ES2967066T3 - Composiciones para su uso como agente profiláctico para aquellos en riesgo de infección de tuberculosis, o como agentes secundarios para tratar pacientes infectados con tuberculosis - Google Patents
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Abstract
La presente invención se refiere a una composición liofilizada compuesta por un microorganismo aislado perteneciente al complejo Mycobacterium tuberculosis, preferentemente un aislado clínico de M. tuberculosis, más preferentemente un aislado clínico de M. tuberculosis, caracterizada porque comprende un fenotipo PhoP-por la inactivación por una deleción genética del gen Rv0757 y la deleción de un segundo gen, Rv2930 (fadD26), que previene la producción de PDIM (fenotipo PDIM) (la cepa MTBVAC), y sacarosa y glutamato sódico como estabilizadores o excipientes. La presente invención se refiere además a la composición reconstituida obtenida añadiendo agua, preferiblemente agua esterilizada para inyección, a la composición liofilizada, así como a sus usos, en particular para su uso como agente profiláctico para aquellos con riesgo de infección por M. tuberculosis. o aquellos en riesgo de desarrollar enfermedad tuberculosa, o como agentes secundarios para el tratamiento de pacientes tuberculosos infectados. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)
Description
DESCRIPCIÓN
Composiciones para su uso como agente profiláctico para aquellos en riesgo de infección de tuberculosis, o como agentes secundarios para tratar pacientes infectados con tuberculosis
Campo de la invención
Esta invención se refiere a métodos de preparación de composiciones farmacéuticas, tales como vacunas.
Antecedentes de la invención
La vacuna del bacilo de Calmette-Guérin (BCG ) es una cepa atenuada deMycobacterium bovis,el agente causal de la tuberculosis (TB) en el ganado bovino. La BCG se introdujo por primera vez para su uso clínico hace casi cien años, cuando en 1921 se administró por vía oral a un lactante cuya madre había fallecido de TB un día después del parto. La lactante no mostró acontecimientos adversos con respecto a la vacunación con BCG y, lo que es más importante, no desarrolló TB. En ese momento, la vía oral de administración de BCG se consideró la vía natural (tracto gastrointestinal) para adquirir TB en lactantes y niños alimentados con leche no pasteurizada. La TB está relacionada con la pobreza, con una carga considerable en las zonas pobres y en desarrollo del mundo. La incidencia de TB está aumentando en todo el mundo debido a la pobreza y a la inequidad, y se agrava con la pandemia de VIH/SIDA, que aumenta en gran medida el riesgo de infección que avanza a una enfermedad activa. La diabetes, el síndrome metabólico, el tabaquismo y más recientemente las deficiencias de vitaminas debidas a la desnutrición y a las deficientes condiciones socioeconómicas están surgiendo como factores de riesgo importantes para la TB. De manera importante, cómo pueden influir estos factores en la evaluación de la eficacia de nuevas vacunas contra la TB requiere una atención específica cuando se definen los diseños de ensayos clínicos que implican poblaciones de estudio o de pacientes con una variedad de tales factores de riesgo. Debido a la creciente globalización y emergencia de cepas de TB multirresistentes (MDR) y ultrarresistentes (XDR), la TB está convirtiéndose en una amenaza cada vez más seria para todo el mundo.
En la actualidad, la TB ha alcanzado proporciones alarmantes de 10,0 millones de casos de incidencia y 1,6 millones de muertes atribuidas a la enfermedad, tal como notifica el último informe de TB global de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de 2018. A nivel mundial, unos 50 millones de individuos ya están infectados de manera latente con cepas deM. tuberculosisMDR, creando un destacable recurso para futuros casos de TB activa con opciones de tratamiento insuficientes. No obstante, la estrategia de fin de la TB de la OMS se ha comprometido a reducir la morbilidad por TB en un 90 % y la mortalidad por TB en un 95 % para el 2035 y reconoce la urgente necesidad de herramientas de diagnóstico más accesibles que sean rápidas y fiables, nuevos antibióticos menos tóxicos y más eficaces para reducir el tiempo de la terapia y, en última instancia, nuevas vacunas para prevenir la TB pulmonar, con el fin de lograr este ambicioso objetivo.
La presente invención contribuye al objetivo de proporcionar nuevas vacunas para prevenir la TB.
Breve descripción de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de una composición de vacuna deM. tuberculosisviva atenuada lista para secar por congelación que comprende un microorganismo aislado perteneciente a una cepa deM. tuberculosisMTBVAC que tiene i) un fenotipo PhoP- mediante la inactivación por una deleción genética del gen Rv0757, en el que la secuencia de marco de lectura abierto (O RF) de PhoP consiste en SEQ ID NO 4, y ii) la deleción de un segundo gen, Rv2930(fadD26),que impide la producción de PDIM (fenotipo PDIM-), en el que la secuencia de marco de lectura abierto (ORF) defadD26consiste en SEQ ID NO 2; y en el que el procedimiento comprende iniciar el cultivo de la cepa MTBVAC en el medio de siembra tal como se define en la tabla a continuación y expandir o amplificar dichas bacterias usando el medio SD tal como se define en la tabla a continuación:
y en el que el procedimiento está caracterizado porque, para el cultivo en masa antes de la liofilización, se usa un medio SDG que comprende la composición cuantitativa y cualitativa mostrada a continuación:
en el que el procedimiento se lleva a cabo en condiciones aerobias.
Preferiblemente, el procedimiento comprende además una etapa de secado por congelación mediante la adición de sacarosa y glutamato de sodio como estabilizadores al medio SDG usado para el cultivo en masa antes de la etapa de liofilización.
Breve descripción de las figuras
Otros objetos, ventajas y nuevas características de la presente invención resultarán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada de la invención cuando se considera junto con los dibujos adjuntos.
Figura 1. Crecimiento de la cepa SO2 en medio Middlebrook 7H9 y medio Sauton sintético. Resultados de DO y ufc/ml de los pases de cultivo 1 y 2.
La figura 2 muestra los resultados de DO de los cultivos de MTBVAC en los medios Sauton, SD y SDG.
La figura 3 muestra los resultados de estabilidad entre 2-8 °C y -30 °C de los lotes identificados en la tabla 15.
Figura 4. Protección en ratones. Los datos en la figura representan un grupo de dos experimentos independientes (n=12 ratones/grupo). Todos los datos son la media ±<e>E<m>. El índice de protección se define como la diferencia entre la carga bacteriana en grupos no vacunados y vacunados (representado en logaritmo decimal).
Figura 5. Inmunogenicidad en ratones. Los datos en la figura proceden de un experimento (n=5 ratones/grupo). Todos los datos son la media ± EEM. SFC : colonia formadora de manchas.
Figura 6. La vacunación de neonatos a partir de un entorno endémico de TB con dosis crecientes de MTBVAC dio como resultado predominantemente respuestas de células T CD4 específicas de antígeno Th1 (IFN-y, IL-2 o TNF-a). La dosis de MTBVAC más alta de 2,5 x 105 UFC indujo la mayor magnitud de respuesta de citocinas de células T CD4 específicas de antígeno el día 70. La dosis de MTBVAC más baja de 2,5 x 103 UFC fue la menos inmunogénica.
Figura 7. La vacunación de neonatos a partir de un entorno endémico de TB con dosis crecientes de MTBVAC dio como resultado un perfil dosis-respuesta del valor cuantitativo del ensayo Q FT el día 180 y 360 tras la vacunación. Los valores de QFT se estratifican en tres regiones diferentes según el riesgo de desarrollar TB activa según Andrews JR , Nemes E, Tameris Met al.Serial QuantiFERON testing and tuberculosis disease risk among young children: an observational cohort study. Lancet Respir Med, (2017).
Figura 8. Ausencia de micobacterias virulentas en el lote de siembra de trabajo en cobayas.
Figura 9. Estudios de estabilidad en los lotes de siembra maestro y de trabajo.
Figura 10. Estudio de estabilidad a largo plazo de la dosis de 3-17 x 103 ufc/0,1 ml, la dosis de 3-17 x 104 ufc/0,1 ml y la dosis de 3-17 x 106 ufc/0,1 ml de la vacuna MTBVAC almacenadas a -15 °C - -30 °C (A) y almacenadas a 2 °C - 8 °C (B).
Figura 11. Construcción por etapas desde SO2 hasta MTBVAC. La cepa con doble deleción final es fenotípicamente idéntica al prototipo SO2 (deficiente en PDIM basado enphoP),pero proporciona una mayor garantía de estabilidad genética. El color azul claro representa el genphoP,el genfadD26se muestra en color naranja claro, los casetes de resistencia a antibióticoskmryhygrson de color magenta, los triángulos de color amarillo representan los sitios res que flanqueanÍJhygro el sitio res residual en las regiones delecionadas; los sitios res no contienen ninguna secuencia codificante exógena.
Descripción detallada de la invención
Definiciones y descripción detallada de la cepa MTBVAC
La “cepa MTBVAC” se usará para referirse al microorganismo aislado de la cepa deM. tuberculosisque tiene delecionado el gen Rv0757 en la cepa clínica deM. tuberculosisMT103 y que comprende adicionalmente la deleción del gen Rv2930(fadD26).Por tanto, dicha cepa presenta dos mutaciones independientes derivadas deM. tuberculosis,sin afectar la deleción dephoPindependiente a las propiedades de la vacuna derivadas de la inactivación de dicho gen. Por tanto, la “cepa MTBVAC” está caracterizada porque se inactiva la producción de PDIM a través de la deleción del gen Rv2930(fadD26)y, por tanto, esta cepa está caracterizada porque comprende la deleción de los genes Rv2930 y Rv0757.
