CN112449604B - 用作有结核感染风险的患者的预防剂或用作治疗结核感染患者的辅助剂的组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含分离的微生物的冷冻干燥的组合物，该微生物属于结核分枝杆菌复合物，优选结核分枝杆菌临床分离株，更优选为结核分枝杆菌临床分离株，其特征在于，其包含：通过使Rv0757基因进行基因缺失而失活的PhoP‑表型和防止PDIM产生(PDIM‑表型)的第二基因Rv2930(fadD26)的缺失(MTBVAC菌株)；以及作为稳定剂或赋形剂的蔗糖和谷氨酸钠。本发明还涉及通过向冷冻干燥的组合物中添加水、优选地注射用无菌水而得到的重构组合物及其用途，特别是用作具有感染结核分枝杆菌风险的那些或具有发展为结核病风险的那些的预防剂、或作为用于治疗感染非结核分枝杆菌的患者的辅助剂。

Description

用作有结核感染风险的患者的预防剂或用作治疗结核感染患 者的辅助剂的组合物
技术领域
本发明涉及药物组合物，例如疫苗，以及制备和使用这种组合物的方法。
背景技术
卡介苗(Bacille Calmette–Guérin，BCG)疫苗是牛结核(Tuberculosis，TB)病原体牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)的减毒株。BCG大约在一百年前首次被引入临床用途，1921年，对母亲在分娩后一天死于TB的婴儿给予BCG口服。婴儿没有显示出接种BCG的不良反应，并且重要的是没有发展为TB。当时，BCG给药的口服途径被认为是在未经巴氏杀菌的奶喂养的婴幼儿中获得TB的自然(胃肠道)途径。TB与贫困相关，是世界上贫困地区和发展中地区中的主要负担。由于贫困和不平等，TB的发病率正在全世界范围内提高，并且随着HIV/AIDS流行病而加剧，这大大增加了感染发展为活动性疾病的风险。由于营养失调和不良的社会经济状况，糖尿病、代谢综合征、吸烟以及最近的维生素缺乏症正成为TB的重大危险因素。重要的是，在定义涉及具有多种此类风险因素的研究或患者群的临床试验设计时，需要特别注意这些因素如何影响新TB疫苗的疗效评估。由于全球化的不断发展以及耐多药(Multidrug-resistant，MDR)和广泛耐药性TB(Extensively drug resistant，XDR)菌株的出现，TB正日益成为对整个世界的严重威胁。
根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)最新的2018年全球TB报告，如今，TB已达令人担忧的归因于该疾病的1000万发病例和160万死亡病例。在全球范围内，已经有大约5000万的个体被MDR结核分枝杆菌(M.tuberculosis)菌株潜伏感染，在治疗选择不足的情况下，这为活动性TB创造了可观的资源。尽管如此，WTO终结TB战略已誓言要在2035年之前将TB的发病率降低90％并将TB的死亡率降低95％，并认识到为了实现这一宏伟目标，迫切需要更快速可靠的易使用诊断工具、用以缩短治疗的毒性更小且功效更强的新型抗生素以及最终的新疫苗以预防肺结核。
本发明有助于提供预防TB的新疫苗的目的。
发明内容
本发明涉及减毒活结核分枝杆菌疫苗组合物、优选为冷冻干燥后的重构组合物，该组合物包含属于MTBVAC菌株的分离的微生物，该分离的微生物具有：i)通过使Rv0757基因进行基因缺失而失活的PhoP-表型；和ii)防止PDIM产生(PDIM-表型)的第二个基因Rv2930(fadD26)的缺失，其中所述组合物的特征在于每mL该组合物包含以下组分(按百分比计算)：
Figure BDA0002731985410000011
附图说明
当结合附图考虑时，通过本发明的以下详细描述，本发明的其他目的、优势和新颖的特征将变得显而易见。
图1.SO2菌株在Middlebrook 7H9培养基和合成Sauton培养基中的生长。培养阶段1和培养阶段2的OD和Cfu/mL结果；
图2示出了Sauton、SD和SDG培养基中MTBVAC培养物的OD结果；
图3示出了表15中认定的批或批次在2℃-8℃和-30℃的稳定性结果；
图4.在小鼠中的防护。图中的数据表示两个独立实验的集合(n＝12只小鼠/组)。所有数据表示为平均值±SEM。保护指数定义为未接种组和接种组之间的细菌载量之差(以十进制对数表示)；
图5.小鼠的免疫原性。图中的数据来自一个实验(n＝5只小鼠/组)。所有数据均为表示为平均值±SEM。SFC：斑点形成菌落；
图6.用逐步上升的MTBVAC剂量对来自TB流行地区的新生儿进行疫苗接种主要导致Th1(IFN-γ、IL-2或TNF-α)抗原特异性CD4 T细胞应答。在第70天时，2.5×105CFU的最高MTBVAC剂量诱导了最大程度的抗原特异性CD4 T细胞细胞因子应答。2.5×103CFU的最低MTBVAC剂量产生最低免疫原性；
图7.用逐步上升的MTBVAC剂量对来自TB流行地区的新生儿进行疫苗接种导致在接种后第180天和第360天产生了QFT分析定量值的剂量-应答曲线。根据Andrews JR,NemesE,Tameris M et al.Serial QuantiFERON testing and tuberculosis disease riskamong young children:an observational cohort study.Lancet Respir Med,(2017)，根据发展为活动性TB的风险，将QFT值分为三个不同区域；
图8.豚鼠的工作种子批中没有毒性分枝杆菌；
图9.主种子批和工作种子批中的稳定性研究；
图10.在-15℃至-30℃(A)下和在+2℃至+8℃(B)下储存3×103cfu/0.1mL-17×103cfu/0.1mL剂量、3×104cfu/0.1mL-17×104cfu/0.1mL剂量和3×106cfu/0.1mL-17×106cfu/0.1mL剂量的MTBVAC疫苗的长期稳定性研究；
图11.从SO2到MTBVAC的逐步构建。最终的双重缺失菌株在表型上与原型SO2(基于phoP的PDIM缺陷)相同，但为遗传稳定性提供了更大的保证。浅蓝色表示phoP基因，fadD26基因显示为浅橙色，抗生素抗性盒kmr和hygr为品红色，黄色三角形表示位于Ωhygr两侧的res位点或缺失区域的残余res位点；res位点不包含任何外源编码序列。
具体实施方式
MTBVAC菌株的定义和详细描述
“MTBVAC菌株”将用于指这样的分离的结核分枝杆菌菌株微生物：已使结核分枝杆菌MT103临床菌株中的Rv0757基因缺失并且另外包含Rv2930(fadD26)基因的缺失。因此，所述菌株呈现两个源自结核分枝杆菌的独立突变，独立的phoP缺失不影响源自所述基因失活的疫苗的性质。因此，“MTBVAC菌株”的特征在于PDIM的产生通过Rv2930(fadD26)基因的缺失而失活，因此该菌株的特征在于其包括Rv2930和Rv0757基因的缺失。
因此，应指出，MTBVAC菌株构建为包含两个独立的不可逆的不含抗生素标记的缺失突变，满足了将活分枝杆菌疫苗推进到I期临床评估的首个日内瓦共识安全要求(Genevaconsensus safety requirement)。MTBVAC菌株经过基因工程改造，在表型和功能上均类似于其原型SO2。通过插入卡那霉素抗性盒(kanamycin resistance cassette，kmr)(Mt103phoP::kmr)使SO2成为标记的Mt103 phoP突变体(见图11)，除工程改造的PhoP缺陷表型外，SO2在PDIM生物合成中有获得性自发性损失(参见Dessislava Marinova,JesusGonzalo-Asensio,Nacho Aguilo&Carlos Martin(2017)MTBVAC from discovery toclinical trials in tuberculosis-endemic countries,Expert Review of Vaccines,16:6,565-576,DOI:10.1080/14760584.2017.1324303一文中的图2)，一种在结核分枝杆菌中被描述为常见的过程，这是重复实验室继代培养和操作实践的结果。
