JP2021514392A

JP2021514392A - 結核の感染リスクがある人に対する予防剤として、又は感染した結核患者を治療するための二次薬として使用する組成物

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Publication number: JP2021514392A
Application number: JP2020566323A
Authority: JP
Inventors: モンタニェスカルロスマルティン; アネントフアンイグナシオアギロ; アセンシオヘススアンヘルゴンサロ; デシスラバヴァネバマリノバ; マイスサンティアゴウガンダ; サンチェスエステバンロドリゲス; コロラドエウヘニアプエンテス; アルバレス−サントゥラーノコンセプシオンフェルナンデス
Original assignee: ウニベルシダッドデサラゴサ; ビオファブリエセ．エレ．
Priority date: 2018-02-19
Filing date: 2019-02-19
Publication date: 2021-06-10
Anticipated expiration: 2039-02-19
Also published as: US20230330201A1; ES2967066T3; EP3755374B1; US20230165948A1; CN112449604B; RU2020130786A; AU2024203034A1; EP3755374A1; AU2019221709B2; EP4233912A2; JP2023153868A; BR112020016704A2; JP7388636B2; CN112449604A; EP3755374C0; WO2019158779A1; EP4233912A3; US11826411B2; CN116751703A; CA3091304A1

Abstract

本発明は、Ｒｖ０７５７遺伝子の遺伝的欠失による不活性化によるＰｈｏＰ−表現型と、ＰＤＩＭ産生を妨げる第２の遺伝子Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）の欠失（ＰＤＩＭ−表現型）とを備えることを特徴とするマイコバクテリウム・ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシス臨床分離株、より好ましくはＭ．ツベルクローシス臨床分離株に属する分離された微生物（ＭＴＢＶＡＣ株）と、安定剤又は賦形剤としてのスクロース及びグルタミン酸ナトリウムとからなるフリーズドライ組成物に関する。さらに本発明は、水、好ましくは注射用滅菌水を、フリーズドライ組成物に添加して得られる再構成組成物と並んで、特に、Ｍ．ツベルクローシスに感染するリスクがある人、若しくは結核疾患を発症するリスクがある人に対する予防剤として、又は感染した結核患者を治療するための二次薬としての使用に対するそれらの使用に関する。【選択図】なし

Description

本発明は、ワクチン等の医薬組成物、及びかかる組成物を作製及び使用する方法に関する。

バチルス・カルメット−ゲラン（ＢＣＧ：Bacille Calmette-Guerin）ワクチンは、ウシの結核（ＴＢ：tuberculosis）病原体であるマイコバクテリウム・ボビス（Mycobacterium bovis）の弱毒株である。ＢＣＧは、およそ１００年前の１９２１年に母親が出産の翌日にＴＢで死亡した乳児に経口的に与えられたとき初めて臨床用途に導入された。その乳児はＢＣＧによるワクチン接種に有害事象を示さず、重要なことに、ＴＢを発症しなかった。その際、経口経路のＢＣＧ投与は、低温殺菌されていない乳を与えられた乳児及び小児においてＴＢを獲得する自然な（胃腸管）経路と考えられていた。ＴＢは貧困と関連しており、世界の貧しい発展途上地域の大きな負担となっている。ＴＢの発生率は貧困及び不平等のために世界的に増加しており、感染が活動性疾患へと進行するリスクを大幅に増加させるＨＩＶ／ＡＩＤＳの大流行と共に悪化している。糖尿病、メタボリックシンドローム、喫煙、並びに最近では栄養失調及び貧しい社会経済的状況に起因するビタミン欠乏症が、ＴＢの重要なリスク因子として現れてきている。重要なことに、これらの因子が新たなＴＢワクチンの有効性評価にどのように影響し得るのか、研究又は患者集団を含む臨床試験計画を様々なかかるリスク因子で定義する際には、特に注意が必要である。グローバル化の高まりと、ＴＢの多剤耐性（ＭＤＲ：multidrug-resistant）株及び広範囲薬剤耐性（ＸＤＲ：extensively drug resistant）株の出現により、ＴＢは世界全体にとってますます深刻な脅威になりつつある。

今日、最新の世界保健機関（ＷＨＯ）の世界ＴＢ報告書２０１８によって報告されているように、ＴＢは、この疾患に起因する１０００万人の発病例及び１６０万人の死亡という警戒すべき割合に達している。世界的に、約５０００万人がＭＤＲＭ．ツベルクローシス（M. tuberculosis：結核菌）株に既に潜伏感染しており、治療選択肢が不十分な将来の活動性ＴＢ症例に対して注目すべきリソースとなっている。それにもかかわらず、ＷＨＯの世界結核終息戦略（End TB Strategy）は、２０３５年までにＴＢ罹患率を９０％、ＴＢ死亡率を９５％削減することを誓い、この野心的な目標を達成するために、迅速で信頼性の高い、よりアクセスしやすい診断ツール、治療を短縮するための新たな毒性が低くてより効果的な抗生物質、及び最終的には肺ＴＢを予防するための新たなワクチンに対する緊急の必要性が認識されている。

本発明は、ＴＢを予防するための新たなワクチンを提供するという目的に貢献する。

本発明は、ｉ）Ｒｖ０７５７遺伝子の遺伝的欠失による不活性化によるＰｈｏＰ−表現型、及びｉｉ）ＰＤＩＭ産生を妨げる第２の遺伝子Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）の欠失（ＰＤＩＭ−表現型）を有するＭＴＢＶＡＣ株に属する分離された微生物を含む、弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物、好ましくはフリーズドライ後の再構成組成物に関するものであり、該組成物は、１ｍＬ当たり以下の成分（パーセンテージで）を含むことを特徴とする。

本発明のその他の目的、利点及び新規な特徴は、添付の図面と併せて検討した場合に、以下の発明の詳細な説明から明らかになる。

Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９培地及び合成Ｓａｕｔｏｎ培地におけるＳＯ２株の増殖。培養継代１及び培養継代２のＯＤ及びＣｆｕ／ｍＬの結果を示す図である。Ｓａｕｔｏｎ培地、ＳＤ培地及びＳＤＧ培地おけるＭＴＢＶＡＣ培養物のＯＤの結果を示す図である。表１５で特定したロット又はバッチの２℃〜８℃及び−３０℃の安定性の結果を示す図である。マウスにおける防御を示す図である。図中のデータは、２つの独立した実験（ｎ＝マウス１２匹／群）のプールを表す。全てのデータは平均±ＳＥＭである。防御指数は、ワクチン接種を受けていない群とワクチン接種した群との細菌負荷の差（１０進対数で表される）と定義される。マウスにおける免疫原性を示す図である。図中のデータは、１つの実験（ｎ＝マウス５匹／群）のものである。データはいずれも平均±ＳＥＭである。ＳＦＣ：スポット形成コロニー。ＭＴＢＶＡＣの用量を段階的に増大させるＴＢエンデミック環境の新生児のワクチン接種は、主にＴｈ１（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、又はＴＮＦ−α）抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答をもたらした。最高用量である２．５×１０^５ＣＦＵのＭＴＢＶＡＣは、７０日目に最も大きい抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞サイトカイン応答を誘導した。最低用量である２．５×１０^３ＣＦＵのＭＴＢＶＡＣは、最も免疫原性が低かった。ＭＴＢＶＡＣの用量を段階的に増大させるＴＢエンデミック環境の新生児のワクチン接種は、ワクチン接種後１８０日目及び３６０日目のＱＦＴアッセイの定量値の用量応答プロファイルをもたらした。ＱＦＴ値は、Andrews JR, Nemes E, Tameris M et al. Serial QuantiFERON testing and tuberculosis disease risk among young children: an observational cohort study. Lancet Respir Med, (2017)に従って活動性ＴＢを発症するリスクに応じて、３つの異なる領域に階層化されている。モルモットのワーキングシード（working seed）ロットに病原性マイコバクテリアが存在していないことを示す図である。マスターシードロット及びワーキングシードロットの安定性研究を示す図である。 −１５℃〜−３０℃で保管された（Ａ）及び＋２℃〜＋８℃で保管された（Ｂ）、３×１０^３ｃｆｕ／０．１ｍＬ〜１７×１０^３ｃｆｕ／０．１ｍＬの用量、３×１０^４ｃｆｕ／０．１ｍＬ〜１７×１０^４ｃｆｕ／０．１ｍＬの用量、及び３×１０^６ｃｆｕ／０．１ｍＬ〜１７×１０^６ｃｆｕ／０．１ｍＬの用量のＭＴＢＶＡＣワクチンの長期安定性研究を示す図である。ＳＯ２からＭＴＢＶＡＣへの段階的な構築を示す図である。最終的な二重欠失株は、プロトタイプＳＯ２（ｐｈｏＰ−ベースのＰＤＩＭ欠損）と表現型上では同一であるが、より大きな遺伝的安定性を保証する。水色はｐｈｏＰ遺伝子を示し、ｆａｄＤ２６遺伝子は淡いオレンジ色で示され、抗生物質耐性カセットｋｍ^ｒ及びｈｙｇ^ｒは赤紫色であり、黄色三角形は欠失された領域にあるΩｈｙｇ^ｒに隣接するｒｅｓ部位又は残存ｒｅｓ部位を示し、ｒｅｓ部位はいかなる外因性コーディング配列も含まない。

ＭＴＢＶＡＣ株の定義及び詳細な説明
「ＭＴＢＶＡＣ株」は、Ｍ．ツベルクローシスＭＴ１０３臨床株のＲｖ０７５７遺伝子を欠失し、更にＲｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）遺伝子の欠失を備えるＭ．ツベルクローシス株の分離された微生物を指すために使用される。したがって、上記株は、Ｍ．ツベルクローシスに由来する２つの独立した変異を提示し、独立したｐｈｏＰ欠失は、上記遺伝子の不活性化に由来するワクチンの特性に影響を及ぼさない。したがって、「ＭＴＢＶＡＣ株」は、Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）遺伝子の欠失によりＰＤＩＭ産生が不活性化されることを特徴とするため、この株はＲｖ２９３０遺伝子及びＲｖ０７５７遺伝子の欠失を備えることを特徴とする。

したがって、ＭＴＢＶＡＣ株は、抗生物質マーカーなしで２つの独立した非復帰欠失（non-reverting deletion）変異を含むように構築され、マイコバクテリア生ワクチンを第Ｉ相臨床評価に進めるために第１ジュネーブコンセンサス安全要件（the first Geneva consensus safety requirements）を満たすことに留意されたい。ＭＴＢＶＡＣ株は、プロトタイプＳＯ２に表現型上及び機能上、類似するように遺伝子操作された。ＳＯ２は、カナマイシン耐性カセット（ｋｍｒ）の挿入によってマークされたＭｔ１０３ｐｈｏＰ変異株（Ｍｔ１０３ｐｈｏＰ：：ｋｍｒ）（図１１を参照されたい）であり、操作されたＰｈｏＰ欠損表現型に加えて、ＳＯ２は、実験室で繰り返された継代培養及び操作の実施の結果として、Ｍ．ツベルクローシスにおいて共通していると記載されているＰＤＩＭ生合成を後天的に自然喪失する（Dessislava Marinova, Jesus Gonzalo-Asensio, Nacho Aguilo & Carlos Martin (2017) MTBVAC from discovery to clinical trials in tuberculosis-endemic countries, Expert Review of Vaccines, 16:6, 565-576, DOI:10.1080/14760584.2017.1324303の図２を参照されたい）。

