RU2778094C2 - Композиции для применения в качестве профилактического средства для пациентов с риском туберкулезной инфекции или в качестве вторичных средств для лечения пациентов с туберкулезной инфекцией - Google Patents
Композиции для применения в качестве профилактического средства для пациентов с риском туберкулезной инфекции или в качестве вторичных средств для лечения пациентов с туберкулезной инфекцией Download PDFInfo
- Publication number
- RU2778094C2 RU2778094C2 RU2020130786A RU2020130786A RU2778094C2 RU 2778094 C2 RU2778094 C2 RU 2778094C2 RU 2020130786 A RU2020130786 A RU 2020130786A RU 2020130786 A RU2020130786 A RU 2020130786A RU 2778094 C2 RU2778094 C2 RU 2778094C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mtbvac
- tuberculosis
- strain
- medium
- cfu
- Prior art date
Links
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 88
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 title abstract description 39
- 230000003449 preventive Effects 0.000 title description 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims abstract description 137
- 101710008653 fadD26 Proteins 0.000 claims abstract description 43
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 25
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 16
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 claims abstract description 14
- 230000002068 genetic Effects 0.000 claims abstract description 10
- 229960005486 vaccines Drugs 0.000 claims description 58
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 52
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 29
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 27
- 230000002238 attenuated Effects 0.000 claims description 22
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N D-sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 20
- CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N Sucrose Natural products O([C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)[C@@]1(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-GDQSFJPYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 20
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L mgso4 Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 16
- LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M monosodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O LPUQAYUQRXPFSQ-DFWYDOINSA-M 0.000 claims description 16
- 235000013923 monosodium glutamate Nutrition 0.000 claims description 16
- 239000004223 monosodium glutamate Substances 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M Monopotassium phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 claims description 9
- 229940068968 Polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 8
- FRHBOQMZUOWXQL-UHFFFAOYSA-K azane;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate;iron(3+) Chemical compound N.[Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O FRHBOQMZUOWXQL-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 8
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 8
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 8
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 8
- 229960001230 Asparagine Drugs 0.000 claims description 7
- 235000005979 Citrus limon Nutrition 0.000 claims description 7
- 240000002268 Citrus limon Species 0.000 claims description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N L-Asparagine Natural products OC(=O)[C@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- SPFMQWBKVUQXJV-BTVCFUMJSA-N (2R,3S,4R,5R)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;hydrate Chemical compound O.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O SPFMQWBKVUQXJV-BTVCFUMJSA-N 0.000 claims description 6
- 229960000673 dextrose monohydrate Drugs 0.000 claims description 6
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 6
- 230000000977 initiatory Effects 0.000 claims description 5
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 6
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 abstract description 5
- 229940010383 Mycobacterium tuberculosis Drugs 0.000 abstract description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000002609 media Substances 0.000 description 73
- 229960000190 Bacillus Calmette–Guérin vaccine Drugs 0.000 description 64
- 230000000875 corresponding Effects 0.000 description 42
- 101700073093 phoP Proteins 0.000 description 32
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 23
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 23
- 241000304886 Bacilli Species 0.000 description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 18
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 13
- 241001302239 Mycobacterium tuberculosis complex Species 0.000 description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 102000038129 antigens Human genes 0.000 description 11
- 108091007172 antigens Proteins 0.000 description 11
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 11
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 230000004044 response Effects 0.000 description 10
- 239000001963 growth media Substances 0.000 description 9
- 230000000069 prophylaxis Effects 0.000 description 9
- 230000004083 survival Effects 0.000 description 9
- 229960004689 BCG Vaccine Drugs 0.000 description 8
- 210000004027 cells Anatomy 0.000 description 8
- 229960005150 glycerol Drugs 0.000 description 8
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 8
- 230000001681 protective Effects 0.000 description 8
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 8
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 8
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 8
- 210000001744 T-Lymphocytes Anatomy 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 7
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 7
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 6
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N Trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 5
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal Effects 0.000 description 5
- 230000037348 biosynthesis Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 5
- FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N D-Mannitol Natural products OC[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KAZBKCHUSA-N 0.000 description 4
- 229960001031 Glucose Drugs 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L Zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229920003013 deoxyribonucleic acid Polymers 0.000 description 4
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 4
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 4
- 238000011068 load Methods 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 230000001404 mediated Effects 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003068 static Effects 0.000 description 4
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 4
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N β-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N D-Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 102100016020 IFNG Human genes 0.000 description 3
- 101700086956 IFNG Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- 206010065048 Latent tuberculosis Diseases 0.000 description 3
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 3
- 229950008882 Polysorbate Drugs 0.000 description 3
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 3
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular Effects 0.000 description 3
- 238000000034 method Methods 0.000 description 3
- 235000019161 pantothenic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000011713 pantothenic acid Substances 0.000 description 3
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 3
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-M 3-[[(2R)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-M 0.000 description 2
- 229920001405 Coding region Polymers 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 2
- 101700004541 GSTG Proteins 0.000 description 2
- 229960002989 Glutamic Acid Drugs 0.000 description 2
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 2
- 210000000265 Leukocytes Anatomy 0.000 description 2
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 2
- 229940023488 Pill Drugs 0.000 description 2
- 241000580858 Simian-Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010001801 Tumor Necrosis Factor-alpha Proteins 0.000 description 2
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000010192 crystallographic characterization Methods 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- VZORGPCQYCYZLZ-UHFFFAOYSA-E nonasodium;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O.[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O VZORGPCQYCYZLZ-UHFFFAOYSA-E 0.000 description 2
- 229940014662 pantothenate Drugs 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic Effects 0.000 description 2
- 101700070962 phoR Proteins 0.000 description 2
- 230000001885 phytohemagglutinin Effects 0.000 description 2
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002588 toxic Effects 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 2
- FMKJUUQOYOHLTF-OWOJBTEDSA-N (E)-4-azaniumylbut-2-enoate Chemical compound NC\C=C\C(O)=O FMKJUUQOYOHLTF-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 206010000565 Acquired immunodeficiency syndrome Diseases 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N Ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940064005 Antibiotic throat preparations Drugs 0.000 description 1
- 229940083879 Antibiotics FOR TREATMENT OF HEMORRHOIDS AND ANAL FISSURES FOR TOPICAL USE Drugs 0.000 description 1
- 229940042052 Antibiotics for systemic use Drugs 0.000 description 1
- 229940042786 Antitubercular Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 229940098773 Bovine Serum Albumin Drugs 0.000 description 1
- 108091003117 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 229940105657 CATALASE Drugs 0.000 description 1
- 229920002574 CR-39 Polymers 0.000 description 1
- 210000000349 Chromosomes Anatomy 0.000 description 1
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L Copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 206010012601 Diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 102000016938 EC 1.11.1.6 Human genes 0.000 description 1
- 108010053835 EC 1.11.1.6 Proteins 0.000 description 1
- 210000003743 Erythrocytes Anatomy 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 206010064503 Excessive skin Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 Gastrointestinal Tract Anatomy 0.000 description 1
- 229940093922 Gynecological Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010022085 Injection site oedema Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N Isoniazid Chemical compound NNC(=O)C1=CC=NC=C1 QRXWMOHMRWLFEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N Kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 210000004072 Lung Anatomy 0.000 description 1
- 208000009856 Lung Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 208000001145 Metabolic Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229940114179 Mycobacterium bovis Drugs 0.000 description 1
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 1
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 1
- 229920001850 Nucleic acid sequence Polymers 0.000 description 1
- 229940055726 Pantothenic Acid Drugs 0.000 description 1
- 206010035737 Pneumonia viral Diseases 0.000 description 1
- 208000008128 Pulmonary Tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 241000546321 Sathon Species 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 229940024982 Topical Antifungal Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 208000009421 Viral Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 206010047627 Vitamin deficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 1
- 230000000240 adjuvant Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 229920002892 amber Polymers 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N brefeldin A Chemical compound O[C@@H]1\C=C\C(=O)O[C@@H](C)CCC\C=C\[C@@H]2C[C@H](O)C[C@H]21 KQNZDYYTLMIZCT-KQPMLPITSA-N 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M buffer Substances [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004067 bulking agent Substances 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 229910000365 copper sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012297 crystallization seed Substances 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000534 elicitor Effects 0.000 description 1
- 238000003114 enzyme-linked immunosorbent spot assay Methods 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- 230000002349 favourable Effects 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 229940079866 intestinal antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 229960003350 isoniazid Drugs 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing Effects 0.000 description 1
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 1
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic Effects 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 229940005935 ophthalmologic Antibiotics Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical Effects 0.000 description 1
- GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N pantothenic acid Natural products OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- 244000052769 pathogens Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002688 persistence Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 238000009520 phase I clinical trial Methods 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 229960002862 pyridoxine Drugs 0.000 description 1
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 1
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 1
- 235000020185 raw untreated milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reduced Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory Effects 0.000 description 1
- 231100000812 repeated exposure Toxicity 0.000 description 1
- 230000003362 replicative Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000000391 smoking Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000006076 specific stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous Effects 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 231100000803 sterility Toxicity 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002142 suicide Effects 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissues Anatomy 0.000 description 1
- 230000001131 transforming Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Images
Abstract
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и медицине, а именно к способу получения лиофилизированной композиции, состоящей из выделенного микроорганизма, принадлежащего к Mycobacterium tuberculosis, отличающемуся наличием фенотипа PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и делеции второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающей продукцию PDIM (фенотип PDIM−) (штамм MTBVAC). Изобретение позволяет получать лиофилизированую композицию и эффективно ее использовать в качестве профилактического средства для индивидуумов, имеющих риск инфекции M. tuberculosis или имеющих риск развития туберкулеза, или в качестве вторичных средств для лечения пациентов с туберкулезной инфекцией. 1 з.п. ф-лы, 11 ил., 15 табл., 3 пр.
Description
Область изобретения
Настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, таким как вакцины, и к способам получения и применения таких композиций.
Уровень техники
Вакцина бациллы Кальметта-Герена (БЦЖ) представляет собой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis, возбудителя туберкулеза (TB) у крупного рогатого скота. БЦЖ впервые внедрили в клиническую практику почти сто лет назад, когда в 1921 году ее ввели перорально младенцу, мать которого умерла от TB через день после родов. У младенца не наблюдали нежелательных явлений в ответ на вакцинацию БЦЖ, и, что важно, у него не развился TB. В то время пероральный путь введения БЦЖ считали природным путем (желудочно-кишечный тракт) заражения TB у младенцев и детей, которых кормили непастеризованным молоком. TB связан с бедностью, при этом основное бремя приходится на бедные развивающиеся страны мира. Частота TB повышается по всему миру из-за бедности и неравенства и усугубляется пандемией ВИЧ/СПИД, что значительно повышает риск перехода инфекции в активное заболевание. Диабет, метаболический синдром, курение и, в последнее время, дефицит витаминов по причине недостаточного питания и плохих социально-экономических условий являются важными факторами риска TB. Важно то, как эти факторы могут влиять на оценку эффективности новых вакцин против TB, требуя особого внимания при определении дизайна клинического испытания, включающего исследование или выборки пациентов со спектром таких факторов риска. В результате роста глобализации и возникновения штаммов TB с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) и с широкой лекарственной устойчивостью (XDR), TB становится серьезной угрозой для всего мира.
В настоящее время TB достигает опасной частоты 10,0 миллионов случаев заболевания и 1,6 миллионов случаев смерти, приписываемой заболеванию, что описано в последнем глобальном отчете Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) о TB 2018 года. В мире приблизительно 50 миллионов индивидуумов уже латентно инфицированы штаммами M. tuberculosis с MDR, что создает существенный ресурс для последующих случаев заболевания активным TB в недостаточными вариантами лечения. Несмотря на это, в заявлении ВОЗ "The End TB Strategy" обещано снижение заболеваемости TB на 90% и смертности от TB на 95% к 2035 году и подчеркнута насущная потребность в более доступных диагностических инструментах, являющихся быстрыми и надежными, новых менее токсичных и более эффективных антибиотиках для сокращения терапии и, наконец, новых вакцинах для профилактики TB легких для достижения этой амбициозной цели.
Настоящее изобретение способствует достижению цели получения новых вакцин для профилактики TB.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение относится к живой аттенуированной вакцинной композиции M. tuberculosis, предпочтительно к восстановленной композиции после лиофилизации, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к штамму MTBVAC, имеющему i) фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и ii) делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), где указанная композиция отличается тем, что содержит следующие компоненты на мл (в процентных долях):
| Компоненты | MTBVAC Доза на 1 мл |
| L-аспарагин | 0,034-0,066% |
| Дигидроортофосфат калия | 0,006-0,010% |
| Сульфат магния H2O | 0,008-0,012% |
| Цитрат железа (III)-аммония | 0,0004-0,0008% |
| Моногидрат декстрозы | 0,05-0,066% |
| Глицерин | 0,00005-0,0001% |
| Лимонная кислота | 0,026-0,034% |
| Полисорбат 80 | 0,000002-0,000008% |
| Глутамат натрия | 0,33-1,33% |
| Сахароза | 3,3-13,3% |
| Очищенная вода в достаточном количестве | 1 мл |
Краткое описание чертежей
Другие цели, преимущества и новые признаки настоящего изобретения будут очевидны из следующего подробного описания изобретения в сочетании с сопутствующими чертежами.
Фигура 1. Выращивание штамма SO2 в среде Миддлбрука 7H9 и синтетической среде Сатона. Результаты в OD и КОЕ/мл пассажей культуры 1 и 2.
На фигуре 2 показаны результаты в OD культур MTBVAC в среде Сатона, средах SD и SDG.
На фигуре 3 показаны результаты анализа стабильности при температуре от 2-8°C до -30°C серий или партий, указанных в таблице 15.