Por tanto, cabe destacar que la cepa MTBVAC se construyó para que contuviera dos mutaciones de deleción irreversibles independientes, sin marcadores de antibióticos, cumpliendo con los primeros requisitos de seguridad del Consenso de Ginebra para avanzar con las vacunas micobacterianas vivas a la evaluación clínica de fase I. La cepa MTBVAC se diseñó por ingeniería genética para asemejarse fenotípica y funcionalmente a su prototipo SO2. SO2 es un mutante Mt103phoPmarcado por la inserción de un casete de resistencia a kanamicina (kmr) (Mt103phoP::kmr) (véase la figura 11) que, además del fenotipo deficiente en PhoP diseñado por ingeniería, SO2 tiene una pérdida espontánea adquirida en la biosíntesis de PDIM (véase la figura 2 de Dessislava Marinova, Jesus Gonzalo-Asensio, Nacho Aguilo y Carlos Martin (2017) MTBVAC from discovery to clinical trials in tuberculosisendemic countries, Expert Review of Vaccines, 16:6, 565-576, DOI: 10.1080/14760584.2017.1324303), un procedimiento que se describe como habitual enM. tuberculosiscomo resultado de prácticas repetidas de manipulación y subcultivo en laboratorio.
Tal como refleja la figura 11, la cepa MTBVAC se construyó siguiendo un enfoque por etapas. En primer lugar, la deleción no marcada enfadD26se introdujo en SO2, dando lugar a SO2AfadD26. En consecuencia, la deleción no marcada enphoPenSO2AfadD26generó la cepa MTBVAC. Para la construcción de MTBVAC, se usaron plásmidos suicidas que portaban los genesfadD26yphoPdelecionados, cuyas regiones delecionadas se interrumpieron con un marcador de resistencia a higromicina(hygr)flanqueado por sitios res en cada lado(res::hygr::res).yS-resolvasa deE. colicatalizó la escisión del casete de resistencia a antibióticos tras el reconocimiento de los sitios res, dejando después de eso una copia de una “cicatriz” de res residual en lugar de la deleción (Malaga,et al.2003); los sitios res no contienen ninguna secuencia codificante exógena. El constructo finalSO2AfadD26:: AphoPse denominó cepa MTBVAC. En la cepa MTBVAC, la introducción de una deleción no marcada enfadD26garantiza una supresión genéticamente estable de la biosíntesis de PDIM. El tamaño de la deleción generada en el genfadD26comprende 1.511 pb y da como resultado la completa inactivación de este gen esencial en la biosíntesis de PDIM. El gen de tipo natural tiene 1.752 pb (583 aminoácidos). Se dejó una cicatriz de res residual en el procedimiento de la escisión dehygrpor la yS-resolvasa. Como resultado de esta deleción, disminuyen los niveles de transcripción de los cinco genes siguientes en el locus de PDIM(fadD26-ppsE)y se suprime completamente la biosíntesis de PDIM en MTBVAC (tesis doctoral de Ainhoa Arbués). El locus de PDIM enM. tuberculosiscomprende 13 genes agrupados en un fragmento de 50 kb del cromosoma. La región es el operón más grande en el genoma deM. tuberculosis(Camacho,et al.2001; Camacho,et al.1999; Cox,et al.1999; Trivedi,et al.2005).
EnM. tuberculosis, phoP(744 pb) mapea en el sentido de 5' dephoR(1458 pb) y ambos genes se transcriben en el mismo sentido. El reemplazo de la deleción de 94 pb generada dentro del genphoPpor el sitio de res residual implica la presencia de múltiples codones de terminación, lo que, por otro lado, da como resultado una falta de traducción del dominio de unión a ADN (equivalente a 92 aminoácidos) de PhoP en MTBVAC.
Las deleciones en los genesphoPyfadD26en MTBVAC pueden detectarse/localizarse usando un enfoque de presencia/ausencia por RT-PCR. El método usa reactivos de PCR fluorescentes (cebadores y sondas) para indicar la presencia de los sitios res en los genesAphoPyAfadD26y la ausencia de los genesphoPyfadD26de tipo natural.
A continuación en el presente documento, se proporciona la secuencia de marco de lectura abierto (ORF) del genfadD26en Mt103 a) y en MTBVAC(AfadD26)b); y la secuencia de ORF del genphoPen Mt103 c) y en MTBVAC(AphoP)d). La secuencia de nucleótidos correspondiente a las regiones génicas delecionadas enfadD26(a) yphoP(c) se representan en letras minúsculas; el sitio res residual se destaca en gris. Para el método de detección por PCR basado en fluorescencia, los cebadores para cada diana están subrayados y la sonda Taqman se muestra en negrita.
a) genfadD26de tipo natural en Mt103
SEQ ID NO 1.
ATGCCGGTGACCGACCGTTCAGTGCCCTCTTTGCTGCAAGAGAGGGCCGACCAGCAGCCTGACAGCACTGCATAT ACGTACATCGACTACGGATCCgaccccaagggatttgctgacagcttgacttggtcgcaggtctacagtcgtgcatgcatcattgctgaagaa ctcaagttatgcgggttacccggagatcgagtggcggttttagcgccacaaggactggaatatgtccttgcattcctgggcgcacttcaggctggattt atcgcggttccgctgtcaactccacagtatggcattcacgatgaccgcgtttctgcggtgttgcaggattccaagccggtagccattctcacgacttcgt ccgtggtaggcgatgtaacgaaatacgcagccagccacgacgggcagcctgccccggtcgtagttgaggttgatctgcttgatttggactcgccgcga cagatgccggctttctctcgtcagcacaccggggcggcttatctccaatacacgtccggatcgacgcgtacgccggccggagtcattgtgtcgcacacg aatgtcattgccaatgtgacacaaagtatgtacggctatttcggcgatcccgcaaagattccgaccgggactgtggtgtcgtggctgcctttgtatcacg atatgggcctgattctcggaatttgcgcaccgctggtggcccgacgccgcgcgatgttgatgagcccaatgtcatttttgcgccgtccggcccgctggat gcaactgcttgccaccagcggccggtgcttttctgcggcaccgaatttcgccttcgagctggccgtgcgcagaacatctgaccaggacatggcggggct cgacctgcgcgacgtggtcggcatcgtcagtggcagtgagcgaatccatgtggcaaccgtgcggcggttcatcgagcggttcgcgccgtacaatctca gccccaccgcgatacggccgtcgtacgggctcgcggaagcgaccttatatgtggcagctcccgaagccggcgccgcgcccaagacggtccgttttgac tacgagcagctgaccgccgggcaggctcggccctgcggaaccgatgggtcggtcggcaccgaactgatcagctacggctcccccgacccatcgtctgt gcgaatcgtcaacccggagaccatggttgagaatccgcctggagtggtcggtgagatctgggtgcatggcgaccacgtgactatggggtattggcag aagccgaagcagaccgcgcaggtcttcgacgccaagctggtcgatcccgcgccggcagccccggaggggccgtggctgcgcaccggcgacctgggc gtcatttccgatggtgagctgttcatcatgggccgcatcaaagacctgctcatcgtggacgggcgcaaccactaccccgacgacatcgaggcaacgat ccaggagatcaccggtggacgggccgcggcgatcgcagtgcccgacgacatcaccgaacaactggtggcgatcatcgaattcaagcgacgcggtag taccgccgaagaggtcatgctcaagctccgctcggtgaagcgtgaggtcacctccgcGATATCGAAGTCACACAGCCTGCGGGTGGCC GATCTCGTTCTGGTGTCACCTGGTTCGATTCCCATCACCACCAGCGGCAAGATCCGGCGGTCAGCCTGCGTCGAAC GCTATCGCAGCGACGGCTTCAAGCGGCTGGACGTAGCCGTATGA
b)AfadD26en MTBVAC
SEQ ID NO 2.
ATGCCGGTGACCGACCGTTCAGTGCCCTCTTTGCTGCAAGAGAGGGCCGACCAGCAGCCTGACAGCACTGCATAT ACGTACATCGACTACGGATCCACTAGTTCTAGAGCAACCGTCCGAAATATTATAAATTATCGCACACATAAAAACA GTGCTGTTAATGTGTCTATTAAATCGATTTTTTGTTATAACAGACACTGCTTGTCCGATATTTGATTTAGGATACATT TTTATGAGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCGAAGTCACACAGCCTGCGGGTGGCCGATCTCGTTCTGGT GTCACCTGGTTCGATTCCCATCACCACCAGCGGCAAGATCCGGCGGTCAGCCTGCGTCGAACGCTATCGCAGCGA CGGCTTCAAGCGGCTGGACGTAGCCGTATGA
c) genphoPde tipo natural en Mt103
SEQ ID NO 3.
