TWI775126B - 檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係揭露一種檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法及其用途，其中，含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法係透過提供一經改良之培養基，於一預定溫度下培養待測樣品後，依據該經改良之培養基上顏色變化，識別出含有芽孢乳酸菌或/及其孢子之菌落，進而能夠計算出芽孢乳酸菌之總數，亦能夠推算出芽孢乳酸菌孢子數量。藉由本發明所揭檢測方法，係能應用於檢測樣品中之芽孢乳酸菌活性有無或其活性高低，及評估芽孢乳酸菌菌株促近腸道健康的能力。
Description
本發明係有關益生菌之體外計數方法及其用途，特別係指一種檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法及其用途。
按，如芽孢乳酸菌(Bacillus coagulans)，又稱為凝結芽孢桿菌，係具有乳酸桿菌屬和芽孢桿菌屬的特徵，並有形成內孢子之特性。根據研究，芽孢乳酸菌具多種健康促進功效，如調節胃腸道疾病、免疫調控、降低膽固醇等，故被認為是一種益生菌，不過芽孢乳酸菌係非腸道內之既有菌種，人體必須自行補充才能獲得。
由於芽孢乳酸菌會藉由孢子型態抵抗如高溫或酸性之惡劣環境，故目前多將芽孢乳酸菌以孢子型態作為食品或組合物，以避免其被胃酸等破壞活性，惟，若當芽孢乳酸菌孢子投予至個體後未於腸道內萌發(germination)，則無法於腸道內轉化為營養細胞(vegetative cells)及定著於腸道，意即芽孢乳酸菌無法於個體體內發揮營養細胞的生理活性。
基於目前研究無法徹底瞭解芽孢乳酸菌於腸道內發育之機制，並且現有檢測及分析方法無法將糞便內之芽孢乳酸菌與其他微生物分離並培養，亦未有提供專門自糞便中篩選或分離凝結芽孢桿菌之培養基；另雖有研究提出
可透過短時間之熱處理，如75℃處理30分鐘，來消除其他微生物，以計算出孢子態的芽孢乳酸菌數量，但是加熱處理會產生「熱活化」現象，進而促使孢子萌發生長，以致於獲得錯誤的結果。
由此可知，習知技術係難以判斷芽孢乳酸菌是否已於腸道內萌發，進而難以得知芽孢乳酸菌孢子或含有芽孢乳酸菌孢子之組合物於個體是否發揮營養細胞之活性。
本發明之主要目的係在於提供一種檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法，其係藉由將經前處理及/或未經前處理之糞便樣品培養於經改良後之培養基，直接地或間接地計算出糞便樣品內芽孢乳酸菌孢子或其營養細胞之數量。
本發明之另一目的係在於提供一種檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法的用途，其係透過本發明所揭方法檢測糞便樣品內芽孢乳酸菌及/或其孢子於體內有效性及其孢子之數量，進而推算出檢測芽孢乳酸菌孢子於體內轉化為營養細胞之數量，以達到藉由非侵入性方法準確且快速地評估含有芽孢乳酸菌之組合物能夠建構有利於益菌生長之腸道環境的功效。
緣是，為能達成上述目的，本發明係提供檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法，其係透過將一糞便樣品接種一培養基上進行培養，挑選出一周遭具有顏色變化之菌落，判斷該菌落係為芽孢乳酸菌，再對該菌落進行計數，得到該菌落之數量。
