KR102673134B1 - 박테리오파지를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 증식 억제용 조성물 - Google Patents
박테리오파지를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 증식 억제용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 재증식 풀 컬쳐 기반 박테리오 파지에서 스트리닝한 박테리오파지를 이용하여 식품에서 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)를 증식을 억제하는 것을 확인한 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P), 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P) 및 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)은 식품에 포함된 살모넬라 엔테리티디스균에 대한 항균 활성이 매우 뛰어나므로 식품 첨가제 및 사료첨가제로 유용하게 이용할 수 있다.
Description
본 발명은 재증식 풀 컬쳐 기반 박테리오 파지에서 스트리닝한 박테리오파지를 이용하여 식품에서 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)를 증식을 억제하는 것을 확인한 조성물에 관한 것이다.
살모넬라(Salmonella spp.)는 양계장의 위생 척도가 될 뿐만 아니라 닭에 있어서 병원성을 나타낸다. 그중, 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)와 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella Typhimurium)은 닭뿐만 아니라 사람에게 서도 식중독을 유발하기에 공중보건상 중요한 병원균으로 구분된다. FAO/WHO 보고에 따르면 가금류 유래 발생 식중독의 77.1%가 살모넬라로 보고되었고, 실제 2006년 유럽에서 발생한 살모넬라 식중독 약 1만6천 건을 분석한 결과 살모넬라 엔테리티디스가 62.5%, 살모넬라 티피뮤리움이 12.9%로 높은 비율을 차지했다.
가금류에서 살모넬라 제어를 위해 다양한 항생제들이 사용되고 있으며, 이에 따라 항생제 저항성도 증가하는 추세를 보이고 있다. 실제로 2015년 국내 농장에 있는 닭과 오리에서 분리한 83개의 살모넬라(9개의 혈청형)에는 83개 모두 최소 2개 이상의 항생제 내성을 가지고 있었으며, 특히 66.3%와 57.8% 에서 각각 날리딕스산(nalidixic acid)와 스트렙토마이신(streptomycin)에 내성을 보였다.
다양한 항생제 대체제 중 박테리오파지(또는 파지)가 가지는 특이성, 증식성, 풍부성은 다른 항미생물성 제제(ex.항생제 등)와 구별되는 파지만의 특성들로 최근 항생제 오남용 문제 등의 대두와 함께 파지를 유해균들의 조절에 이용하려는 노력이 다시 각광 받고있다. 박테리오파지의 안전성 실험과 병원균 조절에서의 효율성으로 FDA는 항 리스테리아 파지에 GRAS status를 부여했고, 항생제 저항성 세균에 대한 치료에 파지를 이용하려는 노력들이 진행되고 있다. 또한, 항생제에 저항성을 가지는 병원균과는 달리, 박테리오파지에 저항성을 보이는 병원균은 종종 그 병원성 자체도 감소함이 확인되었기 때문에, 이는 저항성과 관련된 심각성이 항생제에 비해 상대 적으로 낮음을 의미한다.
자연계에 존재하는 셀 수 없이 많은 다양한 wild type 균주들은 실험실 균주들과 다른 특성을 가질 수 있고, 이는 다양한 미생물 억제제들의 한계로 남아있다. 더 나아가 항미생물 제제 저항성 variant 및 mutant에 의한 재증식의 문제는 모든 미생물 억제제의 공통된 숙제이다. 박테리오파지를 이용한 유해세균의 제어 분야에서는 이러한 문제들을 풀기 위해 여러 가지 다른 특성(특히 구별되는 host range)을 가지는 박테리오파지들을 칵테일(cocktail)로 적용하는 방법을 이용하고 있다.
박테리오파지를 'random screening 법'과 'mutant-base screening 법'을 이용한 유용 박테리오파지 스크리닝 방법은 살모넬라균의 효과적인 증식 억제를 가능하게 하는 박테리오파지를 분리하지 못하였다.
이에 본 발명자들은 재증식 풀 컬쳐 기반 박테리오 파지에서 스트리닝한 박테리오파지들을 조합하여 식품에서 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis)를 증식을 억제하는 것을 확인하였으므로 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 박테리오파지 서열번호 1로 표시되는 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P)을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 사멸용 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P)를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 사멸용 조성물을 제공하고자 한다.
또한, 본 발명은 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 사멸용 조성물을 제공하고자 한다.
아울러, 본 발명은 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P), 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P) 및 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)의 혼합물을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명은 박테리오파지 서열번호 1로 표시되는 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P)을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 사멸용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P)를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 사멸용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 사멸용 조성물을 제공한다.
본 발명은 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P), 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P) 및 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)의 혼합물을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 조성물을 제공한다.
박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P), 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P) 및 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)의 혼합물을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 식품 첨가제 및 식품을 제공한다.
박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P), 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P) 및 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)의 혼합물을 포함하는 살모넬라 살모넬라 엔테리티디스 사료 첨가제 및 사료를 제공한다.
본 발명의 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P), 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P) 및 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)은 식품에 포함된 살모넬라 엔테리티디스균에 대한 항균 활성이 매우 뛰어나므로 식품 첨가제 및 사료첨가제로 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 박테리오파지 풀에서 분리된 박테리오파지(phiJR14, phiJR16)를 칵테 일에 적용한 살모넬라 엔테리티디스 증식 억제 시험 결과를 나타낸 그래프이다:
ΦSEP1+phiJR14, ΦSEP1+phiJR16, ΦSEP1+phiJR14+phiJR16의 조합으로 액체 배지 상에서 SE348 억제 실험을 진행하였다. 초기 균 농도는 1x104CFU/ml, 파지의 농도는 1x106PFU/ml로 고정하여 실시하였다.
도 2는 ΦSEP1의 투과 전자 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 3은 ΦSEP1, phiJR14 및 phiJR16의 플라크 형태를 나타낸 사진이다:
좌측부터 ΦSEP1, phiJR14 및 phiJR16의 플락 형태(TSB에서 overnight 배양된 host strain과 희석된 파지 및 0.4% 한천 배지를 TSA plate에 붓고 굳힌 뒤에 37℃에서 6시간 배양 후 결과 확인).
도 4는 ΦSEP1의 원형 게놈를 나타낸 것으로 외부링은 순방향 가닥의 ORF를 나타내고 내부링은 후방 가닥의 ORF를 나타내며, 기능 유전자가 표시한 것이다.
도 5는 ΦSEP1이 있는 전체 게놈 DNA 트리를 나타낸 것으로, LASTN 검색은 NCBI에서 ΦSEP1 DNA 시퀀스로 수행되었고 "결과의 거리 트리" 분석을 위해 상동 시퀀스가 선택하였으며, Neighbor Joining tree 방식을 선택하였고 결과는 “Newick 형식”으로 다운로드 하였고, 전체 게놈 트리를 생성하기 위해 FigTree(버전 1.4.4.)을 이용한 것이다.
도 6은 ΦSEP1의 계통 발생 분석 결과를 나타낸 것으로 주요 외피 단백질(A), 터미네이즈 대형 서브유닛(B), Siphoviridae의 구성원인 ICTV 분류 살모넬라 박테리오파지의 DNA 중합효소(C)를 나타낸 것이다.
도 7은 난황에서 살모넬라 엔테리티디스 성장 억제는 확인한 것으로, (A)는 4℃, (B) 25℃에서 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 난백에서 살모넬라 엔테리티디스 성장 억제는 확인한 것으로, (A)는 4℃, (B) 25℃에서 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 우유에서 살모넬라 엔테리티디스 성장 억제는 확인한 것으로, (A)는 4℃, (B) 25℃에서 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
ΦSEP1+phiJR14, ΦSEP1+phiJR16, ΦSEP1+phiJR14+phiJR16의 조합으로 액체 배지 상에서 SE348 억제 실험을 진행하였다. 초기 균 농도는 1x104CFU/ml, 파지의 농도는 1x106PFU/ml로 고정하여 실시하였다.
도 2는 ΦSEP1의 투과 전자 현미경으로 촬영한 사진이다.
도 3은 ΦSEP1, phiJR14 및 phiJR16의 플라크 형태를 나타낸 사진이다:
좌측부터 ΦSEP1, phiJR14 및 phiJR16의 플락 형태(TSB에서 overnight 배양된 host strain과 희석된 파지 및 0.4% 한천 배지를 TSA plate에 붓고 굳힌 뒤에 37℃에서 6시간 배양 후 결과 확인).
도 4는 ΦSEP1의 원형 게놈를 나타낸 것으로 외부링은 순방향 가닥의 ORF를 나타내고 내부링은 후방 가닥의 ORF를 나타내며, 기능 유전자가 표시한 것이다.