如图11所示，按照逐步方法构建MTBVAC菌株。首先，在SO2中引入fadD26中未标记的缺失，产生SO2ΔfadD26。结果是，SO2ΔfadD26中phoP的未标记的缺失产生了MTBVAC菌株。为了构建MTBVAC，使用了带有缺失的fadD26和phoP基因的自杀质粒，该自杀质粒的缺失区被两侧是res位点(res::hygr::res)的潮霉素抗性标记(hygromycin resistancemarker，hygr)所打断。识别res位点后，来自大肠杆菌(E.coli)的γδ-解离酶催化切除抗生素抗性盒，此后留下了残留的res“疤痕(scar)”的拷贝来代替缺失(Malaga,et al.2003)；res位点不包含任何外源编码序列。最终的构建体SO2ΔfadD26::ΔphoP被命名为MTBVAC菌株。在MTBVAC菌株中，在fadD26中引入未标记的缺失确保了PDIM生物合成在遗传上的稳定消除。基因fadD26中产生的缺失大小包括1,511bp，并导致PDIM生物合成中该必需基因完全失活。野生型基因为1,752bp(583个氨基酸)。在γδ-解离酶切除hygr的过程中留下了残留的res疤痕。该缺失的结果是，PDIM基因座中接下来的五个基因(fadD26-ppsE)的转录水平降低，并且完全消除MTBVAC中的PDIM生物合成消除(Ainhoa Arbués博士论文)。结核分枝杆菌中的PDIM基因座包含13个基因，这些基因簇集在染色体的一个50kb片段上。该区域是结核分枝杆菌基因组中最大的操纵子(Camacho,et al.2001；Camacho,et al.1999；Cox,etal.1999；Trivedi,et al.2005)。
在结核分枝杆菌中，phoP(744bp)位于phoR(1458bp)的上游，并且这两个基因都沿相同方向转录。用残留的res位点替换phoP基因内产生的94bp缺失需要多个STOP密码子的存在，另一方面，这会导致MTBVAC中PhoP的DNA结合结构域(相当于92个氨基酸)翻译缺失。
MTBVAC中phoP基因和fadD26基因的缺失可以使用RT-PCR存在/不存在方法来检测/定位。该方法使用基于荧光的PCR试剂(引物和探针)来指示ΔphoP基因和ΔfadD26基因中res位点的存在和野生型phoP和fadD26基因的不存在。
在下文中，我们提供：Mt103中fadD26基因的开放阅读框(Open-reading frame，ORF)序列a)和MTBVAC(ΔfadD26)中的开放阅读框(ORF)序列b)；以及Mt103中phoP基因的ORF序列c)和MTBVAC(ΔphoP)中的ORF序列d)。与fadD26(a)和phoP(c)中缺失的基因区域相对应的核苷酸序列以小写字母表示；残留的res位点以灰色突出显示。对于基于荧光的PCR检测方法，每个目标的引物都加有下划线，并且Taq-man探针用粗体显示。
a)Mt103中的野生型fadD26基因
SEQ ID NO 1.
Figure BDA0002731985410000031
b)MTBVAC中的ΔfadD26
SEQ ID NO 2.
Figure BDA0002731985410000041
c)Mt103中的野生型phoP基因
SEQ ID NO 3.
Figure BDA0002731985410000042
d)MTBVAC中的ΔphoP
SEQ ID NO 4.
Figure BDA0002731985410000043
SO2具有彻底和完整的临床前历史，证明了在相关动物模型中与BCG相比具有稳健的安全性和减毒曲线以及有希望的疗效。幸运的是，大多数这些临床前研究已经用MTBVAC进行了复制，以证实双重减毒PhoP-PDIM-表型的功能特征和生物学活性。血脂曲线分析已经表明，MTBVAC及其原型SO2在表型上相当，缺少DAT、PAT和PDIM。
另一方面，在本发明内容的下文中，BCG将用于指目前的疫苗，该疫苗自1921年以来用于抗结核。这是一种源自牛分枝杆菌(M.bovis)的减毒活疫苗，该疫苗在实验室继代培养后失去了其毒力，并且现在我们知道该疫苗有超过一百个缺失的基因(Behr,M.A.BCG—different strains,different vaccines Lancet Infect Dis 2002,2(2),86-92)。
在本发明内容的下文中，H37Rv将用于指已测序的致病性结核分枝杆菌菌株，Cole等人将这些基因称为Rv(Ref Cole et al 1998Deciphering the biology ofM.tuberculosis from the complete genome sequence.Nature 393:537-544)。
在本发明内容的下文中，MT103将用于指结核分枝杆菌临床分离株(Camacho etal.1999Identification of a virulence gene cluster of M.tuberculosis bysignature-tagged transposon mutagenesis.Mol Microbiol 34:257-267)。
在本发明内容的下文中，PDIM菌株将被用于指不能合成与结核分枝杆菌的致病性有关的重要脂质phthiocerol dimycocerosate的结核分枝杆菌复合物的菌株。
在本发明内容的下文中，SO2+pSO5将用于指结核分枝杆菌SO2菌株，其中通过用分枝杆菌的phoP基因转化复制质粒使Rv0757中的突变得到Rv0757基因的补充，但是该菌株不能补充PDIM合成，该菌株的表型为PhoP+PDIM-。
在本发明内容的下文中，结核分枝杆菌phoP-将用于指已经通过EcoRV-BspEI位点之间的Rv0757基因缺失而失活的结核分枝杆菌菌株，其表型为phoP-PDIM+。
从本发明内容的下文中，Rv2930(fadD26)将用于指位于负责phthioceroldimycocerosate(PDIM)的合成(Camacho et al.)的操纵子的起始处的基因，并且在结核分枝杆菌中消除该基因赋予了稳定的PDIM-表型。
描述
在人类中使用疫苗预防TB已被证明是近一个世纪以来的巨大挑战。源自牛分枝杆菌的BCG目前是唯一许可使用的TB疫苗，也是世界上使用最广泛的疫苗。自1920年代初以来，BCG疫苗的开发和全面施用代表了一项重大进步，并有望从世界上根除TB。然而，这些最初的承诺没有实现，并且从大量功效试验的结果来看，很明显，目前形式的BCG疫苗在控制疾病方面用途有限，尤其是在疾病流行的第三世界区域的成人中以呼吸道形式使用(Fine,P.E.Variation in protection by BCG:implications of and for heterologousimmunity.Lancet 1995,346(8986),1339-1345)。有了对结核分枝杆菌的毒力以及导致保护性免疫力生成的免疫反应模型的更多了解，就有可能开发出比BCG更好的疫苗。在宿主接种BCG疫苗时观察到保护水平达到更高的结果表明，活力和持久性是结核病疫苗成功所需的基本特性。从这个意义上讲，在US8287886B2中教导了具有灭活的Rv0757(phoP)基因和防止PDIM合成的第二独立的phoP突变的结核分枝杆菌菌株的使用提供了一种原型单剂量活疫苗，该疫苗在免疫受损的SCID小鼠中比BCG减毒得多，在小鼠中提供的保护水平与BCG所赋予的保护水平相当，并且在豚鼠中的保护水平高于BCG。
