第一个改良之处;第二个改良之处在于,在本发明中无菌滤纸片的载药量与普通K-B纸片法中的载药量不同,具体的载药量是发明人在实验实施过程中根据实验结果调整后验证确定的,才能确保能获得SCVs。具体见实施例1步骤1。
大肠杆菌SCVs稳定性检验
将特征菌落标记为第1代大肠杆菌SCVs菌株,在TSA和/或NA平板上进行传代培养10次及以上,以验证其稳定性,经10次及以上传代稳定的SCVs作为稳定的SCVs。
在本实施例中,大肠杆菌野生株150、25-1、1-12、21-2、L-16-1经卡那霉素(其中150和25-1在120μɡ时出现特征性菌落,1-12和21-2在60μɡ时出现特征性菌落,L-16-1在30μɡ时出现特征性菌落)诱导、大肠杆菌L-16-1经庆大霉素(5μɡ时出现特征性菌落)诱导出现抑菌圈边缘或抑菌圈内呈无色透明状的单菌落/菌苔的现象。刮取抑菌圈边缘或抑菌圈内呈无色透明状的单菌落/菌苔接种于TSB中,其生长缓慢。经10次传代确定其稳定性,标记为大肠杆菌SCVs菌株,分别命名为150-S、25-1-S、1-12-S、21-2-S、L16-1-S和L16-1-S-CN。各大肠杆菌SCVs的诱导及培养特性图如图1和图6所示,图1为150-S、25-1-S、21-2-S,其中A:在载药滤纸片周围形成的抑菌圈边缘或抑菌圈内的单菌落/菌苔。B:大肠杆菌及SCVs在血平板上的生长情况。与野生株相比,150-S生长缓慢、呈无色透明的针尖状的小菌落;21-2-S生长缓慢、呈半透明的小菌落。25-1-S并未形成小菌落,但相较于野生株,其在血平板上的菌落更扁平、更透明。C:大肠杆菌及SCVs在NA上的生长情况。与野生株相较,150-S在NA上不生长。21-2-S和25-1-S生长缓慢、呈透明状、圆形、扁平小菌落,与野生株相比差异明显。D:大肠杆菌及SCVs在TSA上的生长情况。与野生株相比,150-S生长缓慢、呈无色透明的针尖状的小菌落;21-2-S生长缓慢、呈半透明的小菌落,而25-1-S在TSA上的菌落更扁平、更透明。
总而言之,如图1所示,与野生株相较,150-S、L16-1-S和L16-1-S-CN在血平板和TSA上生长缓慢、呈无色透明的针尖状的小菌落,而在NA上不生长。相较于野生株,21-2-S在血平板和TSA上生长缓慢、呈半透明的小菌落,在NA上呈透明的小菌落。25-1-S和1-12-S在血平板上并未形成小菌落,但相较于野生株,其在血平板上的菌落更扁平、更透明。与野生株相比,25-1-S和1-12-S在TSA生长良好,差异不明显。而在NA上生长缓慢、呈透明状、圆形、扁平小菌落,与野生株相比差异明显。1-12、1-12-S、L-16-1、L-16-1-S和L16-1-S-CN相关培养特性图如图6所示,其中A:在载药滤纸片周围形成的抑菌圈边缘或抑菌圈内的单菌落/菌苔。B:大肠杆菌及SCVs在血平板上的生长情况;1-12-S并未形成小菌落,但相较于野生株,其在血平板上的菌落更扁平、更透明;与野生株相比,L-16-1-S和L-16-1-S-CN生长缓慢、呈无色透明针尖状小菌落。C:大肠杆菌及SCVs在NA上的生长情况;与野生株相比,1-12-S生长缓慢、呈圆形、扁平、透明状小菌落;L-16-1-S和L-16-1-S-CN在NA上不生长。D:大肠杆菌及SCVs在TSA上的生长情况;与野生株相比,L-16-1-S和L-16-1-S-CN生长缓慢、呈无色透明的针尖状的小菌落;而1-12-S在TSA上的菌落更扁平、更透明。
实施例2
大肠杆菌及其SCVs的特异性基因检测
以大肠杆菌标准菌株ATCC 25922为阳性对照,对大肠杆菌及其SCVs进行特异性基因phoA扩增检测,扩增产物大小在720bp且为单一明亮条带为扩增阳性。本实验采用25μLPCR扩增体系:dd H2O(20.35μL)、Easy Taq酶(0.15μL)、Easy Taq buffer(2.5μL)、dNTP(0.5μL)、上下游引物各0.5μL(引物序列见表1)、DNA模板0.5μL。phoA基因PCR扩增条件为:95℃预变性5min,95℃变性50s、55℃退火50s,共30个循环,72℃延伸1min,72℃最后延伸7min。