Фигура 4. Защита у мышей. Данные на фигуре представляют собой совокупность двух независимых экспериментов (n=12 мышей/группу). Все данные представляют собой среднее ±SEM. Индекс защиты определяют как различие между бактериальной нагрузкой в невакцинированных и вакцинированных группах (показано в десятичном логарифме).
Фигура 5 (А-С). Иммуногенность у мышей. Данные на фигуре соответствуют одному эксперименту (n=5 мышей/группу). Все данные представляют собой среднее ±SEM. SFC: Пятнообразующая колония.
Фигура 6. Вакцинация новорожденных из TB-эндемичных условий с повышением доз MTBVAC, что приводило преимущественно к Th1-опосредованным (ИФНγ, ИЛ-2 или ФНОα) антиген-специфическим ответам CD4+ T-клеток. Наибольшая доза MTBVAC 2,5×105 КОЕ индуцировала наибольшую величину антиген-специфического CD4+ T-клеточно-опосредованного цитокинового ответа в день 70. Наименьшая доза MTBVAC 2,5×103 КОЕ являлась наименее иммуногенной.
Фигура 7. Вакцинация новорожденных из TB-эндемичных условий с повышением доз MTBVAC приводила к дозозависимому профилю количественного значения в анализе QFT в дни 180 и 360 после вакцинации. Значения QFT стратифицируют по трем разным областям в зависимости от риска развития активного TB в соответствии с Andrews JR, Nemes E, Tameris M et al. Serial QuantiFERON testing and tuberculosis disease risk among young children: an observational cohort study. Lancet Respir Med, (2017).
Фигура 8. Отсутствие вирулентных микобактерий в рабочей посевной серии у морских свинок.
Фигура 9. Исследования стабильности в основных и рабочих посевных сериях.
Фигура 10. Исследование долговременной стабильности вакцины MTBVAC в дозе 3-17×103 КОЕ/0,1 мл, дозе 3-17×104 КОЕ/0,1 мл и дозе 3-17×106 КОЕ/0,1 мл, хранящейся при -15°C - -30°C, (A), и хранящейся при +2°C - +8°C, (B).
Фигура 11. Постадийное конструирование из SO2 в MTBVAC. Конечный штамм с двойной делецией фенотипически идентичен прототипу SO2 (с дефицитом PDIM на основе phoP), но обеспечивает более высокую генетическую стабильность. Светло-голубым указан ген phoP, ген fadD26 указан светло-оранжевым, кассеты резистентности к антибиотикам km r и hyg r указаны пурпурным, желтыми треугольниками указаны участки res, фланкирующие Ωhyg r , или остаточный участок res в делетированных областях; участки res не содержат какую-либо экзогенную кодирующую последовательность.
Подробное описание изобретения
Определения и подробное описание штамма MTBVAC
Термин "штамм MTBVAC" будет использоваться для обозначения выделенного микроорганизма штамма M. tuberculosis, в котором из клинического штамма M. tuberculosis MT103 делетирован Rv0757 и который дополнительно содержит делецию гена Rv2930 (fadD26). Таким образом, указанный штамм имеет две независимые мутации, полученные из M. tuberculosis, независимая делеция phoP не влияет на свойства вакцины, полученной в результате инактивации указанного гена. Таким образом, "штамм MTBVAC" отличается тем, что продукция PDIM инактивирована посредством делеции гена Rv2930 (fadD26), и, таким образом, этот штамм отличается тем, что содержит делецию генов Rv2930 и Rv0757.
Таким образом, необходимо отметить, что штамм MTBVAC конструировали так, чтобы он содержал две независимые необратимые делеции без маркеров резистентности к антибиотикам, что соответствует требованиям безопасности Женевского соглашения для продвижения клинического исследования фазы I живых микобактериальных вакцин. Штамм MTBVAC генетически конструировали так, чтобы он напоминал свой прототип SO2. SO2 является маркированным Mt103, мутантым по phoP в результате инсерции кассеты резистентности к канамицину (kmr) (Mt103phoP::kmr) (см. фигуру 11), где, в дополнение к сконструированному PhoP-дефектному фенотипу, SO2 имеет приобретенную спонтанную потерю биосинтеза PDIM (см. фигуру 2 из Dessislava Marinova, Jesus Gonzalo-Asensio, Nacho Aguilo & Carlos Martin (2017) MTBVAC from discovery to clinical trials in tuberculosis-endemic countries, Expert Review of Vaccines, 16:6, 565-576, DOI: 10.1080/14760584.2017.1324303), что, как описано, распространено среди M. tuberculosis в результате повторяющегося лабораторного субкультивирования и различных манипуляций.
Как показано на фигуре 11, штамм MTBVAC конструировали, следуя постадийному подходу. Сначала, в SO2 встраивали немаркированную делецию fadD26, получая SO2ΔfadD26. Таким образом, посредством немаркированной делеции phoP в SO2ΔfadD26 получали штамм MTBVAC. Для конструирования MTBVAC использовали суицидные плазмиды, несущие делетированные гены fadD26 и phoP, делетированные области прерывались маркером резистентности к гигромицину (hyg r ), фланкированному участками res на каждой стороне (res::hyg r ::res). γδ-резольваза из E. coli катализировала эксцизию кассеты резистентности к антибиотикам после распознавания участков res, оставляя копию остаточного res в виде "шрама" вместо делеции (Malaga, et al. 2003); участки res не содержат какую-либо экзогенную кодирующую последовательность. Конечную конструкцию SO2ΔfadD26::ΔphoP называли штаммом MTBVAC. В штамме MTBVAC встраивание немаркированной делеции в fadD26 обеспечивает генетически стабильное устранение биосинтеза PDIM. Размер получающейся делеции в гене fadD26 составляет 1511 п.н., и она приводит к полной инактивации этого гена, необходимого для биосинтеза PDIM. Ген дикого типа имеет размер 1752 п.н. (583 аминокислот). Остаточный "шрам" res образуется в результате эксцизии hyg r под действием γδ-резольвазы. В результате этой делеции уровни транскрипции следующих пяти генов в локусе PDIM (fadD26-ppsE) снижаются, и биосинтез PDIM в MTBVAC полностью прекращается (диссертация Ainhoa Arbués на соискание звания PhD). Локус PDIM в M. tuberculosis содержит 13 генов, кластеризованных на фрагменте хромосомы длиной 50 т.п.н. Область является наибольшим опероном в геноме M. tuberculosis (Camacho, et al. 2001; Camacho, et al. 1999; Cox, et al. 1999; Trivedi, et al. 2005).
В M. tuberculosis phoP (744 п.н.) картируют выше phoR (1458 п.н.), и оба гена транскрибируются в одном направлении. Замена полученной делеции длиной 94 п.н. геном phoP с помощью остаточного участка res приводит к наличию множества стоп-кодонов, что, с другой стороны, приводит к отсутствию трансляции ДНК-связывающего домена (эквивалентного 92 аминокислотам) PhoP в MTBVAC.
Делеции генов phoP и fadD26 в MTBVAC можно определять/локализовать с использованием подхода RT-ПЦР "наличия/отсутствия". В способе используют флуоресцентные реагенты для ПЦР (праймеры и зонды) для определения наличия участков res в генах ΔphoP и ΔfadD26 и отсутствия генов phoP и fadD26 дикого типа.
В настоящем описании ниже представлена последовательность открытой рамки считывания (ORF) гена fadD26 в Mt103 a) и в MTBVAC (ΔfadD26) b); и последовательность ORF гена phoP в Mt103 c) и в MTBVAC (ΔphoP) d). Нуклеотидная последовательность, соответствующая делетированным областям гена fadD26 (a) и phoP (c), указана строчными буквами; остаточный участок res выделен серым. Что касается флуоресцентного способа детекции на основе ПЦР, праймеры для каждой мишени подчеркнуты, а зонд Taq-man выделен полужирным шрифтом.
a) Ген
fadD26
дикого типа в Mt103
SEQ ID NO 1:
ATGCCGGTGACCGACCGTTCAGTGCCCTCTTTGCTGCAAGAGAGGGCCGACCAGCAGCCTGACAGCACTGCATATACGTACATCGACTACGGATCCgaccccaagggatttgctgacagcttgacttggtcgcaggtctacagtcgtgcatgcatcattgctgaagaactcaagttatgcgggttacccggagatcgagtggcggttttagcgccacaaggactggaatatgtccttgcattcctgggcgcacttcaggctggatttatcgcggttccgctgtcaactccacagtatggcattcacgatgaccgcgtttctgcggtgttgcaggattccaagccggtagccattctcacgacttcgtccgtggtaggcgatgtaacgaaatacgcagccagccacgacgggcagcctgccccggtcgtagttgaggttgatctgcttgatttggactcgccgcgacagatgccggctttctctcgtcagcacaccggggcggcttatctccaatacacgtccggatcgacgcgtacgccggccggagtcattgtgtcgcacacgaatgtcattgccaatgtgacacaaagtatgtacggctatttcggcgatcccgcaaagattccgaccgggactgtggtgtcgtggctgcctttgtatcacgatatgggcctgattctcggaatttgcgcaccgctggtggcccgacgccgcgcgatgttgatgagcccaatgtcatttttgcgccgtccggcccgctggatgcaactgcttgccaccagcggccggtgcttttctgcggcaccgaatttcgccttcgagctggccgtgcgcagaacatctgaccaggacatggcggggctcgacctgcgcgacgtggtcggcatcgtcagtggcagtgagcgaatccatgtggcaaccgtgcggcggttcatcgagcggttcgcgccgtacaatctcagccccaccgcgatacggccgtcgtacgggctcgcggaagcgaccttatatgtggcagctcccgaagccggcgccgcgcccaagacggtccgttttgactacgagcagctgaccgccgggcaggctcggccctgcggaaccgatgggtcggtcggcaccgaactgatcagctacggctcccccgacccatcgtctgtgcgaatcgtcaacccggagaccatggttgagaatccgcctggagtggtcggtgagatctgggtgcatggcgaccacgtgactatggggtattggcagaagccgaagcagaccgcgcaggtcttcgacgccaagctggtcgatcccgcgccggcagccccggaggggccgtggctgcgcaccggcgacctgggcgtcatttccgatggtgagctgttcatcatgggccgcatcaaagacctgctcatcgtggacgggcgcaaccactaccccgacgacatcgaggcaacgatccaggagatcaccggtggacgggccgcggcgatcgcagtgcccgacgacatcaccgaacaactggtggcgatcatcgaattcaagcgacgcggtagtaccgccgaagaggtcatgctcaagctccgctcggtgaagcgtgaggtcacctccgcGATATCGAAGTCACACAGCCTGCGGGTGGCCGATCTCGTTCTGGTGTCACCTGGTTCGATTCCCATCACCACCAGCGGCAAGATCCGGCGGTCAGCCTGCGTCGAACGCTATCGCAGCGACGGCTTCAAGCGGCTGGACGTAGCCGTATGA
b) Δ fadD26 в MTBVAC
SEQ ID NO 2:
ATGCCGGTGACCGACCGTTCAGTGCCCTCTTTGCTGCAAGAGAGGGCCGACCAGCAGCCTGACAGCACTGCATATACGTACATCGACTACGGATCCACTAGTTCTAGAGCAACCGTCCGAAATATTATAAATTATCGCACACATAAAAACAGTGCTGTTAATGTGTCTATTAAATCGATTTTTTGTTATAACAGACACTGCTTGTCCGATATTTGATTTAGGATACATTTTTATGAGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCGAAGTCACACAGCCTGCGGGTGGCCGATCTCGTTCTGGTGTCACCTGGTTCGATTCCCATCACCACCAGCGGCAAGATCCGGCGGTCAGCCTGCGTCGAACGCTATCGCAGCGACGGCTTCAAGCGGCTGGACGTAGCCGTATGA
c) Ген
phoP
дикого типа в Mt103
SEQ ID NO 3:
ATGCGGAAAGGGGTTGATCTCGTGACGGCGGGAACCCCAGGCGAAAACACCACACCGGAGGCTCGTGTCCTCGTGGTCGATGATGAGGCCAACATCGTTGAACTGCTGTCGGTGAGCCTCAAGTTCCAGGGCTTTGAAGTCTACACCGCGACCAACGGGGCACAGGCGCTGGATCGGGCCCGGGAAACCCGGCCGGACGCGGTGATCCTCGATGTGATGATGCCCGGGATGGACGGCTTTGGGGTGCTGCGCCGGCTGCGCGCCGACGGCATCGATGCCCCGGCGTTGTTCCTGACGGCCCGTGACTCGCTACAGGACAAGATCGCGGGTCTGACCCTGGGTGGTGACGACTATGTGACAAAGCCCTTCAGTTTGGAGGAGGTCGTGGCCAGGCTGCGGGTCATCCTGCGACGCGCGGGCAAGGGCAACAAGGAACCACGTAATGTTCGACTGACGTTCGCCGATatcgagctcgacgaggagacccacgaagtgtggaaggcgggccaaccggtgtcgctgtcgcccaccgaattcaccctgctgcgctatttcgtGATCAACGCGGGCACCGTGCTGAGCAAGCCTAAGATTCTCGACCACGTTTGGCGCTACGACTTCGGTGGTGATGTCAACGTCGTCGAGTCCTACGTGTCGTATCTGCGCCGCAAGATCGACACTGGGGAGAAGCGGCTGCTGCACACGCTGCGCGGGGTGGGCTACGTACTGCGGGAGCCTCGATGA
d) Δ phoP в MTBVAC
SEQ ID NO 4:
ATGCGGAAAGGGGTTGATCTCGTGACGGCGGGAACCCCAGGCGAAAACACCACACCGGAGGCTCGTGTCCTCGTGGTCGATGATGAGGCCAACATCGTTGAACTGCTGTCGGTGAGCCTCAAGTTCCAGGGCTTTGAAGTCTACACCGCGACCAACGGGGCACAGGCGCTGGATCGGGCCCGGGAAACCCGGCCGGACGCGGTGATCCTCGATGTGATGATGCCCGGGATGGACGGCTTTGGGGTGCTGCGCCGGCTGCGCGCCGACGGCATCGATGCCCCGGCGTTGTTCCTGACGGCCCGTGACTCGCTACAGGACAAGATCGCGGGTCTGACCCTGGGTGGTGACGACTATGTGACAAAGCCCTTCAGTTTGGAGGAGGTCGTGGCCAGGCTGCGGGTCATCCTGCGACGCGCGGGCAAGGGCAACAAGGAACCACGTAATGTTCGACTGACGTTCGCCGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCTCATAAAAATGTATCCTAAATCAAATATCGGACAAGCAGTGTCTGTTATAACAAAAAATCGATTTAATAGACACATTAACAGCACTGTTTTTATGTGTGCGATAATTTATAATATTTCGGACGGTTGCTCTAGAACTAGTGGATCAACGCGGGCACCGTGCTGAGCAAGCCTAAGATTCTCGACCACGTTTGGCGCTACGACTTCGGTGGTGATGTCAACGTCGTCGAGTCCTACGTGTCGTATCTGCGCCGCAAGATCGACACTGGGGAGAAGCGGCTGCTGCACACGCTGCGCGGGGTGGGCTACGTACTGCGGGAGCCTCGATGA
SO2 обладает подробной и полной доклинической историей, демонстрирующей устойчивую безопасность, профиль аттенуации и многообещающую эффективность по сравнению с БЦЖ в соответствующих моделях на животных. К счастью, большинство из этих доклинических исследований были воспроизведены с использованием MTBVAC для подтверждения функционального профиля и биологической активности двойного аттенуированного фенотипа PhoP−PDIM−. Анализы липидного профиля показали, что MTBVAC и его прототип SO2 являются фенотипически сравнимыми, не имея DAT, PAT и PDIM.