도 5는 ΦSEP1이 있는 전체 게놈 DNA 트리를 나타낸 것으로, LASTN 검색은 NCBI에서 ΦSEP1 DNA 시퀀스로 수행되었고 "결과의 거리 트리" 분석을 위해 상동 시퀀스가 선택하였으며, Neighbor Joining tree 방식을 선택하였고 결과는 “Newick 형식”으로 다운로드 하였고, 전체 게놈 트리를 생성하기 위해 FigTree(버전 1.4.4.)을 이용한 것이다.
도 6은 ΦSEP1의 계통 발생 분석 결과를 나타낸 것으로 주요 외피 단백질(A), 터미네이즈 대형 서브유닛(B), Siphoviridae의 구성원인 ICTV 분류 살모넬라 박테리오파지의 DNA 중합효소(C)를 나타낸 것이다.
도 7은 난황에서 살모넬라 엔테리티디스 성장 억제는 확인한 것으로, (A)는 4℃, (B) 25℃에서 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 난백에서 살모넬라 엔테리티디스 성장 억제는 확인한 것으로, (A)는 4℃, (B) 25℃에서 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9는 우유에서 살모넬라 엔테리티디스 성장 억제는 확인한 것으로, (A)는 4℃, (B) 25℃에서 실험한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명에서는 '재증식 풀 컬쳐 기반 박테리오파지 스크리닝 방법'을 통해 분리된 살모넬라 엔테리티디스를 사멸시키는 박테리오파지들(ΦSEP1, phiJR14와 phiJR16)들의 특성을 분석하고, 이들을 식품들(우유와 난황[egg yolk] 및 난백[egg white])에 적용하여 살모넬라 엔테리티디스의 증식을 효과적으로 억제할 수 있음을 확인하였고, ΦSEP1, phiJR14 및 phiJR16을 혼합한 칵테일이 상대적으로 '낮은 농도'로 적용했음에도 불구하고 이전에 보고된 몇몇 박테리오파지들과 비슷하거나 더 나은 억제 능력이 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 박테리오파지 ΦSEP1은 살모넬라 엔테리티디스균에 대한 숙주 감수성을 가져 이들을 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 ΦSEP1은 서열번호 1로 표시되는 핵산서열로 이루어진 것이다.
본 발명의 박테리오파지 phiJR14는 살모넬라 엔테리티디스균에 대한 숙주 감수성을 가져 이들을 사멸시킬 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 phiJR16은 살모넬라 엔테리티디스균에 대한 숙주 감수성을 가져 이들을 사멸시킬 수 있다.
본 발명은 살모넬라 균에 특이적인 사멸능을 갖는 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P)을 제공한다. 또한, 본 발명은 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P), 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P) 및 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)의 혼합물을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 조성물을 제공한다.
살모넬라(Samonella)는 그람 음성의 간균으로, 대부분 장내에서 증식하나 독소를 생성하지 않으며, 주로 오염된 음식 및 물의 섭취, 분변에서 구강으로의 경로로 감염된다. 제대로 익히지 않은 날고기 및 가금류, 달걀류, 채소류, 유제품 등의 음식 식재료에 의해 주로 발생하게 된다. 살모넬라균이 감염되어 발생할 수 있는 대표적인 질환으로는 위장염, 패혈증, 장열, 그리고 불현성 감염증이 있다.
본 발명의 박테리오파지 ΦSEP1, phiJR14 및/또는 phiJR16은 살모넬라 엔테리티디스균에 대한 숙주 감수성을 가져 이들을 사멸시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 칵테일(ΦSEP1, phiJR14 및/또는 phiJR16)를 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 조성물을 제공한다. 본 발명의 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 조성물은 통상적인 살모넬라 제제 제조방법으로 제제화할 수 있으며, 제제화의방법 및 수단에 대해서는 특별히 한정되지 않으나, 인체에 투여하는 경우는 약제학적으로 허용하는 범위내에서, 가축 또는 어류에 투여하는 경우는 수의학에서 허용하는 범위 내에서, 제제화하고 그에 따라 투여경로를 정할 수 있다.
본 발명의 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 조성물은 유효성분인 본 발명의 박테리오파지 칵테일(ΦSEP1, phiJR14 및/또는 phiJR16) 외에 필요에 따라 담체, 기타 보조제 등을 포함할 수 있는데, 상기 담체는 생리식염수, 증류수, 사료, 박테리아용 배지 등이 될 수 있으며, 보조제는 pH 교정 등의 목적으로 완충액 등을 첨가하여 사용할 수 있다.
본 발명의 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 조성물은 액상, 반고체상, 분말상 등의 형태로 제조화될 수 있는데, 반드시 상기 3가지 제제에 한정되는 것은 아니고 다양한 형태의 제형으로 제제화될 수 있다.
본 발명의 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 조성물은 경구, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내, 근육 내, 경피, 비측 내, 흡입 또는 직장 등의 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 조성물의 투여량은 투여대상에서 살모넬라균을 사멸시키는 효과를 이루는데 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 제형의 조율 및 투여대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 경로, 투여 시간 및 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 그 양이 조절될 수 있다.
본 발명의 박테리오파지 칵테일(ΦSEP1, phiJR14 및/또는 phiJR16) 또는 이를 포함한 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 조성물은 기존 항생제에 대한 내성 여부와 상관없이 살모넬라균을 사멸시킬 수 있으므로, 살모넬라균의 감염에 의한 질환 치료용으로 사용할 수 있고, 항생제 내성을 갖는 살모넬라균에 사용 시, 기존 항생제로 제거할 수 없었던 살모넬라 내성균을 사멸시킬 수 있으므로, 기존 항생제 대체물로 유용하게 활용될 수 있다. 특히, 식품업, 축산업 및 어업에서, 식품, 축산물 및 수산물의 항생제 잔류 문제 등을 해결할 수 있는 항생제 사용의 대안으로써 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 칵테일(ΦSEP1, phiJR14 및/또는 phiJR16)을 포함하는 식품 첨가제 또는 식품을 제공한다. 상기 식품 첨가제 또는 식품은 박테리오파지 칵테일(ΦSEP1, phiJR14 및/또는 phiJR16)을 포함하기만 하면 그 제형에 특별히 국한되지 않으나, 대상 식품은 살모넬라균에 오염되기 쉬운 식품이면 더욱 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 박테리오파지 박테리오파지 칵테일(ΦSEP1, phiJR14 및/또는 phiJR16)을 포함하는 사료 첨가제 또는 사료를 제공한다. 상기 사료 첨가제 또는 사료는 박테리오파지 칵테일(ΦSEP1, phiJR14 및/또는 phiJR16)을 포함하기만 하면 그 제형에 특별히 국한되지 않으나, 살모넬라균에 감염되기 쉬운 가축을 대상으로 하는 사료 첨가제 또는 사료이면 더욱 바람직하다. 사료 첨가제의 일 예로 품질 저하를 방지하기 위하여 첨가하는 결착제, 유화제, 보존제 등이나, 효용 증대를 위하여 사료에 첨가하는 아미노산제, 비타민제, 효소제, 생균제, 향미제, 완충제, 착색제, 추출제, 올리고당 등이 포함될 수 있으며, 그 외에도 사료 혼합제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예 및 실험예를 통해 구체적으로 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다
<실시예 1> 실험 방법
<1-1> 세균 및 박테리오파지 균주와 이들의 증식방법
본 실험에 사용된 세균 및 박테리오파지 균주 정보 및 증식 방법들을 표 1 및 표 2에 정리하였다. 세균의 경우 특별한 언급이 없을 경우, TSB (또는 TSB 한천 배지 [TSA])배지를 이용하여 37℃, 160rpm에서 배양하였다.
<1-2> 재증식 풀(regrowth pool) 배지 준비 및 계대배양
살모넬라 엔테리티디스 야생균주 SE348과 살모넬라 티피뮤리움 야생균주 ST288 및 ST393을 각각의 분리된 파지를 이용한 액체 배지 상에서의 균 억제 실험을 진행하여, 24시간 증식 후 발생한 재증식균을 PBS 버퍼로 2-3회 씻고(파지 제거), 동량의 TSB 배지를 넣어 resuspension 후 glycerol stock(15% glycerol)으로 준비하였고, 이를 재증식 풀(Regrowth Pool) 배지로 명명하였다.
재증식 풀 배지의 계대배양은 재증식 풀 glycerol stock 100μl를 5ml fresh TSB 배지에 접종 후 오버나잇(overnight) 배양한 뒤에 동량의 30% glycerol을 섞어 15% glycerol stock으로 보관 및 유지하였다.