表1 phoA基因引物序列
图2和图7为大肠杆菌及其SCVs特异性基因phoA检测电泳图,图2为150和150-S的结果,其中M:2K plusⅡ;泳道1:ATCC 25922;泳道2:150;泳道3:150-S;泳道4:空白对照。其中1-3扩增出目的基因,由电泳图可见扩增产物的条带单一明亮,大小为720bp。其余SCVsphoA基因扩增图如图7所示,其中M:2K plusⅡ;泳道1:ATCC 25922;泳道2:L16-1;泳道3:L16-1-S;泳道4:L16-1-S-CN;泳道5:150;泳道6:150-S;泳道7:21-2;泳道8:21-2-S;泳道9:1-12;泳道10:1-12-S;泳道11:25-1;泳道12:25-1-S;泳道13:空白对照。其中1-12扩增出目的基因(条带单一明亮,大小为720bp)。
实施例3
大肠杆菌及其SCVs的生化试验、生长曲线测定和营养缺陷型试验
1.分别以大肠杆菌标准菌株ATCC 25922和无菌生理盐水为阳性和空白对照,使用微量生化鉴定管对大肠杆菌及其SCVs进行糖发酵实验(乳糖、山梨醇、甘露醇、葡萄糖和三糖铁)以及触酶试验、硝酸盐还原试验和醋酸盐利用试验。
其中在醋酸盐利用试验中野生株均利用醋酸盐,而诱导株均不利用醋酸盐(结果见图3),野生株及其SCVs均发酵利用葡萄糖和乳糖,结果见表2。图3中,A图为醋酸盐利用试验,若待检菌株可利用醋酸盐,可呈现兰色。若待检菌株不能利用醋酸盐则不变色或呈浅黄色。25-1可利用醋酸盐,其实验结果为“+”;25-1-S不能利用醋酸盐,其实验结果为“-”,颜色同空白对照。B图为山梨醇发酵试验,若待检菌株可利用山梨醇产酸,则生化管颜色变黄。若待检菌株不利用山梨醇产酸,则生化管颜色不变。25-1可利用山梨醇产酸,其实验结果为“+”;25-1-S不能利用山梨醇产酸,其实验结果为“-”,颜色同空白对照。
表2生化试验结果
*表示糖类发酵迟缓,24h后缓慢发酵。
2.对大肠杆菌及其SCVs进行生长曲线的测定,将过夜培养的大肠杆菌野生株和诱导株1:200稀释,接种于TSB中,800rpm,37℃。对野生株及其SCVs的生长曲线测定结果如图4所示。图4表明,相较于野生株,诱导株进入对数生长期的时间并延后,对数生长期大幅缩短,提前退出对数生长期,并且进入弛缓期的细菌总OD值也大幅下降。
3.将过夜培养的大肠杆菌SCVs菌悬液涂布于TSA/NA平板上,然后分别滴加15μL100μg/mL的甲萘醌、氯化血红素和胸腺嘧啶脱氧核苷,在有氧条件下37℃恒温培养24-48h。同时将大肠杆菌SCVs划线接种于血平板上,在5%CO2的条件下37℃恒温培养24-48h,然后观察是否有回复现象。
大肠杆菌SCVs的营养缺陷型检测结果如图5所示,其中A为滴加补充氯化血红素(H)、甲萘醌(VK3)和胸腺嘧啶脱氧核苷(TD)作为150-S的依赖物质,进行150-S的还原试验。在滴加补充血红素的周围出现回复菌落,而在VK3和TD的周围并未出现回复菌落。B为在5%CO2条件下培养的150-S菌株,在血平板上也未出现回复菌落。150-S、L-16-1-S和L-16-1-S在所滴加的氯化血红素周围出现回复菌落,而在所滴加的甲萘醌和胸腺嘧啶脱氧核苷周围以及在5%CO2条件下培养的血平板上,均未出现回复菌落。因此可以判断其为血红素依赖型SCVs。而21-2-S、25-1-S和1-12-S未出现回复菌落,无法判断其营养缺陷型。
最后说明的是,以上具体实施方式仅为本发明的优选实施例,但本发明的保护范围并不局限于此,任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
Claims (10)