С другой стороны, далее в контексте настоящего описания термин "БЦЖ" будет использоваться для обозначения существующей вакцины, используемой против туберкулеза с 1921 года. Она является живой аттенуированной вакциной, полученной из штамма M. bovis, утратившего свою вирулентность после субкультивирования в лаборатории, и в котором, как теперь известно, есть более сотни делетированных генов. Behr, M. A. BCG - different strains, different vaccines. Lancet Infect Dis 2002, 2(2), 86-92.
Далее в контексте настоящего описания термин "H37Rv" будет использоваться для обозначения патогенного штамма M. tuberculosis, подвергнутого секвенированию, при этом Cole et al. обозначали гены как Rv (Ref Cole et al 1998 Deciphering the biology of M. tuberculosis from the complete genome sequence. Nature 393: 537-544).
Далее в контексте настоящего описания термин "MT103" будет использоваться для обозначения клинического изолята M. tuberculosis. Camacho et al. 1999 Identification of a virulence gene cluster of M. tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol 34: 257-267.
Далее в контексте настоящего описания термин "PDIM− штамм" будет использоваться для обозначения комплекса штамма M. tuberculosis, неспособного синтезировать фтиоцеролдимикоцерозаты, являющиеся липидами, важными для патогенности M. tuberculosis.
Далее в контексте настоящего описания термин "SO2+pSO5" будет использоваться для обозначения штамма M. tuberculosis SO2, в котором мутация в Rv0757 дополнена геном Rv0757 посредством трансформации с помощью репликативной плазмиды с микобактериальным геном phoP, но он не может восполнять синтез PDIM, его фенотип представляет собой PhoP+ PDIM−.
Далее в контексте настоящего описания термин "M. tuberculosis phoP −" будет использоваться для обозначения штамма M. tuberculosis, инактивированного посредством делеции гена Rv0757 между участками EcoRV-BspEI, его фенотип представляет собой phoP − PDIM+.
Далее в контексте настоящего описания термин "Rv2930 (fadD26)" будет использоваться для обозначения гена, находящегося в начале оперона, отвечающего за синтез фтиоцеролдимикоцерозатов (PDIM) (Camacho et al.), и элиминация этого гена в M. tuberculosis придает стабильный фенотип PDIM−.
Описание
Использование вакцин для профилактики TB у людей уже почти столетие является огромной проблемой. БЦЖ, полученная из M. bovis, в настоящее время является единственной сертифицированной используемой вакциной против TB, а также наиболее широко используемой вакциной в мире. Разработка и генерализованное введение вакцины БЦЖ с начала 1920-х гг. представляло собой значительный прогресс с перспективой ликвидации TB во всем мире. Однако эти исходные перспективы не были достигнуты, и, учитывая результаты большого количества исследований эффективности, очевидно, что вакцина БЦЖ в своей нынешней форме имеет ограниченное использование в контроле заболевания, в частности, при респираторных формах у взрослых в странах третьего мира, где заболевание является эндемичным. Fine, P.E. Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet 1995, 346(8986), 1339-1345. Благодаря росту знаний о вирулентности M. tuberculosis и разработке моделей иммунного ответа, приводящего к образованию защитного иммунитета, можно разработать более эффективные вакцины, чем БЦЖ. Наблюдение достижения более высоких уровней защиты при вакцинации организма-хозяина с помощью БЦЖ позволяет предполагать, что жизнеспособность и персистенция являются основополагающими свойствами, необходимыми для успеха противотуберкулезной вакцины. В связи с этим, в патенте США № US 8287886 B2 описано, что использование штамма M. tuberculosis с инактивированным геном Rv0757 (phoP) и второй независимой мутацией phoP, предотвращающей синтез PDIM, обеспечивает получение прототипа однодозовой живой вакцины, являющейся более аттенуированной, чем БЦЖ, в случае иммунокомпрометированных мышей SCID, приводя к уровням защиты, сравнимым с уровнями, придаваемыми БЦЖ, у мышей и более высокой защите, чем БЦЖ, у морских свинок.
Ген phoP вместе с phoR образует часть двухкомпонентной системы, демонстрирующей высокую степень сходства с другими двухкомпонентными системами, контролирующими транскрипцию ключевых генов вирулентности во внутриклеточных патогенах. Он также контролирует экспрессию многих других генов, не вовлеченных в вирулентность напрямую. Groisman, E. A. The pleiotropic two-component regulatory system PhoP-PhoQ. J Bacteriol 2001, 183(6), 1835-1842. Элиминация генов вирулентности, по-видимому, сама по себе не является единственным способом аттенуации M. tuberculosis. Показано, что пантотенат-ауксотрофный мутант M. tuberculosis, неспособный к синтезу de novo пантотеновой кислоты, персистировал в мышах SCID, не вызывая заболевание. Sambandamurthy, V. K., Wang, X., Chen, B. et al. A pantothenate auxotroph of M. tuberculosis is highly attenuated and protects mice against tuberculosis. Nat Med 2002, 8(10), 1171-1174. Отдельные лейциновые ауксотрофы также сильно аттенуированы и неспособны к репликации in vivo в мышах SCID. Hondalus, M. K., Bardarov, S., Russell, R., Chan, J., Jacobs, W. R., Jr. & Bloom, B. R. Attenuation of and protection induced by leucine auxotroph of M. tuberculosis. Infect Immun 2000, 68(5), 2888-2898. Таким образом, в настоящее время, как правило, принят принцип, согласно которому вакцинные штаммы на основе M. tuberculosis можно успешно аттенуировать при сохранении генов, супрессированных в БЦЖ M. bovis.
До описанного в патенте США № US 8287886 B2, поиск более эффективных вакцин, чем БЦЖ, был основан на наблюдении о том, что потеря вирулентности БЦЖ сама по себе являлась фактором, вносящим вклад в отсутствие полной эффективности защиты. Behr, M. A., Wilson, M. A., Gill, W. P. et al. Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science 1999, 284(5419), 1520-1523. Таким образом, был сделан вывод о том, что новые аттенуированные мутанты M. tuberculosis с меньшей вирулентностью могут быть более эффективными в качестве вакцин. В связи с этим, хотя было показано, что природная инфекция M. tuberculosis и вакцинация БЦЖ не отличаются по своей способности вызывать защитный иммунитет против туберкулеза (Sampson, S. L., Dascher, C. C., Sambandamurthy, V. K. et al. Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph of M. tuberculosis in guinea pigs. Infect Immun 2004, 72(5), 3031-3037), инфицированные M. tuberculosis индивидуумы с латентным туберкулезом имеют на 79% меньший риск прогрессирующего туберкулеза после повторного инфицирования по сравнению с неинфицированными индивидуумами (Andrews 2012. CID 54:784-790). Кроме того, и учитывая тот факт, что большинство из этих индивидуумов могут быть вакцинированы БЦЖ, на практике это свидетельствует о том, что может иметь место различие в защитном иммунитете, обеспечиваемом БЦЖ и M. tuberculosis. Это вызывает вопросы о том, можно ли улучшить БЦЖ посредством рациональной аттенуации M. tuberculosis. В этом контексте особое значение имеет наблюдение того, что мутантный штамм M. tuberculosis, описанный в патенте США № US 8287886 B2, с комбинацией 2 независимых мутаций, связанных с синтезом белка PhoP и синтезом PDIM, является более аттенуированным, чем БЦЖ в модели на мышах SCID даже при использовании дозы, в 10 раз более высокой, чем у БЦЖ, и имеет более высокую степень защиты, чем БЦЖ, в модели на морских свинках.
Мутантный штамм M. tuberculosis, описанный в патенте США № US 8287886 B2, отличается тем, что является выделенным микроорганизмом, принадлежащим к роду Mycobacterium, включающим инактивацию гена Rv 0757 (phoP) и инактивацию второго гена, предотвращающую продукцию PDIM (фтиоцеролдимикоцерозатов). В частности, такой мутантный штамм M. tuberculosis, описанный в патенте США № US 8287886 B2 (штамм SO2), отличается тем, что включает инактивацию гена Rv 0757 (phoP) и вторую независимую мутацию phoP, предотвращающую продукцию PDIM.
Необходимо отметить, что, как описано в патенте США № US 8287886 B2, штамм SO2 не считали токсичным для шести морских свинок, которым инокулировали 50-кратную дозу вакцины для этого биологического вида. Кроме того, исследовали их коэффициент выживаемости и кривую массы. Коэффициент выживаемости составлял 100% после 6-месячного эксперимента. На фиг. 12 из патента США № US 8287886 B2 показано наблюдаемое увеличение массы у всех животных в течение 6 месяцев, что свидетельствует о нетоксичности штамма SO2 (Y=масса в граммах и X=время инфекции в неделях). Кроме того, в патенте США № US 8287886 B2 также исследовали коэффициент выживаемости вакцинированных морских свинок после инфекции M. tuberculosis (фиг. 13). В исследовании защиты на морских свинках отслеживали коэффициент выживаемости после 300 дней. Строили кривую коэффициента выживаемости для невакцинированных морских свинок (физиологический раствор) и морских свинок, вакцинированных существующей вакциной БЦЖ, штаммом M. tuberculosis phoP − или штаммом SO2 (мутантом phoP − и PDIM−). После подкожной вакцинации животных инфицировали вирулентным штаммом M. tuberculosis (H37Rv) в высокой дозе для исследования коэффициента выживаемости. Через 60 дней 6 морских свинок, которых не вакцинировали (вводили физиологический раствор), умерли, в то время как группы, вакцинированные штаммом SO2, phoP − и БЦЖ, выжили. Через 300 дней инфекции 3 морские свинки, вакцинированные БЦЖ и phoP −, умерли, в то время как в группах, вакцинированных штаммом SO2, умерла лишь одна морская свинка, что свидетельствует о том, что защита в случае мутанта phoP схожа с таковой в случае существующей вакцины БЦЖ, в то время как вакцинация штаммом SO2, двойным мутантом phoP − и PDIM−, обеспечивала лучшую защиту в модели на морских свинках. Кроме того, на фиг. 14 из патента США № US 8287886 B2 показана выживаемость после 400 дней у морских свинок, отслеживание которых показано на фиг. 13. 6 невакцинированных морских свинок умерли через 60 дней. Через 400 дней инфекции 3 морские свинки из группы, вакцинированной штаммом SO2 (фиг. 14 a), выжили, в то время как только 1 морская свинка, вакцинированная БЦЖ (фиг. 14 a и фиг. 14 b) и phoP − (фиг. 14 b), выжила, что также свидетельствует о том, что защита в случае мутанта phoP является схожей с таковой в случае БЦЖ, в то время как вакцинация штаммом SO2, двойным мутантом phoP− и PDIM−, обеспечивала лучшую защиту после 400 дней эксперимента.
В заключение, результаты, описанные в патенте США № US 8287886 B2, свидетельствуют о том, что штамм SO2 и, таким образом, микроорганизм, принадлежащий к роду Mycobacterium (в частности, из комплекса M. tuberculosis), с фенотипом PhoP− PDIM− является более эффективной вакциной, чем БЦЖ в соответствии с рядом критериев. Она является более аттенуированной, чем БЦЖ у мышей SCID, обеспечивает мышей защитным иммунитетом, являющимся по меньшей мере настолько же хорошим, насколько и в случае БЦЖ, и вызывает более сильные клеточные иммунные ответы. Кроме того, в экспериментах, проведенных на морских свинках, по исследованию защиты против инфекции высокими дозами штамм H37Rv с фенотипом PDIM− PhoP− приводит к коэффициенту выживаемости морских свинок 100% в условиях, в которых в случае БЦЖ достигали коэффициента выживаемости лишь 33%. Эта защита связана с уменьшением тяжести заболевания и бактериальной нагрузки.
