CN112760252A - 活疫苗制备 - Google Patents

Abstract

描述的是活疫苗制备方法，即用于生成含有稳定细菌的活疫苗的方法，以及通过所述方法获得的含有细菌的疫苗，所述稳定细菌携带至少三个减毒突变。

Description

活疫苗制备

本申请是申请日为2013年9月5日的中国专利申请CN201380063591.0 “活疫苗制备”的分案申请。

技术领域

本发明提供了用于生成含有稳定细菌的活疫苗的方法，以及通过所述方法获得的含有细菌的疫苗，所述稳定细菌携带至少三个减毒突变。

背景技术

活细菌疫苗中的许多包含已通过生物分子技术操作的减毒细菌。不幸的是，出于下述原因，这些疫苗中的大多数视为不足以顺应实践需要：

（a）生产是复杂和耗时的，减毒程度不能得到控制，并且相应地对宿主敏感性的适应通常是不能令人满意的。

（b）通过立法机构要求的测试方法（临床试验）也是复杂的。

（c）待接种疫苗的群体是有限的。

相比之下，通过代谢漂移（MD）减毒的突变体的特征在于下述优点：

（a）制备成本很低，并且经由增加的世代时间的所需选择的减毒程度和因此各自降低的菌落大小原则上几乎是任意的。

（b）当使用具有三个减毒MD突变的稳定特异性疫苗株用于农场动物的疫苗接种时，不需要精细的测试方法。

（c）将取得甚至更小的批量大小。

关于MD减毒的进化原则的关键数据，应强调下述：

（a）致病因子相对于宿主的相互影响基于相互耐受。当偶然由高度有毒力的致病因子的减毒突变体感染时，高度敏感的宿主作为单一个体而存活。宿主群体经由少数存活个体而恢复活力。致病因子作为适应的减毒株而增殖。多发性粘液瘤病是此类过程的典型例子。结论：细菌群体（以及真菌和病毒的群体）始终含有逐渐减毒的突变体，尤其是所谓的MD突变体。

（b）根据定义MD突变体代表在代谢区室中具有突变的克隆，导致功能障碍（即减毒= 适合度代价）。因此，可以发现与野生株相比较逐步降低的菌落大小（取决于克隆）。正常地，这些突变体通过免疫活性宿主消除，或可替代地，被适应的正常菌群生长超过。

（c）MD突变体的菌落大小降低与（延长的）世代时间和（增加的）减毒程度反相关。

（d）MD减毒测试疫苗和疫苗令人信服的功效已得到证明。

MD突变体可以作为下述选择且分离：

（a）例如链霉素、利福平、磷霉素、夫西地酸、萘啶酸的自发MD抗生素抗性（MD "res"）克隆。这些克隆可以以与剧毒抗性克隆有关超过1%的频率分离。MD "res"和有毒力的抗性克隆起因于不同突变。相应地，MD "res"和减毒可以视为功能实体。

（b）在“相继死亡”培养物中的间接累积的环境应激耐受力（iet）增加的突变体。

（c）衍生自链霉素依赖性（Smd）克隆的链霉素不依赖性（Sm-id）抑制基因突变体。这两种标记突变体由广谱克隆组成，所述广谱克隆的特征在于特别的逐渐降低的菌落大小以及分别从几乎野生型毒力到过度减毒（微型菌落）的渐增减毒程度的克隆。一般地，核糖体突变或多或少增加正常错读（错译），并且唯一的抑制突变也引起减毒。

对于例如鸡群体用活的沙门氏菌属（Salmonella）和弯曲杆菌属（Campylobacter）疫苗的免疫接种，对人类的感染链的中断和因此人肠炎的降低是主要目标。通常，鸡耐受兼性致病性沙门氏菌属（和甚至一般的弯曲杆菌属），而不显示任何临床症状。因此，这些野生株对于鸡的低毒力要求疫苗株显示中等程度的减毒，一方面确保对于鸡的免疫原性，但另一方面排除对于人类的危害。