phoP基因与phoR一起构成了两组分体系的一部分，该体系表现出与控制细胞内病原体中关键毒力基因转录的其他两组分体系高度的相似性。该体系还控制许多其他不直接与毒力有关的基因的表达(Groisman,E.A.The pleiotropic two-component regulatorysystem PhoP-PhoQ.J Bacteriol 2001,183(6),1835-1842)。从本质上讲，消除毒力基因似乎并不是使结核分枝杆菌减毒的唯一方法。已经示出，不能从头合成泛酸的泛酸营养缺陷型结核分枝杆菌突变体在SCID小鼠中持续存在，而没有设法引起疾病(Sambandamurthy,V.K.,Wang,X.,Chen,B.et al.A pantothenate auxotroph of M.tuberculosis ishighly attenuated and protects mice against tuberculosis.Nat Med 2002,8(10),1171-1174)。单个亮氨酸营养缺陷型也得到强烈减毒，并且不能在SCID小鼠体内复制(Hondalus,M.K.,Bardarov,S.,Russell,R.,Chan,J.,Jacobs,W.R.,Jr.&Bloom,B.R.Attenuation of and protection induced by a leucine auxotroph ofM.tuberculosis.Infect Immun 2000,68(5),2888-2898)。因此，现在普遍接受这样的原理：基于结核分枝杆菌的疫苗株可以成功减毒，同时保留在牛分枝杆菌BCG中被抑制的基因。
在US8287886B2之前，对比BCG更有效的疫苗的研究基于的观念是：BCG的毒力丧失本身是导致其缺乏完全保护功效的一个因素(Behr,M.A.,Wilson,M.A.,Gill,W.P.etal.Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNAmicroarray.Science 1999,284(5419),1520-1523)。因此，有理由认为，毒性较低的新型减毒结核分枝杆菌突变体可以更有效地用作疫苗。在这方面，并且尽管已经表明，结核分枝杆菌自然感染和BCG接种在引起对结核的保护性免疫力的能力上没有差异(Sampson,S.L.,Dascher,C.C.,Sambandamurthy,V.K.et al.Protection elicited by a double leucineand pantothenate auxotroph of M.tuberculosis in guinea pigs.Infect Immun2004,72(5),3031-3037)，与未感染的个体相比，感染结核分枝杆菌的具有潜伏性结核的患者在再感染后的进行性结核的风险降低了79％(Andrews 2012.CID 54:784-790)。此外，考虑到这些个体中的大多数可能已经接种了BCG的事实，这表明，实际上，BCG和结核分枝杆菌所提供的保护性免疫力可能有所不同。这就提出了问题，即是否可以通过使结核分枝杆菌合理减毒来改善BCG。在这种情况下，在US8287886B2中描述的具有在PhoP蛋白合成和PDIM合成中的2个独立突变的组合的结核分枝杆菌突变菌株比BCG在SCID小鼠模型中更加减毒，即使以为BCG10倍的剂量使用，并且在豚鼠模型中的保护程度比BCG更高，也是如此，这观察结果被认为具有特殊意义。
US8287886B2中描述的结核分枝杆菌突变菌株的特征在于是属于分枝杆菌属的分离的微生物，其包括Rv 0757(phoP)基因的失活和防止PDIM(phthioceroldimycocerosate)产生的第二基因的失活。特别地，US8287886B2中描述的这种结核分枝杆菌突变菌株(SO2菌株)的特征在于，其包括Rv 0757(phoP)基因的失活和防止PDIM产生的phoP的第二独立突变。
有趣的是，如US8287886B2中所述，在接种了50倍豚鼠疫苗剂量的六只该物种中，SO2菌株没有被认为具有毒性。另外，研究了该六只豚鼠的存活率和体重曲线。在实验期间，在6个月后，存活率为100％。US8287886B2的图12示出了在6个月内在所有动物中观察到体重增加，显示出SO2菌株无毒性(Y＝重量(克数)，X＝感染周数)。另外，在US8287886B2中也研究了结核分枝杆菌感染后接种豚鼠的存活率(图13)。对豚鼠的保护研究追踪豚鼠在300天后的存活率。测量了未接种的豚鼠(盐水)和接种了当前BCG疫苗、结核分枝杆菌phoP-菌株或SO2菌株(phoP-突变株和PDIM-突变株)的豚鼠的存活率曲线。皮下接种后，用高剂量的结核分枝杆菌强毒株(H37Rv)感染动物，以研究存活率。60天后，没有接种(盐水)的6只豚鼠已经死亡，而接种SO2菌株(phoP-和BCG)的组存活了下来。感染300天后，接种了BCG和phoP-的三只豚鼠死亡，相比之下接种SO2菌株的组中只有一只死亡，这表明在豚鼠模型中，phoP突变体的保护与当前疫苗BCG的保护相似，而接种SO2菌株(phoP-和PDIM-双重突变体)的保护更好。此外，US8287886B2的图14示出了图13中追踪的豚鼠在400天后的存活。60天后6只未接种的豚鼠已经死亡。感染400天后，接种SO2菌株的组中有三只豚鼠存活(图14a)，而接种BCG(图14a和图14b)和phoP-(图14b)的豚鼠只有1只存活，再次表明在实验400天后phoP突变体的保护与BCG的保护类似，而用SO2菌株(phoP-和PDIM-双重突变体)进行接种保护更好。
总之，US8287886B2中描述的结果显示，根据许多标准，具有PhoP-PDIM-表型的SO2菌株以及因此属于分枝杆菌属(尤其是来自结核分枝杆菌复合物)的微生物是比BCG更有效的疫苗。其在SCID小鼠中比BCG减毒得更多，其为小鼠提供至少与BCG一样好的保护性免疫力，并产生更强的细胞免疫应答。另外，在豚鼠中进行的用高剂量H37Rv抗感染的保护实验中，在BCG仅达到33％的存活率的条件下，具有表型PDIM-PhoP-的菌株导致豚鼠的存活率为100％。该保护作用与减少疾病的严重程度和细菌载量的减少有关。
根据这些结果，本发明的作者着手开发了包含MTBVAC菌株的减毒活结核分枝杆菌疫苗，该MTBVAC菌株以冻干颗粒形式存在于3mL琥珀玻璃瓶中。如已经表明的，MTBVAC菌株构建为包含两个独立的不可逆的不含抗生素标记的缺失突变，满足了首个日内瓦共识安全要求。从这个意义上讲，MTBVAC菌株经过基因工程改造，在表型和功能上均类似于其原型 SO2。在MTBVAC菌株中，在fadD26中引入未标记的缺失确保了PDIM生物合成的在遗传上稳定消除。值得注意的是，SO2具有彻底和完整的临床前历史，证明了在相关动物模型中与BCG相比具有强健的安全性和减毒曲线以及有希望的疗效。如已经表明的，大多数这些临床前研究已经用MTBVAC进行了复制，以证实双重减毒PhoP-/PDIM-缺陷表型的功能特征和生物学活性。
基于以上所述，本发明的作者制备了包含MTBVAC菌株的疫苗。与BCG类似，通过使用皮内途径向新生个体施用一剂0.05mL的所述疫苗。因此，本发明作者的第一个目的是得到在新生儿中有用的、优选为冻干的疫苗，用于治疗或防止该特定年龄组群中的TB。考虑到这一点，他们在新生儿中进行了本申请实施例2和实施例3中所述的实验，其中，作为这些实验的结果，得出的结论是，以2.5×104或2.5×105或更多CFU估计剂量接种MTBVAC在TB流行地区的新生儿中是产生免疫反应的。
应当注意，在本申请中，术语“新生儿”被理解为初生儿(或其他哺乳动物)或小于四周大的婴儿。
根据上述结果，我们目前正在对MTBVAC在健康的未接种过BCG、未暴露于HIV的南非新生个体中的安全性和免疫原性进行2a阶段的随机对照剂量限定试验(RandomisedControlled Dose-defining Trial)。该研究将在没有已知家庭成员暴露于结核分枝杆菌的99例未暴露于HIV的、未接种过BCG的新生个体中进行。估计的研究持续时间(第一位参与者接种疫苗至完成数据收集)将大约为36个月。在该研究中，将以以下三种剂量水平对新生儿施用MTBVAC：1.5×104/0.05ml-8.5×104CFU/0.05ml、1.5×105/0.05ml-8.5×105CFU/0.05ml和1.5×106/0.05ml-8.5×106CFU/0.05ml。阳性对照是BCG疫苗。在研究第0天，参与者将接受皮内施用单剂量的MTBVAC或BCG。该研究的目的如下：