В свете этих результатов, авторы настоящего изобретения приступили к разработке живой аттенуированной вакцины M. tuberculosis, содержащей штамм MTBVAC, находящийся в виде лиофилизированного осадка во флаконах из янтарного стекла объемом 3 мл. Как уже указано, штамм MTBVAC конструировали так, чтобы он содержал две независимые необратимые делеции, не имел маркеров резистентности к антибиотикам, соответствовал требованиям безопасности Женевского соглашения. В связи с этим, штамм MTBVAC генетически конструировали так, чтобы он фенотипически и функционально напоминал свой прототип SO2. В штамме MTBVAC встраивание немаркированной делеции fadD26 обеспечивает генетически стабильное устранение биосинтеза PDIM. Необходимо отметить, что SO2 обладает подробной и полной доклинической историей, демонстрирующей устойчивую безопасность, профиль аттенуации и многообещающую эффективность по сравнению с БЦЖ в соответствующих моделях на животных. Как уже указано, большинство этих доклинических исследований воспроизводили с использованием MTBVAC для подтверждения функционального профиля и биологической активности двойного аттенуированного PhoP-/PDIM--дефектного фенотипа.
С учетом указанного выше, авторы настоящего изобретения получали вакцину, содержащую штамм MTBVAC. Одну дозу 0,05 мл указанной вакцины вводили новорожденным с использованием внутрикожного пути, аналогично БЦЖ. Таким образом, первой целью авторов настоящего изобретения являлось получение, предпочтительно лиофилизированной, вакцины, которую можно использовать для новорожденных для лечения или профилактики TB в этой конкретной возрастной группе популяции. Учитывая это, авторы настоящего изобретения проводили эксперименты на новорожденных, описанные в примерах 2 и 3 настоящей заявки, где, в результате этих экспериментов, делали вывод о том, что вакцинация с использованием MTBVAC в приблизительной дозе 2,5×104 или 2,5×105 или более КОЕ являлась иммуногенной для новорожденных из TB-эндемичных условий.
Необходимо отметить, что в настоящей заявке термин "новорожденные" означает новорожденного ребенка (или другого млекопитающего) или младенца возрастом менее четырех недель.
В силу указанных выше результатов, авторы настоящего изобретения в настоящее время приступили к рандомизированному контролируемому исследованию фазы 2a для определения дозы, безопасности и иммуногенности MTBVAC на здоровых, неподвергавшихся введению БЦЖ, ВИЧ-отрицательных новорожденных из Южной Африки. Это исследование будут осуществлять на выборке из девяносто девяти ВИЧ-отрицательных, неподвергавшихся введению БЦЖ новорожденных без известного воздействия M. tuberculosis в домашних условиях. Приблизительная продолжительность исследования (от вакцинации первого участника до завершения сбора данных) будет составлять приблизительно 36 месяцев. В этом исследовании MTBVAC будут вводить новорожденным при трех уровнях доз: 1,5-8,5×104 КОЕ/0,05 мл, 1,5-8,5×105 КОЕ/0,05 мл и 1,5-8,5×106 КОЕ/0,05 мл. Активным контролем является вакцина БЦЖ. Участникам будут вводить одну дозу MTBVAC или БЦЖ, вводимых внутрикожно в день исследования 0. Цели исследования являлись следующими:
Первичные:
Оценка безопасности и реактогенности MTBVAC при повышении уровней доз по сравнению с вакциной БЦЖ на здоровых, неподвергавшихся введению БЦЖ, ВИЧ-отрицательных новорожденных из Южной Африки.
Оценка иммуногенности MTBVAC при повышении уровней доз на здоровых, неподвергавшихся введению БЦЖ, ВИЧ-отрицательных новорожденных из Южной Африки.
Вторичные:
Оценка коэффициент конверсии в анализе QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT) у новорожденных, подвергнутых повышению уровней доз MTBVAC.
Исследовательские:
Оценка различий рестриктированных по главному комплексу гистосовместимости (MHC) T-клеточных ответов, индуцируемых при вакцинации MTBVAC и БЦЖ.
Оценка различий ответов нерестриктированных по донору T-клеток, индуцируемых при вакцинации MTBVAC и БЦЖ.
Учитывая тот факт, что в примерах 2 и 3 уже указано, что вакцинация MTBVAC в приблизительных дозах 2,5×104 или 2,5×105 КОЕ или более являлась иммуногенной у новорожденных из TB-эндемичных условий, и что реактогенность вакцины MTBVAC была очевидно ниже, чем реактогенность вакцины БЦЖ, представляется вероятным, что введение MTBVAC новорожденным в дозах 1,5-8,5×104 КОЕ/0,05 мл, 1,5-8,5×105 КОЕ/0,05 мл или 1,5-8,5×106 КОЕ/0,05 мл можно использовать в качестве профилактического средства для новорожденных, имеющих риск инфекции M. tuberculosis или риск развития туберкулеза.
Таким образом, в первом аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащих к комплексу M. tuberculosis, предпочтительно - клинический изолят M. tuberculosis, более предпочтительно - клинический изолят M. tuberculosis, отличающийся тем, что имеет фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), более предпочтительно, указанный микроорганизм является штаммом MTBVAC, где композиция содержит по меньшей мере 1,5×104 КОЕ/0,05 мл выделенных микроорганизмов или более. Предпочтительно, композиция содержит от 1,5×104 КОЕ/0,05 мл до 8,5×106 КОЕ/0,05 мл выделенных микроорганизмов. Более предпочтительно, композиция содержит 1,5-8,5×104 КОЕ/0,05 мл, или 1,5-8,5×105 КОЕ/0,05 мл, или 1,5-8,5×106 КОЕ/0,05 мл выделенных микроорганизмов.
Во втором аспекте изобретения композицию по первому аспекту вводят для профилактики у новорожденных, имеющих риск инфекции M. tuberculosis или имеющих риск развития туберкулеза, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis; или для применения в профилактике у новорожденных людей, имеющих риск развития туберкулеза и страдающих латентной туберкулезной инфекцией, против развития клинической симптоматики, ассоциированной с активной формой заболевания, вызываемого комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis; или для применения в качестве вторичных средств для лечения пациентов, имеющих латентную и/или активную инфекцию TB, среди новорожденных; или для применения в ревакцинации, бустерной вакцинации или бустерной дозе при профилактическом лечении новорожденных людей, имеющих риск инфекции M. tuberculosis, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis; или для применения в качестве вторичных средств для профилактики любых неродственных инфекций, иных, чем туберкулез, вызываемый M. tuberculosis, включая инфекции нетуберкулезных микобактерий у новорожденных. Более предпочтительно, указанную композицию вводят новорожденным внутрикожным путем.
В дополнение к изложенному выше, следует отметить, что авторы настоящего изобретения в настоящее время проводят двойное слепое, рандомизированное, БЦЖ-контролируемое исследование безопасности и иммуногенности с повышением дозы на взрослых с латентной туберкулезной инфекцией (LTBI) и без нее, что измеряют с помощью анализа QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT). Оно является двойным слепым, рандомизированным, БЦЖ-контролируемым исследованием фазы 1b/2a безопасности и иммуногенности с повышением дозы на здоровых взрослых с LTBI и без нее. Все участников ранее подвергали вакцинации БЦЖ в младенчестве. Исследовательским продуктом является MTBVAC при четырех уровнях доз: 5×103 КОЕ, 5×104 КОЕ, 5×105 КОЕ и 5×106 КОЕ. Активным контролем является БЦЖ (5×105 КОЕ).
Участников, соответствующих критериям включения/исключения, будут рандомизировать по когортам для введения одной дозы MTBVAC или ревакцинации БЦЖ, вводимых внутрикожно в день исследования 0. Исследование будут проводить в одном центре в Южной Африке. Участников будут включать в одну из восьми когорт и отслеживать контрольные точки безопасности и иммуногенности до дня исследования 182. Приблизительное время до завершения включения составляет приблизительно 9 месяцев.
Когорты 1-8 будут включать QFT-отрицательных (когорты 1-4) и QFT-положительных (когорты 5-8) участников. Участников будут рандомизировать в каждой когорте для введения MTBVAC или БЦЖ.
С учетом этого, в третьем аспекте настоящее изобретение относится к композиции, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к комплексу M. tuberculosis, предпочтительно - клинический изолят M. tuberculosis, более предпочтительно - клинический изолят MT103 M. tuberculosis, отличающийся тем, что содержит фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и делеции второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающей продукцию PDIM (фенотип PDIM−),более предпочтительно - указанный микроорганизм является штаммом MTBVAC, где композиция содержит по меньшей мере 3×103 КОЕ/0,1 мл выделенных микроорганизмов или более. Предпочтительно, композиция содержит от 3×103 КОЕ/0,1 мл до 17×106 КОЕ/0,1 мл выделенных микроорганизмов. Более предпочтительно, композиция содержит 3-17×103 КОЕ/0,1 мл, или 3-17×104 КОЕ/0,1 мл, или 3-17×105 КОЕ/0,1 мл, или 3-17×106 КОЕ/0,1 мл выделенных микроорганизмов.
В четвертом аспекте изобретения композицию по третьему аспекту вводят для профилактики (включая бустерную вакцинацию) у людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые, имеющих риск инфекции M. tuberculosis, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. Более предпочтительно, указанную композицию вводят внутрикожным путем.
В пятом аспекте изобретения композицию по третьему аспекту вводят для профилактики у людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые, имеющих риск развития туберкулеза и страдающих латентной туберкулезной инфекцией, против развития клинической симптоматики, ассоциированной с активной формой заболевания, вызываемого комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. Более предпочтительно, указанную композицию вводят внутрикожным путем.
В шестом аспекте изобретения композицию по третьему аспекту вводят для применения в качестве вторичных средств для лечения пациентов, имеющих латентную и/или активную инфекцию TB, среди новорожденных и людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые. Более предпочтительно, указанную композицию вводят внутрикожным путем.
В седьмом аспекте изобретения композицию по третьему аспекту вводят для бустерной вакцинации или бустерной дозы при профилактическом лечении людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые, имеющих риск инфекции M. tuberculosis, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. В связи с этим, необходимо отметить, что после исходной иммунизации бустерная инъекция или бустерная доза представляет собой повторное воздействие иммунизирующего антигена. Она предназначена для повышения иммунитета против этого антигена обратно до протективных уровней после снижения памяти против этого антигена с течением времени.
С другой стороны, для разработки предпочтительного способа практического осуществления указанных выше аспектов изобретения с использованием штамма MTBVAC и минимизации потери жизнеспособности после лиофилизации при разработке, приводящей к получению постоянного результата и продукта со сроком годности по меньшей мере 2 года при хранении при +2-8°C, авторы настоящего изобретения осуществляли ряд исследований для определения наиболее подходящего способа получения вакцины MTBVAC. При первом приближении, тестировали различные среды для культивирования, а также различные композиции стабилизаторов.
Первой проблемой при получении вакцины MTBVAC являлось культивирование в среде с определенной композицией, в которой отсутствовали компоненты животного происхождения. По этой причине эксперименты осуществляли с использованием штамма SO2. Необходимо отметить, что штамм MTBVAC генетически конструировали так, чтобы фенотипически и функционально он напоминал свой прототип SO2, и, таким образом, штамм SO2 считали подходящей начальной точкой для разработки наиболее подходящего способа получения вакцины MTBVAC.
Используя штамм SO2, разрабатывали и тестировали разные среды, не содержащие какие-либо компоненты животного происхождения в своей композиции. Некоторые из известных сред для культивирования являлись следующими:
• среда Миддлбрука 7H9 и ее варианты (Media for Tubercle Bacilli, Dubos, R.J. and Middlebrook, G. American Review of Tuberculosis and Pulmonary Diseases, 1947 Vol. 56 No.4 pp. 334-45 ref.15).
• синтетическая среда Сатона (Handbook of Microbiological Media, Fourth Edition, Ronald M. Atlas, CRC Press, 2010. Page 1540) и ее варианты.
Композиции среды Сатона и среды Миддлбрука подробно представлены в следующих таблицах:
Таблица 1
| Среда Сатона | |
| Глицерин | 2% |
| L-аспарагин | 0,4% |
| Глюкоза | 0,2% |
| Лимонная кислота | 0,2% |
| Дигидроортофосфат калия | 0,05% |
| Сульфат магния | 0,055% |
| Полисорбат 80 | 0,0155% |
| Цитрат железа (III)-аммония | 0,005% |
| Сульфат цинка | 0,00001% |
Таблица 2
| Среда Миддлбрука 7H9 +ADC+Полисорбат | |
| Гидрофосфат натрия | 2,5 г/л |
| Дигидроортофосфат калия | 1,0 г/л |
| Глутаминовая кислота | 0,5 г/л |
| Сульфат аммония | 0,5 г/л |
| Цитрат натрия | 0,1 г/л |
| Сульфат магния | 50,0 мг/л |
| Цитрат железа (III)-аммония | 40,0 мг/л |
| Сульфат цинка | 1,0 мг/л |
| Сульфат меди | 1,0 мг/л |
| Пиридоксин | 1,0 мг/л |
| Хлорид кальция | 0,5 мг/л |
| Биотин | 0,5 мг/л |
| Глицерин | 2,0 мл/L |
| Бычий сывороточный альбумин | 5,0 г/л |
| Декстроза | 2,0 г/л |
| Каталаза | 3,0 мг/л |
| Полисорбат 80 | 0,5 г/л |
В среде Сатона рост являлся схожим с ростом в референсной среде (среде Миддлбрука без модификаций, таблица 2). На фигуре 1 показано сравнение кривой роста в среде Миддлбрука с кривой роста в среде Сатона. Параллельно композиции среды для культивирования, в этих тестах начинают профилировать другие переменные в лабораторном масштабе, такие как время культивирования, количество пассажей культуры и тип выращивания, статический или при встряхивании (см. таблицу 3).
| Выращивание M. tuberculosis SO2 в среде Сатона | ||||||||
| Условия культивирования | Статический рост | Встряхивание | ||||||
| Серия | 006 | 008 | 005 | 009 | 011 | 007 | 010 | 012 |
| Дни культивирования | 7 | 10 | 15 | 23 | 24 | 28 | 24 | 31 |
| Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/мл) | 9,70×107 | 3,00×108 | 1,91×108 | 1,25×108 | 1,69×108 | 4,70×108 | 3,30×106 | 5,10×106 |
| Оптическая плотность (600 нм) | 0,475 | 0,666 | 1,86 | 2,56 | 2,17 | 2,92 | 0,408 | 0,198 |
Таблица 3. Выращивание M. tuberculosis SO2 в среде Сатона
В конечном итоге, синтетическую среду Сатона выбирали для статических условий выращивания, т.к. она подходит для выращивания штамма SO2. Также можно выбирать нестатические условия выращивания, однако, необходимо, чтобы культура находилась в аэробных условиях.
