KR20150082480A

KR20150082480A - 생백신의 제조

Info

Publication number: KR20150082480A
Application number: KR1020157014763A
Authority: KR
Inventors: 클라우스 린데; 안케 그로쎄-헤렌타이
Original assignee: 로만 아니말 헬쓰 게엠베하
Priority date: 2012-12-07
Filing date: 2013-09-05
Publication date: 2015-07-15
Also published as: CN104995292A; ES2776429T3; CA2901322A1; JP6336461B2; US11904008B2; CA2901322C; MX2015007195A; EP2929058B1; BR112015011944A8; AU2017219152A1; EA201590856A1; EP2929058A1; US20220088168A1; AU2013311675A1; NZ709154A; ES2686325T3; US20150297705A1; US10828362B2; PL2929058T3; EP3714899A1

Abstract

본원에는 3가지 이상의 약독화 돌연변이를 수반하는 안정한 박테리아를 함유하는 생백신의 생성 방법, 및 상기 방법에 의해 수득된 박테리아를 함유하는 백신이 기재되어 있다.
[대표도]
도 1a

Description

생백신의 제조 {PREPARATION OF LIVE VACCINES}

본 발명은 3가지 이상의 약독화 돌연변이를 수반하는 안정한 박테리아를 함유하는 생백신의 생성 방법, 및 상기 방법에 의해 수득된 박테리아를 함유하는 백신을 제공한다.

많은 박테리아 생백신은 생체 분자 기술에 의해 조작된 약독화 박테리아를 포함한다. 불행하게도, 이들 백신의 대부분은 다음과 같은 이유로 인해 실행에 따른 요구 사항을 준수하기에 불충분한 것으로 간주된다:

(a) 그 생성이 복잡하고 시간 소모적이며, 약독화 정도를 제어할 수 없으므로, 숙주의 감수성에 대한 적응이 종종 만족스럽지 못하다.

(b) 입법 기관에 의해 요구되는 시험 방법 (임상 시험)이 정교하다.

(c) 백신 접종받는 집단이 제한된다.

이와는 달리, 대사 드리프트(metabolic drift) (MD)에 의해 약독화된 돌연변이체는 다음 이점을 특징으로 한다:

(a) 제조 비용이 저렴하고, 생성 시간 증가와, 이에 따른 콜로니 크기 감소를 각각 목적하는 대로 선별하는 것을 통한 약독화 정도가 원칙적으로, 거의 임의적이다.

(b) 농장 동물의 백신 접종을 위한 3가지 약독화 MD 돌연변이를 갖는 안정한 특이적 백신 균주를 사용하는 경우에는, 정교한 시험 방법이 요구되지 않는다.

(c) 심지어 더 작은 로트 크기가 성과를 낼 것이다.

MD 약독화의 진화 원리의 주요 데이터와 관련하여, 다음이 강조되어야 한다:

(a) 병원체 대 숙주의 상호 작용은 상호 내성에 기초한다. 고도로 감수성인 숙주는, 고도로 독성인 병원체의 약독화 돌연변이체에 의해 뜻하지 않게 감염된 경우에 단일 개체로서 생존한다. 숙주 집단은 이와 같이 생존한 소수의 개체를 통하여 활기를 되찾게 된다. 병원체는 적응된 약독화 균주로서 증식한다. 점액종증은 이러한 과정의 전형적인 예이다. 결론: 박테리아 집단 (뿐만 아니라 진균 및 바이러스 집단)은 점진적으로 약독화되는 돌연변이체, 특히 소위 MD 돌연변이체를 항상 함유하고 있다.

(b) MD 돌연변이체는 정의에 따르면, 대사 구획 내에 돌연변이를 가져 기능 장애를 초래하는 클론을 나타낸다 (즉, 약독화 = 적응도 비용). 그 결과로서, 야생 균주와 비교하여 점진적으로 감소되는 콜로니 크기 (클론에 따라 결정된다)를 발견할 수 있다. 정상적으로는, 이들 돌연변이체가 면역적격 숙주에 의해 제거되거나 또는, 또 다른 한편으론, 적응된 정상 상재균(flora)에 의해 과다성장된다.

(c) 이와 같이 감소된 MD 돌연변이체의 콜로니 크기는 (연장된) 생성 시간 및 (증가하는) 약독화 정도와 역으로 상관이 있다.

(d) MD 약독화 시험 백신 및 백신의 설득력 있는 효능이 입증되었다.

MD 돌연변이체는 다음과 같은 것으로서 선별되고 단리될 수 있다:

(a) 예를 들어, 스트렙토마이신, 리팜피신, 포스포마이신, 푸시드산, 날리딕스산의 자발적 MD 항생제 저항성 (MD "res") 클론. 이들 클론은 독성의 저항성 클론과 관련해서 1% 초과의 빈도로 단리될 수 있다. MD "res"와 독성의 저항성 클론은 상이한 돌연변이로부터 비롯된다. 따라서, MD "res" 및 약독화는 기능적 실체로서 간주될 수 있다.

(b) "죽어가고 있는" 배양물에 간접적으로 축적되는, 증가된 환경 스트레스 내성 (iet) 돌연변이체.

(c) 스트렙토마이신 의존성 (Smd) 클론으로부터 유래된 스트렙토마이신 비-의존성 (Sm-id) 억제유전자 돌연변이체. 이들 2개의 마커 돌연변이체는 거의 야생형 독성 수준부터 과도한 약독화 (미니 콜로니) 수준까지 특이적으로 단계적 감소된 콜로니 크기와 증가하는 약독화 정도 각각을 나타내는 클론을 특징으로 하는 광범위한 스펙트럼의 클론으로 이루어진다. 일반적으로, 리보솜성 돌연변이는 정상 오독 (오역)을 다소 증가시키고, 유일한 억제유전자 돌연변이 또한 약독화를 유발시킨다.