<1-3> 박테리오파지 풀로부터 단일 플락(single plaque) 분리 및 계대배양
24시간 동안 Salmonella의 증식 억제가 확인된 박테리오파지 풀 희석액과 오버나잇(overnight) 배양된 300μl 글리세롤 스톡(Glycerol stock) 형태의 재증식 풀을 0.4% 한천(Agar) 배지와 섞은 후 미리 준비된 고체 배지 플레이트(plate)(1.5% agar)에 붓고 37℃에서 6시간 배양하였다. 생성된 싱글 플락(Plaque)들을 재증식균에서 플레이트 용출(plate elution)하여 스톡(stock)화하여 보관하였다. Single plaque isolation을 재증식균에서 3회이상 수행하여 single plaque 분리를 완료하였다.
스톡(stock)화 되어있는 파지 300μl와 0.4% 한천(Agar) 배지 4ml 및 TSB에서 재증식 풀 culture glycerol stock을 100μl 접종 후 오버나잇(overnight) 배양한 300μl 배양액을 섞은 후 고체 배지 플레이트(plate)(1.5% agar)에 붓고 37℃에서 6시간 배양하였다. plate elution 및 filter sterilization을 진행하여 유지하였다.
<1-4> Host range 확인을 위한 Dotting assay
Overnight 증식한 indicator culture 300μl를 0.4% 한천배지 4ml에 첨가 후 미리 준비한 TSA(1.5% agar) plate에 붓고 실온에서 30분 정도 방치하여 0.4% 한천배지를 굳혔다. 106 plaque forming unit(pfu)/ml 농도로 희석한 박테리오파지 샘플 10μl를 0.4% 한천배지 위에 dotting 후 37℃에서 24시간 배양 후 lysis 또는 plaque 형성을 확인하였다.
<1-5> 박테리오파지의 대용량 준비
액체 배양에서의 대용량 준비, PEG(폴리에틸렌 글리콜) 침전 및 ΦSEP1의 CsCl 구배 초 원심분리는 이전에 설명한 대로 수행하였으며, 고역가 파지 스톡을 준비하였다.
<1-6> 투과전자현미경 분석
투석된 CsCl로 정제된 박테리오파지 스톡을 투과 전자 현미경에서 관찰하였다, 투석된 CsCl로 정제된 박테리오파지 ΦSEP1 10μl를 탄소 코팅된 구리 그리드에 떨어뜨리고 10분 동안 배양하였다. 과량의 용액을 여과지로 제거하고 그리드를 10μl의 2% 우라닐 아세테이트(Sigma, St. Louis, MO, USA)로 음성 염색하였다. 샘플은 100kV의 가속 전압 및 200,000x 배율로 Bio-TEM(Hitachi, Tokyo, Japan)에 의해 시각화하였다.
<1-7> 박테리오파지의 DNA 분리, Whole genome sequencing 및 염기서열 분석
ΦSEP1의 genomic DNA는 DNase와 SDS 처리 후 PEG 침전된 박테리오파지 스톡 (filter-sterilized)과 ExgeneTM Cell SV DNA 정제 키트(GeneAll Biotechnology Co., LTD., Songpa-gu, LTD.)를 이용하여 추출하였다.
전체 게놈 시퀀싱은 경기도 LAS Inc.에서 MiSeq 시퀀싱 시스템(Illumina, San Diego, CA, USA)을 사용하여 수행하였다.
개방 판독 프레임(ORF)은 RAST, Phanotate 및 ORF 파인더를 사용하여 예측하였다. 세 가지 프로그램 중 두 개 이상이 일치하는 경우 예측된 ORF를 선택하였다.
ORF는 BLASTP 알고리즘을 사용하여 비중복 데이터베이스와 비교하였고 기능적으로 주석을 정리하였다. tRNA 인코딩 유전자는 ARAGORN v1.2.41을 사용하여 확인하였다. ΦSEP1의 원형 게놈 지도는 CGView를 사용하여 작성하였다.
<1-8> 박테리오파지의 동정(identification) 및 분류(Classification)
ΦSEP1의 전체 게놈 서열의 비교분석은 Gegenees 3.1.0[Agren et al. 2012]을 사용하여 다른 ICTV(International Committee on Taxonomy of Viruses)로 분류된 Salmonella 감염 Siphoviridae 박테리오파지(Virus Taxonomy: International Committee on Taxonomy of Viruses, 2020 Release)(Salmonella virus SP31 [NCBI Accession no. NC_021775.1], Salmonella virus AG11 [NC_041991.1], Salmonella virus Ent1 [NC_019539.1], Salmonella virus f18SE [NC_028698.1], Salmonella virus Jersey [NC_021777.1], Salmonella virus L13 [NC_021317.1], Salmonella virus LSPA1 [NC_026017.1], Salmonella virus SE2 [NC_016763.1], Salmonella virus SETP3[NC_009232.2], Salmonella virus SETP7 [NC_022754.1], Salmonella virus SETP13 [NC_022752.1], Salmonella virus SP101 [NC_042065.1], Salmonella virus SS3e [NC_006940.2], Salmonella virus wksl3 [NC_041992.1], Salmonella virus SE1Kor [NC_042025.1], Salmonella virus 35 [NC_048632.1], Salmonella virus 37 [NC_029045.1], Salmonella virus 118970sal1 [NC_031930.1], Salmonella virus BP12C [NC_031228.1], Salmonella virus BSPM4 [NC_048655.1], Salmonella virus Chi [NC_025442.1], Salmonella virus FSLSP030 [NC_021779.1], Salmonella virus FSLSP088 [NC_021780.1], Salmonella virus iEPS5 [NC_021783.1], Salmonella virus KFSSE1 [NC_048683.1], Salmonella virus Siskin [NC_048727.1], Salmonella virus SPN19 [NC_019417.1], Salmonella virus ST101 [NC_048648.1], Salmonella virus YSD1 [NC_048666.1], Salmonella virus Lumpael [NC_048113.1], Salmonella virus 9NA [NC_025443.1], Salmonella virus SP069 [NC_042062.1], Salmonella virus Sasha [NC_047786.1])를 사용하였다.
속(Genus) 수준에서 ΦSEP1를 분류하기 위해 NCBI에서 ΦSEP1 DNA 서열로 BLASTN 검색을 수행하고 "Distance tree of results" 분석을 위해 상동 서열을 선택했다. Neighbor Joining tree 방식을 선택하였고 결과는 "Newick Format"으로 다운로드 되었다. 이것은 수반되는 전체 게놈 트리를 생성하기 위해 FigTree(버전 1.4.4.)을 이용하였다.
종(Species) 수준에서 ΦSEP1을 결정하기 위해 다른 ICTV-classified 살모넬라 감염 박테리오파지(Family, Siphoviridae)와 ΦSEP1의 DNA 동일성(%)을 BLASTN 알고리즘과 다음 방정식을 사용하여 계산하였다.
이전 결과들을 다시 한번 확인하기 위해 위 ICTV-classfied 파지들 및 ΦSEP1의 capsid protein, terminase large subunit과 DNA polymerase들의 아미노산 서열들을 이용하여 ΦSEP1의 phylogenetic position(계통발생위치)을 결정하였다.
<1-9> 액체 배지에서 살모넬라
증식 억제 시험
오버나잇(overnight) 배양한 50μl 살모넬라를 5mL의 신선한 TSB 배지에 첨가하고 진탕(160 rpm)과 함께 37℃에서 배양하였다. OD600가 약 0.3일 때, 균 농도를 5x105 CFU/ml가 되도록 PBS buffer를 이용하여 희석하고 5ml TA 배지에 100μl 넣어 초기 균 농도가 1x104 CFU/ml가 되도록 만들고, 여기에 SM buffer를 이용하여 5x107 PFU/ml 농도로 희석한 박테리오파지 100μl를 첨가하였다(최종 박테리오파지 농도, 1x106 PFU/ml). 37℃, 160 rpm의 조건에서 배양하면서 OD600를 측정하여 세균의 증식을 모니터링하였다.
<1-10> 다양한 식품에서 박테리오파지를 이용한 살모넬라 엔테리티디스 증식 억제 분석
① 난황(egg yolk) 및 난백(egg white)에서 박테리오파지를 적용한 살모넬라 엔테리티디스의 증식 억제시험
신선한 달걀은 전주지역 슈퍼마켓에서 구입하였다. 먼저 달걀의 표면을 70% 에탄올로 세척한 후 멸균 피펫을 이용하여 낭황과 난백을 분리하고, 30분 동안 자외선으로 오염을 제거하였다.