ATGCGGAAAGGGGTTGATCTCGTGACGGCGGGAACCCCAGGCGAAAACACCACACCGGAGGCTCGTGTCCTCGT GGTCGATGATGAGGCCAACATCGTTGAACTGCTGTCGGTGAGCCTCAAGTTCCAGGGCTTTGAAGTCTACACCGC GACCAACGGGGCACAGGCGCTGGATCGGGCCCGGGAAACCCGGCCGGACGCGGTGATCCTCGATGTGATGATGC CCGGGATGGACGGCTTTGGGGTGCTGCGCCGGCTGCGCGCCGACGGCATCGATGCCCCGGCGTTGTTCCTGACG GCCCGTGACTCGCTACAGGACAAGATCGCGGGTCTGACCCTGGGTGGTGACGACTATGTGACAAAGCCCTTCAGT TTGGAGGAGGTCGTGGCCAGGCTGCGGGTCATCCTGCGACGCGCGGGCAAGGGCAACAAGGAACCACGTAATGT TCGACTGACGTTCGCCGATatcgagctcgacgaggagacccacgaagtgtggaaggcgggccaaccggtgtcgctgtcgcccaccgaattc accctgctgcgctatttcgtGATCAACGCGGGCACCGTGCTGAGCAAGCCTAAGATTCTCGACCACGTTTGGCGCTACGAC TTCGGTGGTGATGTCAACGTCGTCGAGTCCTACGTGTCGTATCTGCGCCGCAAGATCGACACTGGGGAGAAGCGG CTGCTGCACACGCTGCGCGGGGTGGGCTACGTACTGCGGGAGCCTCGATGA
d) AphoPen MTBVAC
SEQ ID NO 4.
ATGCGGAAAGGGGTTGATCTCGTGACGGCGGGAACCCCAGGCGAAAACACCACACCGGAGGCTCGTGTCCTCGT GGTCGATGATGAGGCCAACATCGTTGAACTGCTGTCGGTGAGCCTCAAGTTCCAGGGCTTTGAAGTCTACACCGC GACCAACGGGGCACAGGCGCTGGATCGGGCCCGGGAAACCCGGCCGGACGCGGTGATCCTCGATGTGATGATGC CCGGGATGGACGGCTTTGGGGTGCTGCGCCGGCTGCGCGCCGACGGCATCGATGCCCCGGCGTTGTTCCTGACG GCCCGTGACTCGCTACAGGACAAGATCGCGGGTCTGACCCTGGGTGGTGACGACTATGTGACAAAGCCCTTCAGT TTGGAGGAGGTCGTGGCCAGGCTGCGGGTCATCCTGCGACGCGCGGGCAAGGGCAACAAGGAACCACGTAATGT TCGACTGACGTTCGCCGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGGGGATCTCATAAAAATGTATCCTAAATCAAATATCGG ACAAGCAGTGTCTGTTATAACAAAAAATCGATTTAATAGACACATTAACAGCACTGTTTTTATGTGTGCGATAATTT ATAATATTTCGGACGGTTGCTCTAGAACTAGTGGATCAACGCGGGCACCGTGCTGAGCAAGCCTAAGATTCTCGA CCACGTTTGGCGCTACGACTTCGGTGGTGATGTCAACGTCGTCGAGTCCTACGTGTCGTATCTGCGCCGCAAGATC GACACTGGGGAGAAGCGGCTGCTGCACACGCTGCGCGGGGTGGGCTACGTACTGCGGGAGCCTCGATGA
SO2 tiene un historial preclínico minucioso y completo que demuestra un perfil de seguridad y de atenuación robusto y una eficacia prometedora en comparación con BCG en modelos animales relevantes. Afortunadamente, la mayoría de estos estudios preclínicos se han reproducido con MTBVAC para confirmar el perfil funcional y la actividad biológica del fenotipo doblemente atenuante PhoP- PDIM-. Los análisis del perfil lipídico han demostrado que MTBVAC y su prototipo SO2 son fenotípicamente comparables, careciendo de d At , Pa T y PDIM.
Por otro lado, de ahora en adelante en el presente documento en el contexto de la presente invención, BCG se usará para referirse a la actual vacuna que ha estado en uso contra tuberculosis desde 1921. Es una vacuna viva atenuada derivada de una cepa deM. bovisque perdió su virulencia después de subcultivarse en el laboratorio y que ahora se sabe que tiene más de cien genes delecionados. Behr, M. A. BCG-different strains, different vaccines Lancet Infect Dis 2002, 2(2), 86-92.
De ahora en adelante en el presente documento en el contexto de la presente invención, H37Rv se usará para referirse a una cepa patógena deM. tuberculosisque se ha secuenciado, haciendo referencia Coleet al.a estos genes como RV (véase Coleet al1998 Deciphering the biology ofM. tuberculosisfrom the complete genome sequence. Nature 393: 537-544).
De ahora en adelante en el presente documento en el contexto de la presente invención, Mt103 se usará para referirse a un aislado clínico deM. tuberculosis.Camachoet al.1999 Identification of a virulence gene cluster ofM. tuberculosisby signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol 34: 257-267.
De ahora en adelante en el presente documento en el contexto de la presente invención, cepa PDIM- se usará para referirse a la cepa del complejoM. tuberculosisque no es capaz de sintetizar dimicocerosatos de ftiocerol, que son lípidos importantes relacionados con la patogenia deM. tuberculosis.
De ahora en adelante en el presente documento en el contexto de la presente invención, SO2+pSO5 se usará para referirse a la cepa deM. tuberculosisSO2 en la que la mutación en Rv0757 se complementa mediante el gen Rv0757 por la transformación de un plásmido replicativo con el genphoPmicobacteriano, pero que no es capaz de complementar la síntesis de PDIM, siendo su fenotipo PhoP+ PDIM-.
De ahora en adelante en el presente documento en el contexto de la presente invención,M. tuberculosis phoPse usará para referirse a la cepa deM. tuberculosisque se ha inactivado mediante la deleción del gen Rv0757 entre los sitiosEcoRV-BspEI,siendo su fenotipophoP-PDIM+.
De ahora en adelante en el presente documento en el contexto de la presente invención, Rv2930(fadD26)se usará para referirse al gen que se encuentra al principio del operón que es responsable de la síntesis de dimicocerosatos de ftiocerol (PDIM) (Camachoet al.),y la eliminación de este gen enM. tuberculosisconfiere un fenotipo PDIM-estable.
Descripción
Se ha demostrado que el uso de vacunas para prevenir la TB en humanos es un tremendo desafío desde hace casi un siglo. BCG, derivada deM. bovis,es actualmente la única vacuna contra TB autorizada en uso y es la vacuna más ampliamente usada en el mundo. El desarrollo y la administración generalizada de la vacuna BCG desde principios de la década de 1920 representaron un gran avance, con la esperanza de poder erradicar la TB del mundo. Sin embargo, no se lograron estas promesas iniciales y, a partir de los resultados de un gran número de ensayos de eficacia, resulta claro que la vacuna BCG en su forma actual tiene un uso limitado en el control de la enfermedad, particularmente en formas respiratorias en adultos en áreas tercermundistas en las que la enfermedad es endémica. Fine, P .E . Variation in protection by BCG: implications of and for heterologous immunity. Lancet 1995, 346(8986), 1339-1345. Con más conocimiento de la virulencia deM. tuberculosisy modelos de respuesta inmunitaria que conducen a la generación de inmunidad protectora, es posible desarrollar vacunas mejores que BCG. La observación de que se logran mayores niveles de protección cuando el huésped está vacunado con b C g sugiere que la viabilidad y la persistencia son propiedades fundamentales requeridas para el éxito de una vacuna contra la tuberculosis. En este sentido, en el documento US8287886 B2 se enseñó que el uso de una cepa deM. tuberculosiscon el gen Rv0757(phoP)inactivado y una segunda mutación independiente dephoP,que impide la síntesis de PDIM, proporcionó un prototipo de vacuna viva monodosis que estaba más atenuada que BCG en ratones SCID inmunocomprometidos, y proporcionó niveles de protección comparables a los conferidos por BCG en ratones y una mayor protección que b Cg en cobayas.
El genphoP,junto conphoR,forma parte de un sistema bicomponente que muestra un alto grado de similitud con otros sistemas bicomponente que controlan la transcripción de genes de virulencia clave en patógenos intracelulares. También controla la expresión de otros muchos genes que no están directamente implicados en la virulencia. Groisman, E. A. The pleiotropic two-component regulatory system PhoP-PhoQ. J Bacteriol 2001, 183(6), 1835-1842. La eliminación de genes de virulencia no parece ser, por sí misma, el único método para la atenuación deM. tuberculosis.Se demostró que un mutante auxótrofo de pantotenato deM. tuberculosis,que es incapaz de realizar la síntesisde novode ácido pantoténico, persistió en ratones SCID, sin conseguir provocar la enfermedad. Sambandamurthy, V. K., Wang, X., Chen, B.et al.A pantothenate auxotroph ofM. tuberculosisis highly attenuated and protects mice against tuberculosis. Nat Med 2002, 8(10), 1171-1174. Los auxótrofos de leucina individuales también están fuertemente atenuados y son incapaces de realizar la replicaciónin vivoen ratones SCID. Hondalus, M. K., Bardarov, S ., Russell, R., Chan, J ., Jacobs, W. R., Jr. y Bloom, B. R. Attenuation of and protection induced by a leucine auxotroph ofM. tuberculosis.Infect Immun 2000, 68(5), 2888-2898. Por tanto, ahora está generalmente aceptado el principio de que las cepas de vacuna basadas enM. tuberculosispueden atenuarse con éxito al tiempo que conservan los genes que se suprimen en BCG deM. bovis.