살모넬라 (Salmonella) 및 캄필로박터 (Campylobacter) 생백신을 이용하여, 예를 들어 닭 집단을 면역시키는 경우에는, 인간으로의 감염의 연결 고리를 중단시켜, 결과적으로 인간 장염을 감소시키는 것이 주요 목표이다. 정상적으로, 병아리는 어떠한 임상적 증상도 나타내지 않으면서 조건적 병원성 살모넬라 (및 일반적으로 심지어 캄필로박터)에 내성이 있다. 따라서, 병아리에 대한 이들 야생 균주의 낮은 독성으로 인해, 한편으로는 병아리에 대한 면역원성을 보장해주지만, 다른 한편으로는 인간에 대한 위험을 배제시키는 데 적합한 약독화 정도를 나타내는 백신 균주가 요구된다.

백신 균주의 효능에 대한 한 가지 기준은, 예를 들어 시험감염 후 콜로니화 정도의 검증 가능한 감소이다. 상기 박테리아의 모든 구성분 (예를 들어, 외막 단백질)을 발현하는 MD 약독화 생백신은 심지어 캄필로박터와 관련해서도 실행 지향 옵션으로서 간주될 수 있다.

따라서, 조건적 병원성 박테리아, 예컨대 살모넬라 및 캄필로박터에 유효한 백신을 개발하는 것이 가능한데, 단 낮거나 적합한 정도의 약독화로 조정함으로써 과도한 약독화를 피해야 한다. 달리 언급하면, 약독화 등가로서의 콜로니 크기의 감소는 야생 균주의 콜로니 크기의 약 25% 아래로 떨어지지 않아야 한다. 또한, 이러한 필수 불가결한 조건은 WHO의 안전성 요구 사항 (2가지 비-의존성 약독화 돌연변이의 존재로 인한 안정성)과 일치해야만 한다. 마커당 복귀 비율은 약 10^- ⁸이다. 그러나, 심지어 더 높은 안정성을 나타내는, 즉 더 낮은 복귀 비율을 나타내지만 과도하게 약독화되지 않은 백신 균주를 개발할 필요가 있다. 불행하게도, 생백신의 안전성을 증가시키기 위하여 부가의 돌연변이를 도입하게 되면, 통상적으로 과도한 약독화가 초래됨으로써, 이러한 백신이 덜 유효하게 된다.

따라서, 본 발명의 바닥에 깔려있는 기술적 문제점은 증가된 안정성을 특징으로 하는 개선된 생백신 균주를 제공하는 것이다. 이러한 기술적 문제점의 해결책은 본 청구범위에서 명확히 규명된 실시양태를 제공함으로써 달성되는데, 즉 3가지 이상의 돌연변이에 근거하여 증가된 안정성을 나타내지만, 과도한 약독화는 피하게 하고 약독화를 목적하는 수준으로 조정할 수 있게 해주는 개선된 생백신 균주를 제공하는 것이다. 사실상, 본 발명을 초래하는 실험 동안, MD 약독화를 이용함으로써, 증가된 안정성을 나타내고 2가지 MD "res" 약독화 돌연변이를 갖는 백신 균주의 약독화 정도를 초과하지 않는 약독화 정도를 나타내는, 3가지 (또는 심지어 그 초과) 비-의존성 약독화 돌연변이를 특징으로 하는 백신 균주를 생성시킬 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 본 발명의 실험에서는 스트렙토마이신을 사용하였지만, 본 발명에 개시된 과정은 이러한 항생제로만 제한되지 않는다. 다음에 기재된 실험은 Smd 돌연변이체로부터 유래된 소위 Sm-id 클론의 사용을 기초로 한 것인데, 이는 이들 "이중 마커" 돌연변이체 (야생 균주 유사 콜로니부터 미니 콜로니까지 모든 약독화 정도를 나타내는 클론을 포함한다)가 MD "res" 단일 마커 균주의 약독화 정도에 상응하는 약독화 정도를 나타내는 백신 균주를 생성시킬 수 있기 때문이다. 본 발명의 균주 (Sm-id/MD "res")는 약 10^-24의 증가된 안정성을 나타낸다.

지금까지, 살모넬라 및 캄필로박터의 Sm-id/MD "res" 백신 균주는 선행 기술 분야에서 보고되지 않았다. 또한, 2가지 또는 3가지 Sm-id 돌연변이와 부가의 MD "res" (A a, A α) 마커의 단계적 혼입에 의해 생성된 4가지, 5가지 또는 심지어 6가지 약독화 돌연변이를 갖는 백신 균주가 또한, 스트렙토마이신에 대해 신규하다: 각각 Smd 1 → Sm-id I → Smd a → Sm-id II → Sm-α → Sm-id III (6가지 약독화 돌연변이) 및 Sm-id I/Sm-id II/MD "res" (5가지 약독화 돌연변이).

2개, 4개 또는 6개 마커의 조합을 수반한 Sm-id 돌연변이체의 특별한 스펙트럼의 복귀 돌연변이체 (단계적으로 감소된 콜로니 크기)가 다음 균주에 대해 개시되는 것으로 밝혀졌다: (a) 야생 균주의 콜로니 크기를 갖는 Sm-id 균주, (b) Sm-id I-유사 균주의 콜로니 크기를 갖는 Sm-id I/Sm-id II 균주 및 (c) Sm-id I/Sm-id II-유사 클론에만 상응하는 것으로 밝혀진 가장 큰 콜로니인 Sm-id I/Sm-id II/Sm-id III 구축물. 따라서, 이들은 야생 균주-유사 복귀 돌연변이체가 아니다.

원칙적으로, Sm-id 클론의 생성을 위한 출발 균주로서 Smd 돌연변이체를 선별하고 단리하는 것은 최신 기술에 속한다. 예를 들어, 스타필로코쿠스 (Staphyloccocus), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 바실루스 세레우스 (Bacillus cereus)의 정상 Sm-저항성 돌연변이체 콜로니의 약 10%는 Smd 클론이다 (명백한 생물학적 원리로서). 그러나, 이것이 살모넬라와 캄필로박터에는 적용되지 않는다. 저항성을 나타내는 돌연변이체의 콜로니 중 살모넬라의 Smd 클론의 출현 빈도는 약 0.1%인 것으로 보고되고 있거나 또는 이러한 균주의 단리는 돌연변이 유발을 각각 이용함으로써만 달성 가능하다.