밤새 키운 살모넬라균을 5mL의 신선한 TSB 배지(1% inoculum)에 첨가하고 37℃에서 진탕하면서(160rpm) 배양했다. 600nm에서의 optical density(OD=600)가 0.3이 되면 PBS 완충액을 이용하여 세균 농도를 1x106 CFU/ml가 되도록 희석하고 10ml 식재에 100μl를 첨가하여 초기 세균 농도를 1x104 CFU로 하였다. SM 완충액에 희석된 100μl의 파지(들)를 1 x 106 PFU/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 다양한 온도에서 배양하면서 정해진 시간에 CFU counting을 통해 살모넬라 엔테리티디스의 증식 억제를 확인하였다.
② 우유에서 박테리오파지를 적용한 살모넬라 엔테리티디스의 증식 억제 시험
멸균 우유는 전주 지역 슈퍼마켓에서 구입하였다. 멸균 우유를 자외선으로 30분간 다시 한 번 살균하였고, TSA에 plating하여 세균 오염이 없음을 확인하였다.
밤새 키운 살모넬라균을 5mL의 신선한 TSB 배지(1% inoculum)에 첨가하고 37℃에서 진탕하면서(160rpm) 배양했다. 600 nm에서의 optical density(OD=600)가 0.3이 되면 PBS 완충액을 이용하여 세균 농도를 1x106 CFU/ml가 되도록 희석하고 10ml 식재에 100μl를 첨가하여 초기 세균 농도를 1x104 CFU로 하였다. SM 완충액에 희석된 100μl의 파지(들)를 1x106 PFU/ml의 최종 농도로 첨가하였다. 다양한 온도에서 배양하면 서 정해진 시간에 CFU counting을 통해 살모넬라 엔테리티디스의 증식 억제를 확인하였다.
<실시예 2> 실험 결과
<2-1> 재증식 풀 배지를 적용한 다양한 샘플들에서 박테리오파지 풀에서 단일 플락 분리
글리세롤 스톡(glycerol stock) 형태로 저장되어 있는 재증식 풀 배지를 이용하여 플레이팅(Plating) 후 효과가 좋았던 박테리오파지 풀로부터 단일 플락 분리(single plaque isolation)를 진행하였다. 총 16개의 플락을 분리(phiJR1-phiJR16)하였고, 기존에 파지 풀을 제조할 때 사용되었던 ΦSEP1과의 조합 중 액체 배지 상에서 살모넬라 엔테리티디스 SE348을 24시간 이상 억제할 수 있는 배합을 선정하였다. 이렇게 선정된 박테리오파지 cocktail은 ΦSEP1, phiJR14 및 phiJR16로 구성 되어있다.
Phage name |
Host Strain
(=Propagation strain) |
Sources | Description | References |
ΦSEP1 | SE348 | Jeonbuk National University | TSB에서 overnight (37℃, 160rpm) 배양한 host strain culture를 다양한 샘플과 배양한 뒤에 원심 분리 및 여과 살균 후 host strain과 함께 plating하여 single plaque isolation 및 plate elution을 통해 stock화 | 김광표, 최유빈 2021 |
phiJR14 | Regrowth pool culture |
Bacteriophage pool | TSB에서 overnight (37℃, 160rpm) 배양한 Regrowth pool culture를 Bacteriophage pool과 함께 plating한 뒤에 6시간 배양 후 clear lysis를 확인하면 plate elution 및 여과 살균하여 4℃에 보관 | 김광표, 최유빈 2021 |
phiJR16 | Regrowth pool culture |
Bacteriophage pool | 김광표, 최유빈 2021 |
<2-2> phiJR14와 phiJR16의 host range 분석
Dotting assay를 이용한 phiJR14와 phiJR16의 숙주 범위 실험 결과, 16개의 Salmonella Enteritidis, 10개의 Salmonella Typhimurium, 20개의 Salmonella Gallinarum 야생균주 및 mutant-based screening을 통해 분리된 SEM1, SEM2와 재증식 풀 배지를 억제하였다.
Species | Phage Bacteria |
ΦSEP1 | phiJR14 | phiJR16 |
Sal. Enteritidis wild type strains |
SE344 | + | + | + |
SE345 | + | + | + | |
SE346 | + | + | + | |
SE348 | + | + | + | |
SE349 | + | + | + | |
SE351 | + | + | + | |
SE352 | + | + | + | |
SE360 | + | + | + | |
SE373 | + | + | + | |
SE376 | + | + | + | |
SE377 | + | + | + | |
SE378 | + | + | + | |
SE382 | + | + | + | |
SE383 | + | + | + | |
SE384 | + | + | + | |
SE385 | + | + | + | |
Sal. Typhimurium wild type strains |
ST288 | - | + | + |
ST289 | - | - | - | |
ST290 | - | - | - | |
ST292 | - | - | - | |
ST297 | - | - | - | |
ST298 | - | - | - | |
ST299 | - | - | - | |
ST301 | - | - | - | |
ST304 | - | - | - | |
ST305 | - | - | - | |
ST314 | - | - | - | |
ST335 | - | - | - | |
ST357 | - | - | - | |
ST362 | - | - | - | |
ST364 | - | - | - | |
ST367 | - | - | - | |
ST368 | - | - | - | |
ST370 | - | - | - | |
ST371 | - | - | - | |
ST392 | - | + | + | |
ST393 | - | + | + | |
ST395 | - | + | + | |
ST398 | - | + | + | |
ST399 | - | + | + | |
ST404 | - | + | + | |
ST405 | - | + | + | |
ST406 | - | + | + | |
ST407 | - | + | + | |
ST416 | - | + | + | |
Sal. Gallinarum wild type strains |
SG462 | + | + | + |
SG463 | + | + | + | |
SG464 | + | + | + | |
SG465 | + | + | + | |
SG466 | + | + | + | |
SG467 | + | + | + | |
SG468 | + | + | + | |
SG469 | + | + | + | |
SG470 | + | + | + | |
SG471 | + | + | + | |
SG479 | + | + | + | |
SG480 | + | + | + | |
SG481 | + | + | + | |
SG482 | + | + | + | |
SG483 | + | + | + | |
SG484 | + | + | + | |
SG485 | + | + | + | |
SG486 | + | + | + | |
SG487 | + | + | + | |
SG488 | + | + | + | |
Salmonella spp. |
SEM1 | - | + | + |
SEM2 | - | + | + | |
Regrowth pool culture |
+ | + | + |
<2-3> phiJR14 및 phiJR16의 살모넬라 엔테리티디스 증식 억제 능력 확인 시험
ΦSEP1과 phiJR14 및 phiJR16을 동시 투입하여 살모넬라 엔테리티디스 SE348을 억제한 경우 모든 세대에서 24시간 억제가 가능하였다. ΦSEP1과 phiJR14와 phiJR16을 다양한 조합(ΦSEP1+phiJR14, ΦSEP1+phiJR16, ΦSEP1+phiJR14+phiJR16)으로 액체 배지 상에서의 실험을 진행한 뒤에 24시간 경과 후의 OD600값을 측정한 결과이다. ΦSEP1+phiJR14 같은 경우 OD600값이 약 0.3, ΦSEP1+phiJR16은 약 0.2 그리고 ΦSEP1+phiJR14+phiJR16은 0.05 이하로 24시간이 경과했음에도 불구하고 완벽한 억제를 보여주었다.
더 나아가 phiJR14와 phiJR16의 계대배양시 살모넬라 엔테리티디스의 증식 억제 능력이 유지되는 지를 확인하였다. 계대배양을 위해 먼저, glycerol stock화 되어 있는 재증식 풀 culture 100μl를 TSB에 접종 후 37℃, 160rpm 오버나잇 배양해준다. 그 다음 0.4% 한천 배지에 배양액 300μl와 300μl의 phiJR14와 phiJR16을 각각 넣어준 뒤 TSA plate에 붓고 37℃에서 6시간 배양 후 plate elution 및 filter sterilization을 진행한 뒤 4℃에 보관하였다.
7세대 이상의 계대배양을 진행하였고 ΦSEP1과 phiJR14 및 phiJR16을 동시 투입하여 살모넬라 엔테리티디스 SE348을 억제한 경우 모든 세대에서 24시간 억제가 가능하였다(도 1).
<2-4> TEM 분석
살모넬라 엔테리티디스 HJL348 감염 파지 ΦSEP1은 isometric 머리(직경 59±5 nm 길이, n=20)와 비수축성 꼬리(길이, 132±10 nm, n=20)를 가진 Siphoviridae 계통의 구성원인 것으로 밝혀졌다(도 2).
<2-5> ΦSEP1, phiJR14 및 phiJR16의 단일 플락 형태 분석
분리된 단일 ΦSEP1, phiJR14 및 phiJR16의 단일 플락 형태를 알아 보기 위하여 TSB에서 overnight 동안 배양된 host strain과 희석된 파지 및 0.4% 한천 배지를 TSA plate에 붓고 굳힌 뒤에 37℃에서 6시간 배양 후 형태를 확인하였다(도 3).