Следующей стадией разработки являлось исследование способа лиофилизации. Лиофилизация является критической стадией получения живой вакцины. Достижение стабильности лиофилизированных вакцин является комплексным процессом, т.к. микроорганизмы не только восприимчивы к факторам внешней среды после лиофилизации, таким как температура, но и условия выращивания и составления также могут влиять на успех способа. На выход жизнеспособных бактерий после лиофилизации и стабильность при последующем хранении могут влиять такие факторы, как цикл лиофилизации, композиция стабилизатора, остаточная влажность и присутствие воздуха.
В фазе разработки с использованием SO2 тестировали до 11 разных композиций стабилизаторов. В следующей таблице приведены тестируемые композиции стабилизаторов:
Таблица 4
| Стабилизатор | Компоненты | Концентрация |
| S | Среда (без стабилизатора) | NA |
| G | Глутамат натрия | 10-40 г/л |
| GSA | Глутамат натрия | 10-40 г/л |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| M | Маннит | 20-50 г/л |
| MS | Маннит | 20-50 г/л |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| GSM | Глутамат натрия | 10-40 г/л |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| Маннит | 20-50 г/л | |
| GC | Гликокол | 30-200 г/л |
| Трицитрат натрия | 30-40 г/л | |
| GSb | Гликокол | 30-200 г/л |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| GT | Гликокол | 30-200 г/л |
| Трегалоза | 18-60 г/л | |
| CGS | Трицитрат натрия | 30-40 г/л |
| Гликокол | 30-200 г/л | |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| CFT | Хлорид натрия | 2-5 г/л |
| Дигидроортофосфат калия | 2-5 г/л | |
| Трегалоза | 60 г/л |
В исследованиях стабилизаторов также тестировали разные составы, в которых, в дополнение к композициям, варьировали доли стабилизатора и среды для культивирования, а также объем для лиофилизации. Во всех партиях определяли потерю жизнеспособности в лиофилизированном продукте и стабильность после 30 дней при 37°C. В качестве критерия выбора стабилизаторов для последующих тестов использовали предел потери жизнеспособности 90% и/или максимум 80% потери после ускоренного анализа стабильности при 37°C (см. результаты в таблице 5).
Таблица 5 Лиофилизация SO2 с использованием разных стабилизаторов.
| Партия | Стабилизатор | ||||||||||||
| Описание | GSA | G | GSM | M | MS | GSB | GC | GS | CGS | CFT | GT | S | |
| 005 | % потери при лиофилизации | 29% | 53% | 84% | |||||||||
| % потери при 37°C | 90% | >99% | >99% | ||||||||||
| 006 | % потери при лиофилизации | 7,40% | 10% | 8% | 66% | 5,00% | >99% | ||||||
| % потери при 37°C | 87% | 61% | 66% | 99% | 97,7% | ND | |||||||
| 007 | % потери при лиофилизации | 65% | 53% | 99% | |||||||||
| % потери при 37°C | 98,5% | 92,3% | >99% | ||||||||||
| 008 | % потери при лиофилизации | 24% | 12% | 67% | |||||||||
| % потери при 37°C | 88% | 88% | >99% | ||||||||||
| 009 | % потери при лиофилизации | 31% | 20% | 77% | |||||||||
| % потери при 37°C | 85% | >99% | >99% | ||||||||||
| 010 | % потери при лиофилизации | 70% | 91% | 54% | 79% | ||||||||
| % потери при 37°C | 88,5% | >99% | >99% | >99% | |||||||||
| 011 | % потери при лиофилизации | 9,40% | 61% | ||||||||||
| % потери при 37°C | 57% | >99% | |||||||||||
| 012 | % потери при лиофилизации | 84% | 97% | 95% | 98% | >99% | |||||||
| % потери при 37°C | >99% | >99% | >99% | >99% | >99% | ||||||||
После указанных выше предварительных испытаний был сделан вывод о том, что в среду для культивирования необходимо добавлять стабилизатор для лиофилизации, т.к. потери при лиофилизации без стабилизатора составляли более 99%, и лучшим стабилизатором, соответствующим требованиям к потере при лиофилизации и ускоренным исследованиям стабильности при 37°C, являлся GSA (глутамат натрия и сахароза).
После того, как было сделано указанное выше заключение, штамм MTBVAC получали в форме лиофилизированной предосновной серии посевного материала, и вскоре после этого авторы настоящего изобретения начинали культивирование клеток этого конкретного штамма. Для выращивания штамма MTBVAC использовали первую среду Сатона с той же композицией, которую использовали в исследованиях по выращиванию родительского штамма SO2 (см. таблицу 1). Однако в случае MTBVAC неожиданно наблюдали более низкий рост в синтетической среде Сатона, чем в случае штамма SO2. Кроме того, также определяли проблемы в фазе амплификации штамма MTBVAC. Для решения этих проблем проводили тесты, добавляя и удаляя компоненты из композиции среды Сатона. Такие модификации заключались в добавлении или удалении добавок, таких как глюкоза, сульфат цинка, биотин, глицерин и полисорбат.
Обогащение синтетической среды Сатона сульфатом цинка и биотином не приводило к хорошим результатам, и не наблюдали роста MTBVAC. В случае обогащения глюкозой, полисорбатом и глицерином результаты являлись благоприятными, и наблюдали достаточный рост MTBVAC.
В результате этих исследований роста разработали среды SD и SDG и выращивали культуры MTBVAC в этих средах. Рост MTBVAC был хорошим и в среде SD, и в среде SDG, но рост некоторых культур останавливался после успешных пассажей в среде SDG, поэтому для амплификационных пассажей выбирали среду SD. На фигуре 2 показаны результаты OD для культур MTBVAC в среде Сатона и средах SD и SDG.
Однако, когда культуры штамма MTBVAC инициировали из флаконов лиофилизированной основной серии посевного материала, наблюдали невозможность инициации роста в среде SD, поэтому модифицировали ее композицию и разрабатывали посевную среду. В заключение этих исследований и для будущих пилотных и промышленных тестов в качестве средства для инициации культуры выбирали посевную среду, в качестве средства для амплификационных пассажей выбирали среду SD и в качестве средства для массового культивирования перед лиофилизацией выбирали среду SDG. Кроме того, необходимо отметить, что композиция среды SD в комбинации со стабилизатором влияла на лиофилизацию и внешний вид таблетки, таким образом, лиофилизацию будут осуществлять только в среде SDG.
В настоящем описании приведена композиция посевной среды и сред SD и SDG.
Таблица 6
| Компоненты | Посевная среда | Среда SD | Среда SDG |
| L-аспарагин | 2,00-4,00 г | 2,00-4,00 г | 2,00-4,00 г |
| Дигидроортофосфат калия | 0,30-0,60 г | 0,30-0,60 г | 0,30-0,60 г |
| Сульфат магния H2O | 0,5-0,70 г | 0,50-0,70 г | 0,50-0,70 г |
| Цитрат железа (III)-аммония | 0,02-0,05 г | 0,02-0,05 г | 0,02-0,05 г |
| Моногидрат декстрозы | 7,00-8,00 г | 3,00-4,00 г | 3,00-4,00 г |
| Глицерин | 10,0-20,0 мл | 30-40 мл | 3,0-10,0 мл |
| Лимонная кислота | 1,5-2,0 г | 1,5-2 г | 1,5-2 г |
| Полисорбат 80 | 0,15-0,5 мл | 0,15-0,5 мл | |
| Очищенная вода в достаточном количестве |
В связи с этим, в следующих трех таблицах показаны результаты получения пяти партий MTBVAC 2,5×105 в промышленных масштабах, где показана согласованность результатов, полученных с использованием средств, разработанных в ходе исследования.
Таблица 7: Культура MTBVAC из лиофилизированного рабочего посевного банка в посевной среде
| Контроль | Серия 170928 | Серия 170580 | Серия 171811 | Серия 171911 | Серия 172547 |
| Внешний вид культуры | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Чистота (EP 2.6.1) | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации |
| Чистота (по Цилю-Нильсену) | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы |
| Количество жизнеспособных бактерий | 1,37×106 КОЕ/мл | 5,3×106 КОЕ/мл | 5,4×106 КОЕ/мл | 7,5×106 КОЕ/мл | 1×106 КОЕ/мл |
Таблица 8: Культура MTBVAC в среде SD из предыдущего пассажа (таблица 7)
| Контроль | Серия 170928 | Серия 170580 | Серия 171811 | Серия 171911 | Серия 172547 |
| Внешний вид культуры | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Чистота (EP 2.6.1) | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации |
| Чистота (по Цилю-Нильсену) | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы |
| Количество жизнеспособных бактерий | 6,04×108 КОЕ/мл | 4,33×108 КОЕ/мл | 1,16×108 КОЕ/мл | 3,16×108 КОЕ/мл | 3,26×108 КОЕ/мл |
Таблица 9: Культура MTBVAC в среде SD из предыдущего пассажа (таблица 8)
| Контроль | Серия 170928 | Серия 170580 | Серия 171811 | Серия 171911 | Серия 172547 |
| Внешний вид культуры | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Чистота (EP 2.6.1) | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации |
| Чистота (по Цилю-Нильсену) | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы |
| Количество жизнеспособных бактерий | 1,73×108 КОЕ/мл | 3,03×108 КОЕ/мл | 3,02×108 КОЕ/мл | 1,27×108 КОЕ/мл | 3,7×108 КОЕ/мл |
Таблица 10: Культура MTBVAC в среде SDG из предыдущего пассажа (таблица 9)
| Контроль | Серия 170928 | Серия 170580 | Серия 171811 | Серия 171911 | Серия 172547 |
| Внешний вид культуры | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Чистота (EP 2.6.1) | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации | Отсутствие контаминации |
| Чистота (по Цилю-Нильсену) | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы | Кислото- и спиртоустойчивые бациллы |
| Количество жизнеспособных бактерий | 7,1×108 КОЕ/мл | 4,33×108 КОЕ/мл | 4,51×108 КОЕ/мл | 2,77×108 КОЕ/мл | 3,26×108 КОЕ/мл |
В указанных предыдущих исследованиях с использованием штамма SO2 авторы настоящего изобретения делали вывод о том, что при лиофилизации необходимо использовать стабилизатор для снижения потерь количества жизнеспособных бактерий и для улучшения стабильности лиофилизированного продукта. Для разработки MTBVAC использовали те же стабилизаторы, которые выбирали в исследованиях с использованием SO2. Целью являлось получение лиофилизированной вакцины с концентрацией в диапазоне от 3×103 КОЕ/0,1 мл до 17×106 КОЕ/0,1 мл, предпочтительно - в диапазоне 3-17×103 КОЕ/0,1 мл, или 3-17×104 КОЕ/0,1 мл, или 3-17×105 КОЕ/0,1 мл, или 3-17×106 КОЕ/0,1 мл штамма MTBVAC при минимизации потери жизнеспособности после лиофилизации при разработке, что позволило бы получать согласованные результаты и продукт со сроком годности по меньшей мере 2 года при хранении при 2-8°C.
В фазе разработки с использованием MTBVAC тестировали до 7 разных композиций стабилизатора. В следующей таблице 11 приведены тестируемые композиции стабилизаторов:
Таблица 11
| Стабилизатор | Компоненты | Концентрация |
| S | Среда (без стабилизатора) | NA |
| GSA | Глутамат натрия | 10-40 г/л |
| Сахароза | 100 -400 г/л | |
| GSM | Глутамат натрия | 10-40 г/л |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| Маннит | 20-50 г/л | |
| GSb | Гликокол | 30-200 г/л |
| Сахароза | 100-400 г/л | |
| GT | Гликокол | 30-200 г/л |
| Трегалоза | 18-60 г/л | |
| GTS | Трегалоза | 30-60 г/л |
| Гликокол | 40-100 г/л | |
| Сахароза | 75-200 г/л | |
| GSTG | Глутамат натрия | 10-40 г/л |
| Гликокол | 75-150 г/л | |
| Сахароза | 75-200 г/л | |
| Трегалоза | 15-60 г/л |
В следующих ниже таблицах 12 и 13 представлены результаты в терминах процента потери жизнеспособности в ускоренном исследовании стабильности при тестировании лиофилизации MTBVAC лабораторного масштаба. В таблицах ниже показан эффект композиции среды для лиофилизации в комбинации со стабилизатором при лиофилизации. В этих исследованиях был сделан вывод о том, что для лиофилизации MTBVAC необходимо добавлять стабилизатор, и что стабилизатор GSA обеспечивает лучшие результаты в отношении тестируемых параметров.
| Партия | GSA | GSB | GSM | GT | S |
| 001 | 73% | 97% | >99% | ||
| 005 | >99% | ||||
| 009 | >99% | >99% | |||
| 011 | >99% | ||||
| 012 | >99% | ||||
| 013 | >99% | >99% | >99% | ||
| 014 | >99% | >99% |
Таблица 12. Лиофилизация MTBVAC, выращенных в среде SD, с использованием разных стабилизаторов. Процент потери жизнеспособности в ускоренном исследовании стабильности.
| Партия | GSA | GSB | GSM | GTS | GT | GSTG | S |
| 002 | 61% | >99% | 60% | 98% | 98% | ||
| 003 | 62% | 77% | |||||
| 004 | 89% | >99% | >99% | ||||
| 005 | 73% | ||||||
| 006 | 59% | >99% | |||||
| 007 | 49% | 32% | 86% |
Таблица 13. Лиофилизация MTBVAC, выращенных в среде SDG, с использованием разных стабилизаторов. Процент потери жизнеспособности в ускоренном исследовании стабильности.