Antes del documento US8287886 B2, la investigación de vacunas más eficaces que BCG se basaba en la noción de que la pérdida de virulencia con BCG era en sí misma un factor que contribuía a su falta de eficacia protectora completa. Behr, M. A., Wilson, M. A., Gill, W. P.et al.Comparative genomics of BCG vaccines by whole-genome DNA microarray. Science 1999, 284(5419), 1520-1523. Por tanto, se razonó que nuevos mutantes atenuados deM. tuberculosis, con menos virulencia, podrían ser más eficaces como vacunas. A este respecto, y aunque se ha indicado que la infección natural conM. tuberculosisy la vacunación con BCG no difieren en cuanto a su capacidad para proporcionar inmunidad protectora contra la tuberculosis, Sampson, S. L., Dascher, C. C., Sambandamurthy, V. K.et al.Protection elicited by a double leucine and pantothenate auxotroph ofM. tuberculosisin guinea pigs. Infect Immun 2004, 72(5), 3031-3037, los individuos infectados conM. tuberculosiscon tuberculosis latente tienen un 79 % menos de riesgo de tuberculosis progresiva después de la reinfección en comparación con individuos no infectados (Andrews 2012. CID 54:784-790). Además, y teniendo en cuenta el hecho de que la mayoría de estos individuos podrían haberse vacunado con BCG, esto es indicativo de que, en la práctica, puede haber una diferencia en la inmunidad protectora proporcionada por BCG y porM. tuberculosis.Esto planteó cuestiones sobre si era posible o no mejorar BCG mediante una atenuación racional deM. tuberculosis.Dentro de este contexto, se consideraron de particular relevancia la observación de que la cepa mutante deM. tuberculosisdescrita en el documento US8287886 B2 con la combinación de 2 mutaciones independientes, en la síntesis de la proteína PhoP y en la síntesis de PDIM, está más atenuada que BCG en el modelo de ratón SCID, incluso cuando se aplica a una dosis 10 veces mayor que la de BCG, y el mayor grado de protección que BCG en el modelo de cobaya.
La cepa mutante deM. tuberculosisdescrita en el documento US8287886 B2 estaba caracterizada porque era un microorganismo aislado perteneciente al géneroMycobacterium,que comprende la inactivación del gen Rv0757(phoP)y la inactivación de un segundo gen que impedía la producción de PDIM (dimicocerosatos de ftiocerol). En particular, tal cepa mutante deM. tuberculosisdescrita en el documento US8287886 B2 (la cepa SO2) estaba caracterizada porque comprendía la inactivación del gen Rv0757(phoP)y una segunda mutación independiente dephoPque impedía la producción de PDIM.
Cabe destacar que, tal como se describe en el documento US8287886 B2, la cepa SO2 no se consideró tóxica en seis cobayas que fueron inoculadas con 50 veces la dosis de vacuna en esta especie. Además, se estudió su curva de peso y tasa de supervivencia. La tasa de supervivencia fue del 100 % después de los 6 meses de duración del experimento. La figura 12 del documento US8287886 B2 muestra el aumento de peso observado en todos los animales durante los 6 meses, que muestra la ausencia de toxicidad de la cepa SO2 (Y=peso en gramos y X=tiempo en semanas de infección). Además, también se estudió en el documento US8287886 B2 la tasa de supervivencia de cobayas vacunadas después de la infección conM. tuberculosis(figura 13). El estudio de protección en cobayas realizó un seguimiento de la tasa de supervivencia de las cobayas después de 300 días. La curva de tasa de supervivencia se midió para cobayas no vacunadas (solución salina) y vacunadas con la vacuna BCG actual, con una cepa deM. tuberculosis phoP-o con la cepa SO2 (mutantephoP-y PDIM-). Después de la vacunación por vía subcutánea, los animales se infectaron con una cepa virulenta deM. tuberculosis(H37Rv) a una dosis alta para estudiar la tasa de supervivencia. Después de 60 días, las 6 cobayas que no se habían vacunado (solución salina) había muerto, mientras que los grupos vacunados con la cepa SO2,phoP-y BCG habían sobrevivido. Después de 300 días de infección, 3 cobayas vacunadas con BCG yphoP-habían muerto, en comparación únicamente con uno de los grupos vacunados con la cepa SO2, lo que indica que la protección del mutantephoPes similar a la de la vacuna BCG actual, mientras que la vacunación con la cepa SO2, el doble mutantephoP~y PDIM-, proporcionó mejor protección en el modelo de cobaya. Además, la figura 14 del documento US8287886 B2 muestra la supervivencia después de 400 días del seguimiento de las cobayas en la figura 13. Las 6 cobayas no vacunadas habían muerto después de 60 días. Después de 400 días de infección, 3 cobayas del grupo vacunado con la cepa SO2 (figura 14a)sobrevivieron, mientras que tan sólo 1 cobaya vacunada con BCG (figura 14ay figura 14b)yphoP(figura 14 b) había sobrevivido, lo que indica nuevamente que la protección del mutantephoPes similar a la de BCG, mientras que la vacunación con la cepa SO2, el doble mutantephoPy PDIM-, proporciona mejor protección después de los 400 días del experimento.
En conclusión, los resultados descritos en el documento US8287886 B2 muestran que la cepa SO2, y por tanto un microorganismo perteneciente al géneroMycobacterium(particularmente del complejoM. tuberculosis)con fenotipo PhoP- PDIM-, es una vacuna más eficaz que BCG según varios criterios. Está más atenuada que BCG en ratones SCID, proporciona a los ratones una inmunidad protectora que es al menos tan buena como BCG y genera respuestas inmunitarias celulares más fuertes. Además, en experimentos de protección realizados en cobayas contra la infección con altas dosis de H37Rv, la cepa con fenotipo PDIM- PhoP- da como resultado una tasa de supervivencia del 100 % de las cobayas en circunstancias en las que BCG sólo logró una tasa de supervivencia del 33 %. Esta protección está vinculada con una reducción en la gravedad de la enfermedad y la carga bacteriana.
A la luz de estos resultados, los autores de la presente invención procedieron a desarrollar una vacuna deM. tuberculosisviva atenuada que comprende la cepa MTBVAC presentada como gránulo liofilizado en viales de vidrio de color ámbar de 3 ml. Tal como ya se indicó, la cepa MTBVAC se construyó para que contuviera dos mutaciones de deleción irreversibles independientes, sin marcadores de antibióticos, cumpliendo con los primeros requisitos de seguridad del Consenso de Ginebra. En este sentido, la cepa MTBVAC se diseñó por ingeniería genética para asemejarse fenotípica y funcionalmente a su prototipo SO2. En la cepa MTBVAC, la introducción de una deleción no marcada enfadD26garantiza una supresión genéticamente estable de la biosíntesis de PDIM. Cabe destacar que SO2 tiene un historial preclínico minucioso y completo que demuestra un perfil de seguridad y de atenuación robusto y una eficacia prometedora en comparación con BCG en modelos animales relevantes. Tal como ya se indicó, la mayoría de estos estudios preclínicos se han reproducido con MTBVAC para confirmar el perfil funcional y la actividad biológica del fenotipo doblemente atenuante deficiente en PhoP/PDIM.
Basándose en lo anterior, los autores de la presente invención prepararon una vacuna que comprende la cepa MTBVAC. Una dosis de 0,05 ml de dicha vacuna debía administrarse por vía intradérmica a recién nacidos de manera similar a BCG. Por tanto, un primer objetivo de los autores de la presente invención fue obtener una vacuna, preferiblemente liofilizada, útil en neonatos para el tratamiento o la prevención de TB en esta población de grupo de edad específica. Teniendo esto en mente, realizaron, en neonatos, los experimentos descritos en los ejemplos 2 y 3 de la presente solicitud, en los que, como resultado de estos experimentos, se concluyó que la vacunación con MTBVAC a las dosificaciones estimadas de 2,5 x 104 ó 2,5 x 105 o más UFC fue inmunogénica en neonatos a partir de un entorno endémico de TB.
Cabe destacar que, en la presente solicitud, el término “neonatos” se entiende como un bebé recién nacido (u otro mamífero) o como un lactante de menos de cuatro semanas de edad.
En virtud de los resultados anteriores, los presentes autores están realizando actualmente un ensayo de definición de la dosis de fase 2a, aleatorizado y controlado de la seguridad y la inmunogenicidad de MTBVAC en recién nacidos sudafricanos sanos, sin tratamiento previo con BCG y no expuestos al VIH. Este estudio se realizará en una población de noventa y nueve recién nacidos sin tratamiento previo con BCG y no expuestos al VIH sin exposición familiar conocida aM. tuberculosis.La duración estimada del estudio (desde la vacunación del primer participante hasta la finalización de la recopilación de datos) será de aproximadamente 36 meses. En este estudio, se administrará MTBVAC a los neonatos en tres niveles de dosis: 1,5-8,5 x 104 UFC/0,05 ml, 1,5-8,5 x 105 UFC/0,05 ml y 1,5-8,5 x 106 UFC/0,05 ml. El control activo es la vacuna BCG. Los participantes recibirán una dosis única de MTBVAC o BCG administra por vía intradérmica el día 0 del estudio. Los objetivos de este estudio son los siguientes:
Primarios:
• Evaluar la seguridad y la reactogenicidad de MTBVAC a niveles de dosis crecientes en comparación con la vacuna BCG en recién nacidos sudafricanos sanos, sin tratamiento previo con BCG y no expuestos al VIH.