疫苗株功效的一个标准是例如在攻击后能证实的建群程度的降低。甚至对于弯曲杆菌属，表达细菌的所有组分（例如外膜蛋白质）的MD减毒的活疫苗也可以视为实践导向选项。

因此，能够开发用于兼性致病菌例如沙门氏菌属和弯曲杆菌属的有效疫苗，条件是通过调整至低或中等减毒程度来避免过度减毒。换言之，作为减毒等价物的菌落大小降低不应降至低于野生株菌落大小的约25%。另外，这种必要条件必须与WHO的安全要求一致：由于存在两个独立的减毒突变的稳定性。回复率/标记为约10^-8。然而，存在开发疫苗株的需要，所述疫苗株显示甚至更高的稳定性，即更低的回复率，而不是过度减毒。不幸的是，引入另外突变以增加活疫苗的安全性通常导致过量减毒，由此致使疫苗较不有效。

因此，本发明基础的技术问题是提供特征在于稳定性增加的改良活疫苗株。所述技术问题的解决方案通过提供权利要求中表征的实施方案来实现，即提供基于至少三个突变的稳定性增加的改良活疫苗株，然而避免过度减毒且允许将减毒调整至所需水平。事实上，在导致本发明的实验期间，可以显示通过使用MD减毒，可以生成特征在于三个（或甚至更多个）独立减毒突变的疫苗株，其显示增加的稳定性且减毒程度不超过具有两个MD "res"减毒突变的疫苗株的减毒程度。在本发明的实验中使用链霉素，然而，本发明中公开的操作并不仅限于该抗生素。下文描述的实验基于衍生自Smd突变体的所谓的Sm-id克隆的使用，因为这些“双重标记”突变体（包含显示从野生株样菌落到微型菌落的所有减毒程度的克隆）允许生成疫苗株，其显示的减毒程度对应于MD "res"单一标记株的减毒程度。本发明的菌株（Sm-id/MD "res"）显示约10^-24的稳定性增加。

迄今为止，沙门氏菌属和弯曲杆菌属的Sm-id/MD "res"疫苗株在现有技术中仍未得到描述。另外，通过逐步掺入两个或三个Sm-id突变和另外的MD "res"（A a, A α）标记而生成的，具有四个、五个或甚至六个减毒突变的疫苗株同样是新型的，对于链霉素：分别为Smd 1 → Sm-id I → Smd a → Sm-id II → Sm-α→Sm-id III（六个减毒突变）和Sm-idI/ Sm-id II/ MD "res"（五个减毒突变）。

发现具有两个、四个或六个标记的组合的Sm-id突变体的特定逆转株谱（逐渐降低的菌落大小）开始：（a）对于Sm- id菌株，具有野生株的菌落大小，（b）对于Sm-id I/ Sm-idII菌株，具有Sm-id I样菌落大小的菌落大小，和（c）对于Sm-id I/ Sm-id II/ Sm-id III构建体，发现的最大菌落仅对应于Sm-id I/ Sm-id II样克隆。因此，这些不是野生株样逆转株。

原则上，Smd突变体作为用于生成Sm-id克隆的起始菌株的选择和分离属于目前领域发展水平。约10%的例如葡萄球菌属（Staphyloccoci）、大肠杆菌（Escherichia coli）、蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）的正常Sm抗性突变体菌落是Smd克隆（作为外观生物学原则）。然而，这不应用于沙门氏菌属和弯曲杆菌属。在显示抗性的突变体菌落中沙门氏菌属的Smd克隆的出现频率据报道为约0.1%，或分别地，此类菌株的分离可仅通过使用诱变来实现。

发明内容

有趣的是，在分析约5000种Sm抗性突变体后，本发明人无法发现任何Smd菌株。另外，必须强调Sm-id逆转株的谱取决于Sm克隆而改变，相应地，需要几个Smd克隆作为起始突变体。换言之，关于选择的常见操作是不适用的。

因为推测核糖体Smd途径是适应的进化原则，所以测试两种可能机制：

（a）Smd突变体在其形成后立即进入死亡期。因此，此类突变体只能从对数期培养物中分离，例如从≤ 18小时/37℃培养物而不是≥ 48小时/37℃培养物中分离。

（b）在新生状态期间，Smd克隆是脆弱的，显示作为微型菌落（其可能被忽略）的延迟生长。这些微型菌落适合在传代期间的“正常生长”。

对于弯曲杆菌属，不存在关于Smd-和Sm-id突变体可用的数据。在文献中，仅存在关于Sm抗性突变体的一些提示：显示高抗性的克隆只能通过使用针对浓度增加的链霉素的多次传代而获得。一步Sm抗性只能通过使用20 μg链霉素/ml的浓度来实现。本发明人使用100 μg链霉素/ml用于分离显示Sm抗性的突变体和Smd突变体的实验（通过72小时/39℃培养物的铺平板）失败。令人惊讶的是，发现尽管显著增加的细菌量，但活菌数从24小时/39℃到72小时/39℃培养物显著减少，如下表中所示。