於一實施例中，該糞便樣品於接種於該培養基前，需先經次氯酸鈉處理，該糞便樣品中之芽孢乳酸菌營養細胞無法於該培養基上生長。
其中，次氯酸鈉處理該糞便樣品之時間係約為30~60秒，例如：30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒，而又以處理時間為30秒為佳。
其中，次氯酸鈉之濃度係不高於1000ppm，如100、200、300、400、500、600、700、800、900ppm，舉例來說，當次氯酸鈉濃度為500ppm時，處理前後糞便樣品中之芽孢乳酸菌孢子數量仍可維持穩定。
於另一實施例中，本發明所揭檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法中係分別培養該糞便樣品及經次氯酸鈉處理之該糞便樣品，以計算出芽孢乳酸菌之總數及其孢子數量，並進而推算出芽孢乳酸菌營養細胞之數量。具體來說，取該糞便樣品一部分，並以次氯酸鈉處理，將經次氯酸鈉處理之該糞便樣品及未經次氯酸鈉處理之該糞便樣品分別接種該培養基，進行培養；培養完成，觀察該培養基上菌落周遭顏色變化，分別挑選培養基上周遭顏色有變化之該菌落，並計算該菌落之數量，而當該菌落來自未經次氯酸鈉處理之該糞便樣品，該菌落之計數結果為一芽孢乳酸菌總數；當該菌落來自經次氯酸鈉處理之該糞便樣品，該菌落之計數結果為一芽孢乳酸菌孢子數。
其中，次氯酸鈉之濃度低於1000ppm，如500ppm；並以次氯酸鈉處理該糞便樣品之時間以低於60秒為佳，如30秒或45秒。
又，於一實施例中，將該芽孢乳酸菌總數扣除該芽孢乳酸菌孢子數，可得到芽孢乳酸菌營養細胞之數量。
於本發明之實施例中，該培養基係為葡萄糖酵母萃取物培養基(GYEA medium)，並酸鹼值約為5.5。
於本發明之實施例中，該酸鹼指示劑係為溴甲酚綠。
於本發明之實施例中，培養溫度約為55℃。
於本發明之實施例中，該糞便樣品之提供者係於採樣前至少5天被投予芽孢乳酸菌或含有芽孢乳酸菌之組合物。
更進一步來說，本發明所揭於檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法係能應用於檢測或評估一待測樣品內之芽孢乳酸菌孢子於一個體內產酸能力或產酸率，意即一受試者被投予該待測樣品至少5天後，將來自該受試者之糞便樣品培養於該培養基，得計算出芽孢乳酸菌及/或其孢子之數量，當芽孢乳酸菌及其孢子之數量差距越大，顯示該待測樣品於受試者內之產酸能力或產酸率越佳，因而達到評估芽孢乳酸菌菌株促近腸道健康的能力。
圖1a係為芽孢乳酸菌培養於改良GYEA培養基，以肉眼觀察到之菌落型態。
圖1b係為芽孢乳酸菌培養於改良GYEA培養基，於第二階段培養第4天時，以顯微鏡觀察菌落型態之結果。
圖1c係為芽孢乳酸菌培養於改良GYEA培養基，於第二階段培養第5天時，以顯微鏡觀察菌落型態之結果，其中，箭頭所指處為芽孢乳酸菌孢子。
圖1d係為芽孢乳酸菌培養於改良GYEA培養基，於第二階段培養第6天時，以顯微鏡觀察菌落型態之結果，其中，箭頭所指處為芽孢乳酸菌孢子。
圖2係顯示於不同培養天數下，帶有孢子之芽孢乳酸菌菌落之比例(Duncan's test,p<0.05)。
圖3顯示經不同濃度次氯酸鈉處理之樣品中芽孢乳酸菌孢子數量之相對比例，其中，以未經次氯酸鈉處理之芽孢乳酸菌孢子數量作為比較基礎。
圖4顯示經次氯酸鈉處理不同時間之樣品中芽孢乳酸菌孢子數量之相對比例，其中，以次氯酸鈉處理為0秒之芽孢乳酸菌孢子數量作為比較基礎。