• Evaluar la inmunogenicidad de MTBVAC a niveles de dosis crecientes en recién nacidos sudafricanos sanos, sin tratamiento previo con BCG y no expuestos al VIH.
Secundarios:
• Evaluar la tasa de conversión de QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT) en neonatos que reciben niveles de dosis crecientes de MTBVAC.
Exploratorios:
• Evaluar las diferencias en las respuestas de células T restringidas por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) inducidas por la vacunación con MTBVAC y BCG.
• Evaluar las diferencias en las respuestas de células T no restringidas por donante inducidas por la vacunación con MTBVAC y BCG.
Teniendo en cuenta el hecho de que los ejemplos 2 y 3 ya indican que la vacunación con MTBVAC a las dosificaciones estimadas de 2,5 x 104 ó 2,5 x 105 o más UFC fueron inmunogénicas en neonatos a partir de un entorno endémico de TB y que la reactogenicidad de la vacuna MTBVAC fue claramente menor que la reactogenicidad producida con la vacuna BCG, parece factible que la administración de MTBVAC a neonatos en dosis de 1,5-8,5 x 104 UFC/0,05 ml, 1,5-8,5 x 105 UFC/0,05 ml o 1,5-8,5 x 106 UFC/0,05 ml sería útil como agente profiláctico para neonatos en riesgo de infección conM. tuberculosiso aquellos en riesgo de desarrollar la enfermedad tuberculosa.
Además de lo anterior, cabe destacar además que los presentes autores están realizando actualmente un estudio de seguridad e inmunogenicidad con doble enmascaramiento, aleatorizado, controlado con BCG y de aumento de dosis en adultos con y sin infección por tuberculosis latente (LTBI), tal como se mide mediante el ensayo QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT). Este es un estudio de seguridad e inmunogenicidad de fase 1b/2a, con doble enmascaramiento, aleatorizado, controlado con BCG y de aumento de dosis en adultos sanos con y sin LTBI. Todos los participantes habrán recibido vacunación con BCG previa en la infancia. El producto en investigación es MTBVAC a cuatro niveles de dosis: 5 x 103 UFC, 5 x 104 UFC, 5 x 105 UFC y 5 x 106 UFC. El control activo es BCG (5 x 105 UFC).
Los participantes que cumplen con los criterios de inclusión/exclusión se aleatorizarán dentro de una cohorte de estudio para recibir una dosis única de revacunación con MTBVAC o BCG administrada por vía intradérmica el día 0 del estudio. El estudio se realizará en un centro en Sudáfrica. Los participantes se inscribirán en una de las ocho cohortes y serán monitorizados para determinar los criterios de valoración de seguridad e inmunogenicidad hasta el día 182 del estudio. El tiempo estimado para completar la inscripción es de aproximadamente 9 meses.
Las cohortes 1-8 incluirán participantes negativos para Q FT (cohortes 1-4) y positivos para Q FT (cohortes 5-8). Los participantes se aleatorizarán dentro de cada cohorte para recibir o bien MTBVAC o bien BCG.
Por otro lado, los autores de la presente invención, con el fin de lograr una manera preferida de poner en práctica cualquiera de los resultados anteriores con la cepa MTBVAC y de minimizar la pérdida de viabilidad después de la liofilización en un procedimiento de desarrollo que ofrezca resultados coherentes y un producto con una vida útil de almacenamiento de al menos 2 años almacenado entre 2-8 °C, llevaron a cabo numerosos estudios para establecer el procedimiento de producción más apropiado para la vacuna MTBVAC. Como primera aproximación, se sometieron a prueba diferentes medios de cultivo así como diferentes composiciones de estabilizador.
El primer desafío en la producción de la vacuna MTBVAC fue cultivarla en un medio con una composición definida y en el que no hubiera componentes de origen animal. Por este motivo, los experimentos se realizaron usando la cepa SO2. Tal como ya se mencionó, cabe destacar que la cepa MTBVAC se diseñó por ingeniería genética para asemejarse fenotípica y funcionalmente a su prototipo SO2 y, por tanto, la cepa SO2 se consideró un punto inicial apropiado para establecer el procedimiento de producción más apropiado para la vacuna MTBVAC.
Usando la SO2 cepa, se desarrollaron y sometieron a prueba diferentes medios que no contenían ningún componente de origen animal en su composición. Algunos de los medios de cultivo comprobados son los siguientes:
• Middlebrook 7H9 y variaciones (Media for Tubercle Bacilli, Dubos, R .J. y Middlebrook, G. American Review of Tuberculosis and Pulmonary Diseases, 1947, vol. 56, n.°4, págs. 334-45, ref. 15).
• Medio Sauton sintético (Handbook of Microbiological Media, cuarta edición, Ronald M. Atlas, CRC Press, 2010, página 1540) y variaciones.
La composición de los medios Sauton y Middlebrook se detalla en las siguientes tablas:
Tabla 1.
Tabla 2.
En el medio Sauton, el crecimiento fue similar al medio de referencia (medio Middlebrook sin modificaciones, tabla 2). La figura 1 compara la curva de crecimiento en Middlebrook con la del medio de cultivo Sauton. En paralelo a la composición del medio de cultivo, en estas pruebas comenzaron a perfilarse a escala de laboratorio otras variables tales como el tiempo de cultivo, el número de pases de cultivo y el tipo de crecimiento, estático o en agitación (véase la tabla 3).
Tabla 3. Crecimiento deM. tuberculosisSO2 en medio Sauton
Finalmente, se seleccionó el medio Sauton sintético en condiciones de crecimiento estático, ya que es válido para hacer crecer la cepa SO2. También podían haberse seleccionado las condiciones de crecimiento no estático, sin embargo, es necesario que el cultivo esté en condiciones aerobias.
La siguiente etapa del desarrollo fue estudiar el procedimiento de liofilización. La liofilización es una etapa crítica en la producción de una vacuna viva. Lograr la estabilidad de vacunas liofilizadas es un procedimiento complejo, puesto que los microorganismos no sólo son susceptibles a factores medioambientales después de la liofilización, tales como la temperatura, sino que las condiciones de crecimiento y formulación también pueden afectar al éxito del procedimiento. El rendimiento de bacterias viables después de la liofilización y la posterior estabilidad de almacenamiento pueden verse afectados por factores tales como el ciclo de liofilización, la composición de estabilizador, la humedad residual y la presencia de aire.
En la fase de desarrollo con SO2, se sometieron a prueba hasta 11 composiciones de estabilizador diferentes. La siguiente tabla ilustra las composiciones de estabilizador sometidas a prueba.
Tabla 4
En los estudios de estabilizador también se sometieron a prueba diferentes formulaciones, que variaban, además de las composiciones, las proporciones del estabilizador y medio de cultivo, así como el volumen de liofilización. En todas las pruebas, se determinaron la pérdida de viabilidad en el producto liofilizado y la estabilidad después de 30 días a 37 °C. Como criterio para seleccionar los estabilizadores para futuras pruebas, se establecieron un límite de pérdida de viabilidad del 90 % y/o un máximo del 80 % de pérdida después de la prueba de estabilidad en condiciones aceleradas a 37 °C (véanse los resultados en la tabla 5).
Tabla 5. Liofilización de SO2 con diferentes estabilizadores.
Después de los ensayos preliminares mencionados anteriormente, se concluyó que era necesario añadir un estabilizador al medio de cultivo para la liofilización, puesto que las pérdidas en la liofilización sin estabilizador fueron mayores del 99 %, y el mejor estabilizador que cumplía con la especificación para la pérdida en la liofilización y la especificación para la estabilidad en condiciones aceleradas a 37 °C fue GSA (glutamato de sodio y sacarosa).
Después de llegar a las conclusiones anteriores, se recibió la cepa MTBVAC en forma de un lote de siembra premaestro secado por congelación y, poco después, se comenzaron los cultivos celulares de esta cepa particular. Para el crecimiento de la cepa MTBVAc , en primer lugar se usó medio Sauton con la misma composición que la usada en los estudios de crecimiento de la cepa SO2 original (véase la tabla 1). Sin embargo, inesperadamente, en el caso de MTBVAC, se observó un menor crecimiento en medio Sauton sintético que el observado para la cepa SO2. Además, también se detectaron problemas en la fase de amplificación de la cepa MTBVAC. Con el fin de resolver estos problemas, se realizaron pruebas añadiendo y eliminando componentes de la composición del medio Sauton. Tales modificaciones consistieron en la adición o eliminación de suplementos tales como glucosa, sulfato de zinc, biotina, glicerol y polisorbato.
El enriquecimiento del medio Sauton sintético con sulfato de zinc y biotina no ofreció buenos resultados y no se observó crecimiento de MTBVAC. En el caso de enriquecimiento con glucosa, polisorbato y glicerina, los resultados fueron favorables y se obtuvo un crecimiento adecuado de MTBVAC.
Como resultado de estos estudios de crecimiento, se desarrollaron los medios SD y SDG y se hicieron crecer los cultivos de MTBVAC en estos medios. El crecimiento de MTBVAC fue bueno tanto en el medio SD como en el medio SDG, pero algunos cultivos se detuvieron después de pases sucesivos en medio SDG, por lo que el medio SD fue el seleccionado para los pases de amplificación. La figura 2 muestra los resultados de DO de los cultivos de MTBVAC en los medios Sauton, SD y SDG.