図１１に表されるように、ＭＴＢＶＡＣ株を段階的アプローチに従って構築した。まず、ｆａｄＤ２６のマークのない欠失をＳＯ２に導入し、ＳＯ２ΔｆａｄＤ２６を生じた。その結果、ＳＯ２ΔｆａｄＤ２６のｐｈｏＰにおけるマークのない欠失によってＭＴＢＶＡＣ株が作製された。ＭＴＢＶＡＣの構築では、欠失したｆａｄＤ２６遺伝子及びｐｈｏＰ遺伝子を持つ自殺プラスミドが使用され、その欠失した領域は、両側にｒｅｓ部位が隣接するハイグロマイシン耐性マーカー（ｈｙｇ^ｒ）（ｒｅｓ：：ｈｙｇ^ｒ：：ｒｅｓ）で中断されていた。Ｅ．コリ（E.coli）に由来するγδ−リゾルバーゼは、ｒｅｓ部位の認識に続いて抗生物質耐性カセットの切除を触媒し、その後、欠失の場所に残存ｒｅｓ「ｓｃａｒ」のコピーを残し（Malaga, et al. 2003）、ｒｅｓ部位にはいかなる外因性コーディング配列も含まれていない。最終的なコンストラクトＳＯ２ΔｆａｄＤ２６：：ΔｐｈｏＰをＭＴＢＶＡＣ株と名付けた。ＭＴＢＶＡＣ株では、ｆａｄＤ２６にマークのない欠失を導入することで、ＰＤＩＭ生合成の遺伝的に安定した消滅を保証する。遺伝子ｆａｄＤ２６で生じた欠失の大きさは１５１１ｂｐを含み、ＰＤＩＭ生合成においてこの必須遺伝子の完全な不活性化をもたらす。野生型遺伝子は１７５２ｂｐ（５８３アミノ酸）である。残存するｒｅｓｓｃａｒはγδ−リゾルバーゼによるｈｙｇ^ｒの切除の過程で残された。この欠失の結果、ＰＤＩＭ遺伝子座（ｆａｄＤ２６−ｐｐｓＥ）における次の５つの遺伝子の転写レベルが減少し、ＭＴＢＶＡＣにおけるＰＤＩＭ生合成が完全に消滅する（Ainhoa Arbues PhD Thesis）。Ｍ．ツベルクローシスのＰＤＩＭ遺伝子座は、染色体の５０ｋｂフラグメント上にクラスター化した１３個の遺伝子を含む。該領域は、Ｍ．ツベルクローシスのゲノム中で最大のオペロンである（Camacho, et al. 2001、Camacho, et al. 1999、Cox, et al. 1999、Trivedi, et al. 2005）。

Ｍ．ツベルクローシスでは、ｐｈｏＰ（７４４ｂｐ）は、ｐｈｏＲ（１４５８ｂｐ）の上流にマップし、両方の遺伝子が同じ方向に転写される。ｐｈｏＰ遺伝子内に生じた９４ｂｐの欠失の残存ｒｅｓ部位による置き換えは、複数の停止コドンの存在を必要とし、一方でＭＴＢＶＡＣにおけるＰｈｏＰのＤＮＡ結合ドメイン（９２アミノ酸に相当する）の翻訳の欠如をもたらす。

ＭＴＢＶＡＣにおけるｐｈｏＰ遺伝子及びｆａｄＤ２６遺伝子の欠失は、ＲＴ−ＰＣＲの存在／不在アプローチを使用して検出する／場所を特定することができる。該方法では、蛍光性ＰＣＲ試薬（プライマー及びプローブ）を用いて、ΔｐｈｏＰ遺伝子及びΔｆａｄＤ２６遺伝子におけるｒｅｓ部位の存在、並びに野生型のｐｈｏＰ遺伝子及びｆａｄＤ２６遺伝子の不在を示す。

以下、本発明者らは、Ｍｔ１０３ａ）及びＭＴＢＶＡＣ（ΔｆａｄＤ２６）ｂ）においてｆａｄＤ２６遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列、並びにＭｔ１０３ｃ）及びＭＴＢＶＡＣ（ΔｐｈｏＰ）ｄ）においてｐｈｏＰ遺伝子のＯＲＦ配列を提供する。ｆａｄＤ２６（ａ）及びｐｈｏＰ（ｃ）の欠失した遺伝子領域に対応するヌクレオチド配列を小文字で示し、残存ｒｅｓ部位を灰色で強調して示す。蛍光性ＰＣＲ検出法の場合、各標的に対するプライマーに下線を引き、Ｔａｑ−ｍａｎプローブを太字で示す。

ａ）Ｍｔ１０３における野生型ｆａｄＤ２６遺伝子
配列番号１
ATGCCGGTGACCGACCGTTCAGTGCCCTCTTTGCTGCAAGAGAGGGCCGACCAGCAGCCTGACAGCACTGCATATACGTACATCGACTACGGATCCgaccccaagggatttgctgacagcttgacttggtcgcaggtctacagtcgtgcatgcatcattgctgaagaactcaagttatgcgggttacccggagatcgagtggcggttttagcgccacaaggactggaatatgtccttgcattcctgggcgcacttcaggctggatttatcgcggttccgctgtcaactccacagtatggcattcacgatgaccgcgtttctgcggtgttgcaggattccaagccggtagccattctcacgacttcgtccgtggtaggcgatgtaacgaaatacgcagccagccacgacgggcagcctgccccggtcgtagttgaggttgatctgcttgatttggactcgccgcgacagatgccggctttctctcgtcagcacaccggggcggcttatctccaatacacgtccggatcgacgcgtacgccggccggagtcattgtgtcgcacacgaatgtcattgccaatgtgacacaaagtatgtacggctatttcggcgatcccgcaaagattccgaccgggactgtggtgtcgtggctgcctttgtatcacgatatgggcctgattctcggaatttgcgcaccgctggtggcccgacgccgcgcgatgttgatgagcccaatgtcatttttgcgccgtccggcccgctggatgcaactgcttgccaccagcggccggtgcttttctgcggcaccgaatttcgccttcgagctggccgtgcgcagaacatctgaccaggacatggcggggctcgacctgcgcgacgtggtcggcatcgtcagtggcagtgagcgaatccatgtggcaaccgtgcggcggttcatcgagcggttcgcgccgtacaatctcagccccaccgcgatacggccgtcgtacgggctcgcggaagcgaccttatatgtggcagctcccgaagccggcgccgcgcccaagacggtccgttttgactacgagcagctgaccgccgggcaggctcggccctgcggaaccgatgggtcggtcggcaccgaactgatcagctacggctcccccgacccatcgtctgtgcgaatcgtcaacccggagaccatggttgagaatccgcctggagtggtcggtgagatctgggtgcatggcgaccacgtgactatggggtattggcagaagccgaagcagaccgcgcaggtcttcgacgccaagctggtcgatcccgcgccggcagccccggaggggccgtggctgcgcaccggcgacctgggcgtcatttccgatggtgagctgttcatcatgggccgcatcaaagacctgctcatcgtggacgggcgcaaccactaccccgacgacatcgaggcaacgatccaggagatcaccggtggacgggccgcggcgatcgcagtgcccgacgacatcaccgaacaactggtggcgatcatcgaattcaagcgacgcggtagtaccgccgaagaggtcatgctcaagctccgctcggtgaagcgtgaggtcacctccgcGATATCGAAGTCACACAGCCTGCGGGTGGCCGATCTCGTTCTGGTGTCACCTGGTTCGATTCCCATCACCACCAGCGGCAAGATCCGGCGGTCAGCCTGCGTCGAACGCTATCGCAGCGACGGCTTCAAGCGGCTGGACGTAGCCGTATGA

ｂ）ＭＴＢＶＡＣにおけるΔｆａｄＤ２６
配列番号２
ATGCCGGTGACCGACCGTTCAGTGCCCTCTTTGCTGCAAGAGAGGGCCGACCAGCAGCCTGACAGCACTGCATATACGTACATCGACTACGGATCCACTAGTTCTAGAGCAACCGTCCGAAATATTATAAATTATCGCACACATAAAAACAGTGCTGTTAATGTGTCTATTAAATCGATTTTTTGTTATAACAGACACTGCTTGTCCGATATTTGATTTAGGATACATTTTTATGAGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCGAAGTCACACAGCCTGCGGGTGGCCGATCTCGTTCTGGTGTCACCTGGTTCGATTCCCATCACCACCAGCGGCAAGATCCGGCGGTCAGCCTGCGTCGAACGCTATCGCAGCGACGGCTTCAAGCGGCTGGACGTAGCCGTATGA

ｃ）Ｍｔ１０３における野生型ｐｈｏＰ遺伝子
配列番号３
ATGCGGAAAGGGGTTGATCTCGTGACGGCGGGAACCCCAGGCGAAAACACCACACCGGAGGCTCGTGTCCTCGTGGTCGATGATGAGGCCAACATCGTTGAACTGCTGTCGGTGAGCCTCAAGTTCCAGGGCTTTGAAGTCTACACCGCGACCAACGGGGCACAGGCGCTGGATCGGGCCCGGGAAACCCGGCCGGACGCGGTGATCCTCGATGTGATGATGCCCGGGATGGACGGCTTTGGGGTGCTGCGCCGGCTGCGCGCCGACGGCATCGATGCCCCGGCGTTGTTCCTGACGGCCCGTGACTCGCTACAGGACAAGATCGCGGGTCTGACCCTGGGTGGTGACGACTATGTGACAAAGCCCTTCAGTTTGGAGGAGGTCGTGGCCAGGCTGCGGGTCATCCTGCGACGCGCGGGCAAGGGCAACAAGGAACCACGTAATGTTCGACTGACGTTCGCCGATatcgagctcgacgaggagacccacgaagtgtggaaggcgggccaaccggtgtcgctgtcgcccaccgaattcaccctgctgcgctatttcgtGATCAACGCGGGCACCGTGCTGAGCAAGCCTAAGATTCTCGACCACGTTTGGCGCTACGACTTCGGTGGTGATGTCAACGTCGTCGAGTCCTACGTGTCGTATCTGCGCCGCAAGATCGACACTGGGGAGAAGCGGCTGCTGCACACGCTGCGCGGGGTGGGCTACGTACTGCGGGAGCCTCGATGA