흥미롭게도, 약 5,000개의 Sm 저항성 돌연변이체를 분석한 후, 본 발명자들은 어떠한 Smd 균주도 발견할 수 없었다. 또한, Sm-id 복귀 돌연변이체의 스펙트럼은 Smd 클론에 따라서 다양하므로, 몇 가지 Smd 클론이 출발 돌연변이체로서 필요하다는 것을 강조해야만 한다. 달리 언급하면, 선별을 위한 통상의 과정은 적용할 수 없다.

대개는 리보솜성 Smd-경로가 적응의 진화 원리이기 때문에, 2가지 가능한 기전을 시험하였다:

(a) Smd-돌연변이체는 그의 형성 직후에 사멸기로 들어간다. 따라서, 이러한 돌연변이체는 단지, 대수기 배양물, 예를 들어 ≤ 18 h/37℃ 배양물로부터 단리될 수 있지만, ≥ 48 h/37℃ 배양물로부터는 그렇지 않을 수 있다.

(b) 출생의 상태 동안에는 이러한 Smd 클론이 연약하고, 미니 콜로니로서 지연된 성장을 보인다 (이는 간과될 수도 있다). 이들 미니 콜로니는 계대배양 동안 "정상 성장"으로 적응된다.

캄필로박터의 경우에는, Smd- 및 Sm-id 돌연변이체와 관련해서 입수 가능한 데이터가 없다. 당해 분야의 문헌에는, Sm-저항성 돌연변이체와 관련해서 다음의 약간의 힌트만이 기재되어 있다: 고 저항성을 나타내는 클론은 단지, 증가 농도의 스트렙토마이신에 대항하여 다수의 계대배양을 이용함으로써 수득될 수 있었다. 1-단계 Sm-저항성은 단지, 20 ㎍ 스트렙토마이신/ml의 농도를 사용함으로써 달성될 수 있었다. 100 ㎍ 스트렙토마이신/ml를 이용하여 Sm-저항성을 나타내는 돌연변이체 및 Smd-돌연변이체를 단리시키기 위한 본 발명자들의 실험 (72 h/39℃ 배양물을 플레이팅함으로써 수행됨)은 실패하였다. 놀랍게도, 상당히 증가되는 양의 박테리아에도 불구하고, 다음 표에 제시된 바와 같이 24 h/39℃ 배양물부터 72 h/39℃ 배양물까지 생균 계수가 상당히 감소한 것으로 밝혀졌다.

<표 1>

캄필로박터 콜라이 ( Campylobacter coli ) 및 캄필로박터 제주니 ( Campylobacter jejuni ): 39℃에서의 인큐베이션 기간에 대한 카소 ( Caso )-한천을 포함하는 페트리 디쉬 상의 생균 계수

이들 결과는 캄필로박터의 배양물이 생존 가능한 상태로 될 수 있지만, 배양 가능한 상태로는 될 수 없다는 관찰 결과와 일치한다.

따라서, Sm 저항성을 갖는 돌연변이체는 단지, ≤ 24 h/39℃ 배양 물질을 플레이팅함으로써 수득될 수 있었다. 그러나, 정상적인 크기 또는 약간 감소된 크기를 갖는 저항성 콜로니 중에서 Smd 돌연변이체는 전혀 발견할 수 없었다. 그러나, 캄필로박터의 극히 작은 콜로니 및 미니 콜로니 중에서 (뚜렷이 구별되는 지연을 나타내면서 출현된다), 대다수의 클론이 Smd 클론인 것으로 명확히 규명될 수 있었다.