Sin embargo, cuando los cultivos de la cepa MTBVAC se iniciaron a partir de viales del lote de siembra maestro liofilizado o secado por congelación, se observó que no podía iniciarse el crecimiento en el medio SD, por lo que se realizaron modificaciones en la composición del mismo y se desarrolló un medio de siembra. Como conclusión de estos estudios y para las futuras pruebas a escala piloto e industrial, como medio para iniciar los cultivos se seleccionó el medio de siembra, como medio para los pases de amplificación se seleccionó el medio SD y como medio para el cultivo en masa antes de la liofilización se seleccionó el medio SDG. Además, es importante observar que la composición del medio SD en combinación con el estabilizador afectó al procedimiento de liofilización y al aspecto del comprimido, por lo que el procedimiento de liofilización se realizará únicamente en el medio SDG.
En el presente documento se proporciona la composición de los medios de siembra, SD y SDG.
Tabla 6
En este sentido, las tres tablas siguientes muestran los resultados de la producción a escala industrial de cinco lotes de 2,5 x 105 MTBVAC que demuestran la coherencia de los resultados obtenidos con los medios desarrollados en el estudio.
Tabla 7: Cultivo de MTBVAC a partir del banco de siembra de trabajo liofilizado en medio de siembra
Tabla 8: Cultivo de MTBVAC en medio SD desde el pase anterior (tabla 7)
Tabla 9: Cultivo de MTBVAC en medio SD desde el pase anterior (tabla 8)
Tabla 10: Cultivo de MTBVAC en medio SDG desde el pase anterior (tabla 9)
En los estudios de desarrollo indicados previamente con la cepa SO2, se concluyó que en el procedimiento de liofilización era necesario usar un estabilizador para reducir las pérdidas de recuento de bacterias viables y para mejorar la estabilidad del producto liofilizado. Para el desarrollo de MTBVAC, se usaron los mismos estabilizadores seleccionados en el estudio con SO2. El objetivo fue obtener una vacuna liofilizada con una concentración que oscilara desde 3 x 103 ufc/0,1 ml hasta 17 x 106 ufc/0,1 ml, preferiblemente que oscilara desde 3-17 x 103 ufc/0,1 ml, o entre 3-17 x 104 ufc/0,1 ml, o entre 3-17 x 105 ufc/0,1 ml, o entre 3-17 x 106 ufc/0,1 ml, de la cepa MTBVAC, minimizando la pérdida de viabilidad después de la liofilización en un procedimiento de desarrollo que ofrecía resultados coherentes y un producto con una vida útil de almacenamiento de al menos 2 años almacenado entre 2 8 °C.
En la fase de desarrollo con MTBVAC, se sometieron a pruebas hasta 7 composiciones de estabilizador diferentes. La siguiente tabla 11 ilustra las composiciones de estabilizador sometidas a prueba.
Tabla 11
Las siguientes tablas 12 a 13 a continuación muestran los resultados en cuanto a porcentaje de pérdida de viabilidad en un estudio de estabilidad en condiciones aceleradas de pruebas de liofilización a escala de laboratorio de MTBVAC. Las tablas muestran el efecto de la composición del medio de liofilización en combinación con el estabilizador en el procedimiento de liofilización. A partir de estos estudios se concluyó que es necesario añadir un estabilizador para la liofilización de MTBVAC y que el estabilizador G SA es el que ofrece los mejores resultados para los parámetros sometidos a prueba.
Tabla 12. Liofilización de MTBVAC hechas crecer en medio SD con diferentes estabilizadores. Porcentaje de pérdida de viabilidad en un estudio de estabilidad en condiciones aceleradas.
Tabla 13. Liofilización de MTBVAC hechas crecer en medio SDG con diferentes estabilizadores. Porcentaje de pérdida de viabilidad en un estudio de estabilidad en condiciones aceleradas.
Por último, la siguiente tabla muestra los resultados de liofilización de 4 lotes de MTBVAC:
Tabla 14.
La figura 3 muestra los resultados de estabilidad entre 2-8 °C y -30 °C de los lotes identificados en la tabla 14 anterior. Además, la siguiente tabla 15 proporciona resultados adicionales de la liofilización en paralelo del cultivo de la tabla 11 (medio SDG) en una planta a escala piloto e industrial.
Tabla 15.
Todos los resultados anteriores se obtuvieron mediante la liofilización del medio SDG en el que se hicieron crecer las cepas MTBVAC, preferiblemente hechas crecer en el intervalo entre 1 x 108 y 5 x 108 ufc/ml. Cabe destacar que para llevar a cabo dicha liofilización se añadieron glutamato de sodio y sacarosa (GSA), preferiblemente a una concentración de entre 10-40 g/l de glutamato de sodio y de entre 100-400 g/l de sacarosa.
Por tanto, en el presente documento se describen formulaciones y métodos específicos que pueden usarse para la preparación de productos farmacéuticos basados en cepas MTBVAC vivas, tal como se describe adicionalmente a continuación. Las formulaciones de la invención comprenden o consisten en cualquiera de las composiciones detalladas a continuación por sí mismas, y éstas pueden usarse para cultivar cepas MTBVAC. Las composiciones se detallan a continuación:
Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere al uso del medio de siembra, el medio SD y el medio SDG, tal como se caracterizaron anteriormente, para cultivar o expandir cepas MTBVAC, en condiciones aerobias. En este sentido, como medio para iniciar los cultivos de cepa MTBVAC se selecciona el medio de siembra, como medio para los pases de amplificación se selecciona el medio SD y como medio para el cultivo en masa antes de la liofilización se selecciona el medio SDG. En realizaciones particularmente preferidas del primer aspecto de la invención, la invención se refiere a un procedimiento para la producción de una composición de vacuna deM. tuberculosisviva atenuada lista para secar por congelación que comprende un microorganismo aislado perteneciente a una cepa deM. tuberculosisque tiene i) un fenotipo PhoP- mediante la inactivación por una deleción genética del gen Rv0757 y ii) la deleción de un segundo gen, Rv2930(fadD26),que impide la producción de PDIM (fenotipo PDIM-), más preferiblemente la cepa MTBVAC, en el que el procedimiento comprende iniciar el cultivo de la cepa deM. tuberculosisy expandir o amplificar dichas bacterias usando un medio celular adecuado, en el que el procedimiento está caracterizado porque para el cultivo en masa antes de la liofilización se usa un medio SDG. Preferiblemente, el procedimiento comprende iniciar el cultivo de la cepa deM. tuberculosisen el medio de siembra y expandir o amplificar dichas bacterias usando el medio SD, y usar el medio SDG para el cultivo en masa antes de la liofilización. Más preferiblemente, el procedimiento comprende además una etapa de secado por congelación mediante la adición de sacarosa y glutamato de sodio como estabilizadores al medio SDG usado para el cultivo en masa antes de la etapa de liofilización.
Además, se ha hallado que determinados componentes (por ejemplo, estabilizadores, agentes espesantes y tampones particulares) son ventajosos en la preparación de vacunas de cepas MTBVAC liofilizadas. La invención también se refiere a vacunas reconstituidas y a métodos profilácticos y terapéuticos que emplean las composiciones descritas en el presente documento. Las composiciones y los métodos de la invención se describen adicionalmente de la siguiente manera.
En particular, un segundo aspecto de la invención proporciona una composición de vacuna deM. tuberculosisviva atenuada que comprende un microorganismo aislado perteneciente a una cepa deM. tuberculosisque tiene i) un fenotipo PhoP- mediante la inactivación por una deleción genética del gen Rv0757 y ii) la deleción de un segundo gen, Rv2930(fadD26),que impide la producción de PDIM (fenotipo PDIM-), preferiblemente la cepa deM. tuberculosises la cepa MTBVAC, en la que dicha composición es una composición secada por congelación, y en la que dicha composición se obtiene secando por congelación un medio de cultivo que comprende el microorganismo mediante la adición de sacarosa y glutamato de sodio como estabilizadores, y en la que el medio de cultivo es el medio SDG. Más preferiblemente, en un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición de vacuna deM. tuberculosisviva atenuada que comprende un microorganismo aislado perteneciente a una cepa deM. tuberculosisque tiene i) un fenotipo PhoP- mediante la inactivación por una deleción genética del gen Rv0757 y ii) la deleción de un segundo gen, Rv2930(fadD26),que impide la producción de PDIM (fenotipo PDIM-), en la que preferiblemente la cepa deM. tuberculosises la cepa MTBVAC, y en la que dicha composición de vacuna deM. tuberculosisviva atenuada se obtiene o puede obtenerse según el procedimiento del primer aspecto de la invención.
Además, la presente invención divulga una composición de vacuna deM. tuberculosisviva atenuada, preferiblemente una composición reconstituida después del secado por congelación, que comprende un microorganismo aislado perteneciente a una cepa deM. tuberculosisque tiene i) un fenotipo PhoP- mediante la inactivación por una deleción genética del gen Rv0757 y ii) la deleción de un segundo gen, Rv2930 (fadD26), que impide la producción de PDIM (fenotipo PDIM-), en la que preferiblemente la cepa deM. tuberculosises la cepa MTBVAC, y en la que dicha composición está caracterizada porque comprende o consiste en los siguientes componentes por ml (en términos porcentuales):
Más preferiblemente, la composición de vacuna deM. tuberculosisviva atenuada mencionada en el párrafo anterior es una composición secada por congelación o reconstituida obtenida mediante la adición de agua, preferiblemente agua esterilizada para inyección, a una composición secada por congelación.