表1

结肠弯曲杆菌（Campylobacter coli）和空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）：针对在39℃下的温育期在具有Caso琼脂的培养皿上的活菌数

弯曲杆菌属	24小时	48小时	72小时
				结肠弯曲杆菌	1x10<sup>10</sup>	3x10<sup>9</sup>	7x10<sup>8</sup>
空肠弯曲杆菌	3x10<sup>10</sup>	5x10<sup>9</sup>	1x10<sup>9</sup>
				结肠弯曲杆菌Smd	3x10<sup>9</sup>	3x10<sup>8</sup>	4x10<sup>7</sup>

这些结果与下述观察一致：弯曲杆菌属的培养物能够逐渐变成存活但不可培养的状态。

相应地，具有Sm抗性的突变体只能通过≤ 24小时/39℃培养物材料的铺平板来获得。然而，在具有正常大小或轻微降低大小的抗性菌落中无法发现Smd突变体。但在弯曲杆菌属的极小菌落和微型菌落中（伴随独特延迟出现），大多数克隆可以表征为Smd克隆。

附图简要说明

图1：特征在于三个减毒突变的沙门氏菌属疫苗的例子。

板在37℃下温育约20小时。

（A）婴儿沙门氏菌（Salmonella Infantis）（野生株/Sm-id 4.22/ Rif 2（和Iet4））；

（B）维尔肖沙门氏菌（Salmonella Virchow）（野生株/Sm-id 9.3/ Rif 2）；

（C）哈达尔沙门氏菌（野生株/Sm-id 4.1/ Sm 2（和 Rif 1）；

（D）乙型副伤寒沙门氏菌，变体Java 3.2（野生株/Sm-id.1.1/ Rif 3（和Rif 2））。

图2：特征在于三个减毒突变的弯曲杆菌属疫苗株的例子。板分别在39℃下温育约48和72小时。

（A）结肠弯曲杆菌I（野生株/ Sm-id 5.5/ Pho 1和Pho 2）；

（B）结肠弯曲杆菌II（野生株/ Sm-id 18.1/ Sm 2）；

（C）空肠弯曲杆菌I（野生株/ Sm-id 2.3/ Pho 1（和Pho 2））；

（D）空肠弯曲杆菌II（野生株/ Sm-id 2.1/ Sm 2）。

图3：特征在于（两个）、四个、五个或六个减毒10突变的沙门氏菌属疫苗构建体的例子。板在37℃下温育约20小时。

（A）维尔肖沙门氏菌：

野生株/ Sm-id I 1.4/ Sm-id II 0.3/ Sm 4；

野生株/ Sm-id I 1.4/ Sm-id II 0.3/ Sm-id III 0.x.

（B）婴儿沙门氏菌：

野生株/ Sm-id I 4.22/ Sm-id II 0.1/ Rif 2；

野生株/ Sm-id I 4.22/ Sm-id II 0.1/ Sm-id III 1.1。

图4：特征在于（两个）、四个、五个或六个减毒突变的弯曲杆菌属疫苗构建体的例子。板在39℃下温育约48小时。

（A）结肠弯曲杆菌II野生株/ Sm-id I 18.1/ Sm-id II a.1。该菌株特征在于第二个Sm-id a.1突变导致Sm抗性。

（B）结肠弯曲杆菌II野生株/ Sm-id I 17.7/ Sm-id II a.1/ Pho1、野生株/ Sm-id I 17.7/ Sm-id II a.1/ Sm-id III α.l。

具体实施方式

因此，本发明提供了用于生成含有稳定细菌的细菌活疫苗的方法，所述稳定细菌携带至少三个（和最高达六个或七个）减毒突变，其中所述方法包括下述步骤：

（a）提供细菌菌株，且使所述菌株在第一抗生素优选链霉素的存在下生长；

（b）从（a）的菌株中分离此类“微型”菌落，其对应于依赖于第一抗生素的克隆；

（c）使（b）的克隆在不存在第一抗生素的情况下生长，并且分离特征在于菌落大小为野生株菌落大小≥ 50%的减毒逆转株；

（d）使步骤（c）中获得的克隆在补充有第二抗生素的培养基中生长，所述第二抗生素可以不同于第一抗生素（例如氨基糖苷，例如链霉素、新霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素、阿米卡星和妥布霉素；利福平、夫西地酸、萘啶酸、磷霉素），具有合适浓度，优选约十倍MIC；