ｄ）ＭＴＢＶＡＣにおけるΔｐｈｏＰ
配列番号４
ATGCGGAAAGGGGTTGATCTCGTGACGGCGGGAACCCCAGGCGAAAACACCACACCGGAGGCTCGTGTCCTCGTGGTCGATGATGAGGCCAACATCGTTGAACTGCTGTCGGTGAGCCTCAAGTTCCAGGGCTTTGAAGTCTACACCGCGACCAACGGGGCACAGGCGCTGGATCGGGCCCGGGAAACCCGGCCGGACGCGGTGATCCTCGATGTGATGATGCCCGGGATGGACGGCTTTGGGGTGCTGCGCCGGCTGCGCGCCGACGGCATCGATGCCCCGGCGTTGTTCCTGACGGCCCGTGACTCGCTACAGGACAAGATCGCGGGTCTGACCCTGGGTGGTGACGACTATGTGACAAAGCCCTTCAGTTTGGAGGAGGTCGTGGCCAGGCTGCGGGTCATCCTGCGACGCGCGGGCAAGGGCAACAAGGAACCACGTAATGTTCGACTGACGTTCGCCGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCTCATAAAAATGTATCCTAAATCAAATATCGGACAAGCAGTGTCTGTTATAACAAAAAATCGATTTAATAGACACATTAACAGCACTGTTTTTATGTGTGCGATAATTTATAATATTTCGGACGGTTGCTCTAGAACTAGTGGATCAACGCGGGCACCGTGCTGAGCAAGCCTAAGATTCTCGACCACGTTTGGCGCTACGACTTCGGTGGTGATGTCAACGTCGTCGAGTCCTACGTGTCGTATCTGCGCCGCAAGATCGACACTGGGGAGAAGCGGCTGCTGCACACGCTGCGCGGGGTGGGCTACGTACTGCGGGAGCCTCGATGA

ＳＯ２は、関連する動物モデルのＢＣＧと比較して、ロバストな安全性及び弱毒化プロファイル、並びに有望な有効性を実証する、徹底的で完全な前臨床歴を有する。幸いなことに、これらの前臨床研究のほとんどは、二重弱毒化ＰｈｏＰ−ＰＤＩＭ−表現型の機能的プロファイル及び生物学的活性を確認するためにＭＴＢＶＡＣを用いて再現された。脂質プロファイル分析は、ＭＴＢＶＡＣ及びそのプロトタイプＳＯ２が表現型上同等であり、ＤＡＴ、ＰＡＴ及びＰＤＩＭを欠いていることを実証した。

一方、本発明の文脈において、以下、ＢＣＧは１９２１年以降結核に対して使用されている現在のワクチンを指すために使用される。このワクチンは、実験室で継代培養した後に病原性を失い、現在１００超の遺伝子を欠失していることがわかっているＭ．ボビス（M.bovis）株に由来する弱毒生ワクチンである。Behr, M. A. BCG-different strains, different vaccines Lancet Infect Dis 2002, 2(2), 86-92。

本発明の文脈において、以下、Ｈ３７Ｒｖは、配列決定された病原性Ｍ．ツベルクローシス株を指すために使用され、Cole et al.はこれらの遺伝子をＲｖと呼んでいる（Cole et al 1998 Deciphering the biology of M. tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393:537-544を参照されたい）。

本発明の文脈において、以下、ＭＴ１０３は、Ｍ．ツベルクローシス臨床分離株を指すために使用される。Camacho et al. 1999 Identification of a virulence gene cluster of M. tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol 34:257-267。

本発明の文脈において、以下、ＰＤＩＭ−株は、Ｍ．ツベルクローシスの病原性に関連する重要な脂質であるフチオセロールジミコセロセートを合成することができないＭ．ツベルクローシスコンプレックスの株を指すために使用される。

本発明の文脈において、以下、ＳＯ２＋ｐＳＯ５は、Ｒｖ０７５７における変異が、マイコバクテリアｐｈｏＰ遺伝子を含む複製プラスミドの形質転換によってＲｖ０７５７遺伝子によって補完されるが、ＰＤＩＭ合成を補完することはできないＭ．ツベルクローシスＳＯ２株を指すために用いられ、その表現型はＰｈｏＰ＋ＰＤＩＭ−である。

本発明の文脈において、以下、Ｍ．ツベルクローシスのｐｈｏＰ−は、ＥｃｏＲＶ−ＢｓｐＥＩ部位間のＲｖ０７５７遺伝子欠失によって不活性化されたＭ．ツベルクローシス株を指すために用いられ、その表現型はｐｈｏＰ−ＰＤＩＭ＋である。

本発明の文脈において、以下、Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）は、フチオセロールジミコセロセート（ＰＤＩＭ）の合成を担うオペロンの始めにある遺伝子を指すために用いられ（Camacho et al.）、Ｍ．ツベルクローシスにおけるこの遺伝子の排除は、安定なＰＤＩＭ−表現型を付与する。

説明
ヒトにおいてＴＢを予防するためのワクチンの使用は、今でほぼ１世紀の間、大きな課題であることが証明されている。Ｍ．ボビス由来のＢＣＧは、現在使用されている唯一の認可されたＴＢワクチンであり、世界で最も広く使用されているワクチンである。１９２０年代の初めからＢＣＧワクチンの開発及び一般投与は、世界からＴＢを根絶することができるという見通しで、大きく発展してきた。しかしながら、これらの初期の見通しは達成されておらず、多数の有効性試験の結果から、現在の形態のＢＣＧワクチンは、特に疾患が流行している第三世界の地域で成人の呼吸器型の疾患の制御への使用は制限されていることが明らかである。Fine, P.E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet 1995, 346(8986), 1339-1345。Ｍ．ツベルクローシスの病原性及び防御免疫の生成につながる免疫応答モデルに関するより多くの知識により、ＢＣＧよりも良好なワクチンを開発することが可能である。宿主にＢＣＧがワクチン接種される場合に、より高い防御レベルが達成されるという観察は、生存能及び持続性が結核ワクチンの成功に必要な基本特性であることを示唆している。この意味で、米国特許第８２８７８８６号では、不活性化されたＲｖ０７５７（ｐｈｏＰ）遺伝子と、ＰＤＩＭ合成を妨げるｐｈｏＰの第２の独立した変異とを有し、プロトタイプの単回投与の生ワクチン用に提供されるＭ．ツベルクローシス株の使用が、免疫不全ＳＣＩＤマウスにおいてＢＣＧよりも弱毒化されており、マウスではＢＣＧによって付与されるものに匹敵する防御レベル、またモルモットではＢＣＧよりも高い防御をもたらすことを教示した。

ｐｈｏＰ遺伝子は、ｐｈｏＲと共に２成分系の一部を形成し、細胞内病原体における主要な病原性遺伝子の転写を制御する他の２成分系と高い類似度を示す。また、この２成分系は、病原性に直接関与していない他の多くの遺伝子の発現も制御する。Groisman, E. A. The pleiotropic two-component regulatory system PhoP-PhoQ. J Bacteriol 2001, 183(6), 1835-1842。病原性遺伝子の排除自体は、Ｍ．ツベルクローシスを弱毒化するための唯一の方法ではないようである。パントテン酸の新規（de novo）合成ができないＭ．ツベルクローシスのパントテネート栄養要求変異株は、疾患を引き起こすことなく、ＳＣＩＤマウスにおいて持続することを示した。Sambandamurthy, V. K., Wang, X., Chen, B. et al. A pantothenate auxotroph of M. tuberculosis is highly attenuated and protects mice against tuberculosis. Nat Med 2002, 8(10), 1171-1174。また、個々のロイシン栄養要求株は強く弱毒化されており、ＳＣＩＤマウスにおいてｉｎｖｉｖｏでは複製することができない。Hondalus, M. K., Bardarov, S., Russell, R., Chan, J., Jacobs, W. R., Jr. & Bloom, B. R. Attenuation of and protection induced by a leucine auxotroph of M. tuberculosis. Infect Immun 2000, 68(5), 2888-2898。したがって、Ｍ．ボビスＢＣＧで抑制される遺伝子を保持しながら、Ｍ．ツベルクローシスに基づくワクチン株を正常に弱毒化させることができるという原理は、現在一般的に受け入れられている。

米国特許第８２８７８８６号以前は、ＢＣＧよりも効果的なワクチンの研究は、ＢＣＧによる病原性の喪失自体が完全な防御効果の欠如に寄与する要因であるという考えに基づいていた。Behr, M. A., Wilson, M. A., Gill, W. P. et al. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science 1999, 284(5419), 1520-1523。したがって、Ｍ．ツベルクローシスの新たな弱毒変異株は、病原性が少なく、ワクチンとしてより効果的である可能性があると推論された。しかしながら、この点に関して、Ｍ．ツベルクローシスによる自然感染及びＢＣＧによるワクチン接種には、結核に対する防御免疫をもたらす能力に違いはないことが示されている。Sampson, S. L., Dascher, C. C., Sambandamurthy, V. K. et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of M. tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun 2004, 72(5), 3031-3037。潜伏性結核を有するＭ．ツベルクローシスに感染した個体は、感染していない個体と比較して再感染後の進行性結核のリスクが７９％低い（Andrews 2012. CID 54:784-790）。さらに、これらの個体のほとんどがＢＣＧによるワクチン接種を受けている可能性があるという事実を考慮すると、これは実際には、ＢＣＧ及びＭ．ツベルクローシスによって提供される防御免疫に違いがある可能性を示している。これは、Ｍ．ツベルクローシスの合理的な弱毒化によってＢＣＧを改善することが可能かどうかについて疑問を提起した。この文脈では、ＰｈｏＰタンパク質の合成及びＰＤＩＭ合成における２つの独立した変異の組合せを有する、米国特許第８２８７８８６号に記載されている変異型Ｍ．ツベルクローシス株は、ＢＣＧの１０倍の用量で適用された場合でも、ＳＣＩＤマウスモデルでＢＣＧよりも弱毒化されており、モルモットモデルではＢＣＧよりも防御の程度が高いという観察は、特に関連性が高いと考えられた。

米国特許第８２８７８８６号に記載される変異型Ｍ．ツベルクローシス株は、Ｒｖ０７５７（ｐｈｏＰ）遺伝子の不活性化及びＰＤＩＭ（フチオセロールジミコセロセート）産生を妨げる第２の遺伝子の不活性化を含むマイコバクテリウム属に属する分離された微生物であることを特徴とした。特に、米国特許第８２８７８８６号に記載されるかかる変異型Ｍ．ツベルクローシス株（ＳＯ２株）は、Ｒｖ０７５７（ｐｈｏＰ）遺伝子の不活性化、及びＰＤＩＭ産生を妨げるｐｈｏＰの第２の独立した変異を備えることを特徴とした。