首要的：
·为了评估与BCG疫苗相比，以逐步上升的剂量水平的MTBVAC在健康的未接种过BCG、未暴露于HIV的南非新生个体中的安全性和反应原性。
·为了评估以逐步上升的剂量水平的MTBVAC在健康的未接种过BCG、未暴露于HIV的南非新生个体中的免疫原性。
次要的：
·为了评估接受逐步上升的剂量水平的MTBVAC的新生儿的QuantiFERON-TB GoldPlus(QFT)转化率。
探索：
·为了评估由MTBVAC和BCG疫苗诱导的主要组织相容性(Majorhistocompatibility，MHC)限制性T细胞应答的差异。
·为了评估由MTBVAC和BCG疫苗诱导的供体不受限制的T细胞应答的差异。
考虑到以下事实：实施例2和实施例3已经表明，以2.5×104或2.5×105或更多CFU的估计剂量接种MTBVAC在来自TB流行地区的新生儿中是产生免疫反应的，并且MTBVAC疫苗的反应原性明显低于BCG疫苗产生的反应原性，似乎以1.5×104/0.05ml-8.5×104CFU/0.05ml、1.5×105/0.05ml-8.5×105CFU/0.05ml或1.5×106/0.05ml-8.5×106CFU/0.05ml的剂量对新生儿施用MTBVAC有用地作为具有感染结核分枝杆菌风险的新生儿或具有发展为结核病风险的新生儿的预防剂是合理的。
因此，在第一个方面，本发明涉及包含分离的微生物的组合物，该微生物属于结核分枝杆菌复合物，优选为结核分枝杆菌临床分离株，更优选为结核分枝杆菌临床分离株，其特征在于，其包含通过使Rv0757基因进行基因缺失而失活的PhoP-表型和防止PDIM产生(PDIM-表型)的第二基因Rv2930(fadD26)的缺失，更优选地，所述微生物是MTBVAC菌株，其中该组合物包含至少1.5×104cfu/0.05ml或更多的分离的微生物。优选地，组合物包含1.5×104cfu/0.05ml至8.5×106cfu/0.05ml的分离的微生物。更优选地，组合物包含1.5×104/0.05ml-8.5×104CFU/0.05ml、1.5×105/0.05ml-8.5×105CFU/0.05ml或1.5×106/0.05ml-8.5×106CFU/0.05ml的分离的微生物。
在本发明的第二方面，施用第一个方面的组合物，用于具有感染结核分枝杆菌风险或具有发展为结核病风险的新生儿的预防，抵抗由结核分枝杆菌复合物、优选地结核分枝杆菌儿引起的感染；或用于具有发展为结核病和患有潜伏性结核感染风险的人类新生儿中的预防或防护以抵抗与由结核分枝杆菌复合物、优选地结核分枝杆菌引起的活动型疾病相关的临床症状的发展中的用途；或用作治疗新生儿中感染潜伏性和/或活动性TB结核的患者的辅助剂的用途；或用于在具有感染结核分枝杆菌风险的人类新生儿中的预防性治疗或防护性治疗中进行复种、加强接种或加强剂量以抵抗由结核分枝杆菌复合物、优选地结核分枝杆菌引起的感染的用途；或用作防止除由结核分枝杆菌引起的结核病以外的任何无关感染、包括新生儿中的非结核分枝杆菌感染的辅助剂的用途。更优选地，所述组合物经由皮内途径施用于新生儿。
除上述内容外，还需要注意的是，我们目前正在对具有或不具有潜伏性结核感染(Latent tuberculosis infection，LTBI)的成人进行双盲的、随机的、BCG受控的、剂量递增的安全性和免疫原性研究，如全血干扰素TB Gold Plus(QFT)分析所测量的。这是在具有或不具有LTBI的健康成人中进行的1b/2a期双盲的、随机的、BCG受控的、剂量递增的安全性和免疫原性研究。所有参与者都将在婴儿期接受过BCG接种。研究产品是四个剂量的MTBVAC：5×103CFU、5×104CFU、5×105CFU和5×106CFU。阳性对照为BCG(5×105CFU)。
符合纳入/排除标准的参与者将随机分组于研究组中，在研究第0天接受皮内施用的单剂量的MTBVAC或BCG复种。该研究将在南非的一个地点进行。招募参加者进入八个组中的一组，随后是安全性和免疫原性终点贯穿研究182天。估计完成招募的时间大约为9个月。
1-8组将包括QFT阴性(1-4组)参与者和QFT阳性(5-8组)参与者。参与者将在每个组中随机接受MTBVAC或BCG。
在此基础上，在第三个方面，本发明涉及包含分离的微生物的组合物，该微生物属于结核分枝杆菌复合物，优选结核分枝杆菌临床分离株，更优选为结核分枝杆菌临床分离株MT103，其特征在于，其包含通过使Rv0757基因进行基因缺失而失活的PhoP-表型和防止PDIM产生(PDIM-表型)的第二基因Rv2930(fadD26)的缺失，更优选地，所述微生物是MTBVAC菌株，其中该组合物包含至少3×103cfu/0.1ml或更多的分离的微生物。优选地，该组合物包含3×103cfu/0.1ml至17×106cfu/0.1ml的分离的微生物。更优选地，该组合物包含3×103cfu/0.1ml-17×103cfu/0.1ml、或3×104cfu/0.1ml-17×104cfu/0.1ml、或3×105cfu/0.1ml-17×105cfu/0.1ml、或3×106cfu/0.1ml-17×106cfu/0.1ml的分离的微生物。
在本发明的第四个方面，施用第三个方面的组合物用于具有感染结核分枝杆菌风险的人类非新生儿、例如儿童、青少年和成人中的预防或防护(包括加强接种)以抵抗由结核分枝杆菌复合物、优选地结核分枝杆菌引起的感染。更优选地，所述组合物经由皮内途径施用。
在本发明的第五个方面，施用第三个方面的组合物用于具有发展为结核病和患有潜伏性结核感染风险的人类非新生儿、例如儿童、青少年和成人中的预防或防护以抵抗与由结核分枝杆菌复合物、优选地结核分枝杆菌引起的活动型疾病相关的临床症状的发展。更优选地，所述组合物经由皮内途径施用。
在本发明的第六个方面，施用第三个方面的组合物用作治疗人类新生儿和例如儿童、青少年和成人的人类非新生儿中感染潜伏性和/或活动性TB的患者的辅助剂。更优选地，所述组合物经由皮内途径施用。
在本发明的第七个方面，施用第三个方面的组合物用于具有感染结核分枝杆菌风险的人类非新生儿、例如儿童、青少年和成人中的预防性治疗或防护性治疗以抵抗由结核分枝杆菌复合物、优选地结核分枝杆菌引起的感染。从这个意义上讲，应注意的是，在初次免疫后，加强注射或加强剂量是对免疫抗原的再次暴露。其旨在于针对该抗原的记忆力随时间下降之后，将针对该抗原的免疫力提高至保护水平。
另一方面，为了实现：提供一致的结果的、使用MTBVAC菌株实施本发明的任何上述方面并将开发过程中冻干后的活力损失最小化的最佳方式；和储存在+2℃至8℃之间保质期至少为2年的产品，本发明的作者进行了大量的研究，以建立用于MTBVAC疫苗的最适合的生产工艺。作为第一近似值，测试了不同的培养基以及不同的稳定剂组成。
生产MTBVAC疫苗的第一个挑战是将其在具有确定组成且没有动物来源组分的培养基中进行培养。因此，使用SO2菌株进行实验。如上所述，已经注意到，MTBVAC菌株经过基因工程改造，在表型和功能上类似于其原型SO2，因此，SO2菌株被认为是适合的建立用于MTBVAC疫苗的最适合的生产工艺的起点。
通过使用SO2菌株，开发并测试了在其组成中不含任何动物来源组分的不同的培养基。一些经过验证的培养基如下：
·Middlebrook 7H9及变体(Media for Tubercle Bacilli,Dubos,R.J.andMiddlebrook,G.American Review of Tuberculosis and Pulmonary Diseases,1947Vol.56No.4pp.334-45ref.15)。
·Sauton合成培养基(Handbook of Microbiological Media,Fourth Edition,Ronald M.Atlas,CRC Press,2010.Page 1540)及变体。
下表详细列出了Sauton培养基和Middlebrook培养基的组成：
表1.
Figure BDA0002731985410000081
/>
Figure BDA0002731985410000091
表2.