И наконец, в следующей таблице представлены результаты лиофилизации 4 партий MTBVAC:
Таблица 14
| Контроль | Описание | Серия 102897 | Серия 110142 | Серия 110238 | Серия 110380 |
| Внешний вид | Лиофилизированная пилюля | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Вакуум | Использован | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Чистота (EP 2.6.1) | Отсутствие контаминации | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая |
| Остаточная влажность | <3% масс./масс. | 1,44% | 1,26% | 1,68% | 1,84% |
| Идентификация (ПЦР) | Молекулярная характеризация | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая |
| Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/флакон) | 3-17×106 КОЕ/флакон | 1,63×107 | 8,54×106 | 1,58×107 | 8,54×106 |
| Потеря при лиофилизации | <90% | 64% | 67% | 63% | 67% |
На фигуре 3 показаны результаты исследования стабильности при температуре от 2-8°C до -30°C серий или партий, указанных в таблице 14 выше. Кроме того, в следующей таблице 15 приведены дополнительные результаты в отношении параллельной лиофилизации культуры из таблицы 11 (среда SDG) в пилотном и промышленном исследовании.
Таблица 15
| Контроль | Описание | Лиофилизация серия | |||||
| 171437P | 171611In | 171889P | 171976In | 172952P | 172871IN | ||
| Серия культуры MTBVAC | 170928 | 170928 | 170580 | 170580 | 172547 | 172547 | |
| Внешний вид | Лиофилизированная пилюля | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Вакуум | Использован | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий | Соответствующий |
| Чистота (EP 2.6.1) | Отсутствие контаминации | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая |
| Остаточная влажность | <3% масс./масс. | 1,72 | 1,89 | 2,02 | 2,13 | 1,89 | 1,37 |
| Идентификация (ПЦР) | Молекулярная характеризация | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая | Соответствующая |
| Количество жизнеспособных клеток (КОЕ/флакон) | 3-17×106 КОЕ/флакон | 1,5×107 | 1,6×107 | 6,03×107 | 1,17×107 | 1,03×107 | 1,37×107 |
| Потеря при лиофилизации | <90% | 64% | 67% | 63% | 67% | 81,03% | 74,76% |
Все из указанных выше результатов получали посредством лиофилизации среды SDG, в которой выращивали штамм MTBVAC, предпочтительно - выращивали в диапазоне от 1×108 до 5×108 КОЕ/мл. Необходимо отметить, что для осуществления указанной лиофилизации добавляли глутамат натрия и сахарозу (GSA), предпочтительно, в концентрации 10-40 г/л глутамата натрия и 100-400 г/л сахарозы.
Таким образом, в настоящем описании представлены конкретные составы и способы, которые можно использовать для получения фармацевтических препаратов на основе живого штамма MTBVAC, как описано ниже. Составы по изобретению содержат или состоят из любых из композиций, подробно описанных ниже, и их можно использовать для культивирования штаммов MTBVAC. Композиции подробно описаны ниже:
| Компоненты | Посевная среда | Среда SD | Среда SDG | |||
| L-аспарагин | 2,00-4,00 | г | 2,00-4,00 | г | 2,00-4,00 | г |
| Дигидроортофосфат калия | 0,30-0,60 | г | 0,30-0,60 | г | 0,30-0,60 | г |
| Сульфат магния H2O | 0,5-0,70 | г | 0,50-0,70 | г | 0,50-0,70 | г |
| Цитрат железа (III)-аммония | 0,02-0,05 | г | 0,02-0,05 | г | 0,02-0,05 | г |
| Моногидрат декстрозы | 7,00-8,00 | г | 3,00-4,00 | г | 3,00-4,00 | г |
| Глицерин | 10,0-20,0 | мл | 30-40 | мл | 3,0-10,0 | мл |
| Лимонная кислота | 1,5-2,0 | г | 1,5-2 | г | 1,5-2 | г |
| Полисорбат 80 | 0,15-0,5 | мл | 0,15-0,5 | мл | ||
| Очищенная вода в достаточном количестве | 1,00 | л | 1,00 | л | 1,00 | л |
Таким образом, восьмой аспект изобретения относится к композиции, содержащей или состоящей из посевной среды, описанной выше.
Девятый аспект изобретения относится к композиции, содержащей или состоящей из среды SD, описанной выше.
Десятый аспект изобретения относится к композиции, содержащей или состоящей из среды SDG, описанной выше.
Одиннадцатый аспект изобретения относится к любой из посевной среды, среды SD или среды SDG, описанных выше, где указанная среда дополнительно содержит штаммы MTBVAC, выращенные в ней, предпочтительно - в диапазоне от 1×108 до 5×108 КОЕ/мл.
Двенадцатый аспект изобретения относится к применению любой из посевной среды, среды SD или среды SDG, описанных выше, для культивирования или выращивания штаммов MTBVAC в аэробных условиях. В связи с этим, предпочтительно, в качестве средства для инициации культуры штамма MTBVAC выбирают посевную среду, в качестве средств для амплификационных пассажей выбирают среду SD и в качестве средств для массового культивирования перед лиофилизацией выбирают среду SDG. В особенно предпочтительных вариантах осуществления двенадцатого аспекта изобретения настоящее изобретение относится к способу получения готовой лиофилизированной живой аттенуированной вакцинной композиции M. tuberculosis, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к штамму M. tuberculosis, имеющему i) фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и ii) делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), более предпочтительно - штамму MTBVAC, где способ включает инициацию культуры штамма M. tuberculosis и выращивание или амплификацию указанных бактерий с использованием подходящей клеточной среды, где способ отличается тем, что для массового культивирования перед лиофилизацией используют среду SDG. Предпочтительно, способ включает инициацию культуры штамма M. tuberculosis в посевной среде и выращивание или амплификацию указанных бактерий с использованием среды SD и с использованием среды SDG для массового культивирования перед лиофилизацией. Более предпочтительно, способ дополнительно включает стадию лиофилизации посредством добавления сахарозы и глутамата натрия в качестве стабилизаторов в среду SDG, используемую для массового культивирования перед стадией лиофилизации.
Кроме того, обнаружено, что некоторые компоненты (например, конкретные стабилизаторы, объемообразующие средства и буферы) являются предпочтительными для получения лиофилизированных вакцин штаммов MTBVAC. Изобретение также относится к восстановленным вакцинам и профилактическим и терапевтическим способам, в которых используют композиции по настоящему изобретению. Композиции и способы по изобретению описаны далее.
В частности, тринадцатый аспект изобретения относится живой аттенуированной вакцинной композиции M. tuberculosis, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к штамму M. tuberculosis, имеющему i) фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и ii) делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), предпочтительно, штамм M. tuberculosis является штаммом MTBVAC, где указанная композиция является лиофилизированной композицией, и где указанную композицию получают посредством лиофилизации среды для культивирования, содержащей микроорганизм, посредством добавления сахарозы и глутамата натрия в качестве стабилизаторов, и где среда для культивирования является средой SDG. Более предпочтительно, в тринадцатом аспекте настоящее изобретение относится к живой аттенуированной вакцинной композиции M. tuberculosis, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к штамму M. tuberculosis, имеющему i) фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и ii) делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), где предпочтительно штамм M. tuberculosis является штаммом MTBVAC, и где указанную живую аттенуированную вакцинную композицию M. tuberculosis получают или могут получать способом по двенадцатому аспекту изобретения.
Еще более предпочтительно, настоящее изобретение относится к живой аттенуированной вакцинной композиции M. tuberculosis, предпочтительно - восстановленной композиции после лиофилизации, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к штамму M. tuberculosis, имеющему i) фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757 и ii) делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), где, предпочтительно, штамм M. tuberculosis является штаммом MTBVAC, и где указанная композиция отличается тем, что содержит или состоит из следующих компонентов на мл (в процентах):
| Компоненты | MTBVAC Доза на 1 мл |
| L-аспарагин | 0,034-0,066% |
| Дигидроортофосфат калия | 0,006-0,010% |
| Сульфат магния H2O | 0,008-0,012% |
| Цитрат железа (III)-аммония | 0,0004-0,0008% |
| Моногидрат декстрозы | 0,05-0,066% |
| Глицерин | 0,00005-0,0001% |
| Лимонная кислота | 0,026-0,034% |
| Полисорбат 80 | 0,000002-0,000008% |
| Глутамат натрия | 0,33-1,33% |
| Сахароза | 3,3-13,3% |
| Очищенная вода в достаточном количестве | 1 мл |
Более предпочтительно, живая аттенуированная вакцинная композиция M. tuberculosis, описанная в абзаце выше, является лиофилизированной или восстановленной композицией, полученной посредством добавления воды, предпочтительно - стерилизованной воды для инъекции, в лиофилизированную композицию.
В предпочтительном варианте осуществления тринадцатого аспекта изобретения или любого из его предпочтительных вариантов осуществления указанная композиция отличается тем, что содержит по меньшей мере 3×103 КОЕ штаммов микроорганизма на 0,1 мл, предпочтительно - на 0,1 мл воды, или более. Предпочтительно, композиция содержит от 3×104 КОЕ на 0,1 мл до 17×106 КОЕ на 0,1 мл штаммов выделенного микроорганизма. Более предпочтительно, композиция содержит 3-17×104 КОЕ на 0,1 мл, или 3-17×105 КОЕ на 0,1 мл или 3-17×106 КОЕ на 0,1 мл штаммов выделенного микроорганизма. Еще более предпочтительно, в таблице ниже представлена спецификация для выпуска лиофилизированной вакцины MTBVAC, содержащей 1,5-8,5×105 КОЕ/0,05 мл штаммов MTBVAC.
| Тест | Критерии приемлемости | Методология |
| Внешний вид | Белый лиофилизированный осадок | Наблюдение |
| Вакуум | Любой флакон без вакуума выбрасывают | Наблюдают флуоресценцию |
| Чистота | Отсутствие бактериальной и грибковой контаминации, за исключением присутствия микобактерий | Тест стерильности в соответствии с Европейской Фармакопеей (2.6.1) |
| Вода | ≤3% масс./масс. | Способ Карла-Фишера |
| Идентификация-ПЦР | Подтверждение делеций fadD26 и phoP | Анализ ПЦР в реальном времени |
| Количество жизнеспособных бактерий | 1,5-8,5×105 КОЕ/дозу (0,05 мл) | Подсчет в конкретной среде |
| Потеря при лиофилизации | ≤90% | Потеря жизнеспособности |
| Чрезмерная кожная реактивность | Реакция меньше, чем в случае вакцины сравнения | Тест БЦЖ в соответствии с Европейской Фармакопеей (0163) |
| Вирулентные микобактерии | Не более 1 из 10 животных погибает в течение 42 дней после инъекции, и при аутопсии не выявляют какие-либо признаки туберкулеза. | Тест БЦЖ в соответствии с Европейской Фармакопеей (0163) |
| Форма выпуска | Соответствие | Проверка упаковки |
Кроме того, как указано в спецификации, данные о стабильности свидетельствуют о том, что основной и рабочий банки клеток, полученные из предосновного посевного материала, являются стабильными (см. фигуру 8), и что вакцина MTBVAC, хранящаяся при -15°C--30°C и +2-+8°C, является стабильной в течение более 24 месяцев (см. фигуры 3 и 10).
Кроме того, исследование стабильности показало, что вакцина MTBVAC является стабильной в течение по меньшей мере 8 часов при комнатной температуре после восстановления.
Как подробно описано где-либо в настоящем описании, композиции по изобретению являются особенно предпочтительными из-за стабильности и жизнеспособности активных компонентов, являющихся результатом, главным образом, состава и способа, которым получают продукт, включающего лиофилизацию. В основном, этот способ включает следующие стадии: замораживание, первичную сушку, вторичную сушку и закупоривание. Способ подробно описан ниже в экспериментальных примерах, но пример способа является следующим. На стадии замораживания полки лиофилизатора предварительно охлаждают до -50°C. После загрузки всех лотков полки держат при -50°C в течение 120 минут. На стадии первичной сушки вакуум устанавливают на 25 мТорр и осуществляют следующие стадии изменения температуры: изменение температуры при +0,1°C/минуту до температуры полки -40°C, удержание в течение 500 минут; изменение температуры при +0,1°C/минуту до температуры полки -35°C, удержание в течение 500 минут; изменение температуры при +0,1°C/минуту до температуры полки -30°C, удержание в течение 500 минут, и изменение температуры при +0,1°C/минуту до температуры полки -25°C, удержание в течение 800 минут. На стадии вторичной сушки вакуум также устанавливают на 25 мТорр, и стадию изменения температуры осуществляют таким образом, что изменение температуры осуществляют со скоростью +0,1°C/минуту до достижения температуры полки +20°C, и удерживают в течение 800 минут. При необходимости, продукт можно держать при +20°C, 25 мТорр в течение еще до 24 часов перед закупориванием. На стадии закупоривания камеру дегазируют с помощью фильтрованного через фильтр 0,22 мкм, сухого, газообразного азота, вакуум устанавливают на 800 мбар (небольшой вакуум) и проталкивают пробки во флаконы. Альтернативные циклы лиофилизации, которые можно использовать в настоящем изобретении, хорошо известны в этой области. Таким образом, способы по изобретению могут включать замораживание до или до приблизительно, например, температуры от -70°C до -30°C (например, от -60°C до -40°C, или -50°C). Замораживание можно осуществлять в течение приблизительно от 30 до 240 минут (например, от 60 до 120 минут) или более. Затем материал можно подвергать одной или более стадиям сушки, как представлено в настоящем описании. На этих стадиях можно использовать вакуум (например, 25 мТорр) и температуру можно менять постепенно (например, от 0,1 до 1,0°C/минуту или 0,5°C/минуту) за период времени (такой как 100-1000 минут, например, 200-600 или 300-500 минут). При первичной сушке температуру можно повышать до или до приблизительно, например, от -30°C до +10°C, например, от -20°C до +5°C или от -15°C до 0°C, в то время как во время вторичной сушки температуру можно изменять до, например, температуры от +5°C до +35°C, например, от 10°C до 30°C или от 15°C до 20°C. Как известно специалисту в этой области, эти параметры (например, температуры, время удержания, скорость изменения температуры и уровни вакуума) можно изменять с учетом, например, полученных результатов.