興味深いことに、米国特許第８２８７８８６号に記載されているように、ＳＯ２株は、この種のワクチン用量の５０倍で接種された６匹のモルモットにおいて有毒とされなかった。さらに、それらの生存率及び体重曲線が研究された。生存率は６ヶ月の実験期間後に１００％であった。米国特許第８２８７８８６号の図１２は、６ヶ月間の全ての動物で観察された体重増加を示し、ＳＯ２株の非毒性（Ｙ＝グラム単位の体重及びＸ＝週単位の感染時間）を示す。さらに、Ｍ．ツベルクローシスによる感染後にワクチン接種されたモルモットの生存率も米国特許第８２８７８８６号にて研究された（図１３）。モルモットにおける防御研究は、３００日後のモルモットの生存率を追跡した。生存曲線を、ワクチン接種を受けていないモルモット（生理食塩水）及び現在のＢＣＧワクチン、Ｍ．ツベルクローシスｐｈｏＰ−株又はＳＯ２株（ｐｈｏＰ−及びＰＤＩＭ−変異）でワクチン接種されたモルモットについて測定した。皮下ワクチン接種後、生存率を研究するため高用量のＭ．ツベルクローシスの病原性株（Ｈ３７Ｒｖ）で動物を感染させた。６０日後、ワクチン接種を受けていない６匹のモルモット（生理食塩水）が死亡したが、ＳＯ２株、ｐｈｏＰ−及びＢＣＧでワクチン接種された群は生存した。感染の３００日後にＢＣＧ及びｐｈｏＰ−でワクチン接種された３匹のモルモットが死亡したのに対し、ＳＯ２株でワクチン接種された群では１匹のみであり、このことは、ｐｈｏＰ変異株の防御が現在のＢＣＧワクチンの防御と類似しているが、ｐｈｏＰ−及びＰＤＩＭ−の二重変異株であるＳＯ２株によるワクチン接種は、モルモットモデルにおいてより良好に防御したことを示した。さらに、米国特許第８２８７８８６号の図１４は、図１３で追跡したモルモットの４００日後の生存を示す。ワクチン接種を受けていないモルモット６匹は６０日後に死亡した。感染４００日後、ＳＯ２株でワクチン接種を行った群の３匹のモルモットが生存した（図１４ａ）のに対し、ＢＣＧ（図１４ａ及び図１４ｂ）及びｐｈｏＰ−（図１４ｂ）でワクチン接種したモルモットはわずか１匹が生存したにすぎず、ここでも、ｐｈｏＰ変異株の防御がＢＣＧの防御と類似する一方で、ｐｈｏＰ−及びＰＤＩＭ−の二重変異株であるＳＯ２株によるワクチン接種が、実験の４００日後により良好に防御していることを示した。

結論として、米国特許第８２８７８８６号に記載される結果は、ＳＯ２株、したがってｐｈｏＰ−ＰＤＩＭ−表現型を有するマイコバクテリウム属に属する微生物（特にＭ．ツベルクローシスコンプレックス由来）が、多くの基準に従ってＢＣＧよりも有効なワクチンであることを示している。ＳＯ２株は、ＳＣＩＤマウスにおいてＢＣＧより弱毒化されており、少なくともＢＣＧと同じくらい良好な防御免疫をマウスに提供し、より強い細胞性免疫応答をもたらす。さらに、高用量のＨ３７Ｒｖの感染に対してモルモットで行われた防御実験では、ＰＤＩＭ−ＰｈｏＰ−の表現型を有する株は、ＢＣＧが３３％の生存率しか達成しなかった状況でモルモットに１００％の生存率をもたらす。この防御は、疾患の重症度及び細菌負荷の低下に関連している。

これらの結果を踏まえて、本発明の著者らは、３ｍＬ容のアンバーガラスバイアル中の凍結乾燥ペレットとして提示されるＭＴＢＶＡＣ株を含む弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチンの開発を進めた。既に示されているように、ＭＴＢＶＡＣ株は、抗生物質マーカーのない、２つの独立した非復帰欠失変異を含むように構築され、第１ジュネーブコンセンサス安全要件を満たす。この意味で、ＭＴＢＶＡＣ株を、そのプロトタイプＳＯ２に表現型上及び機能上、類似するように遺伝子操作した。ＭＴＢＶＡＣ株では、ｆａｄＤ２６にマークのない欠失を導入することで、ＰＤＩＭ生合成の遺伝的に安定した消滅を保証する。ＳＯ２は、関連する動物モデルにおけるＢＣＧと比較して、ロバストな安全性及び弱毒化プロファイル、並びに有望な有効性を実証する、徹底的で完全な前臨床歴を有することに留意されたい。既に示されているように、これらの前臨床研究のほとんどは、二重弱毒化ＰｈｏＰ−／ＰＤＩＭ−欠損表現型の機能的プロファイル及び生物学的活性を確認するためにＭＴＢＶＡＣを用いて再現された。

以上に基づき、本発明の著者らはＭＴＢＶＡＣ株を含むワクチンを調製した。上記ワクチン０．０５ｍＬの１回の投薬は、ＢＣＧと同様に新生児への皮内経路を使用することによって与えられるものであった。そのため、本発明の著者らの第１の目的は、この特定の年齢層の集団におけるＴＢの治療又は予防のために新生児において有用な、好ましくは凍結乾燥されたワクチンを得ることであった。そのことを念頭に、本発明の著者らは、新生児において、本出願の実施例２及び実施例３に記載される実験を行い、これらの実験の結果、２．５×１０^４ＣＦＵ又は２．５×１０^５ＣＦＵ以上の推定投与量のＭＴＢＶＡＣによるワクチン接種が、ＴＢエンデミック環境の新生児において免疫原性であると結論付けた。

本出願では、「新生児、新生仔（neonates）」という用語は、生まれたばかりの子供（又は他の哺乳動物）として、又は生後４週間未満の乳児として理解されることに留意されたい。

上記の結果により、本発明者らは現在、健康なＢＣＧナイーブのＨＩＶに曝露されていない南アフリカの新生児におけるＭＴＢＶＡＣの安全性及び免疫原性の第２ａ相の無作為化比較用量設定試験を行っている。この研究は、Ｍ．ツベルクローシスへの既知の家庭内曝露のない、９９名のＨＩＶに曝露されていないＢＣＧナイーブ新生児の集団で行われる。推定される研究期間（最初の参加者はデータ収集の完了までワクチン接種を受ける）はおよそ３６ヶ月である。この研究では、ＭＴＢＶＡＣは３つの用量レベル：１．５×１０^４ＣＦＵ／０．０５ｍｌ〜８．５×１０^４ＣＦＵ／０．０５ｍｌ、１．５×１０^５ＣＦＵ／０．０５ｍｌ〜８．５×１０^５ＣＦＵ／０．０５ｍｌ、及び１．５×１０^６ＣＦＵ／０．０５ｍｌ〜８．５×１０^６ＣＦＵ／０．０５ｍｌで新生児に投与される。実薬対照はＢＣＧワクチンである。参加者は、研究０日目に皮内投与で単回用量のＭＴＢＶＡＣ又はＢＣＧを受ける。本研究の目的は以下の通りである。

主要評価項目：
健康なＢＣＧナイーブのＨＩＶに曝露されていない南アフリカの新生児において、ＢＣＧワクチンと比較して、ＭＴＢＶＡＣの用量レベルを段階的に増大させて安全性及び反応原性を評価する。
健康なＢＣＧナイーブのＨＩＶに曝露されていない南アフリカの新生児において、ＭＴＢＶＡＣの用量レベルを段階的に増大させて免疫原性を評価する。

副次評価項目：
段階的に用量レベルを増大させたＭＴＢＶＡＣを受ける新生児においてＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢＧｏｌｄＰｌｕｓ（ＱＦＴ）変換率を評価する。

探索的評価項目（Exploratory）：
ＭＴＢＶＡＣ及びＢＣＧのワクチン接種によって誘導される主要組織適合性（ＭＨＣ）拘束性Ｔ細胞応答の差異を評価する。
ＭＴＢＶＡＣ及びＢＣＧのワクチン接種により誘導されるドナー非拘束性Ｔ細胞応答の差異を評価する。

実施例２及び実施例３が、２．５×１０^４ＣＦＵ又は２．５×１０^５ＣＦＵ以上の推定投与量のＭＴＢＶＡＣによるワクチン接種がＴＢエンデミック環境の新生児において免疫原性であったことを既に示し、またＭＴＢＶＡＣワクチンの反応原性がＢＣＧワクチンで生じる反応原性よりも明らかに低かったという事実を考慮に入れると、ＭＴＢＶＡＣを１．５×１０^４ＣＶＵ／０．０５ｍｌ〜８．５×１０^４ＣＶＵ／０．０５ｍｌ、１．５×１０^５ＣＦＵ／０．０５ｍｌ〜８．５×１０^５ＣＦＵ／０．０５ｍｌ、又は１．５×１０^６ＣＦＵ／０．０５ｍｌ〜８．５×１０^６ＣＦＵ／０．０５ｍｌの用量で新生児に投与することが、Ｍ．ツベルクローシスに感染するリスクがある新生児又は結核疾患を発症するリスクがある新生児にとって、予防剤として有用となり得ることはもっともらしいように見える。

したがって、第１の態様では、本発明は、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックスに属する分離された微生物、好ましくはＭ．ツベルクローシスの臨床分離株、より好ましくはＭ．ツベルクローシス臨床分離株を含む組成物に関するものであり、Ｒｖ０７５７遺伝子の遺伝的欠失による不活性化によるＰｈｏＰ−表現型と、ＰＤＩＭ産生を妨げる第２の遺伝子Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）の欠失（ＰＤＩＭ−表現型）とを備え、より好ましくは、上記微生物はＭＴＢＶＡＣ株であることを特徴とし、該組成物は、少なくとも１．５×１０^４ｃｆｕ／０．０５ｍｌ以上の分離された微生物を含む。上記組成物は、１．５×１０^４ｃｆｕ／０．０５ｍｌ〜８．５×１０^６ｃｆｕ／０．０５ｍｌの分離された微生物を含むことが好ましい。上記組成物は、１．５×１０^４ｃｆｕ／０．０５ｍｌ〜８．５×１０^４ｃｆｕ／０．０５ｍｌ、又は１．５×１０^５ｃｆｕ／０．０５ｍｌ〜８．５×１０^５ｃｆｕ／０．０５ｍｌ、又は１．５×１０^６ｃｆｕ／０．０５ｍｌ〜８．５×１０^６ｃｆｕ／０．０５ｍｌの分離された微生物を含むことがより好ましい。