Figure BDA0002731985410000092
在Sauton培养基中，其生长与参考培养基(未经更改的Middlebrook培养基，表2)中的生长相似。图1比较了Middlebrook和Sauton培养基的生长曲线。与培养基的组成一致，在这些测试中，开始在实验室规模分析其他变量，例如培养时间、培养传代次数以及生长类型(静态或搅动)(参见表3)。
Figure BDA0002731985410000093
表3.Sauton培养基中结核分枝杆菌SO2的生长
最后，在静态生长条件下选择Sauton合成培养基，因为该培养基有效用于SO2菌株生长。也可能已经选择了非静态生长条件，然而，培养需要在有氧条件下进行。
开发的下一步是研究冻干过程。冻干是生产活疫苗的关键步骤。实现冻干疫苗的稳定性是一个复杂的过程，因为微生物不仅冻干后易受环境因素(例如温度)的影响，而且生长和配制条件也可影响该过程的成功。冻干后活细菌的产量和随后的储存稳定性可能受到诸如冻干周期、稳定剂组成、残留水分以及空气的存在的因素的影响。
在使用SO2的开发阶段，测试了多达11种不同的稳定剂组成。下表示出了测试的稳定剂组成：
表4
Figure BDA0002731985410000101
在稳定剂研究中，还测试了不同的制剂，除了组成之外，还改变了稳定剂和培养基的比例以及冻干的体积。在所有测试中，测定了冻干产品的活力损失和30天后在37℃下的稳定性。作为选择用于将来测试的稳定剂的标准，在37℃下进行加速稳定性测试后，确定活力损失极限为90％和/或最大损失为80％(参见表5中的结果)。
Figure BDA0002731985410000111
表5.使用不同的稳定剂的SO2的冻干。
上述初步试验之后，得出的结论是，有必要向培养基中添加稳定剂来进行冻干，因为没有稳定剂下冻干损失大于99％，并且满足冻干损失的技术参数和在37℃下的加速稳定性的技术参数的最好的稳定剂是GSA(谷氨酸钠和蔗糖)。
得出以上结论后，以冷冻干燥的预模板(Pre-master)种子批的形式接收了MTBVAC菌株，并且不久之后，我们开始了该特定菌株的细胞培养。对于MTBVAC菌株的生长，首先使用组分与亲代菌株SO2的生长研究中所用的组分相同的第一Sauton培养基(参见表1)。然而，出乎意料的是，在MTBVAC的情况下，在Sauton合成培养基中观察到的生长低于在SO2菌株中观察到的生长。另外，还检测到MTBVAC菌株在扩增阶段的问题。为了解决这些问题，进行了测试，在Sauton培养基组成中添加和消除组分。这种更改包括添加或消除补充剂，例如葡萄糖、硫酸锌、生物素、甘油和聚山梨酯。
用硫酸锌和生物素富集Sauton合成培养基不能提供良好的结果，并且也没有观察到MTBVAC的生长。在富含葡萄糖、聚山梨酯和甘油的情况下，结果是令人满意的，并且获得了MTBVAC的充分生长。
这些生长研究的结果是，开发了SD培养基和SDG培养基，并在这些培养基中培养了MTBVAC培养物。在SD培养基和SDG培养基中MTBVAC的生长均良好，但在SDG培养基中进行连续传代后一些培养物停止了，因此SD培养基是选择用于扩增传代的培养基。图2示出了Sauton培养基、SD培养基和SDG培养基中MTBVAC培养物的OD结果。
然而，当从冻干或冷冻干燥的模板种子批的小瓶中开始MTBVAC菌株的培养时，观察到在SD培养基中不能开始生长，因此对其组成进行更改并且开发了种子培养基。作为这些研究的结论，并且为了未来的试用和工业测试，选择了种子培养基作为开始培养的工具，选择了SD培养基作为扩增传代的工具，并选择了SDG培养基作为冻干前的大量培养的工具。另外，重要的是要注意，SD培养基的组成与稳定剂的组合影响冻干过程和片剂的外观，因此冻干过程将仅在SDG培养基中进行。
这里我们提供种子培养基、SD培养基和SDG培养基的组成。
表6
Figure BDA0002731985410000112
Figure BDA0002731985410000121
从这个意义上讲，以下三个表格显示了五批MTBVAC 2.5×105的工业规模生产的结果，这些结果证明了与研究中开发的方法所获得的结果的一致性。
表7：由种子培养基中冻干的工作种子库培养MTBVAC
Figure BDA0002731985410000122
表8：以前面的传代(表7)在SD培养基中培养MTBVAC
Figure BDA0002731985410000123
表9：以前面的传代(表8)在SD培养基中培养MTBVAC(表8)
Figure BDA0002731985410000124
表10：以前面的传代(表9)在SDG培养基中培养MTBVAC
Figure BDA0002731985410000125
/>
Figure BDA0002731985410000131
在先前指出的用SO2菌株开发的研究中，我们得出结论，在冻干过程中，必须使用稳定剂来减少活菌计数的损失并提高冻干产品的稳定性。为了开发MTBVAC，使用了在研究中选择的与SO2相同的稳定剂。目的是得到浓度范围为3×103cfu/0.1ml至17×106cfu/0.1ml、优选范围为3×103cfu/0.1ml-17×103cfu/0.1ml、或3×104cfu/0.1ml-17×104cfu/0.1ml、或3×105cfu/0.1ml-17×105cfu/0.1ml或3×106cfu/0.1ml-17×106cfu/0.1ml的MTBVAC菌株的冻干疫苗，在开发过程中将冻干后的活力损失降至最低提供了一致的结果和保质期为在2℃-8℃下储存至少2年的产物。
在MTBVAC的开发阶段，测试了多达7种不同的稳定剂组成。下表11示出了测试的稳定剂组成：
表11
Figure BDA0002731985410000132
下表12至表13示出了MTBVAC实验室规模冻干试验的加速稳定性研究中在活力损失百分比方面的结果。该表示出了冻干培养基与稳定剂的组合在冻干过程中的影响。从这些研究中得出结论，对于MTBVAC的冻干，有必要添加稳定剂，并且GSA稳定剂是为所测试的参数提供最佳结果的稳定剂。
Figure BDA0002731985410000141
表12.在具有不同的稳定剂的SD培养基中生长的MTBVAC的冻干。加速稳定性研究中的活力损失百分比。
Figure BDA0002731985410000142
表13.在具有不同稳定剂的SDG培养基中生长的MTBVAC的冻干物。加速稳定性研究中的活力损失百分比。
最后，下表示出了4批MTBVAC的冻干结果：
表14.
Figure BDA0002731985410000143
图3示出了上表14中认定的批或批次在2℃-8℃和-30℃之间的稳定性结果；此外，下表15提供了在试验工厂和工业厂中表11的培养物(SDG培养基)的平行冻干的进一步结果。
表15.