도 1: 3가지 약독화 돌연변이를 특징으로 하는 살모넬라 백신 균주의 예. 플레이트를 37℃에서 약 20시간 동안 인큐베이션하였다.
(a) 살모넬라 인판티스 (Salmonella Infantis) (야생 균주/Sm-id 4.22/Rif 2 (및 Iet 4));
(b) 살모넬라 비르초우 (Salmonella Virchow) (야생 균주/Sm-id 9.3/Rif 2);
(c) 살모넬라 하다르 (Salmonella Hadar) (야생 균주/Sm-id 4.1/Sm 2 (및 Rif 1));
(d) 살모넬라 파라티피 비 (Salmonella Paratyphi B), 변이체 자바(Java) 3.2 (야생 균주/Sm-id.1.1/Rif 3 (및 Rif 2)).
도 2: 3가지 약독화 돌연변이를 특징으로 하는 캄필로박터 백신 균주의 예. 플레이트를 39℃에서 약 48시간 및 72시간 동안 각각 인큐베이션하였다.
(a) 캄필로박터 콜라이 I (Campylobacter coli I) (야생 균주/Sm-id 5.5/Pho 1 및 Pho 2);
(b) 캄필로박터 콜라이 II (Campylobacter coli II) (야생 균주/Sm-id 18.1/Sm 2);
(c) 캄필로박터 제주니 I (Campylobacter jejuni I) (야생 균주/Sm-id 2.3/Pho 1 (및 Pho 2));
(d) 캄필로박터 제주니 II (Campylobacter jejuni II) (야생 균주/Sm-id 2.1/Sm 2).
도 3: (2가지), 4가지, 5가지 또는 6가지 약독화 10 돌연변이를 특징으로 하는 살모넬라 백신 구축물의 예. 플레이트를 37℃에서 약 20시간 동안 인큐베이션하였다.
(a) 살모넬라 비르초우:
야생 균주/Sm-id I 1.4/Sm-id II 0.3/Sm 4;
야생 균주/Sm-id I 1.4/Sm-id II 0.3/Sm-id III 0.x.
(b) 살모넬라 인판티스:
야생 균주/Sm-id I 4.22/Sm-id II 0.1/Rif 2;
야생 균주/Sm-id I 4.22/Sm-id II 0.1/Sm-id III 1.1.
도 4: (2가지), 4가지, 5가지 또는 6가지 약독화 돌연변이를 특징으로 하는 캄필로박터 백신 구축물의 예. 플레이트를 39℃에서 약 48시간 동안 인큐베이션하였다.
(a) 캄필로박터 콜라이 II 야생 균주/Sm-id I 18.1/Sm-id II a.1. 이 균주는 두 번째 Sm-id a.1 돌연변이로 인해 Sm 저항성이 생기는 것을 특징으로 한다.
(b) 캄필로박터 콜라이 II 야생 균주/Sm-id I 17.7/Sm-id II a.1/Pho1, 야생 균주/Sm-id I 17.7/Sm-id II a.1/Sm-id III α.1.
따라서, 본 발명은
(a) 박테리아 균주를 제공하고, 상기 균주를 제1 항생제, 바람직하게 스트렙토마이신의 존재 하에 성장시키는 단계;
(b) (a)의 균주로부터, 제1 항생제에 의존성인 클론에 상응하는 "미니" 콜로니를 단리하는 단계;
(c) (b)의 클론을 제1 항생제의 부재 하에 성장시키고, 야생 균주의 콜로니 크기의 ≥ 50%인 콜로니 크기를 특징으로 하는 약독화 복귀 돌연변이체를 단리하는 단계;
(d) 적합한 농도, 바람직하게 약 10배 MIC를 갖는, 제1 항생제와 상이할 수 있는 제2 항생제 (예를 들어, 아미노글리코시드, 예컨대 스트렙토마이신, 네오마이신, 카나마이신, 스펙티노마이신, 겐타미신, 아미카신 및 토브라마이신; 리팜피신, 푸시드산, 날리딕스산, 포스포마이신)를 보충한 배지 중에서 단계 (c)에서 수득된 클론을 성장시키는 단계;
(e) 감소된 크기를 나타내는 콜로니 (MD A "res")을 단리하고 연속 계대배양하는 단계; 및
(f) 안정한 특성으로서 콜로니 크기의 단계적 감소를 나타내는 클론을 단리하는 단계
를 포함하는, 3가지 이상 (및 6가지 또는 7가지 이하)의 약독화 돌연변이를 수반하는 안정한 박테리아를 함유하는 박테리아 생백신의 생성 방법을 제공한다.
단계 (a)의 박테리아 균주는 바람직하게, "야생" 독성 균주로부터 수득된다. 이들 균주는 병든 동물 (예를 들어, 닭)로부터 취할 수 있다. 사용되는 출발 자연 균주는 특정 정도의 독성을 지녀야 한다.
단계 (a)의 돌연변이체를 선별하기 위한 항생제의 선택은 실용적인 측면에 의거하여 안내된다. 예를 들어, 스트렙토마이신은 미생물 중에서 저항성 및 의존성 균주의 발생을 신속히 초래하는 것으로 공지되어 있다.
따라서, 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 단계 (a)의 항생제는 스트렙토마이신이다. 그러나, 기타 아미노글리코시드 항생제, 예컨대 네오마이신, 카나마이신, 스펙티노마이신, 겐타미신, 아미카신 및 토브라마이신, 및 리팜피신, 푸시드산 및 날리딕스산이 또한, 단계 (a)의 항생제로서 적합할 수 있다.
항생제에 대한 저항성은 상이한 변형 기전으로부터 비롯될 수 있는 것으로 공지되어 있다. 특히, 유전적 변형은 박테리아의 염색체에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 염색체 변형은 드문 현상인데, 일단 수행되면, 획득한 특성의 안정성을 보장해야 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "미니 콜로니"는 크기의 감소를 특징으로 하는 박테리아 콜로니에 관한 것이다. 바람직하게, 이는 상응하는 야생 균주 콜로니의 ≤ 10%의 크기를 특징으로 한다.
항생제를 함유하는 배지 상에서 성장 기준의 함수로서 약독화 박테리아 균주를 선별하는 것은, 특히 감소된 독성을 갖는 균주의 출현을 유발시킬 목적으로 각종 종에 사용되어 온 작업이다.
3가지 이상 (및 6가지 또는 7가지 이하)의 약독화 돌연변이를 특징으로 하는 본 발명에 따르는 박테리아 균주는 첫째로, 스트렙토마이신과 같은 항생제를 고 함량으로 갖는 배지 상에서의 그의 성장 능력을 알아보기 위하여 자연 독성 균주로부터 선별되고, 또한 상기 항생제의 존재 하에서만 만족스럽게 발생될 수 있는 (단계 b)) 비-독성 균주이다. 이러한 이유로 인해, 이들 균주는, 예를 들어 스트렙토마이신에 의존적인 것으로 여겨진다 (Smd 돌연변이체).
둘째로, 단계 (c)의 균주는 항생제 의존성 균주로부터 선별되고, 제2 약독화 돌연변이 또는 마커의 도입으로 인해 스트렙토마이신의 부재 하에서 발생될 수 있는 특이성을 지닌 돌연변이체이다. 이들 균주는 Sm-id 균주로 불리운다. 바람직하게, 세척 단계는 단계 (b)와 단계 (c) 사이에 수행된다. 단계 (c)에 대한 바람직한 배지는 살모넬라 카소 (SC) 배지 (예를 들어, 살모넬라용) 또는 카소 배지 (예를 들어, 캄필로박터용)이다.
단계 (d)는 부가의 MD 항생제 저항성 ("res") 돌연변이를 (제3 약독화 마커로서) 도입할 수 있게 해준다. 바람직하게, 이러한 항생제는 스트렙토마이신, 리팜피신 또는 포스포마이신이다. 단계 (d) 중의 항생제의 농도는 통상적인 과정에 따라서 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 바람직하게, 살모넬라의 경우, 리팜피신, 스트렙토마이신 (주: 대부분의 Sm-id 돌연변이체는 스트렙토마이신 감수성이므로, 부가의 MD Sm "res" 마커용으로 적합하다) 및 포스포마이신의 농도는 약 10배의 MIC 값에 상응하고, 푸시드산의 농도는 약 4배의 MIC 값에 상응한다. 바람직하게, 캄필로박터의 경우, 적어도 200 ㎍ 포스포마이신/ml 및 적어도 100 ㎍ 스트렙토마이신/ml이 각각 사용된다.