Вакцинные композиции по тринадцатому аспекту изобретения можно вводить по четырнадцатому аспекту изобретения в качестве первичных профилактических средств для индивидуумов, имеющих риск инфекции M. tuberculosis, или индивидуумов, имеющих риск развития туберкулеза, или их можно использовать в качестве вторичных средств для лечения инфицированных пациентов. Т.к. штаммы из этих композиций являются аттенуированными, они особенно подходят для введения "индивидуумам, имеющим риск", таким как новорожденные, дети, подростки, взрослые и пожилые люди. Такие вакцины также можно использовать в ветеринарии.
Предпочтительный вариант осуществления четырнадцатого аспекта изобретения относится к вакцине MTBVAC для иммунизации индивидуума против симптомов, вызываемых туберкулезом. Необходимо отметить, что указанная вакцина также может подходить для лечения рака мочевого пузыря, а также лечения или профилактики TB или в качестве вектора или адъюванта. Предпочтительно иммунизировать индивидуума против симптомов, вызванных TB.
В другом предпочтительном варианте осуществления четырнадцатого аспекта изобретения композицию по тринадцатому аспекту вводят для профилактики у новорожденных, имеющих риск инфекции M. tuberculosis или имеющих риск развития TB, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. Более предпочтительно, указанную композицию вводят новорожденным внутрикожным путем.
В другом предпочтительном варианте осуществления четырнадцатого аспекта изобретения композицию по тринадцатому аспекту вводят для профилактики (включая бустерную вакцинацию) у людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые, имеющих риск инфекции M. tuberculosis, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. Более предпочтительно, указанную композицию вводят внутрикожным путем.
В другом предпочтительном варианте осуществления четырнадцатого аспекта изобретения композицию по тринадцатому аспекту вводят для профилактики у людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые, имеющих риск развития TB и страдающих латентной туберкулезной инфекцией, против развития клинической симптоматики, ассоциированной с активной формой заболевания, вызываемого комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. Более предпочтительно, указанную композицию вводят внутрикожным путем.
В другом предпочтительном варианте осуществления четырнадцатого аспекта изобретения композицию по тринадцатому аспекту вводят для применения в качестве вторичных средств для лечения пациентов, имеющих латентную и/или активную инфекцию TB, среди новорожденных и людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые. Более предпочтительно, указанную композицию вводят внутрикожным путем.
В другом предпочтительном варианте осуществления четырнадцатого аспекта изобретения композицию по тринадцатому аспекту вводят для бустерной вакцинации или бустерной дозы при профилактическом лечении у людей, не являющихся новорожденными, таких как дети, подростки и взрослые, имеющих риск инфекции M. tuberculosis, против инфекций, вызываемых комплексом M. tuberculosis, предпочтительно - M. tuberculosis. В связи с этим, необходимо отметить, что после исходной иммунизации, бустерная инъекция или бустерная доза представляет собой повторное воздействие антигена для иммунизации. Она предназначена для повышения иммунитета против антигена обратно до протективных уровней после того, как память против антигена снизилась с течением времени.
На всем протяжении описания и формулы изобретения термин "содержат" и его варианты не подразумевают исключения других технических характеристик, добавок, компонентов или стадий. Другие цели, преимущества и характеристики изобретения будут очевидны специалисту в этой области частично из описания и частично при практическом осуществлении изобретения. Следующие примеры и фигуры приведены в качестве неограничивающих, иллюстративных примеров по настоящему изобретению.
Примеры
Пример 1.
Иммуногенность и защита не зависят от дозы MTBVAC у новорожденных мышей
Новорожденных мышей C3H (возрастом 1-3 дня) вакцинировали внутрикожно 25 мкл, содержащими одну клиническую дозу БЦЖ (приблизительно 2,5×105) или указанные дозы MTBVAC в КОЕ. В группах БЦЖ использовали коммерческие флаконы БЦЖ Danish, соответствующие сериям 111053F и 113033C. В случае MTBVAC, животных иммунизировали вакциной MTBVAC, полученной посредством лиофилизации среды SDG, в которой были выращены штаммы MTBVAC для осуществления указанной лиофилизации, глутамат натрия и сахарозу (GSA) добавляли в концентрациях 10-40 г/л глутамата натрия и 100-400 г/л сахарозы. Лиофилизированные составы ресуспендировали.
ИССЛЕДОВАНИЯ ЭФФЕКТИВНОСТИ ЗАЩИТЫ
Через восемь недель после вакцинации мышей стимулировали интраназально с помощью 150 КОЕ M. tuberculosis штамма H37Rv. Через четыре недели мышей умерщвляли и определяли бактериальную нагрузку в легких посредством посева гомогенатов ткани на твердую среду 7H11S. Результаты показаны на фигуре 4.
ИССЛЕДОВАНИЯ ИММУНОГЕННОСТИ
Через восемь недель после вакцинации мышей умерщвляли и выделяли спленоциты для оценки иммуногенности. Один миллион спленоцитов инкубировали в течение 24 часов в присутствии 10 мкг/мл очищенного белкового деривата (PPD), 2 мкг/мл перекрывающихся пептидов ESAT6 или CFP10 или не-антигена (отрицательного контроля). Клетки, продуцирующие интерферон гамма (ИФНγ), анализировали посредством ELISPOT. Результаты показаны на фигуре 5.
ВЫВОДЫ
Ни эффективность защиты, ни иммуногенность, специфическая для PPD, ESAT6 или CFP10, индуцируемая с помощью MTBVAC, не являлись дозозависимыми в модели на новорожденных мышах.
Пример 2. ДАННЫЕ ОБ ИММУНОГЕННОСТИ В ИССЛЕДОВАНИИ ФАЗЫ 1B НА НОВОРОЖДЕННЫХ (ЮЖНАЯ АФРИКА)
Цель: Определение иммуногенности и характеризация индуцируемых иммунных ответов после неонатальной вакцинации вакцины MTBVAC по настоящему изобретению.
Способы: Тридцать шесть ВИЧ-отрицательных, неподвергнутых введению БЦЖ здоровых новорожденных рандомизировали в соотношении 1:3 для введения БЦЖ (штамм SSI) или MTBVAC в дозе 2,5×103, 2,5×104 или 2,5×105 КОЕ в пределах 96 ч. после рождения. MTBVAC-специфические цитокиновые ответы в цельной крови измеряли в дни 7, 28, 70 посредством окрашивания цельной крови на внутриклеточные цитокины и проточной цитометрии с помощью BD LSRFortessa (18-цветного, сине-красно-фиолетово-зеленая конфигурация).
Анализ ICS цельной крови:
Свежие гепаринизированные образцы цельной крови незамедлительно стимулировали БЦЖ, MTBVAC или фитогемагглютинином (PHA) или оставляли нестимулированными (Nil) в течение 12 часов при 37°C. Условия стимуляции включают половину объема крови [250 мкл (0,25 мл)] и только Nil, MTBVAC и БЦЖ. После 7 часов стимуляции собирали супернатанты (для анализа растворимых цитокинов/хемокинов), соответствующие всем условиям, замораживали при -BOC и хранили для транспортировки спонсору для дальнейшего анализа. После удаления супернатанта к остальной цельной крови добавляли брефелдин A и инкубировали пробирки еще в течение 5 ч. на программируемой водяной бане. Водяную баню отключали всего после 12 часов стимуляции. На следующее утро добавляли раствор FACSLysing для лизиса эритроцитов и фиксации лейкоцитов. Затем фиксированные лейкоциты замораживали для последующего окрашивания внутриклеточных цитокинов и проточной цитометрии. Окрашивание и проточный цитометрический анализ будут осуществлять в партиях в более поздний момент времени. Оценивали изменение частот и паттернов продукции специфических цитокинов типа 1 и ИЛ-17 CD4+ T-клетками. Временные точки для оценки иммуногенности выбирали на основе недавних исследований, проведенных SATVI, показавших, что пик БЦЖ-индуцированных T-клеточных ответов у младенцев приходится на возраст приблизительно 6-10 недель.
Результаты: Вакцинация повышающимися дозами MTBVAC приводила к преимущественно Th1-опосредованному (ИФНγ, ИЛ-2 или ФНОα) антиген-специфическому ответу CD4+ T-клеток. Наибольшая доза MTBVAC 2,5×105 КОЕ индуцировала наиболее высокую величину антиген-специфического, опосредованного CD4+ T-клетками цитокинового ответа в день 70. Наименьшая доза MTBVAC 2,5×103 КОЕ являлась наименее иммуногенной. Результаты показаны на фигуре 6.
Выводы: Эти данные свидетельствуют о том, что вакцинация с помощью MTBVAC в дозе 2,5×104 или 2,5×105 или более КОЕ является иммуногенной у новорожденных из TB-эндемичных условий.
Пример 3. Рандомизированное, двойное слепое клиническое испытание MTBVAC с повышением дозы по сравнению с вакциной БЦЖ SSI на новорожденных с группой анализа безопасности, включающей взрослых, живущих в TB-эндемичной области
Цели. Оценка безопасности и иммуногенности 3 доз MTBVAC по сравнению с БЦЖ на новорожденных в TB-эндемичной области.
Способы. Восемнадцать ВИЧ-, QuantiFERON (QFT)-, ранее вакцинированных БЦЖ здоровых взрослых рандомизировали в соотношении 1:1 для введения MTBVAC (5×105 КОЕ) или БЦЖ SSI. Затем 36 ВИЧ-отрицательных, неподвергнутых введению БЦЖ здоровых новорожденных рандомизировали в соотношении 1:3 для введения БЦЖ SSI или MTBVAC в дозе 2,5×103, 2,5×104 или 2,5×105 КОЕ в пределах 96 ч. после рождения. QFT осуществляли в дни D180 и D360, и QFT+ младенцев (>0·35 МЕ/мл) направляли для профилактической терапии изониазидом.
Результаты. У всех взрослых наблюдали местные реакции в участке инъекции - отек у 18 индивидуумов (100%), покраснение у 16 индивидуумов (88,9%) и изъязвление у 10 индивидуумов (55,5%). Девять реакций регистрировали как умеренные, и один случай отека был тяжелым (35 мм). Ко дню D28 не регистрировали ни одного SAE.
Недоступность вакцины БЦЖ SSI приводила к немаскированному введению 6 младенцам MTBVAC в наиболее высокой дозе. Шестнадцать (44,4%) младенцев из всех 3 когорт имели местные реакции - 2 [16,6%], 3 [25%] и 11 [91,6%]), все из которых регистрировали как слабые, отек у 14 индивидуумов (38,9%), эритему у 5 индивидуумов (13,9%) и рубцевание у 9 индивидуумов (25,0%). Не наблюдали изъязвления. Системные AE являлись схожими среди когорт (n=32/42/40), при этом 9 регистрировали как умеренные (n=3/4/2) и 8 как тяжелые (n=4/2/2). У шести младенцев наблюдали 7 несвязанных с лекарственным средством SAE, включая несвязанную с лекарственным средством смерть по причине вирусной пневмонии, подтвержденной на аутопсии.
Дозозависимую конверсию QFT наблюдали в день D180 у реципиентов MTBVAC в когорте 1 (n=3, 37,5%), когорте 2 (n=6, 75%) и когорте 3 (n=7, 77,8%), но ни у одного из 7 реципиентов БЦЖ. Положительный QFT в день D360 наблюдали у 0 реципиентов MTBVAC в когорте 1 (0,0%), 2 в когорте 2 (25,0%) и 4 в когорте 3 (44,4%), как показано на фигуре 7.
Выводы. MTBVAC оказалась безопасной при 3 уровнях доз у новорожденных из Южной Африки и, по-видимому, приводила к транзиторной дозозависимой конверсии QFT, что может являться многообещающим показателем иммуногенности в TB-эндемичных областях. Кроме того, реактогенность вакцины MTBVAC была очевидно ниже реактогенности вакцины БЦЖ, где введение вакцины БЦЖ у 5 из 8 (62%) новорожденных приводило к рубцеванию, в то время как MTBVAC в своей наиболее высокой дозе приводила к рубцеванию только у 2 из 10 (20%) новорожденных.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Universidad de Zaragoza
BIOFABRI S.L.