（e）分离且连续传代显示大小降低的菌落（MD A "res"）；和

（f）分离具有菌落大小的逐步降低作为稳定特性的克隆。

步骤（a）的细菌菌株优选得自“野生型”剧毒株。这些菌株可以取自患病动物（例如鸡）。使用的起始天然菌株应具有一定程度的毒力。

用于选择步骤（a）的突变体的抗生素选择通过实际性质的原因加以指导。例如，链霉素已知在微生物中快速导致抗性和依赖性菌株的发展。

因此，在本发明的方法的一个优选实施方案中，步骤（a）的抗生素是链霉素。然而，其他氨基糖苷抗生素，例如新霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素、阿米卡星和妥布霉素，以及利福平、夫西地酸和萘啶酸，作为步骤（a）的抗生素也可以是合适的。

已知对抗生素的抗性可以起因于不同修饰机制。特别地，遗传修饰可以影响细菌的染色体。染色体修饰是罕见事件，一旦进行，其确保所获得特性的稳定性。

如本文使用的，术语“微型菌落”指特征在于大小降低的细菌菌落。优选地，它们的特征在于≤相应的野生株菌落10%的大小。

值得注意的是，根据在含有抗生素的培养基上的生长标准选择减毒的细菌菌株是已用于多个物种的操作，目的是促使毒力降低的菌株出现。

特征在于至少三个（和最高达六个或七个）减毒突变的根据本发明的细菌菌株首先是就其在具有高含量抗生素例如链霉素的培养基上的生长能力，并且另外只能在抗生素的存在下令人满意地发展，从天然剧毒株中选择的无毒株（步骤（b）。为此，这些毒株被说成依赖于例如链霉素（Smd突变体）。

其次，步骤（c）的菌株是选自抗生素依赖性菌株的突变体，并且由于第二减毒突变或标记的引入，所述突变体具有能够在不存在链霉素的情况下发展的特性。这些菌株被称为Sm-id菌株。优选地，在步骤（b）和（c）之间进行洗涤步骤。步骤（c）的优选培养基是沙门氏菌属Caso（SC）培养基（例如用于沙门氏菌属）或Caso培养基（例如用于弯曲杆菌属）。

步骤（d）允许引入另外的MD抗生素抗性（"res"）突变（作为第三个减毒标记）。优选地，抗生素是链霉素、利福平或磷霉素。步骤（d）中的抗生素浓度可以由技术人员根据例行操作加以确定。优选地，对于沙门氏菌属，利福平、链霉素（注：大多数Sm-id突变体是链霉素敏感的，且因此适合于另外的MD Sm "res"标记）和磷霉素的浓度对应于约十倍的MIC值，并且对于夫西地酸，对应于约四倍的MIC值。优选地，对于弯曲杆菌属，分别使用至少200 μg磷霉素/ml和至少100 μg链霉素/ml。

在步骤（e）中，将特征在于另外轻微降低的菌落大小的先前步骤的Sm-id/ MD抗生素"res"菌株分离且连续传代，以便检查稳定性。优选地，进行至少30次连续传代。

最后，在步骤（f）中，提供了具有菌落大小的逐步降低作为稳定特性的从步骤（e）中分离的克隆。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，步骤（a）至（c）至少重复一次，用于生成携带至少四个减毒突变的细菌。例如根据下述方案（对于Sm显示），该方法允许生成新减毒突变体：

（a） Smd 1 → Sm-id I → Smd a → Sm-id II；

（b） Smd 1 → Sm-id I → Smd a → Sm-id II → Smd α→ Sm-id III；

（c） Smd 1 → Sm-id I → Smd a → Sm-id II → Smd α→ Sm-id III → MD抗生素"res"。

令人惊讶的是，发现与具有三个减毒突变的菌株相比较，衍生自携带四个或甚至六个突变的Sm-id突变体的菌株未显示更高的减毒程度，但显示甚至更高的稳定性。

根据本发明用于选择MD抗生素"res"突变株的抗生素选择通过实际性质的原因加以指导，并且原则上能够引入代谢漂移（MD）突变的任何抗生素均可用于本发明的目的，例如链霉素（注：大多数Sm-id突变体是链霉素敏感的，并且因此适合另外的MD Sm "res"标记）、利福平、磷霉素、夫西地酸或萘啶酸。