단계 (e)에서는 약간 더 감소된 콜로니 크기를 특징으로 하는, 앞서 단계의 Sm-id/ MD 항생제 "res" 균주를 단리하고 연속 계대배양하여 안정성을 검사한다. 바람직하게, 30회 이상의 연속 계대배양을 수행한다.
최종적으로, 단계 (f)에서는 안정한 특성으로서 콜로니 크기의 단계적 감소를 나타내는 단계 (e)로부터 단리된 클론이 제공된다.
본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 단계 (a) 내지 (c)는 4가지 이상의 약독화 돌연변이를 수반하는 박테리아를 생성시키기 위하여 1회 이상 반복한다. 이러한 방법으로, 예를 들어 다음 도식 (Sm에 대해 제시됨)에 따라서 신규 약독화 돌연변이체를 생성시킬 수 있다:
(a) Smd 1 → Sm-id I → Smd a → Sm-id II;
(b) Smd 1 → Sm-id I → Smd a → Sm-id II → Smd α→ Sm-id III;
(c) Smd 1 → Sm-id I → Smd a → Sm-id II → Smd α→ Sm-id III → MD 항생제 "res".
놀랍게도, 4가지 또는 심지어 6가지 돌연변이를 수반하는 Sm-id 돌연변이체로부터 유래된 균주가 3가지 약독화 돌연변이를 갖는 균주와 비교하여 보다 높은 약독화 정도를 나타내지 않지만, 훨씬 더 높은 안정성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따르는 MD 항생제 "res" 돌연변이체 균주를 선별하기 위한 항생제의 선택은 실용적인 측면에 의거하여 안내되고, 원칙적으로 대사 드리프트 (MD) 돌연변이를 유도할 수 있는 모든 항생제, 예를 들어 스트렙토마이신 (주: 대부분의 Sm-id 돌연변이체는 스트렙토마이신 감수성이므로, 부가의 MD Sm "res" 마커용으로 적합하다), 리팜피신, 포스포마이신, 푸시드산 또는 날리딕스산이 본 발명의 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 특별한 박테리아로 제한되지 않는다. 살모넬라 종 및 캄필로박터 종 이외의 기타 박테리아, 예컨대 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 에스케리키아 콜라이, 바실루스 세레우스 [슈도안트락스(Pseudoanthrax)], 예르시니아 (Yersinia) 종, 예컨대 와이. 페스티스 (Y. pestis), 클레브시엘라 (Klebsiella) 종, 리스테리아 (Listeria) 종, 아에로모나스 (Aeromonas) 종, 쉬겔라 (Shigella) 종, 파스테우렐라 (Pasteurella)/아비박테리움 (Avibacterium) 종, 리에메렐라 (Riemerella) 종, 오르니토박테리움 리노트라케알레 (Ornithobacterium rhinotracheale), 보르데텔라 (Bordetella) 종, 및 슈도모나스 (Pseudomonas) 종이 또한, 본 발명의 방법에 따라서 안정한 박테리아를 함유하는 박테리아 생백신을 생성하는 데 사용될 수 있다.
그러나, 바람직한 박테리아는 살모넬라 및/또는 캄필로박터, 특히 살모넬라 봉고리 (Salmonella bongori), 에스. 엔테리카 (S. enterica) 아종 엔테리카 (enterica), 아리조나에 (arizonae), 디아리조나에 (diarizonae), 살라마에 (salamae), 호우테나에 (houtenae) 및 인디카 (indica), 바람직하게 에스. 엔테리카 아종 엔테리카, 예컨대 다음 혈청형 변이체: 두불린 (Dublin), 갈리나룸 (Gallinarum) [생물형 변이체 갈리나룸 및 풀로룸 (Pullorum)], 콜레라에수이스 (Choleraesuis), 티피수이스 (Typhisuis), 티피 (Typhi), 파라티피 (Paratyphi) A,B,C, 아보르투세퀴 (Abortusequi), 아보르투소비스 (Abortusovis), 아보니 (Abony), 엔테리티디스 (Enteritidis), 티피무리움 (Typhimurium), 코펜하겐 (Copenhagen), 인판티스 (Infantis), 비르초우 (Virchow), 하다르 (Hadar), 아고나 (Agona), 뉴포트 (Newport), 아나툼 (Anatum), 하이델베르크 (Heidelberg), 파나마 (Panama), 인디아나 (Indiana), 사인트파울 (Saintpaul), 브란덴부르크 (Brandenburg), 및 캄필로박터 콜라이, 캄필로박터 제주니, 및 캄필로박터 페투스 (Campylobacter fetus)이다.
단계 (a) 및 (b) 중의 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, 살모넬라 돌연변이체는 대수기 배양물로부터 단리되고, 37℃에서 48시간 이상 또는 초과 동안 인큐베이션한 후에 출현하기 시작하는 미니-콜로니로서 단리된다.
단계 (a) 및 (b) 중의 본 발명의 방법의 추가의 바람직한 실시양태에서, 캄필로박터 돌연변이체는 39℃에서 72시간 이상 또는 초과 동안 인큐베이션한 후에 출현하기 시작하는 미니-콜로니로서 단리된다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 수득가능한 살아있는 박테리아 균주뿐만 아니라 본 발명의 살아있는 박테리아 균주와 생물학상 허용되는 담체를 포함하는 백신을 제공한다. 이와 같은 백신 접종 기능의 조성물은 물론, 신선하게 배양된 박테리아에 의해 구성될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 백신 조성물은 냉동-건조된다.
백신 접종되는 박테리아를 투여하기 위하여, 이들이 현탁되는 배지는 중요하지 않다. 물론, 이러한 배지는 그것이 함유하고 있는 박테리아의 우수한 생육성을 방해하지 않아야만 한다.
본 발명의 백신은 특정 개체의 면역에 적합한 양으로 투여되고, 부가적으로 하나 이상의 통상의 보조제를 함유할 수 있다. 이와 같이 이용된 용어 "특정 개체의 면역에 적합한 양"은 특정 개체를 면역시킬 수 있는 박테리아의 어떠한 양도 포함한다. "특정 개체의 면역에 적합한 양"은 통상의 기술자에게 공지된 방법을 이용하여 결정할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "개체"는 모든 종류의 개체를 포함한다. 이러한 개체의 예는 동물 (및 인간)이다.
바람직한 백신 투여는 경구 경로이지만, 개체의 각종 부위에서 근육내, 피하, 피내 또는 기타 모든 적용 형태로 주사할 수 있다. 대략 동일한 양을 갖는 하나 이상의 "부스터 주사"를 수행하는 것이 바람직할 수도 있다.
본 발명의 백신은 예방적일 수 있는데, 즉 본 발명의 화합물은 감염 또는 콜로니화, 예를 들어 살모넬라 또는 캄필로박터에 의해 유발된 감염/콜로니화의 발생을 방지 또는 지연시키기 위해 투여된다.
다음 균주가 부다페스트 조약 하에 2012년 11월 27일에 저먼 타입 컬쳐 컬렉션 (German Type Culture Collection) [도이체 잠룽 폰 25 미크로올가니즈멘 운트 젤쿨투어렌 (DSMZ); 독일 브라운슈바이크]에 기탁되었다:

다음 실시예는 본 발명을 보다 상세히 설명한 것이다.
실시예 1
물질
(A) 균주
살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형변이체 비르초우,
살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형변이체 인판티스,
살모넬라 엔테리카 아종 엔테리카 혈청형변이체 하다르,
살모넬라 파라티피 B (변이체 L-타르트라트 (Tartrat)+, 이전명 자바),
캄필로박터 콜라이, 캄필로박터 제주니 [로만 애니멀 헬스 (Lohmann Animal Health; 독일 쿡스하펜)에 의해 제공됨].
(B) 배지
1000 ml 캄필로박터 배지 (카소-배지)는 다음을 함유한다: 35 g 카소 한천 [시핀(Sifin)], 3 g 효모 추출물, 3 g 카제인 가수분해물, 4 g 활성화 탄소, 0.25 g FeSO₄, 0.25 g 소듐 피루베이트, 5 g 한천 코베(Kobe) [로트(Roth)].
1000 ml 살모넬라 배지 (SC-배지)는 다음을 함유한다: 35 g 카소 한천 (시핀), 3 g 효모 추출물, 1 g 글루코스, 5 g 한천 코베 (로트).
(C) 항생제
스트렙토마이신 (Sm) (로트 번호 0236.2), 포스포마이신 (Pho) [시그마(Sigma) 번호 P5396], 리팜피신 (Rif) [림세르 아르즈나이미텔 아게(Riemser Arzneimittel AG), 파톨 에렘파트(Fatol Eremfat) 600 mg].
(D) 야생형 균주의 MIC 값