本発明の第２の態様では、第１の態様の組成物は、Ｍ．ツベルクローシスに感染するリスクがある新生児又は結核疾患を発症するリスクがある新生児において、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる感染症の予防のため投与されるか、又は結核疾患を発症するリスクがあり、潜伏性結核感染症を患うヒト新生児において、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引きこされる活動型の疾患と関連する臨床総体症状の発症の予防若しくは阻止における使用に対するものであるか、又は新生児において潜伏性及び／又は活動性ＴＢ結核に感染した患者を治療するための二次薬としての使用に対するものであるか、又はＭ．ツベルクローシスに感染するリスクがあるヒト新生児において、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる感染症に対する予防治療又は阻止治療における再ワクチン接種、ブースターワクチン接種若しくはブースター投薬における使用に対するものであるか、又は新生児におけるツベルクローシスではないマイコバクテリウムによる感染症を含むＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる結核疾患以外の任意の無関係の感染症の予防のための二次薬としての使用に対するものである。上記組成物は、皮内経路を介して新生児に投与されることがより好ましい。

上記に加えて、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ−ＴＢＧｏｌｄＰｌｕｓ（ＱＦＴ）アッセイで測定される潜伏性結核感染（ＬＴＢＩ）を有する成人及びＬＴＢＩを有さない成人において、本発明者らが、現在、二重盲検、無作為化、ＢＣＧ比較、用量増大安全性及び免疫原性研究を行っていることに更に留意されたい。これは、ＬＴＢＩを有する健康な成人及びＬＴＢＩを有さない健康な成人における第１ｂ相／第２ａ相、二重盲検、無作為化、ＢＣＧ比較、用量増大安全性及び免疫原性研究である。参加者はいずれも、以前、幼児期にＢＣＧワクチン接種を受けている。研究製品は４つの用量レベル：５×１０^３ＣＦＵ、５×１０^４ＣＦＵ、５×１０^５ＣＦＵ、及び５×１０^６ＣＦＵのＭＴＢＶＡＣである。実薬対照はＢＣＧ（５×１０^５ＣＦＵ）である。

選択／除外基準を満たす参加者は、研究コホート内で無作為化され、研究０日目に皮内投与で単回用量のＭＴＢＶＡＣ又はＢＣＧの再ワクチン接種を受ける。研究は南アフリカの１つの施設で行われる。参加者は８つのコホートのうちの１つに登録され、研究１８２日目まで安全性及び免疫原性の評価項目に従った。登録を完了するまでの概算時間はおよそ９ヶ月である。

コホート１〜コホート８には、ＱＦＴ陰性（コホート１〜コホート４）及びＱＦＴ陽性（コホート５〜コホート８）の参加者が含まれる。参加者は各コホート内で無作為化され、ＭＴＢＶＡＣ又はＢＣＧのいずれかを受ける。

これらに基づき、第３の態様では、本発明は、Ｒｖ０７５７遺伝子の遺伝的欠失による不活性化によるＰｈｏＰ−表現型と、ＰＤＩＭ産生を妨げる第２の遺伝子Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）の欠失（ＰＤＩＭ−表現型）とを備えることを特徴とするＭ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシス臨床分離株、より好ましくはＭ．ツベルクローシス分離株ＭＴ１０３に属する分離された微生物を含む組成物に関するものであり、より好ましくは、上記微生物はＭＴＢＶＡＣ株であり、組成物は少なくとも３×１０^３ｃｆｕ／０．１ｍｌ以上の分離された微生物を含む。上記組成物は、３×１０^３ＣＦＵ／０．１ｍｌ〜１７×１０^６ｃｆｕ／０．１ｍｌの分離された微生物を含むことが好ましい。上記組成物は、３×１０^３ｃｆｕ／０．１ｍｌ〜１７×１０^３ｃｆｕ／０．１ｍｌ、又は３×１０^４ｃｆｕ／０．１ｍｌ〜１７×１０^４ｃｆｕ／０．１ｍｌ、又は３×１０^５ｃｆｕ／０．１ｍｌ〜１７×１０^５ｃｆｕ／０．１ｍｌ、又は３×１０^６ｃｆｕ／０．１ｍｌ〜１７×１０^６ｃｆｕ／０．１ｍｌの分離された微生物を含むことがより好ましい。

本発明の第４の態様では、Ｍ．ツベルクローシスによる感染症のリスクがある小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおける、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる感染症の予防又は阻止（ブースターワクチン接種を含む）のため、第３の態様の組成物が投与される。より好ましくは、上記組成物は、皮内経路を介して投与される。

本発明の第５の態様では、結核疾患を発症するリスクがあり、潜伏性結核感染症を患う小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおける、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる活動型疾患と関連する臨床総体症状の発症の予防又は阻止のため、第３の態様の組成物が投与される。より好ましくは、上記組成物は、皮内経路を介して投与される。

本発明の第６の態様では、新生児、並びに小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおいて潜伏性及び／又は活動性のＴＢに感染した患者を治療するための二次薬としての使用のため、第３の態様の組成物が投与される。より好ましくは、上記組成物は、皮内経路を介して投与される。

本発明の第７の態様では、Ｍ．ツベルクローシスによる感染のリスクがある小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおける、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる感染症に対する予防的治療又は阻止治療におけるワクチン再接種又はブースター投薬のため、第３の態様の組成物が投与される。この意味で、初期免疫後のブースター注射又はブースター投薬は免疫抗原への再曝露であることに留意されたい。再曝露は、その抗原に対する記憶が時間の経過により減少した後、その抗原に対する免疫を防御レベルに増大し戻すことを意図している。

一方、本発明の著者らは、ＭＴＢＶＡＣ株を用いて上に言及される本発明のいずれかの態様を実施し、一貫した結果、及び＋２℃〜８℃で保管される少なくとも２年の保管有効期間を有する製品を提供する開発プロセスで凍結乾燥後の生存能の低下を最小限に抑える好ましい方法を達成するため、ＭＴＢＶＡＣワクチンの最も適切な生産プロセスを確立するための数多くの研究を行った。最初の概算として、異なる培養培地と並んで異なる安定剤の組成を試験した。

ＭＴＢＶＡＣワクチンの生産における第１の課題は、規定の組成を有し、動物起源の成分がない培地で培養することであった。このため、ＳＯ２株を用いて実験を行った。既に述べたように、ＭＴＢＶＡＣ株をそのプロトタイプＳＯ２に表現型上及び機能上、類似するように遺伝子操作を行い、したがって、ＳＯ２株はＭＴＢＶＡＣワクチンの最も適切な生産プロセスを確立するための適切な出発点とみなされたことに留意されたい。

ＳＯ２株を用いることで、その組成に何らの動物由来の成分も含まない異なる培地を開発し、試験した。検証済みの培養培地の幾つかは次のとおりである。
Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ７Ｈ９及び変形（Media for Tubercle Bacilli, Dubos, R.J. and Middlebrook, G. American Review of Tuberculosis and Pulmonary Diseases, 1947 Vol. 56 No.4 pp. 334-45 ref.15）。
Ｓａｕｔｏｎ合成培地（Handbook of Microbiological Media, Fourth Edition, Ronald M. Atlas, CRC Press, 2010. Page 1540）及び変形。

Ｓａｕｔｏｎ培地及びＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ培地の組成を下記表で詳述する：

Ｓａｕｔｏｎ培地では、増殖は基準培地と類似していた（改変していないＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ培地、表２）。図１は、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋにおける増殖曲線とＳａｕｔｏｎ培養培地の増殖曲線を比較した。培養培地の組成と並行して、これらの試験では、培養時間、培養の継代数及び増殖のタイプ、静置又は攪拌等のその他の変数を実験室規模でプロファイルし始めた（表３を参照されたい）。

最後に、Ｓａｕｔｏｎ合成培地は、ＳＯ２株の増殖に有効であることから、静置増殖条件下で選択した。非静置増殖条件も選択できたが、培養は好気的条件下にある必要がある。

開発の次の段階は、凍結乾燥プロセスを研究することであった。凍結乾燥は、生ワクチンの生産における重要な工程である。微生物は温度等の凍結乾燥後の環境要因の影響を受けやすいだけでなく、増殖及び製剤化の条件もプロセスの成功に影響を与える可能性があるため、凍結乾燥ワクチンの安定性を達成することは複雑なプロセスである。凍結乾燥後の生存可能な細菌の収率及びその後の保管安定性は、凍結乾燥サイクル、安定剤の組成、残留水分及び空気の存在等の要因によって影響を受ける可能性がある。

ＳＯ２を用いた開発フェーズでは、最大１１種類の異なる安定剤組成物を試験した。下記表は、試験した安定剤の組成を示す。

安定剤の研究では、異なる製剤も試験し、組成に加えて、安定剤及び培養培地の割合と並んで、凍結乾燥の量を変化させた。全ての試験において、凍結乾燥物の生存能低下及び３７°で３０日後の安定性を判断した。今後の試験で安定剤を選択するための基準として、３７℃で加速安定性試験後、生存能低下の限界を９０％及び／又は最大で８０％の低下を確立した（表５の結果を参照されたい）。

上で言及される予備試験の後、安定剤を使用しない凍結乾燥における低下は９９％を超えたため、凍結乾燥する培養培地に安定剤を添加する必要があると結論付け、３７℃での凍結乾燥の低下の仕様及び加速安定化の仕様を満たす最良の安定剤はＧＳＡ（グルタミン酸ナトリウム及びスクロース）であった。

上記の結論に達した後、ＭＴＢＶＡＣ株をフリーズドライされたプレマスターシードロットの形態で受け取り、その直後に、本発明者らは、この特定の株の細胞培養を開始した。ＭＴＢＶＡＣ株の増殖のため、親株ＳＯ２の増殖研究で用いたものと同じ組成を有する第１のＳａｕｔｏｎ培地（表１を参照されたい）を使用した。しかしながら、予想外に、ＭＴＢＶＡＣの場合、ＳＯ２株について観察されたよりも低い増殖がＳａｕｔｏｎ合成培地で観察された。さらに、ＭＴＢＶＡＣ株の増幅フェーズにおける課題も検出された。これらの課題を解決するため、Ｓａｕｔｏｎ培地の組成に成分を追加及び上記培地の組成から成分を除去する試験を行った。かかる改変は、グルコース、硫酸亜鉛、ビオチン、グリセロール及びポリソルベート等の補助剤の添加又は除去で構成される。

硫酸亜鉛及びビオチンによるＳａｕｔｏｎ合成培地の富化は良好な結果を示さず、ＭＴＢＶＡＣの増殖は観察されなかった。グルコース、ポリソルベート及びグリセリンによる富化の場合、結果は良好であり、ＭＴＢＶＡＣの十分な増殖が得られた。

これらの増殖研究の結果、ＳＤ培地及びＳＤＧ培地が開発され、ＭＴＢＶＡＣ培養物をこれらの培地で増殖させた。ＭＴＢＶＡＣの増殖は、ＳＤ培地とＳＤＧ培地の両方で良好であったが、ＳＤＧ培地中の連続継代の後、一部の培養物が停止したため、増幅継代に選択したのはＳＤ培地であった。図２は、Ｓａｕｔｏｎ培地、ＳＤ培地及びＳＤＧ培地におけるＭＴＢＶＡＣ培養物のＯＤの結果を示す。