<120> КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ПРОФИЛАКТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА
ДЛЯ ПАЦИЕНТОВ С РИСКОМ ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИИ ИЛИ В КАЧЕСТВЕ ВТОРИЧНЫХ
СРЕДСТВ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ПАЦИЕНТОВ С ТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ИНФЕКЦИЕЙ
<130> 903 926
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1752
<212> ДНК
<213> Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221> прочий_признак
<222> (1)..(1752)
<223> Ген fadD26 дикого типа в Mt103
<400> 1
atgccggtga ccgaccgttc agtgccctct ttgctgcaag agagggccga ccagcagcct 60
gacagcactg catatacgta catcgactac ggatccgacc ccaagggatt tgctgacagc 120
ttgacttggt cgcaggtcta cagtcgtgca tgcatcattg ctgaagaact caagttatgc 180
gggttacccg gagatcgagt ggcggtttta gcgccacaag gactggaata tgtccttgca 240
ttcctgggcg cacttcaggc tggatttatc gcggttccgc tgtcaactcc acagtatggc 300
attcacgatg accgcgtttc tgcggtgttg caggattcca agccggtagc cattctcacg 360
acttcgtccg tggtaggcga tgtaacgaaa tacgcagcca gccacgacgg gcagcctgcc 420
ccggtcgtag ttgaggttga tctgcttgat ttggactcgc cgcgacagat gccggctttc 480
tctcgtcagc acaccggggc ggcttatctc caatacacgt ccggatcgac gcgtacgccg 540
gccggagtca ttgtgtcgca cacgaatgtc attgccaatg tgacacaaag tatgtacggc 600
tatttcggcg atcccgcaaa gattccgacc gggactgtgg tgtcgtggct gcctttgtat 660
cacgatatgg gcctgattct cggaatttgc gcaccgctgg tggcccgacg ccgcgcgatg 720
ttgatgagcc caatgtcatt tttgcgccgt ccggcccgct ggatgcaact gcttgccacc 780
agcggccggt gcttttctgc ggcaccgaat ttcgccttcg agctggccgt gcgcagaaca 840
tctgaccagg acatggcggg gctcgacctg cgcgacgtgg tcggcatcgt cagtggcagt 900
gagcgaatcc atgtggcaac cgtgcggcgg ttcatcgagc ggttcgcgcc gtacaatctc 960
agccccaccg cgatacggcc gtcgtacggg ctcgcggaag cgaccttata tgtggcagct 1020
cccgaagccg gcgccgcgcc caagacggtc cgttttgact acgagcagct gaccgccggg 1080
caggctcggc cctgcggaac cgatgggtcg gtcggcaccg aactgatcag ctacggctcc 1140
cccgacccat cgtctgtgcg aatcgtcaac ccggagacca tggttgagaa tccgcctgga 1200
gtggtcggtg agatctgggt gcatggcgac cacgtgacta tggggtattg gcagaagccg 1260
aagcagaccg cgcaggtctt cgacgccaag ctggtcgatc ccgcgccggc agccccggag 1320
gggccgtggc tgcgcaccgg cgacctgggc gtcatttccg atggtgagct gttcatcatg 1380
ggccgcatca aagacctgct catcgtggac gggcgcaacc actaccccga cgacatcgag 1440
gcaacgatcc aggagatcac cggtggacgg gccgcggcga tcgcagtgcc cgacgacatc 1500
accgaacaac tggtggcgat catcgaattc aagcgacgcg gtagtaccgc cgaagaggtc 1560
atgctcaagc tccgctcggt gaagcgtgag gtcacctccg cgatatcgaa gtcacacagc 1620
ctgcgggtgg ccgatctcgt tctggtgtca cctggttcga ttcccatcac caccagcggc 1680
aagatccggc ggtcagcctg cgtcgaacgc tatcgcagcg acggcttcaa gcggctggac 1740
gtagccgtat ga 1752
<210> 2
<211> 410
<212> ДНК
<213> Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221> прочий_признак
<222> (1)..(410)
<223> fadD26 в MTBVAC
<400> 2
atgccggtga ccgaccgttc agtgccctct ttgctgcaag agagggccga ccagcagcct 60
gacagcactg catatacgta catcgactac ggatccacta gttctagagc aaccgtccga 120
aatattataa attatcgcac acataaaaac agtgctgtta atgtgtctat taaatcgatt 180
ttttgttata acagacactg cttgtccgat atttgattta ggatacattt ttatgagatc 240
ccccgggctg caggaattcg atatcgaagt cacacagcct gcgggtggcc gatctcgttc 300
tggtgtcacc tggttcgatt cccatcacca ccagcggcaa gatccggcgg tcagcctgcg 360
tcgaacgcta tcgcagcgac ggcttcaagc ggctggacgt agccgtatga 410
<210> 3
<211> 744
<212> ДНК
<213> Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221> прочий_признак
<222> (1)..(744)
<223> Ген phoP дикого типа в Mt103
<400> 3
atgcggaaag gggttgatct cgtgacggcg ggaaccccag gcgaaaacac cacaccggag 60
gctcgtgtcc tcgtggtcga tgatgaggcc aacatcgttg aactgctgtc ggtgagcctc 120
aagttccagg gctttgaagt ctacaccgcg accaacgggg cacaggcgct ggatcgggcc 180
cgggaaaccc ggccggacgc ggtgatcctc gatgtgatga tgcccgggat ggacggcttt 240
ggggtgctgc gccggctgcg cgccgacggc atcgatgccc cggcgttgtt cctgacggcc 300
cgtgactcgc tacaggacaa gatcgcgggt ctgaccctgg gtggtgacga ctatgtgaca 360
aagcccttca gtttggagga ggtcgtggcc aggctgcggg tcatcctgcg acgcgcgggc 420
aagggcaaca aggaaccacg taatgttcga ctgacgttcg ccgatatcga gctcgacgag 480
gagacccacg aagtgtggaa ggcgggccaa ccggtgtcgc tgtcgcccac cgaattcacc 540
ctgctgcgct atttcgtgat caacgcgggc accgtgctga gcaagcctaa gattctcgac 600
cacgtttggc gctacgactt cggtggtgat gtcaacgtcg tcgagtccta cgtgtcgtat 660
ctgcgccgca agatcgacac tggggagaag cggctgctgc acacgctgcg cggggtgggc 720
tacgtactgc gggagcctcg atga 744
<210> 4
<211> 819
<212> ДНК
<213> Mycobacterium tuberculosis
<220>
<221> прочий_признак
<222> (1)..(819)
<223> phoP в MTBVAC
<400> 4
atgcggaaag gggttgatct cgtgacggcg ggaaccccag gcgaaaacac cacaccggag 60
gctcgtgtcc tcgtggtcga tgatgaggcc aacatcgttg aactgctgtc ggtgagcctc 120
aagttccagg gctttgaagt ctacaccgcg accaacgggg cacaggcgct ggatcgggcc 180
cgggaaaccc ggccggacgc ggtgatcctc gatgtgatga tgcccgggat ggacggcttt 240
ggggtgctgc gccggctgcg cgccgacggc atcgatgccc cggcgttgtt cctgacggcc 300
cgtgactcgc tacaggacaa gatcgcgggt ctgaccctgg gtggtgacga ctatgtgaca 360
aagcccttca gtttggagga ggtcgtggcc aggctgcggg tcatcctgcg acgcgcgggc 420
aagggcaaca aggaaccacg taatgttcga ctgacgttcg ccgatatcga attcctgcag 480
cccgggggat ctcataaaaa tgtatcctaa atcaaatatc ggacaagcag tgtctgttat 540
aacaaaaaat cgatttaata gacacattaa cagcactgtt tttatgtgtg cgataattta 600
taatatttcg gacggttgct ctagaactag tggatcaacg cgggcaccgt gctgagcaag 660
cctaagattc tcgaccacgt ttggcgctac gacttcggtg gtgatgtcaa cgtcgtcgag 720
tcctacgtgt cgtatctgcg ccgcaagatc gacactgggg agaagcggct gctgcacacg 780
ctgcgcgggg tgggctacgt actgcgggag cctcgatga 819
<---
Claims (6)
1. Способ получения готовой лиофилизированной живой аттенуированной вакцинной композиции M. tuberculosis, содержащей выделенный микроорганизм, принадлежащий к штамму M. tuberculosis MTBVAC, имеющему i) фенотип PhoP− в результате инактивации посредством генетической делеции гена Rv0757, где последовательность открытой рамки считывания (ORF) PhoP состоит из SEQ ID NO: 4, и ii) делецию второго гена, Rv2930 (fadD26), предотвращающую продукцию PDIM (фенотип PDIM−), где последовательность открытой рамки считывания (ORF) fadD26 состоит из SEQ ID NO: 2; и где способ включает инициирование культивирования штамма MTBVAC в посевной среде, определенной в таблице ниже, и выращивание или амплификацию указанных бактерий с использованием среды SD, определенной в таблице ниже:
и где способ отличается тем, что для массового культивирования перед лиофилизацией используют среду SDG, содержащую представленную ниже количественную и качественную композицию:
где способ осуществляют в аэробных условиях.
2. Способ по п.1, где способ дополнительно включает стадию лиофилизации посредством добавления сахарозы и глутамата натрия в качестве стабилизаторов в среду SDG, используемую для массового культивирования перед стадией лиофилизации.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP18382097 | 2018-02-19 | ||
| EP18382097.6 | 2018-02-19 | ||
| PCT/EP2019/054106 WO2019158779A1 (en) | 2018-02-19 | 2019-02-19 | Compositions for use as a prophylactic agent to those at risk of infection of tuberculosis, or as secondary agents for treating infected tuberculosis patients |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2020130786A RU2020130786A (ru) | 2022-03-21 |
| RU2778094C2 true RU2778094C2 (ru) | 2022-08-15 |
Family
ID=
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8287886B2 (en) * | 2006-03-24 | 2012-10-16 | Universidad De Zaragoza | Tuberculosis vaccine |
| RU2520078C1 (ru) * | 2013-04-25 | 2014-06-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА Ag85A-DBD И ДЕКСТРАНА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pAg85A-DBD, ШТАММ Escherichia coli [pREP4, pAg85A-DBD], ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК Ag85A-DBD |
| RU2526910C2 (ru) * | 2006-10-30 | 2014-08-27 | Арчивель Фарма, Сл | Профилактическая вакцина от туберкулеза |
| CN104324365B (zh) * | 2014-10-24 | 2016-03-16 | 孙二琳 | 重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法 |
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8287886B2 (en) * | 2006-03-24 | 2012-10-16 | Universidad De Zaragoza | Tuberculosis vaccine |
| RU2526910C2 (ru) * | 2006-10-30 | 2014-08-27 | Арчивель Фарма, Сл | Профилактическая вакцина от туберкулеза |
| RU2520078C1 (ru) * | 2013-04-25 | 2014-06-20 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи" Минздрава России) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕННОЙ КОМПОЗИЦИИ НА ОСНОВЕ ГИБРИДНОГО БЕЛКА Ag85A-DBD И ДЕКСТРАНА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДА pAg85A-DBD, ШТАММ Escherichia coli [pREP4, pAg85A-DBD], ХИМЕРНЫЙ БЕЛОК Ag85A-DBD |
| CN104324365B (zh) * | 2014-10-24 | 2016-03-16 | 孙二琳 | 重组人干扰素-α-2b-BCG的干粉剂制备方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Dessislava Marinova, Jesus Gonzalo-Asensio, Nacho Aguilo & Carlos Martin (2017) MTBVAC from discovery to clinical trials in tuberculosis-endemic countries, Expert Review of Vaccines, 16:6, 565-576, DOI: 10.1080/14760584.2017.1324303. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4363782B2 (ja) | Ｖｉ抗原を構成的に発現するＳａｌｍｏｎｅｌｌａの弱毒化した変異株 | |
| KR101329323B1 (ko) | 엔도솜을 이탈하는 능력이 보강된 재조합 비씨지 균주 | |
| JP5461776B2 (ja) | マイコバクテリウムのエレクトロポレーションおよびマイコバクテリア中における抗原類の過剰発現 | |
| AU2017357813B2 (en) | Attenuating bacterial virulence by attenuating bacterial folate transport | |
| KR101734590B1 (ko) | 마이코플라스마 하이오뉴모니에의 온도 감수성 백신 균주 및 그의 용도 | |
| AU2024203034A1 (en) | Compositions for use as a prophylactic agent to those at risk of infection of tuberculosis, or as secondary agents for treating infected tuberculosis patients | |
| KR20100065243A (ko) | 마이코박테리움의 일렉트로포레이션 및 마이코박테리아에서의 항원의 과발현 | |
| JP2005538923A (ja) | ミコバクテリアワクチン | |
| Lopez et al. | Safety and immunogenicity of a live-attenuated auxotrophic candidate vaccine against the intracellular pathogen Rhodococcus equi | |
| US20240058433A1 (en) | Compositions and methods | |
| CN111867622A (zh) | 经修饰的用于治疗布鲁氏菌病的布鲁氏菌疫苗株 | |
| JP5324420B2 (ja) | 結核ワクチン | |
| RU2778094C2 (ru) | Композиции для применения в качестве профилактического средства для пациентов с риском туберкулезной инфекции или в качестве вторичных средств для лечения пациентов с туберкулезной инфекцией | |
| US10213503B2 (en) | Attenuated Burkholderia mallei strain which protects against pathogenic Burkholderia infections, vaccine containing and use thereof | |
| FR2676068A1 (fr) | Souches recombinantes immunogenes de b. anthracis - compositions immunogenes les contenant. | |
| JP2022550722A (ja) | 弱毒生マイコバクテリアの肺送達による治療有効性 | |
| Khakhum | Nittaya Khakhum, Daniel Tapia, and Alfredo G. Torres | |
| Troy | TLR9 agonist produces effective mucosal immunity as a vaccine against mycobacterium tuberculosis | |
| Muñoz-Elías et al. | 13. Immunological Aspects of Chest Diseases: The Case of Tuberculosis |