本发明的方法并不限于特定细菌。除沙门氏菌属物种和弯曲杆菌属物种之外，其他细菌例如金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌、蜡状芽孢杆菌（假炭疽）、耶尔森菌属物种例如鼠疫耶尔森菌（Y. pestis）、克雷伯菌属物种（Klebsiella sp.）、李斯特菌属物种（Listeria sp.）、气单胞菌属物种（Aeromonas sp.）、志贺氏菌属物种（Shigella sp.）、巴斯德氏菌属（Pasteurella）/禽杆菌属物种（Avibacterium sp.）、里默氏菌属（Riemerella sp.）、鼻气管鸟杆菌（Ornithobacterium rhinotracheale）、博德特菌属物种（Bordetella sp.）和假单胞菌属物种（Pseudomonas sp.），也可以根据本发明的方法用于生成含有稳定细菌的细菌活疫苗。

然而，优选细菌是沙门氏菌属和/或弯曲杆菌属，尤其是邦戈尔沙门氏菌（Salmonella bongori），肠道沙门氏菌的肠道、亚利桑那、双相亚利桑那、萨拉姆、浩敦和因迪卡亚种（S. enterica subspecies enterica、arizonae, diarizonae, salamae, houtenae和indica），优选肠道沙门氏菌的肠道亚种例如下述血清型：都柏林、鸡（生物变型鸡和鸡白痢）、猪霍乱、猪伤寒、伤寒、副伤寒A,B,C、马流产、羊流产、阿邦尼、肠道、鼠伤寒、哥本哈根、婴儿、维尔肖、哈达尔、阿贡纳、纽波特、鸭沙门、海德堡、巴拿马、印第安纳、圣保罗、勃兰登堡，以及结肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌和胎儿弯曲杆菌（Campylobacter fetus）。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，在步骤（a）和（b）中，沙门氏菌属突变体从对数期培养物中并且作为微型菌落分离，所述微型菌落在37℃温育至少或超过48小时后开始出现。

在本发明的方法的一个进一步优选实施方案中，在步骤（a）和（b）中，弯曲杆菌属突变体作为微型菌落分离，所述微型菌落在39℃温育至少或超过72小时后开始出现。

本发明还提供了可通过本发明的方法获得的活的细菌菌株，以及包含本发明的活的细菌菌株和生物学可接受的载体的疫苗。疫苗接种组合物当然可以借助于新鲜培养的细菌进行构建。

优选地，本发明的疫苗组合物是冷冻干燥的。

为了施用疫苗接种细菌，它们在其中悬浮的培养基并非关键。当然，该培养基必须不干扰它们含有的细菌的良好活力。

本发明的疫苗以适合于个体免疫接种的量施用，并且可以另外含有一种或多种常见辅助试剂。采用的术语“适合个体免疫接种的量”包含个体可以用其进行免疫的任何细菌量。“适合个体免疫接种的量”可以使用本领域技术人员已知的方法进行测定。如本文使用的术语“个体”包含任何种类的个体。此类个体的例子是动物（和人）。

疫苗的施用优选是经口途径，但注射也可以在个体的多个部位肌内、皮下、皮内或约任何其他应用形式进行。进行具有大约等量的一次或多次“加强”注射也可以是有利的。

本发明的疫苗可以是预防的，即施用化合物以预防或延迟感染或建群，例如由沙门氏菌属或弯曲杆菌属引起的感染/建群的发展。

根据布达佩斯条约，下述菌株已于2012年11月27日保藏于德国典型培养物保藏中心（German Type Culture Collection）（Deutsche Sammlung von 25 Mikrorganismenund Zellkulturen（DSMZ）, Braunschweig）：