しかしながら、ＭＴＢＶＡＣ株の培養が凍結乾燥又はフリーズドライしたマスターシードロットのバイアルから開始された場合、ＳＤ培地では増殖を開始できなかったことが観察されたため、その組成に改変を行って、シード培地を開発した。これらの研究の結論として、また、培養を開始する手段として将来のパイロット試験及び産業試験のためにシード培地を選択し、ＳＤ培地を増幅継代するための手段として選択し、凍結乾燥前の大量培養のための手段としてＳＤＧ培地を選択した。さらに、安定剤と組み合わせたＳＤ培地の組成が凍結乾燥プロセス及び錠剤の外観に影響を及ぼしたことから、凍結乾燥プロセスをＳＤＧ培地でのみで行うことに留意することが重要である。

本発明者らは、本明細書において、シード培地、ＳＤ培地及びＳＤＧ培地の組成を提供する。

この意味で、以下の３つの表は、研究で開発された手段で得られた結果の一貫性を実証するＭＴＢＶＡＣ２．５×１０^５の５つのバッチの工業規模の生産の結果を示す。

以前に示されたＳＯ２株を用いた開発の研究では、本発明者らは、凍結乾燥プロセスでは、生存細菌数の損失を減らし、凍結乾燥物の安定性を改善するために安定剤を使用する必要があると結論付けた。ＭＴＢＶＡＣの開発には、ＳＯ２を用いた研究で選択したのと同じ安定剤を用いた。目的は、３×１０^３ｃｆｕ／０．１ｍｌ〜１７×１０^６ｃｆｕ／０．１ｍｌの範囲、好ましくは３×１０^３ｃｆｕ／０．１ｍｌ〜１７×１０^３ｃｆｕ／０．１ｍｌ、又は３×１０^４ｃｆｕ／０．１ｍｌ〜１７×１０^４ｃｆｕ／０．１ｍｌ、又は３×１０^５ｃｆｕ／０．１ｍｌ〜１７×１０^５ｃｆｕ／０．１ｍｌ、又は３×１０^６ｃｆｕ／０．１ｍｌ〜１７×１０^６ｃｆｕ／０．１ｍｌの範囲の濃度のＭＴＢＶＡＣ株を含む凍結乾燥ワクチンを得て、一貫した結果及び２℃〜８℃で保管される少なくとも２年の保管有効期間を有する製品を提供する開発プロセスで凍結乾燥後の生存能の低下を最小限にすることであった。

ＭＴＢＶＡＣを用いる開発フェーズでは、最大７種類の異なる安定剤組成物を試験した。下記表１１は、試験した安定剤の組成を説明する。

下記表１２及び表１３は、ＭＴＢＶＡＣの実験室規模での凍結乾燥試験の加速安定性研究における生存能低下のパーセンテージの観点で結果を示している。表は、凍結乾燥プロセスにおける安定剤と組み合わせた凍結乾燥培地の組成の効果を示す。これらの研究から、ＭＴＢＶＡＣの凍結乾燥のために安定剤を添加する必要があり、ＧＳＡ安定剤は試験したパラメータについて最良の結果をもたらすものであると結論付けた。

最後に、下記表は、ＭＴＢＶＡＣの４つのバッチの凍結乾燥の結果を示す。

図３は、上記表１４で特定したロット又はバッチの２℃〜８℃及び−３０℃の間の安定性の結果を示す。さらに、下記表１５は、パイロットプラント及び工業プラントにおける表１１（ＳＤＧ培地）の培養物の並行凍結乾燥の更なる結果を提供する。

上記の結果はいずれも、ＭＴＢＶＡＣ株を増殖させた、好ましくは１×１０^８ｃｆｕ／ｍＬ〜５×１０^８ｃｆｕ／ｍＬの範囲で増殖させたＳＤＧ培地の凍結乾燥により得られた。上記の凍結乾燥を行うため、グルタミン酸ナトリウム及びスクロース（ＧＳＡ）を、好ましくは１０ｇ／Ｌ〜４０ｇ／Ｌのグルタミン酸ナトリウム及び１００ｇ／Ｌ〜４００ｇ／Ｌのスクロースの濃度で添加したことに留意されたい。

したがって、以下に更に記載されるように、生きているＭＴＢＶＡＣ株に基づく医薬品の調製に使用することができる具体的な製剤及び方法が本明細書に記載されている。本発明の製剤は、以下に詳述するいずれかの組成物それ自体を含み又はそれからなり、これらはＭＴＢＶＡＣ株を培養するために使用され得る。組成を以下に詳述する。

したがって、本発明の第８の態様は、上記を特徴とするシード培地を含む、又はそれのみからなる組成物に関する。

本発明の第９の態様は、上記を特徴とするＳＤ培地を含む、又はそれのみからなる組成物に関する。

本発明の第１０の態様は、上記を特徴とするＳＤＧ培地を含む、又はそれのみからなる組成物に関する。

本発明の第１１の態様は、上記を特徴とするシード培地、ＳＤ培地又はＳＤＧ培地のいずれかに関するものであり、上記培地は、そこで増殖するＭＴＢＶＡＣ株を、好ましくは１×１０^８ｃｆｕ／ｍＬ〜５×１０^８ｃｆｕ／ｍＬの範囲で更に含む。

本発明の第１２の態様は、ＭＴＢＶＡＣ株を好気条件下で培養又は拡大するための、上記を特徴とするシード培地、ＳＤ培地又はＳＤＧ培地のいずれかの使用に関する。この意味で、好ましくはＭＴＢＶＡＣ株培養を開始する手段としてシード培地が選択され、増幅継代の手段としてＳＤ培地が選択され、凍結乾燥前の大量培養の手段としてＳＤＧ培地が選択される。本発明の第１２の態様の特に好ましい実施形態では、本発明は、使用準備の整った（a ready to）フリーズドライ弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物を製造する方法であって、上記組成物が、ｉ）Ｒｖ０７５７遺伝子の遺伝的欠失による不活性化によるＰｈｏＰ−表現型と、ｉｉ）ＰＤＩＭ産生を妨げる第２の遺伝子Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）の欠失（ＰＤＩＭ−表現型）とを有する、Ｍ．ツベルクローシス株に属する分離された微生物、より好ましくはＭＴＢＶＡＣ株を含み、該方法が、Ｍ．ツベルクローシス株の培養を開始することと、適切な細胞培地を用いて上記細菌を拡大又は増幅することとを含み、上記方法が、凍結乾燥前の大量培養のためＳＤＧ培地を使用することを特徴とする、方法に関する。上記方法は、シード培地においてＭ．ツベルクローシス株の培養を開始することと、ＳＤ培地を用いて上記細菌を増殖又は増幅することと、凍結乾燥前の大量培養にＳＤＧ培地を使用することとを含むことが好ましい。上記方法は、凍結乾燥工程に先立って大量培養に用いるＳＤＧ培地に安定剤としてスクロース及びグルタミン酸ナトリウムを添加することによるフリーズドライ工程を更に含むことがより好ましい。

さらに、或る特定の成分（例えば、特定の安定剤、増量剤、及びバッファー）は、凍結乾燥ＭＴＢＶＡＣ株ワクチンの調製において有利であることがわかっている。本発明はまた、再構成されたワクチン、並びに本明細書に記載される組成物を利用する予防方法及び治療方法に関する。本発明の組成物及び方法を、以下のとおり更に説明する。

特に、本発明の第１３の態様は、Ｍ．ツベルクローシス株に属する分離された微生物を含む弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物であって、
前記微生物が、
ｉ）Ｒｖ０７５７遺伝子の遺伝的欠失による不活性化によるＰｈｏＰ−表現型と、
ｉｉ）ＰＤＩＭ産生を妨げる第２の遺伝子Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）の欠失（ＰＤＩＭ−表現型）とを有し、好ましくは前記Ｍ．ツベルクローシス株がＭＴＢＶＡＣ株であり、
前記組成物がフリーズドライ組成物であり、
前記組成物が、安定剤としてスクロース及びグルタミン酸ナトリウムを添加することにより前記微生物を含む培養培地を凍結乾燥させることによって得られ、
前記培養培地がＳＤＧ培地である、ワクチン組成物を提供する。より好ましくは、第１３の態様では、本発明は、弱毒生Ｍ．テューバキュローシスワクチン組成物であって、ｉ）Ｒｖ０７５７遺伝子の遺伝的欠失による不活性化によるＰｈｏＰ−表現型と、ｉｉ）ＰＤＩＭ産生を妨げる第２の遺伝子Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）の欠失（ＰＤＩＭ−表現型）とを有するＭ．ツベルクローシス株に属する分離された微生物を含み、好ましくは前記Ｍ．ツベルクローシス株がＭＴＢＶＡＣ株であり、前記弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物が本発明の第１２の態様の方法によって得られる又は取得可能である、ワクチン組成物を提供する。

更に好ましくは、本発明は、弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物、好ましくはフリーズドライ後の再構成組成物であって、ｉ）Ｒｖ０７５７遺伝子の遺伝的欠失による不活性化によるＰｈｏＰ−表現型と、ｉｉ）ＰＤＩＭ産生を妨げる第２の遺伝子Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）の欠失（ＰＤＩＭ−表現型）とを有するＭ．ツベルクローシス株に属する分離された微生物を含み、好ましくは前記Ｍ．ツベルクローシス株がＭＴＢＶＡＣ株であり、前記組成物が、１ｍＬ当たりに以下の成分（パーセント単位で）を含むか、又はそれらのみからなることを特徴とする、ワクチン組成物を提供する。

更に好ましくは、上の段落で言及される弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物は、フリーズドライされているか、又はフリーズドライされた組成物に水、好ましくは注射用滅菌水を添加して得られる再構成組成物である。

本発明の第１３の態様における好ましい実施形態において、又はその好ましい実施形態のいずれかにおいて、前記組成物は、０．１ｍｌ当たり、好ましくは水０．１ｍｌ当たり、少なくとも３×１０^３ｃｆｕ以上の微生物株を含むことを特徴とする。好ましくは、前記組成物は、０．１ｍｌ当たり３×１０^４ｃｆｕ〜０．１ｍｌ当たり１７×１０^６ｃｆｕの前記分離された微生物株を含む。より好ましくは、前記組成物は、０．１ｍｌ当たり３×１０^４ｃｆｕ〜１７×１０^４ｃｆｕ、又は０．１ｍｌ当たり３×１０^５ｃｆｕ〜１７×１０^５ｃｆｕ、又は０．１ｍｌ当たり３×１０^６ｃｆｕ〜１７×１０^６ｃｆｕの前記分離された微生物株を含む。更に好ましくは、１．５×１０^５ｃｆｕ／０．０５ｍｌ〜８．５×１０^５ｃｆｕ／０．０５ｍｌのＭＴＢＶＡＣ株を含むフリーズドライＭＴＢＶＡＣワクチンの放出仕様を下記表に詳述する。