1.诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法,其特征在于,制备方法具体包括以下步骤:
a.将细菌在TSB中37℃条件下恒温培养6-8h的细菌混悬液,用无菌生理盐水稀释后均匀涂布于TSA平皿上,将含有抗生素的无菌滤纸片贴于TSA平皿表面,然后在37℃恒温下培养18-24h,得到F1代;
b.取F1代抑菌圈边缘或抑菌圈内的单菌落/菌苔于TSB中,在37℃下,180rpm培养24-56h,得到F1代细菌混悬液;若有细菌生长,则将F1代细菌混悬液接种于血平板和/或NA平板上37℃恒温培养24-48h,观察和野生株相比,诱导株是否生长缓慢、有明显的菌落变化,挑取特征性菌落划线纯化;同时将F1代细菌混悬液用无菌生理盐水稀释后均匀涂布于TSA上,将含有60μɡ卡那霉素和/或10μɡ庆大霉素的无菌滤纸片贴于平皿表面;
然后放入37℃恒温培养18-24h,得到F2代,并观察有无特征菌落;
若无细菌生长,则重复取F1代抑菌圈边缘或抑菌圈内的单菌落/菌苔于TSB中,在37℃下,180rpm培养24-56h,直到若有细菌生长,再重复上述有细菌生长的后续步骤;
c.重复上述步骤b操作,不同的是,随着重复次数的增加,无菌滤纸片所含抗生素浓度也依次增加,直到出现特征菌落或抗生素增加至最高浓度。
2.根据权利要求1所述诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法,其特征在于,细菌混悬液用无菌生理盐水稀释至1×108CFU/mL-2×108CFU/mL。
3.根据权利要求1所述诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法,其特征在于,步骤a中含有抗生素的无菌滤纸片上含有30μɡ卡那霉素和/或5μɡ庆大霉素。
4.根据权利要求1所述诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法,其特征在于,所述菌落变化具体为菌落呈无色透明或半透明的小菌落。
5.根据权利要求1所述诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法,其特征在于,步骤c中无菌滤纸片所含抗生素浓度也依次增加具体为120μɡ卡那霉素、240μɡ卡那霉素和/或20μɡ庆大霉素、40μɡ庆大霉素。
6.根据权利要求1所述诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法,其特征在于,所述细菌为大肠杆菌。
7.根据权利要求1-6任一项所述诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括SCVs稳定性检验。
8.根据权利要求7所述诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法,其特征在于,所述SCVs稳定性检验为将特征菌落标记为第1代SCVs菌株,在TSA和/或NA平板上进行传代培养10次及以上,经10次及以上传代稳定的SCVs作为稳定SCVs。
9.根据权利要求1-6任一项所述诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括SCVs的特异性基因检测。
10.根据权利要求6所述诱导细菌形成小菌落变异体的制备方法,其特征在于,所述制备方法还包括SCVs的特异性基因检测,所述特异性基因为phoA,所述检测为PCR检测,所述PCR检测的引物序列如下所示:
5'-CGATTCTGGAAATGGCAAAAG-3'SEQ ID No.1;
5'-CGTGATCAGCGGTGACTATGAC-3'SEQ ID No.2。
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