。

下述实施例更详细地说明本发明。

实施例

实施例1

材料

（A）菌株

肠道沙门氏菌肠道亚种维尔肖血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Virchow），

肠道沙门氏菌肠道亚种婴儿血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Infantis），

肠道沙门氏菌肠道亚种哈达尔血清型（Salmonella enterica subsp. enterica serovar Hadar），

乙型副伤寒沙门氏菌（Salmonella paratyphi B）（变型L-Tartrat+，以前的Java），

结肠弯曲杆菌、空肠弯曲杆菌（由Lohmann Animal Health, Cuxhaven，德国提供）。

（B）培养基

1000 ml弯曲杆菌属培养基（Caso培养基）含有：35 g Caso琼脂（Sifin）、3 g酵母提取物、3 g酪蛋白水解产物、4 g活性炭、0.25 g FeS0₄、0.25 g丙酮酸钠、5 g琼脂Kobe（Roth）。

1000 ml沙门氏菌属培养基（SC培养基）含有：35 g Caso琼脂（Sifin）、3 g酵母提取物、1 g葡萄糖、5 g琼脂Kobe（Roth）。

（C）抗生素

链霉素（Sm）（Roth编号0236.2）、磷霉素（Pho）（Sigma编号P5396）、利福平（Rif）（Riemser Arzneimittel AG、Fatol Eremfat 600 mg）。

（D）野生型菌株的MIC值

菌株	链霉素	利福平	磷霉素
				肠道沙门氏菌肠道亚种维尔肖血清型	12.5	12.5	n.d.
肠道沙门氏菌肠道亚种婴儿血清型	12.5	12.5	n.d.
				肠道沙门氏菌肠道亚种哈达尔血清型	25	12.5	n.d.
乙型副伤寒沙门氏菌<i>（变型L- tartrate+）</i>	30	12.5	n.d.
				结肠弯曲杆菌<i>WS I</i>	1	n.d.	25
结肠弯曲杆菌<i>WS II</i>	1	n.d.	25
				空肠弯曲杆菌<i>WS I</i>	2	n.d.	25
空肠弯曲杆菌<i>WS II</i>	2	n.d.	25

n.d.: 未确定。

实施例2

Smd突变体的选择和分离

（a）沙门氏菌属的Smd突变体的实践导向的分离

将约10¹⁰ cfu的沙门氏菌属的18小时/37℃培养物在含有SC琼脂的培养皿上铺平板，所述SC琼脂补充有500 μg链霉素/ml。除具有正常大小的菌落和具有轻微减少大小的单个菌落（剧毒Sm抗性克隆和MD Sm "res"克隆）之外，取决于菌株，可以检测到具有不同频率的“微型菌落”（占优势的小菌落变体= scv）。在约≥ 48小时（在37℃下）的温育时间后，可以检测到1 - 2个另外的微型菌落（每约30个具有正常大小的菌落和具有轻微减少大小的菌落），其无法与scv区分。取决于scv表型的出现频率，3% - 20%的这些微型菌落可以显示为代表Smd突变体。

计算的与抗性突变体有关的Smd克隆的频率为≥ 1%。

注：Smd克隆的分离通过使用Sm敏感性野生型菌株作为原材料来实现。菌株优选具有低MIC值。

（b）弯曲杆菌属的Smd突变体的实践导向分离

将得自Caso琼脂培养皿培养物（24小时/39℃；约10¹⁰ cfu）的细菌材料铺平板到补充有100 μg链霉素/ml的1或2个Caso琼脂培养皿，并且在39℃下温育72小时，所述细菌材料已以这样的方式接种，从而使得皿的整个表面被覆盖。取决于菌株，可检测到≤ 10个具有正常大小的菌落/平板（平均值）和具有轻微减少大小的菌落（链霉素抗性和MD Sm“res”菌落）。另外，与具有正常大小的菌落和具有轻微降低大小的菌落相比较，可以检测到频率约20%的具有明确降低大小的菌落（直径为正常大小的≤ 25%）。这些菌落中的约三分之一为Smd克隆。

计算的与抗性突变体有关的Smd克隆的频率为≥ 5%。

实施例3

Sm-id突变体的选择和分离

（a）从Smd克隆中分离沙门氏菌属Sm-id突变体

将约10⁹ cfu（每培养皿）洗涤的Smd突变体用SC培养基铺平板，并且在37℃下温育48小时。从获得的减毒逆转株中，仅此类突变体进一步处理，所述突变体与野生型菌株菌落相比较（根据获得仅具有低减毒的Sm- id克隆的目的），其显示约≥ 50%的菌落大小。