실시예 2
Smd 돌연변이체의 선별 및 단리
(a) 살모넬라의 Smd 돌연변이체의 실행-지향 단리
살모넬라의 약 10¹⁰ cfu의 18h/37℃ 배양물을 500 ㎍ 스트렙토마이신/ml으로 보충시킨 SC 한천을 함유하는 페트리 디쉬 상에 플레이팅하였다. 정상 크기를 갖는 콜로니 및 약간 감소된 크기를 갖는 단일 콜로니 (독성 Sm 저항성 클론 및 MD Sm "res" 클론) 외에도, 균주에 따라서 다양한 빈도를 나타내는 "미니 콜로니" (주로 작은 콜로니 변이체 = scv)가 검출될 수 있었다. (37℃에서) 약 ≥ 48 h의 인큐베이션 시간 후, (정상 크기를 갖는 약 30개 콜로니 및 약간 감소된 크기를 갖는 콜로니당) 1 내지 2개의 부가 미니 콜로니를 검출할 수 있었는데, 이는 scv와 구별될 수 없었다. scv 표현형의 출현 빈도에 따라서, 이들 미니 콜로니의 3% 내지 20%가 Smd 돌연변이체를 나타내는 것으로 밝혀질 수 있었다.
저항성 돌연변이체와 관련해서 Smd 클론의 계산된 빈도는 ≥ 1%였다.
주: Smd 클론의 단리는 출발 물질로서 Sm 감수성 야생형 균주를 사용함으로써 달성된다. 균주는 바람직하게, 낮은 MIC 값을 갖는다.
(b) 캄필로박터의 Smd 돌연변이체의 실행-지향 단리
디스크의 전체 표면을 덮는 방식으로 접종시킨, 카소 한천 페트리 디쉬 배양물로부터 수득된 박테리아 물질 (24 h/39℃; 약 10¹⁰ cfu)을 100 ㎍ 스트렙토마이신/ml로 보충시킨 1 또는 2개의 카소 한천 페트리 디쉬 상에 플레이팅하고 39℃에서 72 h 동안 인큐베이션하였다. 균주에 따라서, 정상 크기를 갖는 ≤ 10개 콜로니/플레이트 (평균 값) 및 약간 감소된 크기를 갖는 콜로니 (스트렙토마이신 저항성 및 MD Sm "res" 클론)이 검출 가능하였다. 또한, 정상 크기를 갖는 콜로니 및 약간 감소된 크기를 갖는 콜로니와 비교하여, 명백하게 감소된 크기를 갖는 콜로니 (직경이 정상 크기의 ≤ 25%이다)이 약 20%의 빈도로 검출될 수 있었다. 이들 콜로니의 약 1/3이 Smd 클론이었다.
저항성 돌연변이체와 관련해서 Smd 클론의 계산된 빈도는 ≥ 5%였다.
실시예 3
Sm -id 돌연변이체의 선별 및 단리
(a) Smd 클론으로부터 살모넬라 Sm-id 돌연변이체의 단리
(페트리 디쉬당) 세척된 Smd 돌연변이체 약 10⁹ cfu를 SC 배지와 함께 플레이팅하고 37℃에서 48 h 동안 인큐베이션하였다. 수득된 약독화 복귀 돌연변이체로부터, (단지 낮은 약독화를 나타내는 Sm-id 클론을 수득하고자 하는 목표에 따라서) 야생형 균주 콜로니와 비교하여 약 ≥ 50%의 콜로니 크기를 나타낸 상기 돌연변이체 만을 추가로 처리하였다.
(b) Smd 클론으로부터 캄필로박터 Sm-id 돌연변이체의 단리
디스크의 전체 표면을 덮는 방식으로 접종시킨, 카소 한천 (100 ㎍ 스트렙토마이신/ml로 보충시킴) 페트리 디쉬 배양물 (24 h/39℃)로부터 수득된 박테리아 물질을 대상으로 하여 1회 세척 단계를 수행하고, 이를 1:1 (약 3x10⁹ cfu) 내지 1:4의 비로 카소 배지 상에 플레이팅한 다음 39℃에서 72 h 동안 인큐베이션하였다. 이들 배양 조건 하에, 대다수의 Smd 클론은 (평균적으로) ≤ 10개의 약독화 복귀 돌연변이체를 발생시킨 것으로 나타났다. 이들 약독화 복귀 돌연변이체의 대부분은 Sm 감수성이었다. 일반적으로, 야생형 균주 콜로니와 비교하여 약 ≥ 50%의 감소된 콜로니 크기를 나타내는 Sm-id 클론을 추가로 처리하였다.
일부 균주, 예를 들어 캄필로박터 제주니는 야생형 균주와 비교하여 ≤ 50%의 콜로니 크기를 갖는 Sm-id로부터만의 단리를 허용하였다.
주: 모든 캄필로박터 균주 및 그로부터 유래된 Smd 돌연변이체가 어떠한 문제도 없이 Sm-id 복귀 돌연변이체의 단리를 허용하는 것은 아니다. 그러나, 예를 들어 몇 가지 비-의존성 Smd 돌연변이체를 이용하여 상기 문제를 일으키는 균주로부터 또한 Sm-id 복귀 돌연변이체를 단리시키는 것이 가능하다.
실시예 4
부가의 MD 항생제 "res" 돌연변이체의 단리
약독화 및 인식을 위해 제3 마커로서 선별된 Sm-id 돌연변이체에 부가의 MD 항생제 "res" 돌연변이를 혼입시키는 것은 앞서 기재된 바와 같이 수행하였다.
간략하게 언급하면, 다음과 같다:
(a) 살모넬라: 10^9-10 cfu의 상기 선별된 Sm-id 클론을 약 10배 MIC 값 농도의 리팜피신 또는 스트렙토마이신 (푸시드산과 관련해서는 약 4배 MIC 값 농도)으로 각각 보충시킨 SC 배지 상에 플레이팅하고, 37℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
(b) 캄필로박터: 전체 표면을 덮는 방식으로 Sm-id 돌연변이체를 접종하고 39℃에서 24 h 동안 인큐베이션한 페트리 디쉬 배양물 (카소 배지)의 물질을 200 ㎍ 포스포마이신/ml 또는 100 ㎍ 스트렙토마이신/ml로 보충시킨 카소 배지 상에 1:4 내지 1:8의 비로 플레이팅하고, 39℃에서 ≥ 72 h 동안 인큐베이션하였다.
(다소) 감소된 크기를 나타내는 콜로니를 단리하고, 이를 대상으로 하여 연속 계대배양을 수행하였다. 이들 클론의 약 20%는 안정된 특색으로서 콜로니 크기가 특이적으로 단계적 감소된 클론을 유지하였다.
실시예 5
4가지 또는 6가지 약독화 돌연변이를 갖는 백신 균주의 생성
4가지 또는 6가지 약독화 돌연변이를 갖는 백신 균주의 생성은 제2, 및 임의로, 제3의 Sm-id 억제유전자 돌연변이를 기본적 Sm-id I 클론: Sm-id I/ Sm-id II/ Sm-id III 내로 순차적으로 혼입시킴으로써 달성되었다.
(a) 살모넬라: 약 10¹⁰ cfu의 상기 기본적 Sm-id I 돌연변이체 (또는 Sm-id II 출발 균주)를 500 ㎍ 스트렙토마이신/ml로 보충시킨 SC 배지 상에 플레이팅하고 37℃에서 48 h 동안 인큐베이션하였다. Sm-저항성 콜로니의 약 5%는 Smd 돌연변이체 (현재 주로, "정상 크기"를 갖는 콜로니로서 성장하고 있다)이다. Sm-id I 균주 및 Sm-id II 균주로부터 각각 유래된 이들 Smd 클론을 이용함으로써, Sm-id 돌연변이체는 실시예 3(a)에 기재된 접근방식에 따라서 다시 단리하였다. 콜로니 크기의 목적하는 감소를 나타내는 클론을 추가로 처리하였다.
(b) 캄필로박터: 전체 표면을 덮는 방식으로 Sm-id 돌연변이체를 접종하고 39℃에서 24 h 동안 인큐베이션한 카소 배지 페트리 디쉬 배양물로부터 수득된 물질을 100 ㎍ 스트렙토마이신/ml로 보충시킨 카소 배지 상에 1:4의 비로 플레이팅하고, 39℃에서 72 h 동안 인큐베이션하였다. "정상 크기"를 갖는 약 15개의 Sm 저항성 콜로니 외에도, 2 내지 3개의 작은 콜로니가 검출될 수 있었다. 이들 콜로니의 50%가 Smd 클론이다. 이들 Smd 클론 (Sm-id I 균주 및 Sm-id II 균주로부터 각각 수득됨)은 실시예 3(b)에 따라서, Sm-id 돌연변이체를 다시 단리하기 위한 출발 클론으로서 사용되었다. 콜로니 크기의 목적하는 감소를 나타내는 클론을 추가로 처리하였다.
실시예 6
선별된 Sm -id II 돌연변이체로부터 MD 항생제 "res" 돌연변이체의 단리
(a) 살모넬라: 유리한 MD 항생제 "res" 돌연변이를 부가의 제5의 약독화 및 인식 마커로서 선별된 Sm-id I/Sm-id II 돌연변이체 내로 혼입시키는 것은 실시예 4(a)에 기재된 접근방식에 따라서 유사하게 수행하였다.
(b) 캄필로박터: 유리한 MD 항생제 "res" 돌연변이를 부가의 제5의 약독화 및 인식 마커로서 선별된 Sm-id I/Sm-id II 돌연변이체 내로 혼입시키는 것은 실시예 4(b)에 기재된 접근방식에 따라서 유사하게 수행하였다.
주: 상기 언급된 접근방식은 또한, MD 항생제 "res" 돌연변이를 약독화 및 인식을 위한 제7의 마커로서 선별된 Sm-id III 돌연변이체 (6가지 약독화 돌연변이를 갖는다) 내로 부가로 혼입시키기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 이는 과도한 약독화를 초래하여, 실행에 따른 타당성을 방해할 수도 있다.
실시예 7
약독화의 예상되는 정도를 전향적으로 지향 평가하기 위해 막대 그래프로 전환된 콜로니 크기
상응하는 야생형 균주 및 이들 균주로부터 유래된 MD 돌연변이체의 현탁물을 대수적으로 희석시킨 다음, 이를 페트리 디쉬당 10 내지 50개의 웰 한정 가능한 단일 콜로니를 수득할 수 있는 방식으로 배양 배지 상에 플레이팅하였다. 배지로 인한 성장 상의 차이를 보상하기 위해 희석 등급당 적어도 5개의 페트리 디쉬를 준비하였다. 표준화된 조건 (예를 들어, 동일한 인큐베이션 시간, 배지의 동일한 층 두께) 하에 성장시킨 단일 콜로니의 사진을 찍었다. 셀프로파일러(CellProfiler) 프로그램 [브로드 인스티튜트(Broad Institute)]을 이용하여 디지털 사진을 처리하였다: 개별 콜로니의 직경을 결정하고 저장하였다. 그 값들의 평균을 낸 후, 데이터를 야생형 균주 콜로니의 크기 (100%로서 제공됨)와 관련해서 막대 그래프로서 플롯한다.
실시예 8
적합한 백신 균주로부터의 백신의 제조, 및 병아리/닭 및 보호하고자 하는 추가 숙주 각각에 백신 접종하기 위한 용도
생백신을 제조하기 위하여, 3가지 (4가지, 5가지 및 6가지 각각) 약독화 돌연변이를 정착시킨 백신 균주를 대수기까지 통상의 액상 배지에서 성장시켰다. 백신 현탁물 및 백신 침강물을 각각, 적합한 안정화제로 보충시키고, 연속해서 동결건조시켰다. 수득된 백신을 경구 또는 비경구 투여에 의해 투여하였다 (적응증의 종류에 따라서 1회, 2회 또는 3회 용량으로 투여함).