En una realización preferida del segundo aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, dicha composición está caracterizada porque comprende al menos 3 x 103 ufc por 0,1 ml, preferiblemente por 0,1 ml de agua, o más de cepas del microorganismo. Preferiblemente, la composición comprende entre 3 x 104 ufc por 0,1 ml y 17 x 106 ufc por 0,1 ml de cepas del microorganismo aislado. Más preferiblemente, la composición comprende entre 3 y 17 x 104 ufc por 0,1 ml, o entre 3 y 17 x 105 ufc por 0,1 ml, o entre 3 y 17 x 106 ufc por 0,1 ml, de cepas del microorganismo aislado. Todavía más preferiblemente, la especificación de liberación para la vacuna MTBVAC secada por congelación que comprende entre 1,5 y 8,5 x 105 ufc/0,05 ml de cepas MTBVAC se detalla en la tabla a continuación:
Además, tal como se muestra en esta memoria descriptiva, los datos de estabilidad demuestran que los bancos celulares tanto maestro como de trabajo, preparados a partir del lote de siembra premaestro, son estables (véase la figura 8) y que la vacuna MTBVAC almacenada entre -15°C-30°C y entre 2-+8 °C es estable durante más de 24 meses (véanse las figuras 3 y 10).
Además, en uso, el estudio de estabilidad muestra que la vacuna MTBVAC es estable durante al menos 8 horas a temperatura ambiente una vez que se ha reconstituido.
Tal como se comenta en más detalle en otras partes en el presente documento, las composiciones de la invención son particularmente ventajosas debido a la estabilidad y la viabilidad de los componentes activos, que se debe en gran parte a la formulación y al procedimiento mediante el cual se prepara el producto, que implica liofilización. En general, este procedimiento incluye las siguientes etapas: congelación, secado primario, secado secundario y taponamiento. El procedimiento se describe en más detalle a continuación en los ejemplos experimentales, pero un ejemplo del procedimiento es el siguiente. En la etapa de congelación, se enfrían previamente las baldas del liofilizador hasta -50 °C. Una vez cargadas todas las bandejas, se mantienen las baldas a 50 ° C durante 120 minutos. En la etapa de secado primario, se establece el vacío a 25 mT, y se llevan a cabo las siguientes etapas de variación en rampa: variar en rampa a 0,1 °C/minuto hasta una temperatura de balda de -40 °C, mantener durante 500 minutos; variar en rampa a 0,1 °C/minuto hasta una temperatura de balda de -35 °C, mantener durante 500 minutos; variar en rampa a 0,1 °C/minuto hasta una temperatura de balda de -30 °C, mantener durante 500 minutos, y variar en rampa a 0,1 °C/minuto hasta una temperatura de balda de -25 °C, mantener durante 800 minutos. En la etapa de secado secundario, el vacío permanece a 25 mT, y se lleva a cabo una etapa de variación en rampa de manera que la variación en rampa es a 0,1 °C/minuto hasta una temperatura de balda de 20 °C, mantener durante 800 minutos. Si es necesario, el producto puede mantenerse a 20 °C, 25 mT, hasta 24 horas adicionales antes del taponamiento. En la etapa de taponamiento, se desgasifica la cámara con gas de nitrógeno seco filtrado a través de un filtro de 0,22 |im, se establece el vacío a 800 mbar (vacío ligero) y se colocan tapones en los viales. En la técnica se conocen bien ciclos de liofilización alternativos que pueden usarse en la invención. Por tanto, los métodos de la invención pueden implicar congelación a o hasta aproximadamente, por ejemplo, de -70 °C a -30 °C (por ejemplo, de -60 °C a -40 °C, o -50 °C). La congelación puede llevarse a cabo durante de aproximadamente 30 a 240 minutos (por ejemplo, de 60 a 120 minutos) o más. Luego puede someterse el material a una o más etapas de secado, tal como se describe en el presente documento. En estas etapas, puede aplicarse un vacío (por ejemplo, 25 mT) y puede cambiarse gradualmente la temperatura (por ejemplo, de 0,1 a 1,0 °C/minuto, o 0,5 °C/minuto), durante el transcurso de un periodo de tiempo (tal como 100-1000 minutos, por ejemplo, 200-600 ó 300-500 minutos). En el secado primario, la temperatura puede aumentarse hasta o aproximadamente, por ejemplo, de -30 °C a 10 °C, por ejemplo, de -20 °C a 5 °C o de -15 °C a 0 °C, mientras que en el secado secundario, la temperatura puede cambiarse a, por ejemplo, de 5 °C a 35 °C, por ejemplo, de 10 °C a 30 °C, o de 15 °C a 20 °C. Tal como conocen los expertos en esta técnica, estos parámetros (por ejemplo, temperaturas, tiempos de mantenimiento, velocidad de variación en rampa y niveles de vacío) pueden cambiarse, por ejemplo, en función de los resultados obtenidos.
Las composiciones de vacuna del segundo aspecto de la invención pueden administrarse como agentes profilácticos primarios a aquellos en riesgo de infección conM. tuberculosiso aquellos en riesgo de desarrollar enfermedad tuberculosa, o pueden usarse como agentes secundarios para tratar a pacientes infectados. Debido a que las cepas de estas composiciones están atenuadas, son particularmente muy adecuadas para su administración a “individuos en riesgo” tales como recién nacidos, niños, adolescentes, adultos y ancianos. Tales vacunas también pueden usarse en contextos veterinarios.
Preferiblemente, una divulgación de la invención se refiere a la vacuna MTBVAC para inmunizar a un individuo contra los síntomas provocados por la tuberculosis. Cabe destacar que dicha vacuna también puede ser adecuada para el tratamiento de cáncer de vejiga, así como para el tratamiento o la prevención de TB, o como vector o adyuvante. Preferiblemente para inmunizar a un individuo contra los síntomas provocados por la TB.
En otra divulgación de la invención, la composición del segundo aspecto puede administrarse para la profilaxis en neonatos en riesgo de infección conM. tuberculosiso aquellos en riesgo de desarrollar enfermedad TB, contra infecciones provocadas por el complejoM. tuberculosis,preferiblementeM. tuberculosis.Más preferiblemente, dicha composición puede administrarse por vía intradérmica a los neonatos.
En otra divulgación de la invención, la composición del segundo aspecto puede administrarse para la profilaxis o la prevención (incluyendo la vacunación de refuerzo) en humanos no neonatos, tales como niños, adolescentes y adultos, en riesgo de infección conM. tuberculosis,contra infecciones provocadas por el complejoM. tuberculosis,preferiblementeM. tuberculosis.Más preferiblemente, dicha composición puede administrarse por vía intradérmica.
En otra divulgación de la invención, la composición del segundo aspecto puede administrarse para la profilaxis o la prevención en humanos no neonatos, tales como niños, adolescentes y adultos, en riesgo de desarrollar enfermedad TB y que padecen infección de tuberculosis latente, contra el desarrollo de la sintomatología clínica asociada con la forma activa de la enfermedad provocada por el complejoM. tuberculosis,preferiblementeM. tuberculosis.Más preferiblemente, dicha composición puede administrarse por vía intradérmica.
En otra divulgación de la invención, la composición del segundo aspecto se administra para su uso como agente secundario para tratar a pacientes infectados con TB latente y/o activa en neonatos y humanos no neonatos, tales como niños, adolescentes y adultos. Más preferiblemente, dicha composición puede administrarse por vía intradérmica.
En otra divulgación de la invención, la composición del segundo aspecto se administra para la vacunación de refuerzo o la dosificación de refuerzo en un tratamiento profiláctico o preventivo en humanos no neonatos, tales como niños, adolescentes y adultos, en riesgo de infección conM. tuberculosis,contra infecciones provocadas por el complejoM. tuberculosis,preferiblementeM. tuberculosis.En este sentido, cabe destacar que, después de la inmunización inicial, una inyección de refuerzo o una dosis de refuerzo es una reexposición al antígeno inmunizante. Se pretende que aumente la inmunidad contra ese antígeno de vuelta a niveles protectores, después de que haya disminuido la memoria contra ese antígeno a lo largo del tiempo.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra “comprender” y sus variantes no implican la exclusión de otras características técnicas, aditivos, componentes o etapas. Para un experto en la técnica, otros objetos, ventajas y características de la invención surgirán parcialmente a partir de la descripción y parcialmente cuando se ponga en práctica la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ejemplo ilustrativo y no limitativo de la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1. La inmunogenicidad y la protección son independientes de la dosis de MTBVAC en ratones recién nacidos
Se vacunaron por vía intradérmica ratones C3H recién nacidos (de 1 a 3 días de edad) con 25 |il que contenían una dosis clínica de BCG (2,5 x 105 aprox.), o las dosificaciones de UFC indicadas de MTBVAC. Para los grupos de BCG, se usaron viales comerciales de BCG danesa, correspondiente a los lotes 111053F y 113033C. En el caso de MTBVAC, los animales se inmunizaron con la vacuna MTBVAC producida mediante la liofilización del medio SDG en el que se hicieron crecer las cepas MTBVAC; para llevar a cabo dicha liofilización, se añadieron glutamato de sodio y sacarosa (GSA) a una concentración de entre 10-40 g/l de glutamato de sodio y entre 100-400 g/l de sacarosa. Se resuspendieron las formulaciones liofilizadas.