（b）从Smd克隆中分离弯曲杆菌属Sm-id突变体

对得自Caso琼脂（补充有100 μg链霉素/ml）培养皿培养物（24小时/39℃）的细菌材料实施一个洗涤步骤，以1:1（约3xl0⁹ cfu）至1:4的比例在Caso培养基上铺平板，并且随后在39℃下温育72小时，所述细菌材料已以这样的方式接种，从而使得皿的整个表面被覆盖。在这些培养条件下，大多数Smd克隆显示≤ 10个减毒逆转株（平均起来）的发展。这些减毒逆转株中的大多数是Sm敏感性的。一般地，进一步处理与野生型菌株菌落相比较显示约≥ 50%的降低菌落大小的Sm-id克隆。

一些菌株例如空肠弯曲杆菌允许仅来自Sm-id的分离，与野生型菌株相比较，所述Sm-id具有≤ 50%的菌落大小。

注：并非所有弯曲杆菌属菌株和由其衍生的Smd突变体均允许分离Sm-id逆转株，而无任何问题。然而，还能够使用例如几种不依赖性Smd突变体，从有问题的菌株中分离Sm-id逆转株。

实施例4

另外的MD抗生素"res"突变体的分离

如上文已经描述的，进行在所选Sm-id突变体中另外的MD抗生素"res"突变的掺入，作为用于减毒和识别的第三种标记。

简言之，

（a）沙门氏菌属：使10^9-10 cfu所选Sm-id克隆在SC培养基上温育，所述SC培养基分别补充有约十倍MIC值浓度的利福平或链霉素（关于夫西地酸，约四倍MIC值浓度），并且在37℃下温育48小时。

（b）弯曲杆菌属：将培养皿培养物（Caso培养基）的材料以1:4至1:8的比在Caso培养基上铺平板，所述Caso培养基补充有200 μg磷霉素/ml或100 μg链霉素/ml，并且在39℃下温育≥ 72小时，所述培养皿培养物材料已以这样的方式用Sm-id突变体接种，从而使得它覆盖整个表面且在39℃下温育24小时。

分离显示（或多或少）降低大小的菌落，并且实施连续传代。这些菌落中的约20%维持以菌落大小的特别分级降低作为稳定特点的克隆。

实施例5

具有4或6个减毒突变的疫苗株的生成

通过将第二个和任选的第三个Sm-id抑制突变序贯掺入基础的Sm-id I克隆内，实现具有4或6个减毒突变的疫苗株的生成：Sm-id I/ Sm-id II/ Sm-id III。

（a）沙门氏菌属：将约10¹⁰ cfu的基础Sm-id I突变体（或Sm-id II起始菌株）铺平板到补充有500 μg链霉素/ml的SC培养基上，并且在37℃下温育48小时。约5%的Sm抗性菌落是Smd突变体（目前主要作为具有“正常大小”的菌落生长）。通过使用分别衍生自Sm-id I菌株和Sm-id II菌株的这些Smd克隆，根据实施例3（a）中所述的方法再次分离Sm-id突变体。进一步处理具有所需菌落大小降低的克隆。

（b）弯曲杆菌属：得自Caso培养基培养皿培养物的材料以1:4的比在补充有100 μg链霉素/ml的Caso培养基上铺平板，并且在39℃下温育72小时，所述材料已以这样的方式用Sm-id突变体接种，从而使得整个表面被覆盖且在39℃下温育24小时。除具有“正常大小”的约15个Sm抗性菌落之外，可以检测到2 - 3个小菌落。这些菌落中的50%是Smd克隆。根据实施例3（b），这些Smd克隆（分别衍生自Sm-id I菌株和Sm-id II菌株）用作起始克隆，用于再次分离Sm-id突变体。进一步处理显示所需菌落大小降低的克隆。

实施例6

从所选Sm-id II突变体中分离MD抗生素"res"突变体

（a）沙门氏菌属 ：根据实施例4（a）中所述的方法，类似地进行有利的MD抗生素"res"突变进入所选Sm-id I/ Sm-id II突变体内的掺入，作为另外的第5个减毒和识别标记。

（b）弯曲杆菌属 ：根据实施例4（b）中所述的方法，类似地进行有利的MD抗生素"res"突变进入所选Sm-id I/ Sm-id II突变体内的掺入，作为另外的第5个减毒和识别标记。