圖5係顯示芽孢乳酸菌孢子與營養細胞分別於不同腸道部位之比例，其中，a-b間具有顯著差異(p<0.05)、c-d間具有顯著差異(Duncan's test,p<0.05)。
圖6係顯示各組大鼠之糞便中短鏈脂肪酸之含量，其中，*表示有顯著差異(Duncan's test,p<0.05)。
本發明係揭露一種檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法及其用途，其透過提供一種經改良而具有一預定酸鹼值之培養基，並得搭配前處理糞便樣品之技術，而將糞便樣品接種於培養基，於一預定溫度下進行培養後，藉由培養基上菌落周遭之顏色變化，挑選且判斷出含有芽孢乳酸菌菌落，再進而計算出芽孢乳酸菌之總數及/或芽孢乳酸菌孢子數量。又，當得知芽孢乳酸菌總數及芽孢乳酸菌孢子數量後，計算出芽孢乳酸菌總數及芽孢乳酸菌孢子數量間之差值，其即為芽孢乳酸菌營養細胞之數量，藉此能夠評估待測樣品內之芽孢乳酸菌於個體體內之產酸能力或產酸率，而基於腸道內若能維持穩定之弱酸性環境，將有利於益菌生長，並且抑制壞菌增生，因此，透過本發明所揭方法係能夠推估該待測樣品於個體體內之活性有無及其活性好壞，以達到判斷該待測樣品有效性之功效。
本發明所指所謂「判斷」，係指經篩選確認菌落為芽孢乳酸菌之程序，而得以人工或機器進行。
本發明所指「營養細胞(vegetative cells)」，係指當一產孢細菌於適當生長環境下，由孢子態的休眠狀態再度活化之情形，而營養細胞係處於生長狀態，具有繁殖能力。
以下，為能說明本發明及其功效，將茲舉若干實例，並搭配實例結果與圖式做更詳細說明如後。
本發明所使用之芽孢乳酸菌，係為「孢子型態之芽孢桿菌純菌株(約5 x 109孢子/g)」，其由生展生物科技股份有限公司所提供之商業菌，並保存於4℃之環境下；此菌株選用僅為例示，非限制本案之保護範圍，意即使用其他非生展生物科技股份有限公司提供之芽孢乳酸菌亦能達成本發明所揭之功效。
以下實例中所進行之動物實驗皆經過國立中興大學動物照護及使用委員會核准，並遵守相關的倫理規範。
以下實例所有數據都經鄧肯氏新多重變域測驗(Duncan's test)進行統計分析。
實例一：複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌之確認
取待測菌樣，先培養於改良GYEA(glucose yeast extract agar)培養基，其中，改良條件如下：pH值調整為5.5，將溴甲酚綠作為酸鹼指示劑；於55℃好氧環境下培養2天後，透過溫度篩去無法於超過55℃以上溫度生存之為細菌，留下芽孢乳酸菌菌落(如圖1a)，而由於芽孢乳酸菌生長會導致培養環境中之酸鹼值降低，約為pH 3.8，因此，於芽孢乳酸菌菌落周圍會發生由藍變黃之顏色變化，並且以顯微鏡確認菌落之產孢情況後，可知周圍為黃色環並帶有孢子的藍色菌落係為芽孢乳酸菌菌落。進行第二階段的培養，意即持續放置在55℃之恆溫環境下培養特定天數後，挑出有黃色環之芽孢乳酸菌菌落，並以孔雀石綠和番紅花染色，透過顯微鏡觀察，結果如圖1b至圖1d所示，並且進行帶有孢子之菌落計數之結果如圖2所示。
由圖1b顯示，於第二階段培養4天後，芽孢乳酸菌菌落係僅以生長型營養細胞(vegetative form)呈現，而於第二階段培養第5天開始，可發現芽
孢乳酸菌菌落中開始出現孢子，並且隨著培養天數增加而增加(如圖1c及圖1d)。更一步來說，由圖2之結果顯示，帶有孢子之芽孢乳酸菌菌落之比例明顯增加係在於第二階段培養第6天，並且於培養第七天時，幾乎所有菌落都會帶有孢子。