Figure BDA0002731985410000144
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Figure BDA0002731985410000151
所有上述结果都是通过将生长有MTBVAC菌株、优选地生长在1×108cfu/mL至5×108cfu/mL范围内的MTBVAC菌株的SDG培养基冻干而得到的。应当指出，为了进行所述冻干，添加了谷氨酸钠和蔗糖(GSA)，优选地以10g/L-40g/L谷氨酸钠和100g/L-400g/L蔗糖的浓度添加。
因此，本文描述了可用于制备基于活MTBVAC菌株的药物产品的特定制剂和方法，如下文进一步描述的。本发明的制剂包含以下详细描述的任何组合物本身或由以下详细描述的任何组合物组成，并且这些可以用于培养MTBVAC菌株。组合物详细如下：
Figure BDA0002731985410000152
因此，本发明的第八个方面涉及包含如上表征的种子培养基或由如上表征的种子培养基组成的组合物。
本发明的第九个方面涉及包含如上表征的SD培养基或由如上表征的SD培养基组成的组合物。
本发明的第十个方面涉及包含如上表征的SDG培养基或由如上表征的SDG培养基组成的组合物。
本发明的第十一方面涉及如上表征的种子培养基、SD培养基或SDG培养基中的任何培养基，其中所述培养基进一步包含在其中生长、优选地在1×108cfu/mL至5×108cfu/mL范围内的MTBVAC菌株。
本发明的十二个方面涉及如上表征的任何种子培养基、SD培养基或SDG培养基中的任何培养基在有氧条件下用于培养或扩增MTBVAC菌株的用途。从这个意义上讲，优选地，选择种子培养基作为开始MTBVAC菌株培养的工具，选择SD培养基作为扩增传代的工具，并选择SDG培养基作为冻干前的大量培养的工具。在本发明的第十二个方面的特别优选的实施方式中，本发明涉及用于生产即时冷冻干燥的减毒活结核分枝杆菌疫苗组合物的方法，该组合物包含属于结核分枝杆菌菌株、很优选的是MTBVAC菌株的分离的微生物，该分离的微生物具有：i)通过使Rv0757基因进行基因缺失而失活的PhoP-表型；和ii)防止PDIM产生(PDIM-表型)的第二基因Rv2930(fadD26)的缺失，其中该方法包括开始MTBVAC菌株的培养，并通过使用合适的细胞培养基来扩展或扩增所述细菌，其中该方法的特征在于，使用SDG培养基用于冻干前的大量培养。优选地，该方法包括在种子培养基中开始培养结核分枝杆菌菌株，并通过使用SD培养基来扩展或扩增所述细菌，并且使用SDG培养基用于冻干前的大量培养。更优选地，该方法进一步包括通过在冻干步骤之前将蔗糖和谷氨酸钠作为稳定剂添加到用于大量培养的SDG培养基中进行冷冻干燥步骤。
另外，已经发现某些组分(例如，特定的稳定剂、填充剂和缓冲剂)在冻干MTBVAC菌株疫苗的制备中是有利的。本发明还涉及重构疫苗，以及采用本文所述组合物的预防性方法和治疗性方法。本发明的组合物和方法进一步描述如下。
特别地，本发明的第十三个方面提供减毒活结核分枝杆菌疫苗组合物，该组合物包含属于结核分枝杆菌菌株的分离的微生物，该分离的微生物具有：i)通过使Rv0757基因进行基因缺失而失活的PhoP-表型；和ii)防止PDIM产生(PDIM-表型)的第二基因Rv2930(fadD26)的缺失，优选地结核分枝杆菌菌株是MTBVAC菌株，其中所述组合物是冷冻干燥的组合物，并且其中所述组合物是通过添加蔗糖和谷氨酸钠作为稳定剂使包含该微生物的培养基冷冻干燥得到的，并且其中培养基是SDG培养基。更优选地，在第十三个方面中，本发明提供减毒活结核分枝杆菌疫苗组合物，该组合物包含属于结核分枝杆菌菌株的分离的微生物，该分离的微生物具有：i)通过使Rv0757基因进行基因缺失而失活的PhoP-表型；和ii)防止PDIM产生(PDIM-表型)的第二基因Rv2930(fadD26)的缺失，其中优选地结核分枝杆菌菌株是MTBVAC菌株，并且其中所述减毒活结核分枝杆菌疫苗组合物是根据本发明的第十二个方面的方法得到的或可得到的。
仍更优选地，本发明提供减毒活结核分枝杆菌疫苗组合物、优先为冷冻干燥后的重构组合物，该组合物包含属于结核分枝杆菌菌株的分离的微生物，该分离的微生物具有：i)通过使Rv0757基因进行基因缺失而失活的PhoP-表型；和ii)防止PDIM产生(PDIM-表型)的第二基因Rv2930(fadD26)的缺失，其中优选地结核分枝杆菌菌株是MTBVAC菌株，并且其中所述组合物的特征在于该组合物每mL包含以下组分或由以下组分组成(按百分比计算)：
Figure BDA0002731985410000161
更优选地，以上段落中提到的减毒活结核分枝杆菌疫苗组合物是冷冻干燥的，或通过将水、优选地注射用无菌水添加到冷冻干燥的组合物中而得到的重构组合物。
在本发明的第十三个方面的优选实施方式或其任何优选的实施方式中，所述组合物的特征在于，该组合物每0.1ml、优选地每0.1ml水包含至少3×103cfu或更多的微生物菌株。优选地，该组合物每0.1ml包含3×104cfu至17×106cfu的分离的微生物菌株。更优选地，该组合物每0.1ml包含3×104cfu至17×104cfu、或每0.1ml包含3×105cfu至17×105cfu、或每0.1ml包含3×106cfu至17×106cfu的分离的微生物菌株。仍更优选地，下表中详细描述了包含1.5×105cfu/0.05ml至8.5×105cfu/0.05ml的MTBVAC菌株的冷冻干燥的MTBVAC疫苗的释放技术参数。
Figure BDA0002731985410000162
/>
Figure BDA0002731985410000171
此外，如本说明书中所示，稳定性数据表明，模板和从预模板种子制备的工作细胞库均是稳定的(见图8)，并且在-15℃至30℃和+2℃至+8℃储存的疫苗MTBVAC在超过24个月是稳定的(参见图3和图10)。
此外，在使用稳定性研究中表明，MTBVAC疫苗一旦重构，在室温下至少稳定8小时。
如本文其他地方进一步详细讨论的，由于活性组分的稳定性和活力，本发明的组合物是特别有利的，这在很大程度上归因于制剂和涉及冻干的制备产品的方法。通常，该方法包括以下步骤：冷冻、一次干燥、二次干燥和停止。下面在实验实施例中进一步详细描述该方法，但是该方法的一个实施例如下。在冷冻步骤中，将冻干机托架预冷至-50℃。装载所有托盘后，将托架在-50℃下保持120分钟。在一次干燥步骤中，将真空设置为25mT，并执行以下升温步骤：以+0.1℃/分钟升温至-40℃的托架温度，保持500分钟；以+0.1℃/分钟升温至-35℃的托架温度，保持500分钟；以+0.1℃/分钟升至-30℃的托架温度，保持500分钟；以+0.1℃/分钟升至-25℃的托架温度，保持800分钟。在二次干燥步骤中，使真空保持在25mT，并且进行这样的升温步骤：以+0.1℃/分钟升至+20℃的托架温度，保持800分钟。如有必要，可以在停止之前将产物再保持在+20℃，25mT最多24小时。在停止步骤中，用0.22μm过滤后的干燥氮气对腔室进行除气，将真空度设置为800mbar(轻度真空)，然后将塞子推入小瓶中。可以用于本发明的替代性冻干循环是本领域众所周知的。因此，本发明的方法可以涉及在例如-70℃至-30℃(例如-60℃至-40℃、或-50℃)冷冻或冷冻至约-70℃至-30℃(例如-60℃至-40℃、或-50℃)。冷冻可以进行约30分钟至240分钟(例如60分钟至120分钟)或更长时间。然后，如本文所述，可以对材料进行一个或多个干燥步骤。在这些步骤中，可以在一段时间内(例如100分钟-1000分钟，例如200分钟-600分钟或300分钟-500分钟)施加真空(例如25mT)，并且可以逐渐改变温度(例如0.1℃/分钟至1.0℃/分钟或0.5℃/分钟)。在一次干燥中，温度可以升高至或大约为例如-30℃至+10℃，例如-20℃至+5℃或-15℃至0℃。而在二次干燥中，温度可以改变为例如+5℃至+35℃，例如10℃至30℃或15℃至20℃。如本领域技术人员所公知的，这些参数(例如，温度、保持时间、升温速率和真空度)可以基于例如得到的结果而改变。
根据本发明的第十四个方面，可以将本发明的第十三个方面的疫苗组合物作为主要的预防剂施用于具有感染结核分枝杆菌风险或具有发展为结核病风险的那些，或者可以用作治疗感染患者的辅助药物。因为这些组合物的菌株是减毒的，所以这些组合物特别适合于向“风险个体”、例如新生个体、儿童、青少年、成人和老人施用。这种疫苗也可用于兽医环境。
本发明的第十四个方面的一个优选的实施方式涉及用于针对由结核引起的症状使个体免疫的MTBVAC疫苗。应当指出，所述疫苗还可以适合于治疗膀胱癌以及用于TB的治疗或预防，或者可以作为载体或佐剂。优选地，针对由yTB引起的症状使个体免疫。
在本发明第十四个方面的一个优选的实施方式中，施用第十三个方面的组合物用于具有感染结核分枝杆菌风险的新生儿中或具有发展为TB病风险的新生儿中的预防，以抵抗与由结核分枝杆菌复合物、优选地结核分枝杆菌引起的感染。更优选地，所述组合物经由皮内途径施用于新生儿。
本发明的第十四个方面的另一个优选的实施方式中，施用第十三个方面的组合物用于具有感染结核分枝杆菌风险的人类非新生儿(例如儿童、青少年和成人)中的预防或防护(包括加强接种)以抵抗由结核分枝杆菌复合物、优选地结核分枝杆菌引起的感染。更优选地，所述组合物经由皮内途径施用。
本发明的第十四个方面的另一个优选的实施方式中，施用第十三个方面的组合物用于具有发展为TB病和患有潜伏性结核感染风险的人类非新生儿(例如儿童、青少年和成人)中的预防或防护，以抵抗与由结核分枝杆菌复合物、优选地结核分枝杆菌引起的活动型疾病相关的临床症状的发展。更优选地，所述组合物经由皮内途径施用。
本发明的第十四个方面的另一个优选的实施方式中，施用第十三个方面的组合物用作治疗人类新生儿和人类非新生儿(例如儿童、青少年和成人)中感染潜伏性和/或活动性TB的患者的辅助剂。更优选地，所述组合物经由皮内途径施用。