さらに、本明細書に示すとおり、安定性データは、プレマスターシードから調製されたマスター細胞バンク及びワーキング細胞バンクの両方が安定していること（図８を参照されたい）、並びに−１５℃〜３０℃及び＋２〜＋８℃で保管されたワクチンＭＴＢＶＡＣが２４ヶ月を超えて安定していることを実証している（図３及び図１０を参照されたい）。

さらに、使用安定性試験では、ＭＴＢＶＡＣワクチンが再構成されると室温で少なくとも８時間安定であることが示されている。

本明細書の他の箇所で更に詳細に論じるように、本発明の組成物は、有効成分の安定性及び生存能の点で特に有利であり、これは、大部分が、凍結乾燥を含む製剤化及び製品が調製される方法に起因する。一般に、この方法には、凍結、一次乾燥、二次乾燥、及びストッパーリング（stoppering）の工程が含まれる。この方法は、以下の実験例において更に詳細に記載されるが、その方法の一例は次の通りである。凍結工程では、凍結乾燥機の棚を−５０℃に予冷する。全てのトレイを入れたら、棚を−５０℃で１２０分間保持する。一次乾燥工程では、真空を２５ｍＴに設定し、＋０．１℃／分で−４０℃の棚温度まで上昇させ、５００分間保持する；＋０．１℃／分で−３５℃の棚温度まで上昇させ、５００分間保持する；＋０．１℃／分で−３０℃の棚温度まで上昇させ、５００分間保持し、＋０．１℃／分で−２５℃の棚温度まで上昇させ、８００分間保持するランプ（ramp）工程を行う。二次乾燥工程では、真空を２５ｍＴのままにし、＋０．１℃／分で＋２０℃の棚温度まで上昇させて８００分間保持するようにランプ工程を行う。必要に応じて、製品は、ストッパーリング前に＋２０℃、２５ｍＴで更に２４時間まで保持することができる。ストッパーリング工程では、チャンバーを、０．２２μｍで濾過された乾燥窒素ガスにより脱気し、真空を８００ｍｂａｒ（わずかに真空）に設定し、ストッパーをバイアルに押し込む。本発明で使用され得る代替の凍結乾燥サイクルは、当該技術分野でよく知られている。したがって、本発明の方法は、例えば−７０℃〜−３０℃（例えば、−６０℃〜−４０℃、又は−５０℃）の温度で又はその程度の温度まで（at or to about）凍結することを含んでもよい。凍結を約３０分〜２４０分（例えば、６０分〜１２０分）以上行うことができる。次いで、本明細書に記載されているように、材料を１つ以上の乾燥工程に供してもよい。これらの工程では、真空を適用することができ（例えば、２５ｍＴ）、一定期間（１００分〜１０００分等、例えば、２００分〜６００分又は３００分〜５００分）に亘って徐々に（例えば、０．１℃／分〜１．０℃／分、又は０．５℃／分）温度を変化させることができる。一次乾燥では、温度は、例えば−３０℃〜＋１０℃、例えば−２０℃〜＋５℃又は−１５℃〜０℃まで又はその程度の温度まで上昇させてもよく、一方、二次乾燥では、例えば＋５℃〜＋３５℃、例えば１０℃〜３０℃、又は１５℃〜２０℃まで温度を変化させてもよい。当業者に知られているとおり、これらのパラメータ（例えば、温度、保持時間、ランプ速度、及び真空レベル）は、例えば、得られる結果に基づいて変更することができる。

本発明の第１３の態様のワクチン組成物は、本発明の第１４の態様に従って、Ｍ．ツベルクローシスに感染するリスクにある人若しくは結核疾患を発症するリスクがある人に対する一次予防薬として投与されてもよく、又は感染患者を治療するための二次薬として使用されてもよい。これらの組成物の株は弱毒化されているため、新生児、小児、青年、成人及び高齢者等の「リスクがある個体」への投与に特に適している。かかるワクチンは、獣医学の状況でも使用することができる。

本発明の第１４の態様の好ましい実施形態は、結核によって引き起こされる症状に対して個体を免疫するためのＭＴＢＶＡＣワクチンに関する。上記ワクチンは、膀胱癌の治療だけでなく、ＴＢの治療若しくは予防、又はベクター若しくはアジュバントとしても適している可能性があることに留意されたい。ＴＢによって引き起される症状に対して個体を免疫することが好ましい。

本発明の第１４の態様の別の好ましい実施形態では、第１３の態様の組成物は、Ｍ．ツベルクローシスに感染するリスクがある新生児又はＴＢ疾患を発症するリスクがある新生児において、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる感染症の予防のため投与される。上記組成物は、皮内経路を介して新生児に投与されることがより好ましい。

本発明の第１４の態様の別の好ましい実施形態では、第１３の態様の組成物は、Ｍ．ツベルクローシスによる感染症のリスクがある小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおける、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる感染症の予防又は阻止（ブースターワクチン接種を含む）のため投与される。上記組成物は、皮内経路を介して投与されることがより好ましい。

本発明の第１４の態様の別の好ましい実施形態では、第１３の態様の組成物は、ＴＢ疾患を発症するリスクがあり、潜伏性結核感染症を患う小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおける、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる活動型疾患と関連する臨床総体症状の発症の予防又は阻止のため投与される。上記組成物は、皮内経路を介して投与されることがより好ましい。

本発明の第１４の態様の別の好ましい実施形態では、第１３の態様の組成物は、新生児、並びに小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおいて潜伏性及び／又は活動性のＴＢに感染した患者を治療するための二次薬としての使用のため投与される。上記組成物は、皮内経路を介して投与されることがより好ましい。

本発明の第１４の態様の別の好ましい実施形態では、第１３の態様の組成物は、Ｍ．ツベルクローシスによる感染のリスクがある小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおける、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる感染症に対する予防的治療又は阻止治療におけるワクチン再接種又はブースター投薬のため投与される。この意味で、初期免疫後のブースター注射又はブースター投薬は免疫抗原への再曝露であることに留意されたい。再曝露は、その抗原に対する記憶が時間の経過により減少した後、その抗原に対する免疫を防御レベルに増大し戻すことを意図している。

本明細書及び特許請求の範囲を通して、「含む」という単語及びその変化形は、その他の技術的な特性、添加剤、成分又は工程の除外を意味するものではない。当業者にとって、本発明のその他の目的、利点及び特性は、一部には本明細書から、また一部には発明が実施される際に生じる。以下の実施例及び図面は、本発明の非限定的な実例により提供される。

実施例１．免疫原性及び防御は、新生仔マウスにおけるＭＴＢＶＡＣの用量とは無関係である
新生仔Ｃ３Ｈマウス（１日齢〜３日齢）に、１回の臨床用量を含む２５μｌのＢＣＧ（およそ２．５×１０^５）、又は指定のＣＦＵ投与量のＭＴＢＶＡＣを用いて皮内にワクチン接種を行った。ＢＣＧ群の場合、ロット１１１０５３Ｆ及びロット１１３０３３Ｃに対応する、ＢＣＧデンマーク株の市販バイアルを使用した。ＭＴＢＶＡＣの場合、ＭＴＢＶＡＣ株を増殖させたＳＤＧ培地の凍結乾燥によって生産されるＭＴＢＶＡＣワクチンで動物を免疫し、上記凍結乾燥を行うため、グルタミン酸ナトリウム１０ｇ／Ｌ〜４０ｇ／Ｌ及びスクロース１００ｇ／Ｌ〜４００ｇ／Ｌの濃度のグルタミン酸ナトリウム及びスクロース（ＧＳＡ）を加えた。凍結乾燥した製剤を再懸濁した。

防御有効性研究
ワクチン接種から８週間後、マウスに１５０ＣＦＵのＭ．ツベルクローシス株Ｈ３７Ｒｖで鼻腔内チャレンジを行った。４週間後、マウスを屠殺し、７Ｈ１１Ｓ固体培地上の組織ホモジネートのプレーティングにより肺における細菌負荷を特定した。結果を図４に示す。

免疫原性に関する研究
ワクチン接種から８週間後、マウスを屠殺し、免疫原性評価のため脾臓細胞を分離した。１００万個の脾臓細胞を、精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）１０μｇ／ｍｌ、オーバーラップするＥＳＡＴ６ペプチド若しくはＣＦＰ１０ペプチド２μｇ／ｍｌ、又は非抗原（陰性対照）の存在下で２４時間インキュベートした。インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）産生細胞をＥＬＩＳＰＯＴにより分析した。結果を図５に示す。

結論
ＭＴＢＶＡＣによって誘発されるＰＰＤ、ＥＳＡＴ６又はＣＦＰ１０に特異的な防御有効性も免疫原性も、新生仔マウスモデルにおいて用量依存性ではないことが示された。

実施例２．新生児における第１Ｂ相免疫原性データ（南アフリカ）
目的：本発明者らは、本発明に記載されるＭＴＢＶＡＣワクチンを用いた新生児のワクチン接種後の免疫原性を決定し、誘導免疫応答を特性評価するため探索を行った。

方法：３６名のＨＩＶに曝露されていないＢＣＧナイーブ健常新生児を１：３に無作為化し、生後９６時間以内に２．５×１０^３ＣＦＵ、２．５×１０^４ＣＦＵ又は２．５×１０^５ＣＦＵのＢＣＧ（ＳＳＩ株）又はＭＴＢＶＡＣのいずれかを与えた。全血中のＭＴＢＶＡＣ特異的サイトカイン応答を、全血細胞内サイトカイン染色及びＢＤＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａのフローサイトメトリー（１８色、青−赤−紫−緑の構成）によって７日目、２８日、７０日目に測定した。

全血ＩＣＳアッセイの説明（Narrative）：
ヘパリン化した新鮮な全血を、ＢＣＧ、ＭＴＢＶＡＣ、若しくはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で直ちに刺激するか、又は３７℃で１２時間刺激せずにおいた（Ｎｉｌ）。刺激条件は、血液量の半分［２５０μＬ（０．２５ｍｌ）］、並びにＮｉｌのみ、ＭＴＢＶＡＣ及びＢＣＧを含む。７時間の刺激の後、上清（可溶性サイトカイン／ケモカイン分析用）を全ての条件から収集し、−ＢＯＣで凍結し、更なる分析用にＳｐｏｎｓｏｒに送るため保管した。上清除去後、ブレフェルジン（brefeldin）Ａを、残りの全血及びチューブに加えて、プログラム可能な水浴で更に５時間インキュベートした。水浴は、合計１２時間の刺激の後にスイッチがオフになる。翌朝、赤血球を溶解するため、また白血球を固定するためＦＡＣＳ溶解液を加えた。次いで、固定された白血球を、後の細胞内サイトカイン染色用及びフローサイトメトリー用に凍結した。フローサイトメトリーの染色及び取得は、後の時間点で、バッチで行われる。ＣＤ４Ｔ細胞による特異的１型サイトカイン及びＩＬ−１７の頻度及びパターンの測定を評価した。免疫原性の時間点は、ＳＡＴＶＩにより行われた最近の研究に基づいて選択されており、乳児におけるＢＣＧ誘発性Ｔ細胞応答のピークは生後６週〜１０週あたりであることを示している。

