CN104324365B

CN104324365B - 重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法

Info

Publication number: CN104324365B
Application number: CN201410574032.2A
Authority: CN
Inventors: 孙二琳; 丁娜; 王丽宁; 韩瑞发
Original assignee: TIANJIN INSTITUTE OF UROLOGY
Current assignee: TIANJIN INSTITUTE OF UROLOGY
Priority date: 2014-10-24
Filing date: 2014-10-24
Publication date: 2016-03-16
Anticipated expiration: 2034-10-24
Also published as: CN104324365A

Abstract

本发明公开了一种重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法，属于生物工程技术。其是将重组人干扰素-α-2b-BCG菌种接种到含卡那霉素30微升/毫升的Middlebrook？7H9液体培养基中，获得一级种子液；再在上述培养基中转接获得浓度标准OD₆₀₀的A值＞2的二级种子液；使用生物反应发生器进行大规模深层发酵培养，发酵罐原位连接切向流中空过滤柱，对发酵液离散洗涤菌体，再加入等体积的含有20％蔗糖、1~2％明胶、2％氯化钾、1~4％谷氨酸钠的混合液进行保护液置换；并经慢速预冷降温，真空冷冻干燥成干粉剂。这样获得的重组人干扰素-α-2b-BCG菌苗活性率高，降低了生产过程中污染的可能性。

Description

重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术，具体是一种重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法。

背景技术

重组人干扰素-α-2b-BCG（hIFN-α-2b-BCG）是目前用于膀胱肿瘤免疫灌注治疗的生物制剂。

以往卡介苗的冻干制备都是采用苏通马铃薯静置培养，菌膜挤压去水，钢瓶研磨后冻干的方法，首先进行种子活化：启开工作种子批菌种，在苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基或液体苏通培养基上静置培养2~3周，培养传代活化。然后，进行生产培养：可在苏通马铃薯培养基上再传一代或直接挑取生长良好的菌膜，接种于苏通综合培养基或经批准的其他培养基的表面，在培养瓶中，37~39℃恒温、静置培养7~14天。生产用培养基为苏通马铃薯培养基、胆汁马铃薯培养基或液体苏通综合培养基。倒入三角瓶内加蒸馏水，加热使全部溶解；纱布或G3砂芯漏斗过滤后用纯氢氧化铵NH₄OH矫正PH至7.2~7.4；用三角瓶进行分装，经15磅121℃，30~40分钟灭菌备用（马铃薯培养基需要将土豆切块，去离子蒸馏水中煮沸20~30分钟，静置冷却后脱脂棉纱布过滤，其余按照以上操作进行）培养结束后逐瓶检查，若有污染、湿膜、浑浊等情况应废弃。收集菌膜压干后，移入盛有不锈钢珠瓶内，钢珠与菌体的比例应根据研磨机转速控制在一适宜的范围，并尽可能在低温下研磨，加入适量无致敏原保护液稀释成一定浓度的原液。最后冷冻干燥：以明胶、蔗糖或谷氨酸钠作为冻干保护剂/赋形剂，进行真空冷冻干燥。对产品进行质量检测。

上述冻干粉剂制备虽然操作成本低廉，但是操作复杂，生长缓慢，活菌率低，容易产生污染，过程可控性差。

由于重组干扰素-α-2b-BCG在膀胱肿瘤免疫灌注治疗中，用量大，活性要求高，因此，需要更高效、可控，自动化程度高，活菌率高的大批量生产方法。

发明内容

本发明就是为了解决现有技术中，重组干扰素-α-2b-BCG冻干粉剂生产过程操作复杂，生长缓慢，活菌率低，容易产生污染，过程可控性差等问题，而提供一种重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法。

本发明是按照以下技术方案实现的。

一种重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法，其实按以下步骤制备的：

a.种子活化和培养基制备

采选重组干扰素-α-2b-BCG菌种并接种于含卡那霉素30微升/毫升的新鲜配制的Middlebrook7H9液体培养基中获得一级活化种子液；将一级活化种子液重新接种至上述培养基中，获得浓度达标准OD₆₀₀的A值>2的二级种子液；