本发明的第十四个方面的另一个优选的实施方式中，施用第十三个方面的组合物用于具有感染结核分枝杆菌风险的人类非新生儿(例如儿童、青少年和成人)中的预防性治疗或防护性治疗，以抵抗由结核分枝杆菌复合物、优选地结核分枝杆菌引起的感染。从这个意义上讲，应注意的是，在初次免疫后，加强注射或加强剂量是对免疫抗原的再次暴露。旨在于针对该抗原的记忆力随时间下降之后，将针对该抗原的免疫力提高至保护水平。
在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”及其变体并不意味着为排除其他技术特征、添加剂、组分或步骤。对于本领域技术人员而言，本发明的其他目的、优点和特征将部分地超出说明书的范围，并且本发明是部分地付诸实践。通过本发明的非限制性说明性实施例提供以下实施例和附图。
实施例
实施例1.免疫原性和保护作用与新生小鼠的MTBVAC剂量无关
用25μl含有1个临床剂量的BCG(大约2.5×105)或指定的CFU剂量的MTBVAC对新生C3H小鼠(1-3天大)进行皮内接种。对于BCG组，使用BCG Danish商业小瓶，对应于批次111053F和113033C。在MTBVAC的情况下，使用通过生长有MTBVAC菌株的SDG培养基的冻干物产生的MTBVAC疫苗使动物免疫，以进行所述冻干，以10g/L-40g/L的谷氨酸钠和100g/L-400g/L的蔗糖的浓度添加谷氨酸钠和蔗糖(GSA)。将冻干的制剂重悬。
防护功效研究
接种后八周，用150CFU的结核分枝杆菌菌株H37Rv鼻内攻击小鼠。四周后，处死小鼠，并通过在7H11S固体培养基上进行组织匀浆涂板来确定肺中的细菌负荷。结果如图4所示。
免疫原性研究
接种后八周，处死小鼠并分离脾细胞用于免疫原性评估。在10μg/ml纯化蛋白衍生物(Purified Protein Derivative，PPD)、2μg/ml重叠的ESAT6或CFP10肽、或非抗原(阴性对照)存在下，将一百万个脾细胞孵育24小时。用ELISPOT分析产生干扰素γ(IFNγ)的细胞。结果如图5所示。
结论
在新生小鼠模型中，MTBVAC诱导的PPD、ESAT6或CFP10的保护功效和免疫原性均未显示为剂量依赖性。
实施例2.新生个体(南非)的1B期免疫原性数据
目的：我们试图确定本发明所述的使用MTBVAC疫苗进行新生儿疫苗接种后的免疫原性并表征诱导的免疫应答。
方法：将三十六名未暴露于HIV、未接种过BCG的健康新生个体1：3随机在出生96小时内以2.5×103CFU、2.5×104CFU或2.5×105CFU接受BCG(菌株SSI)或MTBVAC。在BDLSRFortessa(18色，蓝-红-紫-绿配置)上，通过全血细胞内细胞因子染色和流式细胞术在第7天、第28天、第70天测量全血中MTBVAC特异性细胞因子应答。
全血ICS分析说明
在37℃下，立即用BCG、MTBVAC或植物凝集素(Phytohemagglutinin，PHA)刺激或不刺激(Nil)新鲜的全肝素化血液12小时。刺激条件包括将血液量的分为两半[250μL(0.25ml)]，并且仅用Nil、MTBVAC和BCG。刺激7小时后，从所有条件下收集上清液(用于可溶性细胞因子/趋化因子分析)，在-BOC冷冻并储存，运输给赞助商以供进一步分析。上清液去除后，添加布雷菲德菌素A(brefeldin A)用于剩余的全血，并将试管在可编程水浴中再孵育5小时。总共刺激12小时后，水浴将关闭。第二天早晨，添加FACS裂解液以裂解红细胞并固定白细胞。然后将固定的白细胞冷冻，用于随后的细胞内细胞因子染色和流式细胞术。流式细胞术染色和采集将在随后的时间点分批进行。评估了由CD4 T细胞产生特定1型细胞因子和IL-17的频率和模式的测量。已根据SATVI最近进行的研究选择免疫原性的时间点，这些研究表明，婴儿中BCG诱导的T细胞应答的峰值大约在6-10周龄。
结果：用剂量逐步上升的MTBVAC进行疫苗接种主要导致Th1(IFN-γ、IL-2或TNF-α)抗原特异性CD4 T细胞应答。在第70天时，2.5×105CFU的最高MTBVAC剂量诱导了最大程度的抗原特异性CD4 T细胞细胞因子应答。2.5×103CFU的最低MTBVAC剂量时免疫原性最低。结果进一步如图6中所示。
结论：这些数据表明，在来自TB流行地区的新生儿中，以2.5×104或2.5×105或更高的CFU进行MTBVAC接种是会产生免疫反应的。
实施例3.与BCG疫苗SSI做对比，在TB流行地区有成人安全保护的新生个体中使用MTBVAC进行的一项随机的、双盲的、剂量逐步上升的临床试验。
目的：评估在TB流行地区的新生个体中使用3剂MTBVAC对比BCG的安全性和免疫原性。
方法：将十八名HIV-、QuantiFERON(QFT)-、先前接种过BCG的健康成人1：1随机接受MTBVAC(5×105CFU)或BCG SSI。这之后，将三十六名未暴露于HIV、未接种过BCG的健康新生个体1：3随机在出生96小时内以2.5×103CFU、2.5×104CFU或2.5×105CFU接受BCG SSI或MTBVAC。QFT在D180和D360进行，QFT+婴儿(＞0·35IU/mL)涉及异烟肼预防性治疗。
结果：所有成人均经历局部注射部位反应，18名(100％)肿胀，16名(88.9％)发红，10名(55.5％)溃疡。据报告有九个反应为中度，并且有单个肿胀事件严重(35mm)。在D28时未报告SAE。
BCG疫苗SSI的不适用性导致使用MTBVAC以最高剂量对6名婴儿采用开放标签给药。在所有3个组中，有十六名婴儿(44.4％)具有局部反应(一组2例[16.6％]、一组3例[25％]以及另一组11例[91.6％])，均被定为轻度，其中有14名(38.9％)肿胀，5名(13.9％)红斑和9名(25.0％)瘢痕化。未见溃疡。所有组(n＝32/42/40)的系统性AE相似，其中9名等级为中度(n＝3/4/2)，而8名为重度(n＝4/2/2)。尸检证实，有六名婴儿经历了7次无关的SAE，包括因病毒性肺炎引起的无关的死亡。
应注意MTBVAC接受者在D180时的剂量相关的QFT转换为：组1：(n＝3，37.5％)，组2：(n＝6，75％)以及组3：(n＝7，77.8％)，但在7名BCG接收者中为零。如图7所示，看到MTBVAC接受者在D360的QFT阳性情况为：组1中0名(0.0％)，组2中2名(25.0％)以及组3中4名(44.4％)。
结论：3种剂量水平的MTBVAC在南非新生个体中显示是安全的；并且显示出导致瞬时的剂量依赖性QFT转换，这可以是TB流行地区中免疫原性的令人鼓舞的指标。此外，MTBVAC疫苗的反应原性明显低于BCG疫苗产生的反应原性，其中有八分之五(62％)的新生婴儿施用BCG疫苗产生疤痕，而最高剂量的MTBVAC仅在十分之二(20％)的新生婴儿中产生疤痕。
序列表
<110> 萨拉戈萨大学
生物法布里公司
<120> 用作有结核感染风险的患者的预防剂或用作治疗结核感染患者的辅助剂的组合物
<130> 903 926
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1752
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1752)
<223> wild-type fadD26 gene in Mt103
<400> 1
atgccggtga ccgaccgttc agtgccctct ttgctgcaag agagggccga ccagcagcct 60
gacagcactg catatacgta catcgactac ggatccgacc ccaagggatt tgctgacagc 120
ttgacttggt cgcaggtcta cagtcgtgca tgcatcattg ctgaagaact caagttatgc 180
gggttacccg gagatcgagt ggcggtttta gcgccacaag gactggaata tgtccttgca 240
ttcctgggcg cacttcaggc tggatttatc gcggttccgc tgtcaactcc acagtatggc 300
attcacgatg accgcgtttc tgcggtgttg caggattcca agccggtagc cattctcacg 360
acttcgtccg tggtaggcga tgtaacgaaa tacgcagcca gccacgacgg gcagcctgcc 420
ccggtcgtag ttgaggttga tctgcttgat ttggactcgc cgcgacagat gccggctttc 480
tctcgtcagc acaccggggc ggcttatctc caatacacgt ccggatcgac gcgtacgccg 540
gccggagtca ttgtgtcgca cacgaatgtc attgccaatg tgacacaaag tatgtacggc 600
tatttcggcg atcccgcaaa gattccgacc gggactgtgg tgtcgtggct gcctttgtat 660
cacgatatgg gcctgattct cggaatttgc gcaccgctgg tggcccgacg ccgcgcgatg 720
ttgatgagcc caatgtcatt tttgcgccgt ccggcccgct ggatgcaact gcttgccacc 780
agcggccggt gcttttctgc ggcaccgaat ttcgccttcg agctggccgt gcgcagaaca 840
tctgaccagg acatggcggg gctcgacctg cgcgacgtgg tcggcatcgt cagtggcagt 900