據此可知，檢測及培養芽孢乳酸菌之環境必須要包含有下列條件：55℃之培養溫度；於培養後至少5天才能觀察到孢子形成，其中以培養7天的觀察效果較佳；而所使用之培養基需要能使生產乳酸之細菌生長，且以具有酸鹼值變化指示劑為佳，如前所述改良GYEA培養基。
實例二：樣品前處理參數試驗(一)
將一含芽孢乳酸菌樣品，分別以不同濃度之次氯酸鈉：0、500、750、1000ppm處理30秒後，分別接種於改良GYEA培養基上，於55℃下培養2天後，挑選出具有黃色環自菌落，並計算菌落之菌數，得到芽孢乳酸菌孢子數量，結果如表1，其中，各數據彼此間具有顯著差異(Duncan's test,p<0.05)，並且進一步以未經次氯酸鈉處理芽孢乳酸菌孢子數量為基準，計算出經不同濃度次氯酸鈉處理後之相對芽孢乳酸菌孢子比例，結果如圖3所示。
基於以次氯酸鈉處理樣本之目的在於要消除芽孢乳酸菌之營養細胞，並且要維持樣品中芽孢乳酸菌孢子數量之穩定，以使培養後所得到之芽孢乳酸菌孢子數量是正確的，因此，以次氯酸鈉處理的樣品中之芽孢乳酸菌孢子數量應越接近未經次氯酸鈉處理的樣品中之芽孢乳酸菌孢子數量為佳。
而由表1及圖3之結果可知，當樣品經越高濃度之次氯酸鈉處理，其內芽孢乳酸菌孢子數量會越少，意即高濃度之次氯酸鈉會使樣品中芽孢乳酸菌孢子數量無法穩定維持與處理前相近；是以，根據表1及圖3的結果可知，若要同時達到消除樣品中芽孢乳酸菌營養細胞且維持芽孢乳酸菌孢子數量，所使用之次氯酸鈉濃度不應超過1000ppm，並且，以濃度為約500ppm為佳。
實例三：樣品前處理參數試驗(二)
將一芽孢乳酸菌樣品，分別以濃度為500ppm之次氯酸鈉處理不同時間：0、30、60、180秒後，再分別接種於改良GYEA培養基上，於55℃下培養2天後，挑選出具有黃色環自菌落，並計算菌落之菌數，得到芽孢乳酸菌孢子數量，結果如表2，其中，各數據彼此間具有顯著差異(Duncan's test,p<0.05)，並且進一步以未經次氯酸鈉處理芽孢乳酸菌孢子數量為基準，計算出經次氯酸鈉處理不同時間後之相對芽孢乳酸菌孢子比例，結果如圖4所示。如同前所述者，若經次氯酸鈉處理後之樣品中芽孢乳酸菌孢子數量與未經次氯酸鈉處理之樣品中芽孢乳酸菌孢子數量差距越大，表示無法維持芽孢乳酸菌孢子數量之穩定。
由表2及圖4之結果可知，經次氯酸鈉溶液處理30秒之樣品中的芽孢乳酸菌孢子數量相近於未經次氯酸鈉處理者；當樣品經次氯酸鈉處理60秒時，其內芽孢乳酸菌孢子數量則較未經次氯酸鈉處理之樣品減少；而當樣品經次氯酸鈉處理180秒時，其內芽孢乳酸菌孢子數量係較未經次氯酸鈉處理之樣品中芽孢乳酸菌孢子數量大幅增加。由上述結果顯示，若要同時達到消除樣品中芽孢乳酸菌營養細胞且維持芽孢乳酸菌孢子數量，次氯酸鈉處理樣品之時間應於60秒以下，並且，以處理時間約30秒為佳。
表2：經次氯酸鈉處理不同時間之樣品中芽孢乳酸菌孢子數量
實例四：動物試驗
取16隻8週齡雄性SD大鼠(購自台灣，BioLASCO公司)，其體重分別為336.6±16.7g，飼養於受調控之環境中：22±1℃、60±5%濕度、12小時光暗循環。
將SD大鼠隨機分為2組，其中一組為控制組，另一組為芽孢乳酸菌組(以下簡稱BC菌組)，各組大鼠於試驗期間都被供給相同飲食，不同在者，BC菌組係會每天被投予含芽孢乳酸菌孢子(5 x 107CFU/g)。於試驗期間，每天記錄各組SD大鼠之攝食量及體重，並於試驗第28天，收集新鮮糞便。將收集之糞便存放於-20℃之環境；於試驗結束後，犧牲各組SD大鼠。
根據記錄結果，SD大鼠之平均攝食量為28.4-28.9g/day，並試驗結束之平均最終體重為434.3-439.0g。
實例五：腸道與糞便中之細菌型態檢測