Claims

(a) 박테리아 균주를 제공하고, 상기 균주를 제1 항생제의 존재 하에 성장시키는 단계;
(b) (a)의 균주로부터, 제1 항생제에 의존성인 클론에 상응하는 "미니" 콜로니를 단리하는 단계;
(c) (b)의 클론을 제1 항생제의 부재 하에 성장시키고, 야생 균주의 콜로니 크기의 ≥ 50%인 콜로니 크기를 특징으로 하는 약독화 복귀 돌연변이체를 단리하는 단계;
(d) 단계 (c)에서 수득된 클론을 적합한 농도를 갖는 제2 항생제를 보충한 배지 중에서 성장시키는 단계;
(e) 감소된 크기를 나타내는 콜로니 (MD "res")를 단리하고 연속 계대배양하는 단계; 및
(f) 안정한 특성으로서 콜로니 크기의 단계적 감소를 나타내는 클론을 단리하는 단계
를 포함하는, 3가지 이상 및 7가지 이하의 약독화 돌연변이를 수반하는 안정한 박테리아를 함유하는 박테리아 생백신의 생성 방법.
제1항에 있어서, 제1 및 제2 항생제가 스트렙토마이신, 네오마이신, 카나마이신, 스펙티노마이신, 겐타미신, 아미카신, 토브라마이신, 리팜피신, 푸시드산 및 날리딕스산으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 제1 항생제가 스트렙토마이신, 네오마이신, 카나마이신, 스펙티노마이신, 겐타미신, 아미카신, 토브라마이신, 리팜피신, 푸시드산 및 날리딕스산으로부터 선택되고; 제2 항생제가 스트렙토마이신, 네오마이신, 카나마이신, 스펙티노마이신, 겐타미신, 아미카신, 토브라마이신, 리팜피신, 푸시드산, 날리딕스산 및 포스포마이신으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아가 살모넬라 (Salmonella) 또는 캄필로박터 (Campylobacter)인 방법.
제4항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)에서 살모넬라 돌연변이체가 대수기 배양물로부터 및 37℃에서 48시간 이상 또는 초과 동안 인큐베이션한 후에 출현하기 시작하는 미니-콜로니로서 단리되는 것인 방법.
제4항에 있어서, 단계 (a) 및 (b)에서 캄필로박터 돌연변이체가 39℃에서 72시간 이상 또는 초과 동안 인큐베이션한 후에 출현하기 시작하는 미니-콜로니로서 단리되는 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (a) 내지 (c)가 1회 이상 반복되는, 4가지 이상의 약독화 돌연변이를 수반하는 박테리아를 생성시키는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 살아있는 박테리아 균주.
제8항의 살아있는 박테리아 균주 및 생물학상 허용되는 담체를 포함하는 백신 조성물.
제9항에 있어서, 동결 건조되는 백신 조성물.
제9항 또는 제10항에 있어서, 박테리아 감염을 퇴치하거나 또는 예방하는 데 사용하기 위한 백신 조성물.
제9항 또는 제10항에 있어서, 살모넬라 또는 캄필로박터에 의해 유발된 감염을 퇴치하거나 또는 예방하는 데 사용하는 것을 특징으로 하는, 제10항에 따라서 사용하기 위한 백신 조성물.