其中的Middlebrook7H9液体培养基是按以下重量份的原料制成的，Middlebrook7H95份、甘油5份、Tween805份，加入900份蒸馏水121℃高压蒸汽灭菌15分钟制成A液；另将葡萄糖2份、牛血清白蛋白5份、NaCl0.8份加入100份蒸馏水，0.22μm滤膜过滤除菌后制成B液，将A液、B液混合制得；

b．生物反应器深层培养

发酵罐中最终装料容积比6~7:10的发酵培养基高压灭菌后，将二级种子液接种到发酵罐中，深层发酵培养7~10天，发酵期间取样检测生长情况并涂玻片抗酸染色检测无污染，检测OD₆₀₀值达2.0以上，收集发酵液；

其中每升发酵培养基按以下重量份数比的原料制备的：7H95份、甘油5份、Tween805份、葡萄糖2份，蒸馏水溶解；培养基配置后调节PH至7.0~7.5，高压蒸汽原位灭菌；

c．离散洗涤和保护液置换

发酵罐原位连接切向流中空过滤柱1.5PD600，用3倍体积以上的0.9％氯化钠溶液进行发酵液置换洗涤，再用6倍以上的1％谷氨酸钠无菌液进行置换洗涤，继续菌液富集培养4~6倍，最后加入相同体积的混合液，得到BCG终含量约为4*10⁸CFU/mL的冻干保护剂；

其中的混合液含有20％蔗糖、1~2％明胶、2％氯化钾、1~4％谷氨酸钠；

d．真空冷冻干燥

每个西林瓶中分装上述冻干保护剂1毫升，在真空冷冻干燥机中，慢速预冷降温，负压充氮压塞制成冻干粉末。

这样设计的本发明具有的优点是：

①扩增生长高效，菌体离散度好，制备效率高，单次生产量大，菌苗活性率高，适合大规模工业化生产；

②生产过程易检测；

③制备过程条件参数可控，容易优化和放大，更好地做到不同批次产物各种指标的一致性；

④发酵培养和洗涤富集是在全封闭自动化系统中进行，极大减少了污染的机会；

⑤直接富集散在菌体进行冻干制备，避免了研磨等容易造成的污染和细菌物理损耗。

附图说明

图1是本发明中发酵产物的离散洗涤和保护液置换步骤的生产流程示意图。

图中：1.阀门2.洗涤置换液容器

3.第一蠕动泵4.发酵罐

5.第二蠕动泵6.过滤柱

7.废液阀门8.第三蠕动泵

9.废液容器10.产品阀门

11.收获容器。

具体实施方式

下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。

一.主要材料及设备

1.Middlebrook（米德尔布鲁克）7H9培养基系在售商品

附表1Middlebrook7H9培养基成分

2.发酵罐采用美国NBSBIOFLO415的工作容积5升发酵罐。

3.切向流中空过滤柱1.5PD600，美国.通用电气医疗集团(GEHealthcare)生产。

4.蠕动泵，中国保定兰格恒流泵有限公司，BT600-2J，0.07-3000ml/min；

NBSBIOFLO415发酵罐的蠕动泵。

二.产品制备

1．种子活化和制备

冷冻或低温保存重组干扰素-α-2b-BCG种子批的液体培养复苏，菌种采选后接种于含卡那霉素30微升/毫升的新鲜配制的Middlebrook7H9液体培养基250mL中，恒温35~38℃、转速100~200rpm、饱和湿度下，于2000mL烧瓶中震摇培养7~10天获得一级活化种子液。以上新鲜的活化种子液接种至含卡那霉素30微升/毫升的Middlebrook7H9培养基2~3升（装料容积比4~6:10）中，发酵培养7~14天获得二级种子液（浓度达标准OD₆₀₀的A值>2）。

Middlebrook7H95g、甘油5ml、Tween805ml加入900ml蒸馏水121℃高压蒸汽灭菌15分钟制成A液，葡萄糖2g、牛血清白蛋白5g、NaCl0.8g加入100ml蒸馏水，0.22μm滤膜过滤除菌后制成B液，将A液、B液混合制成该步骤所需培养基。