注：上文描述的方法还可以用于MD抗生素"res"突变进入所选Sm-id III突变体（具有六个减毒突变）内的另外掺入，作为用于减毒和识别的第7个标记。然而，这可能导致过度减毒，这可能干扰与实践的关联。

实施例7

菌落大小转换为条形图用于可能减毒程度的有希望的定向进化

将相应的野生型菌株和衍生自这些菌株的MD突变体的悬浮液对数稀释，并且随后以这样的方式在培养基上铺平板，从而使得每培养皿可以获得10 - 50个界限分明的单个菌落。制备至少5个培养皿/稀释级别，以便补偿由于培养基在生长中的差异。给在标准化条件下生长的单个菌落（例如相同的温育时间、相同的培养基层厚度）拍照。用CellProfiler程序（Broad Institute）处理数字照片：测定且保存个别菌落的直径。在值求平均之后，将数据标绘为与野生型菌株菌落大小（作为100%给出）有关的条形图。

实施例8

由合适的疫苗株制备疫苗以及分别用于小鸡和待保护的更多宿主的疫苗接种的用途

对于活疫苗的制备，使具有三种（分别为四个、五个和六个）减毒突变的疫苗株在常见液体培养基中生长直到对数期。疫苗悬浮液和疫苗沉淀物分别补充有合适的稳定剂且随后冻干。所获得的疫苗通过经口或肠胃外施用进行施用（根据适应症种类，一个、两个或三个剂量）。

Claims (14)

1.用于生成稳定的减毒细菌菌株的方法，所述稳定的减毒细菌菌株携带至少三个和最高达七个减毒突变，其中所述方法包括下述步骤：

(a)提供细菌菌株，且使所述菌株在存在第一抗生素的情况下生长；

(b)从(a)的菌株中分离此类“微型”菌落，其对应于依赖于所述第一抗生素的克隆；

(c)使(b)的克隆在不存在所述第一抗生素的情况下生长，并且分离特征在于菌落大小为野生株菌落大小的≥ 50%的减毒逆转株；

(d)使步骤(c)中获得的克隆在补充有具有合适浓度的第二抗生素的培养基中生长；

(e)分离且连续传代显示大小降低的菌落(MD "res")；和

(f)分离具有菌落大小的逐步降低作为稳定特性的克隆。

2.权利要求1的方法，其中所述第一抗生素和第二抗生素选自链霉素、新霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、利福平、夫西地酸和萘啶酸。

3.权利要求1的方法，其中所述第一抗生素选自链霉素、新霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、利福平、夫西地酸和萘啶酸；并且其中所述第二抗生素选自链霉素、新霉素、卡那霉素、壮观霉素、庆大霉素、阿米卡星、妥布霉素、利福平、夫西地酸、萘啶酸和磷霉素。

4.权利要求1、2或3的方法，其中所述细菌菌株是沙门氏菌属或弯曲杆菌属。

5.权利要求4的方法，其中步骤(a)和(b)中选择的沙门氏菌属突变体从对数期培养物中并且作为微型菌落分离，所述微型菌落在37℃温育至少或超过48小时后开始出现。

6.权利要求4的方法，其中步骤(a)和(b)中选择的弯曲杆菌属突变体作为微型菌落分离，所述微型菌落在39℃温育至少或超过72小时后开始出现。

7.权利要求1 - 6中任一项的方法，其用于生成携带至少四个减毒突变的稳定的减毒细菌菌株，其中步骤(a)至(c)至少重复一次。

8.可通过权利要求1至7中任一项的方法获得的稳定的减毒细菌菌株。

9.疫苗组合物，其包含权利要求8的稳定的减毒细菌菌株和生物学可接受的载体。

10.权利要求9的疫苗组合物，其为冷冻干燥的。

11.权利要求9或10的疫苗组合物，其用于对抗或预防细菌感染。

12.权利要求9或10的疫苗组合物在制备用于对抗或预防由沙门氏菌属或弯曲杆菌属引起的感染的药物中的用途。

13.权利要求8的稳定的减毒细菌菌株，其用于对抗或预防细菌感染。

14.权利要求13的稳定的减毒细菌菌株，其中所述细菌感染由沙门氏菌属或弯曲杆菌属引起。

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