收集各組大鼠之糞便，並檢測其糞便含水度、重量及酸鹼值，結果如表3所示。
另收集大鼠之盲腸液、結腸內容物和糞便，並分別以1：10(w/v)之比例懸浮在無菌磷酸鹽緩衝鹽水中。以磷酸鹽緩衝鹽水進行連續十倍的稀釋，以獲得細菌計數所需之濃度。
為了進行芽孢乳酸菌孢子計數(spore counts，SCs)，於塗佈於改良GYEA培養基前，取各組大鼠之糞便，先分別以濃度為500ppm之次氯酸鈉(NaOCl)溶液處理30秒。
將各組大鼠未經次氯酸鈉溶液處理之糞便及經次氯酸鈉溶液處理之糞便於改良GYEA培養基上培養於55℃下培養2天後，挑選出具有黃色環自菌落，並計算菌落之菌數，當菌落來自於未經次氯酸鈉溶液處理之糞便時，所計算出來之數量為芽孢乳酸菌之總計數(total viable counts，TCs)，包含營養細胞與孢子，而當菌落來自於經次氯酸鈉溶液處理之糞便時，所計算出來之數量為芽孢乳酸菌孢子數，再將芽孢乳酸菌之總計數減去芽孢乳酸菌孢子數，得到營養細胞的數量。結果如下表4及圖5，其中，表4中未檢測出數量小於1 x102CFU/g。
所有菌落都有經過實例一所示方法處理，並以下列RNA引子對進行16S rRNA之確認，根據結果可以確定本實例中所檢測及進行計數的菌落與NCBI BLAST資料庫中芽孢乳酸菌的相似度為99.8%，顯示本實例中所培養之菌落皆為芽孢乳酸菌菌落。
正向引子(F)：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；反向引子(R)：5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
由表3之結果可知，相較於控制組，投予芽孢乳酸菌孢子係能增加糞便濕度，並使重量增加，且由於芽孢乳酸菌會產生乳酸，所以糞便酸鹼值會降低。
由表4之結果可知，於控制組中，未被檢測出有芽孢乳酸菌孢子存在，而BC菌組經過連續28天口服芽孢乳酸菌孢子之試驗後，於SD大鼠糞便中分別可以發現3.64 x105CFU/g之孢子與6.31 x105CFU/g之營養細胞。
更進一步，由圖5之結果可知BC菌組之SD大鼠盲腸液、結腸內容物和糞便中芽孢乳酸菌孢子與芽孢乳酸菌營養細胞之比例分別為2.3：7.7、2.1：7.9及3.9：6.1。此結果係顯示芽孢乳酸菌營養細胞係於腸道及糞便中都有出現，並且其於盲腸及結腸之比例係高於糞便中，可推知芽孢乳酸菌之再孢子化(resporulation)會發生在結腸遠端，排便前。
由上述結果可知，透過本發明所揭方法培養糞便後，確實能夠得知糞便中之芽孢乳酸菌之總數及芽孢乳酸菌孢子之數量，進而可以準確且快速地推算出芽孢乳酸菌營養細胞之數量，當芽孢乳酸菌營養細胞數量增加或較高時，或是當芽孢乳酸菌孢子數量減少或降低時，表示該芽孢乳酸菌菌株可於腸道內萌發，並發揮營養細胞的保健效益，例如具有較佳之產酸能力；反之，當芽孢乳酸菌營養細胞數量減少或較低時，或是當芽孢乳酸菌孢子數量增加或較高時，表示該芽孢乳酸菌菌株的保健效益較差。
由此可知，本發明所揭方法係能夠用於得知芽孢乳酸菌於腸胃道內萌發為營養細胞的能力，進而用以評估投予進入個體內之芽孢乳酸菌菌株是否能夠有助於改善或維持腸道健康。
實例六：檢測糞便中之短鏈脂肪酸