<2-6> ΦSEP1 완전한 게놈 시퀀싱 및 기능 주석
ΦSEP1의 게놈은 길이가 42,730 bp이고 62개의 ORF(정방향 가닥에 17개, 역방향 가닥에 45개)가 있으며 tRNA는 예측되지 않았다(도 4, 표 1). 이 중 33개의 ORF(53.2%)가 BLASTP 알고리즘을 사용하여 기능적으로 annotation되었는데, 이들은 구조 단백질 (ORF23, ORF24, ORF29, ORF30, ORF31, ORF36, ORF37, ORF38, ORF39, ORF40, ORF41, ORF42, ORF43, ORF44, ORF45, ORF46, ORF48, ORF49), DNA 복제, 전사 및 repair(ORF10, ORF11, ORF12, ORF16, ORF17, ORF18, ORF21, ORF22, ORF35), DNA 패키징(ORF51, ORF52, ORF53), 숙주 lysis(ORF1, ORF2, ORF47) 및 기타 등이다. Integrase 및 항생제 내성에 대한 유전자는 확인되지 않았는데, 이는 식품 등에서 유용하게 사용될 수 있음을 보여준다.
<2-7> ΦSEP1 완전한 게놈 시퀀싱 및 기능 주석
TEM 분석을 통해 ΦSEP1이 Siphoviridae 계통의 구성원임을 알 수 있었다. 따라서 우리 는 Siphoviridae 계통의 구성원들 중 ICTV-classfied Salmonella 파지들을 이용하여 ΦSEP1의 genome sequence를 비교했다(표 2).
Gegenees(v. 3.1.0.)를 이용하여 Siphoviridae 계통의 다른 ICTV-classified Salmonella 파지와 비교할 때, ΦSEP1은 Guernseyvirinae 아과(Subfamily)의 구성원인 Salmonella virus SS3e 및 Salmonella virus wksl3과 높은 유사성을 나타냈다(표 5).
다음으로, "Distance tree of results" 분석을 위해 선택된 ΦSEP1 DNA 서열의 전체 게놈 서열과 상동 서열을 이용한 BlastN 검색은 ΦSEP1이 Jerseyvirus의 구성원과 관련이 있음을 보여주었다(도 5).
마지막으로, ΦSEP1 및 살모넬라 바이러스들(표 2)의 전체 genome을 비교한 BlastN 분석은 ΦSEP1이 살모넬라 파지 SE2와 95.65% 뉴클레오티드 서열 상동성을 나타냄을 보여준다(표 6). 또한 major capsid 단백질과 Terminase Large subunit 및 DNA polymerase을 이용한 계통발생학적 분석 결과에서도 ΦSEP1은 Jerseyvirus 속 파지의 구성원인 Salmonella phage SE2와 많은 관련이 있음을 보여주었다(도 6).
이러한 결과들을 종합해 봤을 때, ΦSEP1의 계통학적 동정은, Family Siphoviridae, Subfamily Guernseyvirinae, Genus Jerseyvirus 및 Species SE2에 속하는 것으로 결론 낼 수 있었다.
<2-8> ΦSEP1, phiJR14 및 phiJR16을 이용한 식품에서 살모넬라 엔테리티디스의 증식 억제
① 난황에서 살모넬라 엔테리티디스 증식 억제(냉장온도, 4℃)
104 CFU/ml의 살모넬라 엔테리티디스와 1x106 및 1x107PFU/ml 농도의 파지들을 처리하여 4℃에서 보관 후 6일까지 살모넬라 엔테리티디스의 CFU를 모니터링하였다.
그 결과, 박테리오파지를 처리하지 않은 경우 살모넬라 엔테리티디스의 CFU는 6일 동안 변화하지 았았다. 이에 반해 1x106PFU/ml 처리의 경우, 24시간 배양 후 살모넬라 엔테리티디스의 CFU는 ΦSEP1로 단독처리 했을 때, 0.5 logCFU 정도가 감소하였고, cocktail(ΦSEP1+phiJR14+phiJR16)로 처리했을 때는 1 logCFU 정도의 감소가 확인되었다(도 7A).
ΦSEP1 1x107 PFU/ml 처리의 경우, 24시간 배양 후 살모넬라 엔테리티디스의 CFU는 1.5 logCFU 감소하였고, 48시간 배양시 2.5 logCFU까지 감소하고, 이후 다시 약간의 증식이 확인되었다. 이에 반해 cocktail 처리의 경우 최초 24시간 후 2.5 logCFU 감소하고 같은 수준의 CFU를 유지하다 5일차부터 다시 감소하기 시작하여 6일차에 3.5 logCFU 감소하였다(도 7A).
② 난황에서 살모넬라 엔테리티디스 증식 억제(실온, 25℃)
25℃에서 박테리오파지 무첨가시, 살모넬라 엔테리티디스의 CFU는 배양 1일, 2일, 3일 및 4일후에 각각 약 2, 4, 5 및 6 logCFU 농도로 증가했다.
1x106 PFU/ml 농도의 ΦSEP1 단독 처리의 경우, 6일 동안 살모넬라 엔테리티디스의 증식 억제를 확 인할 수 없었다. 이에 반해 cocktail(Φ SEP1+phiJR14+phiJR16) 처리의 경우 배양 기간 동안 약 0.5 logCFU 정도가 더 낮은 살모넬라 엔테리티디스 농도를 확인할 수 있었다(도 7B).
ΦSEP1 1x107PFU/ml 처리의 경우, cocktail 1x106PFU/ml 처리와 매우 유사한 증식 억제를 보였으며, 이에 반해 cocktail 1x107PFU/ml 처리의 경우, 6일의 배양 기간 동안 control 대비 2-3 logCFU 더 낮은 살모넬라 엔테리티디스 농도를 확인할 수 있었다(도 7B).
이러한 결과들은 난황에서 살모넬라 엔테리티디스의 증식은 배양 온도에 따라 매우 다르며, 모든 조건에서 ΦSEP1 단독처리보다는 같은 cocktail 처리가 증식을 저해하거나 사멸시키는데 효용성이 높음을 확인하였다.
③ 난백에서 살모넬라 엔테리티디스 증식 억제(냉장온도, 4℃)
달걀 난백에 104CFU/ml의 살모넬라 엔테리티디스와 1x106 및 1x107PFU/ml 농도의 파지들을 처리하여 4℃에서 보관 후 6일까지 살모넬라 엔테리티디스의 CFU를 모니터링하였다.
그 결과, 박테리오파지를 처리하지 않은 경우 살모넬라 엔테리티디스의 CFU는 6일 동안 변화하지 았았다. 이에 반해 1x106PFU/ml 처리의 경우, 24시간 배양 후 살모넬라 엔테리티디스의 CFU는 ΦSEP1로 단독처리 했을 때, 0.5 logCFU 정도가 감소하였고, cocktail(ΦSEP1+phiJR14+phiJR16)로 처리했을 때는 1 logCFU 정도의 감소가 확인되었고, 총 CFU의 감소는 48시간까지 이어지다가 이후 일정한 수준으로 유지되었다(도 8A).
ΦSEP1 1x107PFU/ml 처리의 경우, 24시간 배양 후 살모넬라 엔테리티디스의 CFU는 1.5 logCFU 감소하였고, 48시간 배양이후 nondetectable까지 감소하고, 6일까지 유지되었다. 이에 반해 cocktail 처리의 경우 최초 24시간 후 2.5 logCFU 감소하고, 48시간 배양 이후부터 nondetectable 수준으로 낮아지고, 6일까지 유지되었다(도 8A).
④ 난백에서 살모넬라 엔테리티디스 증식 억제(실온, 25℃)
25℃에서 박테리오파지 무첨가 시, 살모넬라 엔테리티디스의 CFU는 배양 1일차 후 6 logCFU에 근접하였고, 이후 약간씩 증가하는 추세를 보였다(도 8B).
1x106PFU/ml 농도의 ΦSEP1 단독 처리의 경우, 2일차까지 4 logCFU/ml을 유지하다 3일차부터 5 logCFU/ml까지 증식하였고 이후 같은 수준을 유지하였다. 이에 반해 cocktail 처리의 경우 1일차 후 0.5 logCFU의 감소가 확인되었고 이후 약간씩의 증식이 진행되었으나, 단독처리보다는 꾼준히 낮은 수준의 살모넬라 엔테리티디스 count를 유지하였다(도 8B).