2．生物反应器深层培养

（1）培养基每升中含药用级Middlebrook7H95g、甘油5mL、Tween805mL、葡萄糖2g，蒸馏水溶解。培养基配置后调节PH至7.0~7.5，体积约3~4升（美国NBSBIOFLO415的工作容积5升发酵罐为例），105℃高压蒸汽原位灭菌30分钟，开始发酵时的最终装料容积比6~7:10；

（2）培养温度设定为35~38℃，接入过滤空气，通气速度0.5SLPM（stardliterperminute），转速150~250rpm稳定2h后，确定溶氧度（D0-1）值为100%，PH约稳定至7.0~7.5；

（3）取二级种子新鲜培养液50mL（标准OD₆₀₀的A值为2时的BCG种子液，加料比2~8%）无菌情况下经加料孔加入发酵罐，设定发酵参数：接入过滤空气通气的起始速度0.5SLPM，起始转速150rpm，根据溶氧度80~90%关联调节通气保持0.5~2.0SLPM和转速150~400rpm，温度维持35~39℃。消泡剂采用植物豆油；

（4）培养过程中发酵培养液隔天取样，观察有无异常污浊和颜色变化，分光光度计检测OD₆₀₀值检测生长情况，并涂玻片进行抗酸染色检测无污染，如有污染立即停止发酵。发酵运行7~10天，检测OD₆₀₀值达2.0以上（2*10⁸CFU/mL）收获物料。

3．离散洗涤和保护液置换

发酵罐原位连接切向流中空过滤柱1.5PD600，用0.9%氯化钠进行进出入液体速度相同的置换洗涤>88%(>=3倍体积)，用含1％谷氨酸钠的无菌液置换>98%(约6倍或以上体积)，达到洗涤和离散菌体的作用。继续进行菌液富集约4-6倍，最后加入相同体积的混合液（20％蔗糖、1~2％明胶、2％氯化钾、1~4％谷氨酸钠）。冻干保护剂中BCG终含量约为4~6*10⁸CFU/mL。

4．真空冷冻干燥

每个西林瓶中装1毫升以上制备的液体，在真空冷冻干燥机中进行以下操作设定，冻干条件为慢速预冷降温：放入物料，搁板温度从室温开始下降，在2.5~3.5h到达设定预冷-35~-45℃温度后维持1~2小时，第一阶段升华干燥温度-10~-20℃，维持12~16小时，升华干燥真空度为0.3毫巴，第二阶段解析干燥保持温度25~30℃，时间设定为4~6小时。负压充氮情况下压塞制成冻干粉末。最后通过检测菌苗纯度、活菌量、水含量、溶解速度、热稳定性和豚鼠免疫效力实验检测其质量。

三．生物反应发生器原位洗涤和置换溶液流程

发酵结束后，发酵罐按照图1所示原位连接切向流中空过滤柱1.5PD600，向洗涤置换液容器2中加入3倍体积以上的0.9%氯化钠，打开阀门1、7，关闭产品阀门10，氯化钠溶液经第一蠕动泵3进入发酵罐4，发酵罐4中发酵溶液经第二蠕动泵5泵入切向流中空过滤柱6一端，第三蠕动泵8将废液从废液阀门7排入废液容器9，置换后的液体从中空过滤柱6的另一端进入发酵罐4继续循环置换，此步骤中始终保持第一蠕动泵3、第三蠕动泵8内液体流过的速度相同并小于第二蠕动泵5的速度，此步骤置换率可达88％。再向洗涤置换液容器2中加入6倍体积以上的含1％谷氨酸钠无菌液，按照上述步骤进行置换，置换率可达到98％。然后关闭阀门1和第一蠕动泵3继续浓缩置换液约4~6倍，使菌液富集，此过程中保持第二蠕动泵5的速度大于第三蠕动泵8。经过这两种溶液的置换，菌体达到了洗涤和离散的作用。最后加入相同体积的含有20％蔗糖、1~2％明胶、2％氯化钾、1~4％谷氨酸钠的混合液组成冻干保护剂，将获得的冻干保护剂产品经产品阀门10收集到收获容器11供分装。冻干保护剂中BCG终含量约为4~6*10⁸CFU/mL。