首先將糞便樣品以1：10(w/v)的比例與0.9%(w/v)之冷鹽水進行均質化，以1006g離心10分鐘後，取2mL上清液與10μL異卡甲酸(內標)和20μL 50%(w/v)硫酸混合，以乙醚萃取後，利用管柱(Agilent J & W HP-INNO Wax GC Column,30m,0.25mm.0.25μm)以氣相層析火焰離子化檢測器分析1μL醚層，其中，以7mL/min的流速提供氦氣作為載氣；分析條件如下：初始烘箱溫度在80℃下1分鐘，以20℃/min之速度升至140℃，然後在140℃下1分鐘，再20℃/min之速度升高至220℃，在220℃ 2分鐘；進樣器和檢測器的溫度分別為140℃和250℃。各組SD大鼠糞便中短鏈脂肪酸之檢測結果係如圖6所示。
由圖6之結果可知，BC菌組之SD大鼠因被投予芽孢乳酸菌孢子而導致乙酸(由96.1至147.7mol/g糞便)以及丁酸(由34.9至99.0mol/g糞便)之急遽上升，不過丙酸之含量並未明顯變高。整體來說，於投予芽孢乳酸菌孢子後，孢子萌發生長可使總短鏈脂肪酸濃度約提高1.7倍(由169.3至279.2mol/g糞便)。
並由此結果綜合前述實例之結果係能合理得知，當芽孢乳酸菌孢子於個體腸胃道內被活化為營養細胞後，會於腸胃道內產生乳酸等物質，使原本固存於腸胃道之產酸細菌(acid-producing bacteria)能夠生長並產酸，進而提高腸胃道內總短鏈脂肪酸濃度。
而綜合前述實例之結果可知，本發明所揭於檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法能夠透過檢測糞便樣品中所含有之芽孢乳酸菌數量及芽孢乳酸菌孢子數量，得知進入糞便樣品之提供者體內之芽孢乳酸菌是否能夠被活化或是再次萌發成為營養細胞，而當進入體內之芽孢乳酸菌孢子轉化成為營養細胞之數量為高時，顯示投予至體內之芽孢乳酸菌或是含有芽孢乳酸菌之組合物具有較佳之生理活性，而能改善腸道環境並促進腸道健康。
Claims (5)
- 一種檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法，其係包含下列步驟：取一糞便樣品；將該糞便樣品以次氯酸鈉處理30秒，其中，次氯酸鈉之濃度為500ppm；製備一培養基，其中，該培養基之酸鹼值係為5.0~6.0，具有一營養成分，用以提供一生產乳酸之細菌生長，以及一溴甲酚綠，用以作為酸鹼指示劑；分別將經次氯酸鈉處理之該糞便樣品及未經次氯酸鈉處理之糞便樣品接種於培養基上，於50℃~60℃之培養溫度下進行培養；培養完成後，觀察該培養基上菌落周遭顏色變化，分別挑選培養基上周遭顏色有變化之該菌落，並計算該菌落之菌數，其中，當該菌落來自未經次氯酸鈉處理之該糞便樣品，該菌落之計數結果為一芽孢乳酸菌總數，而當該菌落來自經次氯酸鈉處理之該糞便樣品，該菌落之計數結果為一芽孢乳酸菌孢子數。
- 如請求項1所述檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法，其更包含有一步驟e，將該芽孢乳酸菌總數扣除該芽孢乳酸菌孢子數，得到芽孢乳酸菌營養細胞之數量。
- 如請求項1所述檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法，其中，該培養基係為葡萄糖酵母萃取物培養基，其酸鹼值約為5.5。
- 如請求項1所述檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法，其中，該步驟c中之培養溫度約為55℃。
- 如請求項1所述檢測含有複雜微生物檢體中的芽孢乳酸菌數量之方法，其中，該糞便樣品之提供者係於採樣前至少5天被投予芽孢乳酸菌或含有芽孢乳酸菌之組合物。
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