ΦSEP1 1x107PFU/ml 처리의 경우, 24시간 배양 후 2 logCFU 이상의 총 CFU 감소가 확 인되었으나, 이후 꾸준히 증가하여 6일차에는 3.3 logCFU/ml 정도에 도달하였다. 이에 반해 같은 농도의 cocktail 처리의 경우, 24시간 배양에서 nondetectable을 확인하였으나, 이후 꾸준히 증식하여 6일차에 2.5 logCFU/ml의 농도를 확인하였다(도 8B).
이러한 결과들은 살모넬라 엔테리티디스가 난황보다 난백에서 증식이 더 활발하며, 같은 농도라면 단일 파지 처리보다는 cocktail 처리가 더 효과적으로 살모넬라 엔테리티디스의 증식을 억제할 수 있음을 보여주는 결과이며, 더 나아가 phiJR14 및 phiJR16의 유용성을 확인해주는 결과이다.
⑤ 우유에서 살모넬라 엔테리티디스 증식 억제(냉장온도, 4℃)
멸균우유에 104CFU/ml의 살모넬라 엔테리티디스와 1x106 및 1x107PFU/ml 농도의 파지들을 처리하여 4℃에서 보관 후 6일까지 살모넬라 엔테리티디스의 CFU를 모니터링하였다.
그 결과, 박테리오파지를 처리하지 않은 경우 살모넬라 엔테리티디스의 CFU는 6일 동안 변화하지 았았다. 이에 반해 1x106PFU/ml 처리의 경우, 24시간 배양 후 Salmonella의 CFU는 ΦSEP1 로 단독처리 했을 때, 2.3 logCFU 정도가 감소하였고, cocktail(ΦSEP1+phiJR14+phiJR16)로 처리했을 때는 3 logCFU 정도의 감소가 확인되었다. 이후 지속적으로 총 CFU의 감소가 이어졌고 ΦSEP1 단독처리의 경우 4일차부터, cocktail 처 리의 경우 2일차부터 nondetectable 수준에 도달하여 6일차까지 유지되었다(도 9A).
ΦSEP1 1x107PFU/ml 처리의 경우, 24시간 배양 후 살모넬라 엔테리티디스의 CFU는 3.5 logCFU 감소하였고, 48시간 배양이후 nondetectable까지 감소하고, 6일까지 유지되었다. 이에 반해 cocktail 처리의 경우 최초 24시간 후 nondetectable 수준으로 낮아지고, 6일까지 유지되었다(도 9A).
⑥ 우유에서 살모넬라 엔테리티디스 증식 억제(실온, 25℃)
25℃에서 박테리오파지 무첨가시, 살모넬라 엔테리티디스의 CFU는 배양 1일차 후 8 logCFU/ml에 근접하였고, 이후 약간씩 증가하여 4일차에 9.5 logCFU/ml 이상으로 증가하였다(도 9B).
1x106PFU/ml 농도의 ΦSEP1 단독 처리의 경우, 1일차까지 4 logCFU/ml을 유지하다 2일 차 및 3일차에서 각각 5-6 및 7-8 logCFU/ml까지 증가하였고 이후 같은 수준을 유지하였다. 이에 반해 cocktail 처리의 경우 전체적으로 ΦSEP1 단독처리와 증식 패턴이 비슷하였으나, 최대 0.5 logCFU 더 낮은 살모넬라 엔테리티디스 증식을 확인하였다(도 9B).
ΦSEP1 1x107PFU/ml 처리의 경우, 24시간 배양 후 0.7-0.8 logCFU 정도의 총 CFU 감소가 확인되었고, 이후 같은 수준을 유지하다 5일차부터 재증식이 발생해 6일차에는 7 logCFU/ml 도달하였다. 이에 반해 같은 농도의 cocktail 처리의 경우, 전체적으로 ΦSEP1 단독처리와 비슷한 양상을 보였으나, 0.5-1 logCFU 이상 더 낮은 CFU/ml을 유지하였다(도 9B).
따라서, 본 실험의 결과는 박테리오파지 농도는 낮게 하여도 살모넬라 엔테리티디스을 사멸하는 효과는 뛰어나므로 ΦSEP1, phiJR14 및 phiJR16를 혼합한 칵테일의 우수함을 확인하였다.
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<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION JEONBUK NATIONAL UNIVERSITY
<120> Composition for inhibiting proliferation of Salmonella
enteritidis comprising bacteriophage
<130> DHP22-154
<160> 1
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 42730
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SEP1 whole genome sequence
<400> 1
aatcccggta agggtcagtt accgggataa aggagctaga gggatgaata agcaggagca 60
ggtttagtat cttaggaatt ctcctatgtg tcaacctact ttgcttcgcg gccgatggct 120
tccgcctgtt gccacggcat accgtcgaat agcgcaacac gacccgcggc acgccgacgc 180
aatccaagga gtgatttgcc gttctgataa tggaactgag atagcttatt ccgcagtgtg 240
gcaacgtcgc ccttacgcag ggcctgccct gttccggtag aagccgcaat cacaccggcg 300
ccagcgttat acaccaggtc gcacatcgca tcgaactgtg actgattgag cgacggatgc 360
gctacagcgt ctaccgcagc tacggcctta gccatatcct tgtgcagcag cagaagaccc 420
tgtccctcgg taatcttctg gccttctttc acatctgcgc cgtagtggcc atagccgata 480
gtaaggtact tctcactctt cgttgccttg tacgcggttc cgcggaaacc ttcgaacgcg 540
gcggtgaatt tgatgccgtt gttactgatg tttcggtttg acatacatcc tccggtattt 600
gtagtagcga gcgcctttca cgcaaatgtg acgcaccgat ttaagcgcga atatagcgac 660
gagagtcgta attatgaacg gtggaatggc accggtaaag agatgggcga gacctccggc 720
ggcggtaacc accgacgcca tgtacagcag gcggccgaaa agaccgtctt caacccagtc 780
ggcgtagata ttaattaacg aggtggcgat gatggcaacc aggcaaatga tgccaattga 840
tgagttgagc atgttatctc ccccacggta acttaaagtt gctgagggat gagtcagcag 900
cttcgaataa cttaagccag aacataccta ccccgaaagg aaccaggtac tgaccctcag 960
actgtgataa ttcatagtaa cttataatga tgggggatgc gtacactgca caacaggcgg 1020
aagcggtgag atggcacaat cgcaaccatg gcgaaatagc ctcacgcttc ttaatctgag 1080
atacggcacc cccggcgagg cccgccacac taagccaaag gtatttatcg tccacaataa 1140
aaaaatctcc gaaagttggt ttatccttcg gagattagca tttatacgac aattttagta 1200
acagataatt cggatttatc ctagtcgatg tgttatcacg cttccatcgg taccagggtc 1260
aaacctcttc gcaacctcta ccgcttccgt tgccgtcgcg cccatgaaca tggctgtaag 1320
cgcatacgga gccccggagc ctacggcagc agcgttacct gcaattggta taaccgagct 1380
taacggtgcg tcccacgccc tacagaattc taccgcgaaa atacggttat cctctttaac 1440
aaacaccagc gccgaaaagt cgaagtcgta gtgcttaggc gtcagtatct catcatcggc 1500
aaccaacaac atacccaccc cggcgtcccc ggatacccct ataacaaagt ggtcgttctc 1560
gtaaatcttg gtatccgtgt ggtatttgta attgccggtg acacaggtat cacaggccat 1620
ggttttgccg tcgaaagcta tcgtagtcat ataaattacc tgaacgtata aagtctgatg 1680
gatggcttgt gcgggatatc tgagtgcccg cgtttacgcc acagtttgta cagtttaacc 1740
gccatatgcg cccgcgcctg gctactgaac tcgccaaggt ttaccacttt cttcccgtcg 1800
taagagtgcg cacgccacag acctttgcct acacaatact taggctggtg caccccaggg 1860
atgcgcggat acacgtccgg catctcatta actggctttg cgcgcggttt aggtttacgc 1920
ttaacctttt ctttaacgcg agtaaccttc tttgttaccg ccgatgaagg aggtgccagg 1980
ttgatgccgg cgtgtttcag tatatcggtt gcgagactca taatcacttc tcctgtttac 2040
cgagtcgctt aggcgaacag atagcgcgta cttctgaatc atttggcttg tcgccctgaa 2100
acaggaagtg cgcattctcg gcggcgcgtg ccgctgaccg gcacgcctct aatgtgtaaa 2160
acgtttccga tgccgcgagt tgcatctggc ctgcggacag tacccagata aataagatac 2220
tggtcatttc tttaacccgc atattctgca catcatcgac gcacttgtat cgtaaaagta 2280
ccaatcgtgc tcgcacccct gagcatcttc tttacggaaa ccagattgct ccggcccgtg 2340
ttcacctttg cgcgcaagtt tgtacgcctc cacgtcgccc gtagctttta ccggcgccat 2400
acgcaactcc ttaacttgcc ctgtcaggtg tgatatgtgc tcagatttct taatgttgtc 2460
ttcctgtaac tcagccacca gcaccgacac atcacgtaac tgattcttaa gtgactgcac 2520
ctcctgcatc aggtcttcac actggttgct gtttacccgc tgccgtagct ggtcaatcag 2580
gtactctaat acctcgtctt tgttattcac ccccacactc ctctatctcg tttcgataaa 2640
gtaatagtac cctattatgt tttgttacgt caatactatt ttacgattaa tttatcccga 2700
cgcaccgtaa gataacgggg tttcttcgca tgagcacgcc accactcaac acgggcgtag 2760
atgccctgaa gcgatgttac tttgccgtgt ctgatttctc cgttccgccc ggtccaggtt 2820
acaaggtcat ttggtttcat tcgttagtct ctgttatcga ttcgacgaag tccctaagtt 2880
tcaggtaaca gtatgtccac tccttcgacg attcttcatg cgcgtcgtgg tcacccccgg 2940
cggtatagga catagccgcc gaagcatcat caacggcgtg gacaagtacc atcagatagg 3000
ttgcctgttc tttagtaata attgttgcgt ctcctgcaac aattgcgttg attgttgcat 3060
ttcgtgaaat agaaaaatat taacaaaaat ggtacgctgc tactcagcag cgtaagtcac 3120
tcagtaaaat cctaaactac tgttacaagc ttcctgcggt tccgataaca gcgcccaggt 3180
gcggccccac caccacgata ccccaggaac tatccaccca tcatcatcgg cgtccggatg 3240