結果：ＭＴＢＶＡＣの用量を段階的に増大させて行うワクチン接種は、主にＴｈ１（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、又はＴＮＦ−α）抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞応答をもたらした。最高用量である２．５×１０^５ＣＦＵのＭＴＢＶＡＣは、７０日目に最も大きい抗原特異的ＣＤ４Ｔ細胞サイトカイン応答を誘導した。最低用量である２．５×１０^３ＣＦＵのＭＴＢＶＡＣは、最も免疫原性が低かった。図６において結果を更に説明する。

結論：これらのデータは、２．５×１０^４ＣＦＵ又は２．５×１０^５ＣＦＵ以上のＭＴＢＶＡＣによるワクチン接種が、ＴＢエンデミック環境の新生児において免疫原性であることを示している。

実施例３．ＢＣＧワクチンＳＳＩと比較したＭＴＢＶＡＣの無作為化、二重盲検、用量増大臨床試験、ＴＢエンデミック地域に住む成人において安全アームを有する新生児

目的．ＴＢエンデミック地域の新生児におけるＭＴＢＶＡＣ対ＢＣＧの３つの用量の安全性及び免疫原性の評価

方法１８名のＨＩＶ−、ＱｕａｎｔｉＦＥＲＯＮ（ＱＦＴ）−、以前にＢＣＧワクチン接種した健康な成人を１：１に無作為化してＭＴＢＶＡＣ（５×１０^５ＣＦＵ）又はＢＣＧＳＳＩを与えた。その後、３６名のＨＩＶに曝露されていないＢＣＧナイーブ健常新生児を１：３に無作為化し、生後９６時間以内に２．５×１０^３ＣＦＵ、２．５×１０^４ＣＦＵ又は２．５×１０^５ＣＦＵのＢＣＧＳＳＩ又はＭＴＢＶＡＣを与えた。ＱＦＴを１８０日目及び３６０日目に行い、ＱＦＴ＋乳児（０・３５ＩＵ／ｍＬ超）をイソニアジド予防療法に対して参照した。

結果全ての成人が局所注射部位の反応を経験し、１８名（１００％）が腫脹、１６名（８８．９％）が発赤、１０名（５５．５％）が潰瘍を起こした。９例の反応が中等度と報告され、１例の腫脹事象が重症であった（３５ｍｍ）。２８日目においてＳＡＥは報告されなかった。

ＢＣＧワクチンＳＳＩが利用不可であることから、最高用量のＭＴＢＶＡＣを６名の乳児に非盲検で投薬した。３つ全てのコホートの乳児１６名（４４．４％）で、局所反応があり（２名［１６．６％］、３名［２５％］及び１１名［９１．６％］）、腫脹１４名（３８．９％）、紅斑５名（１３．９％）及び瘢痕化９名（２５．０％）はいずれも軽度と評価された。潰瘍は見られなかった。全身のＡＥはコホート（ｎ＝３２／４２／４０）間で類似しており、９名が（ｎ＝３／４／２）中程度、８名（ｎ＝４／２／２）が重症と評価された。６名の乳児は７例の無関係なＳＡＥを経験し、これには検死によって確認されたウイルス性肺炎による無関係の死亡が含まれる。

用量関連ＱＦＴ変換は、コホート１（ｎ＝３、３７．５％）、コホート２（ｎ＝６、７５％）、及びコホート３（ｎ＝７、７７．８％）のＭＴＢＶＡＣレシピエントにおいて１８０日目に認められたが、ＢＣＧレシピエントの７名ではゼロであった。３６０日目において、図７に示すように、コホート１で０名（０．０％）、コホート２で２名（２５．０％）、及びコホート３で４名（４４．４％）のＭＴＢＶＡＣレシピエントに陽性ＱＦＴが見られた。

結論ＭＴＢＶＡＣは、南アフリカの新生児において３つの用量レベルで安全のようであり、一時的な用量依存性ＱＦＴ変換をもたらすように見え、これらは、ＴＢエンデミック地域における免疫原性の有望な指標となり得る。さらに、ＭＴＢＶＡＣワクチンの反応原性は、ＢＣＧワクチンで産生される反応原性よりも明らかに低く、ＢＣＧワクチンを投与した８名中５名（６２％）の新生児で瘢痕を生じるが、最高用量のＭＴＢＶＡＣは１０名中わずか２名（２０％）の新生児で瘢痕を生じたにすぎない。

Claims

使用準備の整ったフリーズドライ弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物を製造する方法であって、
前記組成物が、
ｉ）Ｒｖ０７５７遺伝子の遺伝的欠失による不活性化によるＰｈｏＰ−表現型であって、ＰｈｏＰのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列が配列番号４からなる表現型と、
ｉｉ）ＰＤＩＭ産生を妨げる第２の遺伝子Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）の欠失（ＰＤＩＭ−表現型）であって、ｆａｄＤ２６のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）配列が配列番号２からなる欠失と、
を有する、Ｍ．ツベルクローシスＭＴＢＶＡＣ株に属する分離された微生物を含み、
前記方法が、ＭＴＢＶＡＣ株の培養を開始することと、１つ以上の適切な細胞培地を用いて前記細菌を拡大又は増幅することとを含み、
前記方法が、凍結乾燥前の大量培養のため、以下：

に示す定量的及び定性的な組成を含むＳＤＧ培地を使用することを特徴とし、
前記方法が好気的条件下で行われる、方法。
前記方法が、下記表に定義されるシード培地でＭＴＢＶＡＣ株の培養を開始することと、下記表に定義されるＳＤ培地を使用して前記細菌を拡大又は増幅することとを含む、請求項１に記載の方法。
前記方法が、凍結乾燥工程に先立って大量培養に使用されるＳＤＧ培地に安定剤としてスクロース及びグルタミン酸ナトリウムを添加することによるフリーズドライ工程を更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
ＭＴＢＶＡＣ株に属する分離された微生物を含む弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物であって、
前記微生物が、
ｉ）Ｒｖ０７５７遺伝子の遺伝的欠失による不活性化によるＰｈｏＰ−表現型と、
ｉｉ）ＰＤＩＭ産生を妨げる第２の遺伝子Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）の欠失（ＰＤＩＭ−表現型）と、
を有し、
前記組成物がフリーズドライ組成物であり、
前記組成物が、安定剤としてスクロース及びグルタミン酸ナトリウムを添加することにより前記微生物を含む培養培地を凍結乾燥させることによって得られ、
前記培養培地がＳＤＧ培地である、ワクチン組成物。
弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物であって、ｉ）Ｒｖ０７５７遺伝子の遺伝的欠失による不活性化によるＰｈｏＰ−表現型と、ｉｉ）ＰＤＩＭ産生を妨げる第２の遺伝子Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）の欠失（ＰＤＩＭ−表現型）とを有するＭＴＢＶＡＣ株に属する分離された微生物を含み、前記弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物が請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法によって得られる又は取得可能である、ワクチン組成物。
弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物、好ましくはフリーズドライ後の再構成組成物であって、ｉ）Ｒｖ０７５７遺伝子の遺伝的欠失による不活性化によるＰｈｏＰ−表現型と、ｉｉ）ＰＤＩＭ産生を妨げる第２の遺伝子Ｒｖ２９３０（ｆａｄＤ２６）の欠失（ＰＤＩＭ−表現型）とを有するＭＴＢＶＡＣ株に属する分離された微生物を含み、前記組成物が、１ｍＬ当たりに以下の成分を含むことを特徴とする、ワクチン組成物。
フリーズドライされている、弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物。
請求物４又は７に記載のフリーズドライ組成物に、水、好ましくは注射用滅菌水を添加して得られる再構成組成物。
前記組成物が、０．１ｍｌ当たり、好ましくは水０．１ｍｌ当たり、少なくとも３×１０^３ｃｆｕ以上の微生物株を含むことを特徴とする、請求項４〜８のいずれか一項に記載の弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物。
前記組成物が、０．１ｍｌ当たり３×１０^４ｃｆｕ〜０．１ｍｌ当たり１７×１０^６ｃｆｕの前記分離された微生物株を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物。
前記組成物が、０．１ｍｌ当たり３×１０^４ｃｆｕ〜１７×１０^４ｃｆｕ、又は０．１ｍｌ当たり３×１０^５ｃｆｕ〜１７×１０^５ｃｆｕ、又は０．１ｍｌ当たり３×１０^６ｃｆｕ〜１７×１０^６ｃｆｕの前記分離された微生物株を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物。
前記組成物が、０．１ｍｌ当たり少なくとも３×１０^３ｃｆｕ以上の前記分離された微生物株、及び０．１ｍｌ当たり１７×１０^６ｃｆｕの前記分離された微生物株を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物。
前記組成物が、０．１ｍｌ当たり３×１０^４ｃｆｕ〜１７×１０^４ｃｆｕ、又は０．１ｍｌ当たり３×１０^５ｃｆｕ〜１７×１０^５ｃｆｕ、又は０．１ｍｌ当たり３×１０^６ｃｆｕ〜１７×１０^６ｃｆｕの前記分離された微生物株を含む、請求項４〜８のいずれか一項に記載の弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物。
Ｍ．ツベルクローシスによる感染のリスクがある新生児における、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる感染症の予防又は阻止に使用される、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物。
Ｍ．ツベルクローシスによる感染症のリスクがある小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおける、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる感染症の予防又は阻止（ブースターワクチン接種を含む）に使用される、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物。
結核疾患を発症するリスクがあり、潜伏性結核感染症を患う、ヒト新生児、並びに小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおける、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる活動型疾患と関連する臨床総体症状の発症の予防又は阻止に使用される、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物。
新生児、並びに小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおいて潜伏性及び／又は活動性のＴＢに感染した患者を治療するための二次薬として使用される、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物。
Ｍ．ツベルクローシスによる感染のリスクがあるヒト新生児、並びに小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおける、Ｍ．ツベルクローシスコンプレックス、好ましくはＭ．ツベルクローシスによって引き起こされる感染症に対する予防的治療又は阻止治療におけるワクチン再接種、ブースターワクチン接種又はブースター投薬に使用される、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物。
新生児、並びに小児、青年及び成人等の新生児ではないヒトにおける非結核マイコバクテリアによる感染症を含む、Ｍ．ツベルクローシスによって引き起こされる結核疾患以外の任意の無関係の感染症の予防のための二次薬として使用される、請求項４〜１３のいずれか一項に記載の弱毒生Ｍ．ツベルクローシスワクチン組成物。