四．工艺效果对比结果

初始菌量相同，用本法和传统培养法（静止培养收获菌膜法，然后菌膜挤压去水，钢瓶研磨分散菌后，加入相同冻干保护液）制备的对比结果见表2。

结果可见：①本法培养重组人干扰素-α-2b-BCG在产量，干扰素分泌量显著优于传统法。②不需要菌膜研磨过程就可以取得更多散在的菌落形成单位，避免了研磨这一容易造成污染的步骤。③与传统方法下获得的相同湿重的菌相比，经本法可获得更多活菌量。④而且在培养过程中可以进行实时监测，不必等到最后收获时才可以进行，如有污染可中途及时停止生产，避免了无效劳动。

附表2与传统制备法的结果对比

Claims

1.一种重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法，其是按以下步骤制备的：

a.种子活化和培养基制备

采选重组人干扰素-α-2b-BCG菌种并接种于含卡那霉素30微升/毫升的新鲜配制的Middlebrook7H9液体培养基中获得一级活化种子液；将一级活化种子液重新接种至上述培养基中，获得浓度达标准OD600的A值>2的二级种子液；

其中所述的Middlebrook7H9液体培养基是按以下重量份的原料制成的：Middlebrook7H95份、甘油5份、Tween805份，加入900份蒸馏水，121℃高压蒸汽灭菌15分钟制成A液；另将葡萄糖2份、牛血清白蛋白5份、NaCl0.8份加入100份蒸馏水，0.22μm滤膜过滤除菌后制成B液，将A液、B液混合制得；

b．生物反应器深层培养

发酵罐中最终装料容积比6~7:10的发酵培养基高压灭菌后，将所述二级种子液接种到发酵罐中，深层发酵培养7~10天，发酵期间取样检测生长情况并涂玻片抗酸染色检测无污染，检测OD600值达2.0以上，收集发酵液；

其中每升所述发酵培养基按以下重量份数比的原料制备：Middlebrook7H95份、甘油5份、Tween805份、葡萄糖2份，蒸馏水溶解；培养基配置后调节pH至7.0~7.5，高压蒸汽原位灭菌；

c．离散洗涤和保护液置换

发酵罐原位连接切向流中空过滤柱1.5PD600，用3倍体积以上的0.9％氯化钠溶液进行发酵液置换洗涤，再用6倍以上的1％谷氨酸钠无菌液进行置换洗涤，继续菌液富集培养4~6倍，最后加入相同体积的混合液，得到BCG终含量约为4×10⁸CFU/mL的冻干保护剂；

其中所述的混合液含有20％蔗糖、1~2％明胶、2％氯化钾、1~4％谷氨酸钠；

d．真空冷冻干燥

2.根据权利要求1所述重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法，其特征在于：菌种采选后接种于250mL含30微升/毫升卡那霉素的新鲜配制的Middlebrook7H9液体培养基中，恒温35~38℃、转速100~200rpm、饱和湿度下，于2000mL烧瓶中震摇培养7~10天获得一级活化种子液。

3.根据权利要求1所述重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法，其特征在于：在所述生物反应器深层培养时，培养温度设定为35~38℃，接入过滤空气，通气速度0.5SLPM，转速150~250rpm稳定2h后，确定溶氧度D0-1值为100%，pH稳定至7.0~7.5；二级种子新鲜培养液无菌加入发酵罐时，设定的发酵参数：接入过滤空气通气的起始速度0.5SLPM，起始转速150rpm，根据溶氧度80~90%关联调节通气保持0.5~2.0SLPM和转速150~400rpm，温度维持35~39℃，培养基采用Middlebrook7H9溶液，消泡剂采用植物豆油。

4.根据权利要求1所述重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法，其特征在于：所述慢速预冷降温是从室温开始下降，在2.5~3.5h到达设定预冷-35~-45℃温度后维持1~2小时，第一阶段升华干燥温度-10~-20℃，维持12~16小时，升华干燥真空度为0.3毫巴，第二阶段解析干燥保持温度25~30℃，时间设定为4~6小时。