cggccccggg gaccactaaa accctagcca taaacggcaa cctcctttaa gacccgagaa 3300
tcaccggcgc ggactcttta gaatcttttg ccgtggggtt atttacaggg aggtccctgc 3360
cccattagag tgcctttatt ctcgtccctc gtcaggtaag cgcttgccgc aaggcaagtg 3420
cgttaatccc tgagtagtag actaagaatc tttcggcatt tcagttacgt tgccgttgtc 3480
cagtgttgtg cctttattct tattacttgg taactaaagg gcaggcctta agcctgccca 3540
ctaatcgtta catttttacg gttgcgaatc tacggcacat caaggaattc agatacttaa 3600
gagatatgct gccgatgaga atatagctcg cccagggcag ttcagatact aaggaaggga 3660
agttactgag ttttaagttt gcgggtttca gtaagcctta acgcgtatcc gcttggggcg 3720
gacccgctaa gctctcacaa ggtgaaacag aaacttaagt aacttgaagt tacaagagac 3780
aacttacacg aaaaaaatga aaatgtcaat aggtgtgttt atagttgatt tcccattatg 3840
ccgtgggtat acttgcttta ctaactgaga tggaggattt gagaatgaca cagaatgaag 3900
tagctgagct tattggggtt acccgccgca cgctgaataa ctggttaaga gacggcaagt 3960
tcccggattg ttgtgtccgg attatgggtc gccggatgcc gggtacgttt gaccgggaga 4020
aagtggaagc gtggattagg gagaatgtaa agtgaccgat ttccagaaaa gggtattcag 4080
aactgtagtc gcgcttacgc gtaaaaaagg gtcgtgtagt gttcttgact tgcgccgcgc 4140
ttattttcag tactatagtt cctctctcat cgagaggtcg ctggaagttt tggttagaga 4200
cggagcagtt aaaagtaagg ccggaaaata ttcggcagta gctgaagtta aaggctccca 4260
ggcgacccca gaagaccttg aataaaagaa aagccccaac gcgcgaacgt cagggcctta 4320
aacactacaa aggaaaagca catgtcaaca ggcaatttag catactcatg gtcgcgtcgc 4380
aatcgccgtg aggaacgcgc tgacattaac gtttacacca cgacctccgg cacctgggat 4440
gagtttgtcg aacttatgca accgcttaaa cgttcgcgcc ggaaccccaa gacagacccc 4500
ggctacatta ccgccgcttg taccgccacg gtaagctcta ccggtaaaga agccgccgaa 4560
ggtatgttct atcgctgcaa tgcgtctgtt acgtcttcat ccctggccta tgccgacgtg 4620
gacagcgcga cgccggaaga gttcgcaacc gactgtgaga tggtgcgcga gtcacgttac 4680
gcaatgatgc tctacaccac ggcatcccac accgaagaag cgccgcgcta ccgcgtcgtt 4740
atgcctgtac gcactccggt aaccggtggc gacatcatcc gcatccggta cggcctgttg 4800
gcacacttcc ttaaaggtcg tgacgtggat agcgccgggt tcaccctgtc gcagcctatg 4860
taccgccctc cggtaggaag ccaggtcatc gtgtctgaaa gtagccgcat gattacggcg 4920
agcaagctta tggaggaagt tcctgaaatt aacgttaccg gtgcttctga ttataaagtt 4980
ccggagggtg aacaatccga attaaccgac ctgtttgaag agttcgcttt tgaattcggc 5040
ggacgtatga ccgaccgcgg cctgcaaatg cccgccacgc cggagcacgc cgcccaatac 5100
accaccggcg aacctaagca ggacgacttc ctgttctgtt ggccgcgcga cggcttcgag 5160
cgacccaacg ttaccctgta ccacgatacc gacctggtag ctacgggcgg gatgaagcct 5220
ggcggacggg atatgtgggc ttacgcttgt gcggccaccg gcttaccttt tgaccgtgtg 5280
gaggtggcgc ttgggtgggc ggagggggtc acttgcgacg aagaagacct ggacgacgaa 5340
gaaccaccag caccacaagc ggacttcatc gtcgagggct atatgccgtc taattgcatt 5400
tgggatatcg tcggtgaatc cgggacgtat aaatcgttct acacactcgg catgatgtat 5460
atcagcgccg ccgggtatcg gttcgcgggg gcagacaccc gtaaagccca tcatttctat 5520
attgatggtg agggtgggga gttcacgcac acccgtatcg ctgcgttggc cgctaaatac 5580
ggcgatgaag gtatgcgata tatgcatgtg cttgacgctg gtgaattcgc ggatacgaag 5640
aaactggtgc gtaaaatgcg ccagatagcg ggcagtgaac ctgtcgggat ggtcgctttc 5700
gacactctta accagacctt cgggaactgg atagacaagt tcaatgagaa ctcagccgga 5760
caggacggta tgggccgtgt cgtggctatg ctcaaagaag tgcgcgacgg tactaaaggc 5820
gctgtaggcg ttgtccacca caccccgaaa ggtggaagta aggcgcgtgg aagtggtgcg 5880
ctgtatgccg gtgtcgatgt ggaactaacg cttgtccgcg ctaccgagaa acaaataaac 5940
gttgcgcaca ccaagaacaa aaacggtatg cagcagaaaa caataggcat ggtgcttgaa 6000
ccagtacagt ttcgcgaggc cccgccgccg aaagagttcc aggcggtaga attcgctggg 6060
ggtgagggat acggggagat agtcaacctc gaccttccgg agccgcataa agctctcgta 6120
cttatgccgt ggggcttcca gccgttcgaa acggacgagg aaaaagagcg aaacgaagga 6180
ttggatggta aaggtaaaga ttccgtaaag gatacggtta aacggtctaa agacgcttcg 6240
gcccgtgagt cggttatgtc cgctctcgag gatttacagc aagccgatga tacgggacga 6300
gggttcacac aacggcaaat agtcgcgaga gctggagacc acagtatcac aaacctggtg 6360
cttgagaaga tgctacgcga gggtgaattg attcttggtt gcgacgaaaa cggtgaagtt 6420
gtaacgaata cttacaggtt gccgatgggt atagacgacc gtaagcgacc gaagaaccgg 6480
tatgaaccta acgacaacat aaagacaaca gaaggggatt tagagtaaaa agaaaggggc 6540
catcaggccc ctgtatcacc aaagcttaac catcgagggt caacaccgag agcatcggca 6600
atgtggaaga ttttaaaaca gtctacctta cacacccggc cggttgccag gtgggtaatc 6660
aggctttggg atacgccagc tttgaaagca agctcagttt gacccatgcc gatttcttta 6720
cggcggcgct ctatgcgagc gcctagctca gattgctgca tatgtttact ccttagttag 6780
atatgcagta atagtacagt aataaaatac acgacgcaat ttacgaaaaa gttcttgcat 6840
aaataataga gtacgattat agtctttatc accaactaaa caggagaaga aataatgtta 6900
gaccaattct taaaattact tgaacgtttc gtagtcgccc atgaactgat tgctgcgaat 6960
agtgtgaaac agacgtctaa caaatccgta agcgaaatga ctgttgacgt ctccgttgcc 7020
ggtgtcgaga cagttaaaaa agaactggct aaagcactgg aagaagtcga gaaagcaaaa 7080
gaaattccgg tcgaaggtga ggacatcgtc gacactaaac cggcagaaga ggagaaacca 7140
aaacgtaagc cgcgtaaggc aaaagtagag gaaccagtac aagaagagaa ggaagaagta 7200
gattaccagt ctcttcgtga ccagattaag gctatcgacg acgcaattaa tgaaggtccg 7260
agcgatgccg cgtgtgacga ttcagatgaa ctgctggaag agttcaccgg taagaaaatg 7320
aagattgcct cgattaaaga cgaagacctg gccgagtacc tggaacgcct gacggcaatc 7380
aagaacaagt atttcgaaga agaataaata taccgcggcc ttcgggccgc tttaactgag 7440
ggtcggaatt atggctattt tagctaagaa aagtggtctt atgattgcag ggcgagttat 7500
agaagaaaca gataactttg tatgcttcca cgctacggat aacaaacgtc ctacgtatgt 7560
acaaaagtcg gataaaacac aaaaagtttt cgatggtgat ttttctatgg atgacgtttt 7620
cgcgtggatg gattctgtga gggtaaagaa atgatttacc aactctaccg cgccgtagac 7680
aggcgggata acacagaagc actatggctg ttgcgtgcat cgtccggtgc gcacctgatg 7740
gaagagatgg cgtacttagg caaagtgcca cggcctaaag atataggccg tcacgtgtcg 7800
cagattaagc gcacgacttt cgcaaaacct gacttttatg tcttcgagtc gatgtatgga 7860
tgggctatgc attgcgacca taagacgcga catttaattg accagtggga gaacagggta 7920
tgattttaaa ggaacgcggt ggcaataacg atgtgcacgc cctgctgtcg ccgtctggcg 7980
ctaaaaagtg gcttagctgt gccgcatcac tggcatgcga aaaagacatc cccaacacgt 8040
ccggtaaatc cgccattaca ggaaccgcat gtcacactat agccgaggtc catctcaacg 8100
cctatatccg cggcactgca ctgccactag agcgagaagt cggtgcttac gtgctggatg 8160
agggtaaagg ccagattaag gcgctaatca gcccgatgaa aggcgcggta ctgattacgg 8220
cggacatgat tgagcaggtg cgcaagtaca ctgactactg caaaccaatt atcgacgtag 8280