ESTUDIO S DE EFICACIA PRO TECTO RA
Ocho semanas tras la vacunación, los ratones se sensibilizaron por vía intranasal con 150 UFC de cepa deM. tuberculosisH37Rv. Cuatro semanas más tardes, se sacrificaron los ratones y se determinó la carga bacteriana en los pulmones mediante la siembra de homogeneizado tisular en medio sólido 7H11S. Los resultados se muestran en la figura 4.
ESTUDIO S DE INMUNOGENICIDAD
Ocho semanas tras la vacunación, se sacrificaron los ratones y se aislaron los esplenocitos para la evaluación de la inmunogenicidad. Se incubaron un millón de esplenocitos durante 24 horas en presencia de 10 |ig/ml de derivado proteico purificado (PPD), 2 |ig/ml de péptidos ESAT6 o CFP10 solapantes, o sin antígeno (control negativo). Se analizaron las células productoras de interferón gamma (IFN-y) mediante ELISPO T. Los resultados se muestran en la figura 5.
CONCLUSIÓN
Se demostró que ni la eficacia protectora ni la inmunogenicidad específica para PPD, ESAT6 o CFP10 inducidas por MTBVAC eran dependientes de la dosis en el modelo de ratón recién nacido.
Ejemplo 2. DATOS DE INMUNOGENICIDAD DE FA SE 1B DATA EN RECIÉN NACIDOS (SUDÁFRICA)
Objetivo: se buscaba determinar la inmunogenicidad y caracterizar las respuestas inmunitarias inducidas después de la vacunación de neonatos con la vacuna MTBVAC descrita en la presente invención.
Métodos: Treinta y seis recién nacidos sanos, sin tratamiento previo con BCG y no expuestos al VIH se aleatorizaron 1:3 para recibir o bien BCG (cepa SS I) o bien MTBVAC a 2,5 x 103, 2,5 x 104 o 2,5 x 105 UFC en el plazo de 96 h del nacimiento. Se midieron las respuestas de citocinas específicas de MTBVAC en sangre completa los días 7, 28 y 70 mediante tinción de citocinas intracelulares de sangre completa y citometría de flujo en un dispositivo BD LSRFortessa (configuración de 18 colores, azul-rojo-violeta-verde).
Descripción del ensayo ICS de sangre completa:
Se estimularon sangres heparinizadas completas recién extraídas inmediatamente con BCG, MTBVAC o fitohemaglutinina (PHA) o se dejaron sin estimular (Nil), durante 12 horas a 37 °C. Las condiciones de estimulación incluían la mitad del volumen de sangre [250 |il (0,25 ml)] y sólo Nil, MTBVAC y BCG. Después de 7 horas de estimulación, se recogió el sobrenadante (para el análisis de citocinas/quimiocinas solubles) a partir de todas las condiciones, se congeló a -BOC y se almacenó para su envío al patrocinador para su análisis adicional. Tras la retirada del sobrenadante, se añadió brefeldina A a la sangre completa restante y se incubaron los tubos durante 5 h adicionales en un baño de agua programable. Se apagó el baño de agua después de un total de 12 horas de estimulación. A la mañana siguiente, se añadió disolución de lisis FACS para lisar los glóbulos rojos y fijar los glóbulos blancos. Luego se congelaron los glóbulos blancos fijados para la posterior tinción de citocinas intracelulares y la citometría de flujo. La tinción y adquisición por citometría de flujo se realizarán en lotes en un punto de tiempo posterior. Se evaluaron la medición de frecuencias y patrones de citocinas de tipo 1 específicas e IL-17 por células T CD4. Los puntos de tiempo para la inmunogenicidad se han seleccionado en función de estudios recientes realizados por SATVI, que han demostrado que el máximo de las respuestas de células T inducidas por BCG en lactantes es de alrededor de 6-10 semanas de edad.
Resultados: la vacunación con dosis crecientes de MTBVAC dio como resultado predominantemente respuestas de células T CD4 específicas de antígeno Th1 (IFN-y, IL-2 o TNF-a). La dosis de MTBVAC más alta de 2,5 x 105 UFC indujo la mayor magnitud de respuesta de citocinas de células T CD4 específicas de antígeno el día 70. La dosis de MTBVAC más baja de 2,5 x 103 UFC fue la menos inmunogénica. Los resultados se ilustran adicionalmente en la figura 6.
Conclusiones: estos datos indican que la vacunación con MTBVAC a 2,5 x 104 ó 2,5 x 105 o más UFC es inmunogénica en neonatos a partir de un entorno endémico de TB.
Ejemplo 3. Un ensayo clínico aleatorizado, con doble enmascaramiento y de aumento de dosis de MTBVAC en comparación con la vacuna BCG SSI en recién nacidos con una rama de seguridad en adultos que viven en una región endémica de TB
Objetivos. Evaluación de la seguridad y la inmunogenicidad de 3 dosis de MTBVAC frente a BCG en recién nacidos en una región endémica de TB.
Métodos. Dieciocho adultos sanos previamente vacunados con BCG negativos para el VIH y negativos para QuantiFERON (QFT) se aleatorizaron 1:1 para recibir MTBVAC (5 x 105 UFC) o Bc G SSI. Después de eso, 36 recién nacidos sanos, sin tratamiento previo con BCG y no expuestos al VIH se aleatorizaron 1:3 para recibir BCG SSI o MTBVAC a 2,5 x 103, 2,5 x 104 o 2,5 x 105 UFC en el plazo de 96 h del nacimiento. Se realizó QFT en D180 y D360 y los lactantes positivos para Q FT (>0,35 UI/ml) fueron derivados a terapia preventiva con isoniazida.
Resultados. Todos los adultos experimentaron reacciones locales en el sitio de inyección con hinchazón en 18 (100% ), enrojecimiento en 16 (88 ,9% ) y ulceración en 10 (55 ,5% ). Nueve reacciones fueron notificadas como moderadas y un único acontecimiento de hinchazón fue grave (35 mm). No se notificaron AAG en D28.
La indisponibilidad de la vacuna BCG SSI dio como resultado una dosificación abierta de 6 lactantes con MTBVAC a la dosis más alta. Dieciséis (44,4 %) lactantes a lo largo de las 3 cohortes tuvieron reacciones locales (2 [16,6 %], 3 [25 %] y 11 [91,6%]), todas ellas calificadas como leves con hinchazón en 14 (38 ,9% ), eritema en 5 (13 ,9% ) y cicatrización en 9 (25,0 %). No se observó ulceración. Los AA sistémicos fueron similares a lo largo de las cohortes (n=32/42/40) con 9 calificadas como moderadas (n=3/4/2) y 8 como graves (n=4/2/2). Seis lactantes experimentaron 7 AAG no relacionados, incluyendo una muerte no relacionada debido a neumonía viral, confirmada por la autopsia.
Se observó la conversión de QFT relacionada con la dosis en D180 en receptores de MTBVAC en la cohorte 1 (n=3, 37,5 %), la cohorte 2 (n=6, 75 %) y la cohorte 3 (n=7, 77,8 %), pero en ninguno de los 7 receptores de BCG. Se observó un QFT positivo en D360 en 0 receptores de MTBVAC en la cohorte 1 (0,0 %), 2 receptores en la cohorte 2 (25,0 %) y 4 receptores en la cohorte 3 (44,4 %) tal como se ilustra en la figura 7.
Conclusión. MTBVAC parecía segura a los 3 niveles de dosis en recién nacidos sudafricanos; y parecía dar como resultado una conversión de QFT dependiente de la dosis transitoria, lo que puede ser un indicador alentador de inmunogenicidad en regiones endémicas de TB. Además, la reactogenicidad de la vacuna MTBVAC fue claramente menor que la reactogenicidad producida con la vacuna BCG, en la que la administración de la vacuna BCG produjo cicatrices en 5 de los 8 (62 %) recién nacidos, mientras que MTBVAC a su dosis más alta produjo cicatrices en tan sólo 2 de los 10 (20 %) recién nacidos.
Claims (2)
- REIVINDICACIONES i. Procedimiento para la producción de una composición de vacuna deM. tuberculosisviva atenuada lista para secar por congelación que comprende un microorganismo aislado perteneciente a una cepa deM. tuberculosisMTBVAC que tiene i) un fenotipo PhoP- mediante la inactivación por una deleción genética del gen Rv0757, en el que la secuencia de marco de lectura abierto (ORF) de PhoP consiste en SEQ ID NO 4, y ii) la deleción de un segundo gen, Rv2930(fadD26),que impide la producción de PDIM (fenotipo PDIM-), en el que la secuencia de marco de lectura abierto (O RF) defadD26consiste en SEQ ID NO 2; y en el que el procedimiento comprende iniciar el cultivo de la cepa MTBVAC en el medio de siembra tal como se define en la tabla a continuación y expandir o amplificar dichas bacterias usando el medio SD tal como se define en la tabla a continuación:y en el que el procedimiento está caracterizado porque, para el cultivo en masa antes de la liofilización, se usa un medio SDG que comprende la composición cuantitativa y cualitativa mostrada a continuación:en el que el procedimiento se lleva a cabo en condiciones aerobias.
- 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende además una etapa de secado por congelación mediante la adición de sacarosa y glutamato de sodio como estabilizadores al medio SDG usado para el cultivo en masa antes de la etapa de liofilización.
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