gagcgaatcc atgtggcaac cgtgcggcgg ttcatcgagc ggttcgcgcc gtacaatctc 960
agccccaccg cgatacggcc gtcgtacggg ctcgcggaag cgaccttata tgtggcagct 1020
cccgaagccg gcgccgcgcc caagacggtc cgttttgact acgagcagct gaccgccggg 1080
caggctcggc cctgcggaac cgatgggtcg gtcggcaccg aactgatcag ctacggctcc 1140
cccgacccat cgtctgtgcg aatcgtcaac ccggagacca tggttgagaa tccgcctgga 1200
gtggtcggtg agatctgggt gcatggcgac cacgtgacta tggggtattg gcagaagccg 1260
aagcagaccg cgcaggtctt cgacgccaag ctggtcgatc ccgcgccggc agccccggag 1320
gggccgtggc tgcgcaccgg cgacctgggc gtcatttccg atggtgagct gttcatcatg 1380
ggccgcatca aagacctgct catcgtggac gggcgcaacc actaccccga cgacatcgag 1440
gcaacgatcc aggagatcac cggtggacgg gccgcggcga tcgcagtgcc cgacgacatc 1500
accgaacaac tggtggcgat catcgaattc aagcgacgcg gtagtaccgc cgaagaggtc 1560
atgctcaagc tccgctcggt gaagcgtgag gtcacctccg cgatatcgaa gtcacacagc 1620
ctgcgggtgg ccgatctcgt tctggtgtca cctggttcga ttcccatcac caccagcggc 1680
aagatccggc ggtcagcctg cgtcgaacgc tatcgcagcg acggcttcaa gcggctggac 1740
gtagccgtat ga 1752
<210> 2
<211> 410
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(410)
<223> fadD26 in MTBVAC
<400> 2
atgccggtga ccgaccgttc agtgccctct ttgctgcaag agagggccga ccagcagcct 60
gacagcactg catatacgta catcgactac ggatccacta gttctagagc aaccgtccga 120
aatattataa attatcgcac acataaaaac agtgctgtta atgtgtctat taaatcgatt 180
ttttgttata acagacactg cttgtccgat atttgattta ggatacattt ttatgagatc 240
ccccgggctg caggaattcg atatcgaagt cacacagcct gcgggtggcc gatctcgttc 300
tggtgtcacc tggttcgatt cccatcacca ccagcggcaa gatccggcgg tcagcctgcg 360
tcgaacgcta tcgcagcgac ggcttcaagc ggctggacgt agccgtatga 410
<210> 3
<211> 744
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(744)
<223> wild-type phoP gene in Mt103
<400> 3
atgcggaaag gggttgatct cgtgacggcg ggaaccccag gcgaaaacac cacaccggag 60
gctcgtgtcc tcgtggtcga tgatgaggcc aacatcgttg aactgctgtc ggtgagcctc 120
aagttccagg gctttgaagt ctacaccgcg accaacgggg cacaggcgct ggatcgggcc 180
cgggaaaccc ggccggacgc ggtgatcctc gatgtgatga tgcccgggat ggacggcttt 240
ggggtgctgc gccggctgcg cgccgacggc atcgatgccc cggcgttgtt cctgacggcc 300
cgtgactcgc tacaggacaa gatcgcgggt ctgaccctgg gtggtgacga ctatgtgaca 360
aagcccttca gtttggagga ggtcgtggcc aggctgcggg tcatcctgcg acgcgcgggc 420
aagggcaaca aggaaccacg taatgttcga ctgacgttcg ccgatatcga gctcgacgag 480
gagacccacg aagtgtggaa ggcgggccaa ccggtgtcgc tgtcgcccac cgaattcacc 540
ctgctgcgct atttcgtgat caacgcgggc accgtgctga gcaagcctaa gattctcgac 600
cacgtttggc gctacgactt cggtggtgat gtcaacgtcg tcgagtccta cgtgtcgtat 660
ctgcgccgca agatcgacac tggggagaag cggctgctgc acacgctgcg cggggtgggc 720
tacgtactgc gggagcctcg atga 744
<210> 4
<211> 819
<212> DNA
<213> Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(819)
<223> phoP in MTBVAC
<400> 4
atgcggaaag gggttgatct cgtgacggcg ggaaccccag gcgaaaacac cacaccggag 60
gctcgtgtcc tcgtggtcga tgatgaggcc aacatcgttg aactgctgtc ggtgagcctc 120
aagttccagg gctttgaagt ctacaccgcg accaacgggg cacaggcgct ggatcgggcc 180
cgggaaaccc ggccggacgc ggtgatcctc gatgtgatga tgcccgggat ggacggcttt 240
ggggtgctgc gccggctgcg cgccgacggc atcgatgccc cggcgttgtt cctgacggcc 300
cgtgactcgc tacaggacaa gatcgcgggt ctgaccctgg gtggtgacga ctatgtgaca 360
aagcccttca gtttggagga ggtcgtggcc aggctgcggg tcatcctgcg acgcgcgggc 420
aagggcaaca aggaaccacg taatgttcga ctgacgttcg ccgatatcga attcctgcag 480
cccgggggat ctcataaaaa tgtatcctaa atcaaatatc ggacaagcag tgtctgttat 540
aacaaaaaat cgatttaata gacacattaa cagcactgtt tttatgtgtg cgataattta 600
taatatttcg gacggttgct ctagaactag tggatcaacg cgggcaccgt gctgagcaag 660
cctaagattc tcgaccacgt ttggcgctac gacttcggtg gtgatgtcaa cgtcgtcgag 720
tcctacgtgt cgtatctgcg ccgcaagatc gacactgggg agaagcggct gctgcacacg 780
ctgcgcgggg tgggctacgt actgcgggag cctcgatga 819

Claims (3)

1.用于生产即时冷冻干燥的减毒活结核分枝杆菌疫苗组合物的方法，所述组合物包含属于结核分枝杆菌MTBVAC菌株的分离的微生物，所述分离的微生物具有：i)通过使Rv0757基因进行基因缺失而失活的PhoP-表型，其中PhoP的开放阅读框(ORF)序列由SEQ ID NO 4组成；和ii)防止PDIM产生(PDIM-表型)的第二基因Rv2930(fadD26)的缺失，其中fadD26的开放阅读框(ORF)序列由SEQ ID NO 2组成；以及其中所述方法包括在下表定义的种子培养基中开始MTBVAC菌株的培养并通过使用下表定义的SD培养基来扩展或扩增所述细菌，
Figure FDA0004043948530000011
其中所述方法的特征在于，对于冻干前的大量培养，使用包含以下所示的定量和定性组成的SDG培养基：
Figure FDA0004043948530000012
其中所述方法在有氧条件下进行。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括通过在冻干步骤之前，将蔗糖和谷氨酸钠作为稳定剂添加到用于大量培养的SDG培养基中进行冷冻干燥步骤。
3.冷冻干燥的减毒活结核分枝杆菌疫苗组合物，其中所述组合物根据权利要求1或2的方法获得。
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