cgacttacgc caagctcgag atgcgggtaa atcttactga ggtattgcat ccgggttacg 8340
aaggcgttga gacattcgga acggctgacc ttgttgccgt tcaggaactg gctaactccg 8400
acgagcacat gctcattatc ggcgacctta aaaccggacg gcatcgtgtt gaagcgaaag 8460
aaaacaagca gcttatgctt tacgctctcg gtgtttatcg ccgactcaag agacgttata 8520
acatcaccgt ggttcgtctg gtcatcttcc agccgtatgc tggcggggcg tccgagtggg 8580
acatctcggt tgaaggtctg gaactgttcg ctaagttcgc acagaaacgt gcgctgttag 8640
cgcttgatgc ctatttccgc ggtaagaaga acctgaaatc gtcggacttc aaaccgtcgg 8700
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tcgtagctga gtatgagaag ttgccactgc tgcgccagca catcgacaag gtcgagaaag 8880
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gcccgggtaa tcgtgcgtgg aaagataccg atgcgctgct ggaaacgcta tcacattttg 9000
agttgggcgc tgaaatgctt cataaagaag tactaatgac cccgaccgag gccgagaagc 9060
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tccccggata aactctaaaa cgcgagaaaa ctaaaatggg aattaaactt aatcttcgta 9300
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gttccgttac taaaggtacg tataacggta cttttatcct gactccggaa cacccacaaa 9420
ttgaagagct tcgcgatacg gtattcgcag tagtgtcgga agcattggga gaggccgccg 9480
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acggcatcaa atttgcaggt gaaggtaaag cgtttggcgg ttcttcggtt tctgccagcg 9840
ttgatgacct ggaagatgat gaagaagatg aaaccccgcg ccgcgaacgt cgccgtaacc 9900
gttaatatat tctcatttca tttaaggcgg cttcggtcgc cttttctata agggtcaaat 9960
gaatgaactt gctttatctt gatactgaaa cattctccga agctgatttg aaaaaagtcg 10020
gctcctatgc ctacgctgaa catcccacta ccgaaattgt tatttgcacc tacgctttcg 10080
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tccttatgtt cgaccgacca gttattaagc attgctgggg attcgaactc ctgatagaaa 10260
acatcatcga cactatgata gttgcattcc gccatgccct tcctgggtca ctagccgcgt 10320
tgtgcgaggt tttaaacatt gacgccagca tggctaagga taaacgtggt aaggcgctta 10380
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gtgaagtgta taagaaaatg cctaagtggg ggaattctga gttcgaagac agcgtgctgc 10560
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cggaagccgg gcgtaagttt gttgttgcgg attactctaa cgtcgaaggc cgtgggcttg 11160
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gatttaagga tattatggcg gttacatcag catataaagt atggaatggc gaaaaatggg 11400
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tgagctacca aaacgacaag gccaaagaca actactcgtc caatgtgatt gcggagagat 11640
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gtggagggcc gataaaaggt cgtttcttag atatgttcaa actttggaag gctgggatga 11940
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aggcgttttg tcgtgactta ttggcctacg caatgcttaa tgttgaggct ggcgggtacc 12900
ctatagttct ttctgttcac gatgaactgg tatgcgagac tccggataca tcagattaca 12960
cggtagctga actggaaaaa ctaatgtgtg cattgccaga atgggctgat ggttttcctc 13020
ttgtagcgga aggtgcggag ttaaaacggt atgctaagta aactgattat ttattatttc 13080
agggaagaag actgtcgaat ctgtccgcgc tgtggggtta agcacacgaa acgtgagggg 13140
tgcatagatg agtacgcctg agggccgcgt ccagaaatat gcaaaagagc gattcgaggc 13200
cctggggggc ctcgtacgca aattgtcgta cgaaaataga gtgggcgctc ctgacctgct 13260
ggtgattctc cccggtggca tcatctggtt cgtcgaggtg aagaaagacg aaaacacgaa 13320
gccagacccg caccagttgc gcgagcacga gaggatgcgt aaacgcggcg caaatgtttt 13380
tgttgttggg tcgaagaaac aggttgataa attaatagaa cactattata tttagttaac 13440
accaaacaga aataaggaat tgagaaatga aatatgaata tgaccgcaaa ccagcacgtg 13500
acatcgtacc aggcgatatg attttcaacg ttaaaacccg ccagccggtt gccgttgata 13560
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cgttcgggcg gaaggaactg gtactggtgg cgaaatgagt aaattcacta gaaggcctta 13680
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aggttcatgg ccagataaca ccgttttcga cataagcgtc cgcgactggc ttaagttgcc 14040
gaaatatgta accgggccta atgggtatct taagggttgg cgggtacctg tcgattttcc 14100
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cggtacttcg tcgtctgggg ccataacatc aggagagaac gaaaaggaaa taagggcgta 14220
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gtgagttcgc gaggttagat gatgcccctt tcacggacgg cgacaagagc ttcgccaacg 20820
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ccacaatgtg gaaagtcgcg ttttctttca gtgcttcgaa gtcttctgtt acgtcgttat 20940
cttctccgat ttcgtcaatg aaaacacgca ccggcacccc gtccggaaca tggttcacga 21000
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gtcgatgaac taaatataat agggttaatg ttactagtca actattattt ctgaatacag 42720
ataaaaaaaa 42730
Claims (8)
- 서열번호 1로 표시되는 핵산서열로 이루어진 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P)을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 사멸용 조성물.
- 제1항에 있어서, 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P)를 더 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 사멸용 조성물.
- 제1항에 있어서, 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)을 더 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 사멸용 조성물.
- 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P), 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P) 및 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)의 혼합물을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스(Salmonella Enteritidis) 사멸용 조성물.
- 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P), 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P) 및 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)의 혼합물을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 식품 첨가제.
- 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P), 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P) 및 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)의 혼합물을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 식품.
- 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P), 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P) 및 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)의 혼합물을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 사료 첨가제.
- 박테리오파지 ΦSEP1(기탁번호 KCTC18931P), 박테리오파지 phiJR14(기탁번호 KCTC18927P) 및 박테리오파지 phiJR16(기탁번호 KCTC18928P)의 혼합물을 포함하는 살모넬라 엔테리티디스 사멸용 사료.
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2022
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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