ES2319527T3 - Cepas atenuadas de vibrio cholerae y vacunas liofilizadas que las contienen. - Google Patents

Abstract

La presente invención propone nuevas cepas vivas para inmunizar oralmente contra el cólera, liofilizadas en formulaciones que permiten su almacenamiento a largo plazo. En estas cepas se combinan las dos propiedades más importantes que deben poseer los candidatos vacunales concebidos para inmunizar oralmente contra el cólera. Una de estas propiedades es la de poseer un nivel de reactogenicidad disminuido hasta niveles aceptables, en virtud del empleo de mutaciones ya conocidas y descritas en el arte anterior. La otra propiedad es poseer un mejor índice de seguridad ambiental en virtud de la supresión del gen mshA o mutaciones espontáneas que conduzcan a la ausencia de la fimbria MSHA en la superficie externa de la bacteria y la ausencia del fago VGJF en su dotación genética, los cuales, si estuvieran presentes, permitirían la incorporación y diseminación del fago CTXF asistida por VGJF, objeto de la presente

Description

Cepas atenuadas de Vibrio cholerae y vacunas liofilizadas que las contienen.

Sector técnico

El campo de la invención es el de la biotecnología, en particular la obtención de cepas vacunales vivas atenuadas de Vibrio cholerae, más específicamente, la introducción de mutaciones definidas para prevenir o limitar la posibilidad de la readquisición y (o) la posterior dispersión de genes codificados del fago CTX\phi mediante cepas vacunales vivas y un procedimiento para conservarlas y usarlas como vacunas.

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Técnica anterior Primero, definiciones

En la descripción de la invención se usará una terminología cuyo significado se relaciona a continuación.

Por virus CTX\phi se quiere decir la partícula de ADN recubierto por proteínas producida por ciertas cepas de V. cholerae, que tiene la capacidad de traducir su ADN, que comprende los genes de la toxina del cólera, a otros vibrios.

Por toxina del cólera (TC) se quiere decir la proteína responsable de los síntomas clínicos del cólera cuando es producida por la bacteria.

Por genes de la toxina codificados por CTX\phi se quiere decir, además de los genes de la TC, los genes zot y ace que codifican la "toxina de la zónula ocludens" y la enterotoxina accesoria del cólera, respectivamente. La actividad de ZOT es responsable de la destrucción de las uniones estrechas entre las membranas basolaterales de las células epiteliales y la proteína ACE tiene una actividad accesoria a la de la toxina del cólera.

El término vacuna bien tolerada o cepa bien tolerada se refiere a la cepa que carece de reactogenicidad residual que caracteriza a la mayoría de las cepas no toxigénicas de V. cholerae. En términos prácticos, quiere decir que es una cepa lo bastante segura como para usarse en las comunidades con acceso limitado o sin acceso a las instituciones sanitarias sin que constituya un riesgo para la vida de los vacunados. Se debería esperar una tasa de diarrea en el 8% o menos de los vacunados y la diarrea se caracteriza porque no supera los 600 ml (g), en que sólo el 1% de los vacunados, o menos, podría padecer cefaleas, que deberían ser leves y de corta duración (menos de 6 horas) y, por último, que produzcan vómitos en menos del 0,1% de los vacunados, dichos vómitos se caracterizan por se un único episodio de 500 ml o menos.

Por hemaglutinina proteasa (HA/P) se quiere decir la proteína secretada por V. cholerae que manifiesta una función doble, siendo una de ellas la capacidad para aglutinar los eritrocitos de ciertas especies y la otra la propiedad de degradar o procesar proteínas tales como la mucina y la toxina del cólera.

Por celA se quiere decir la secuencia de nucleótidos que codifica la síntesis de la endoglucanasa A. Esta proteína es natural en las cepas de Clostridium thermocellum y tiene una actividad \beta(1-4)glucan-glucano hidrolasa que confiere capacidad para degradar la celulosa y sus derivados.

El término MSHA se refiere a las fimbrias estructurales de la superficie de V. cholerae con capacidad para aglutinar eritrocitos de diferentes especies y que es inhibida por la manosa.

Por reversión a la virulencia mediada por VGJ\phi se quiere decir el acontecimiento en el que una cepa previamente atenuada obtenida mediante la supresión de los genes de CTX\phi readquiere todos los genes de este fago a través de un mecanismo completamente dependiente y mediado por VGJ\phi y la interacción con su receptor, MSHA.

La posibilidad de diseminar el fago CTX\phi en un proceso mediado por VGJ\phi es aquélla en la que el fago filamentoso VGJ\phi forma una estructura híbrida estable (HybP\phi) mediante recombinación genética con el ADN de CTX\phi y disemina su genoma con genes activos hacia otras cepas de V. cholerae, que podrían ser cepas no patogénicas para el medio ambiente, cepas vacunales u otras de diferentes especies.

Segundo, información sobre la técnica anterior

El cólera clínico es una enfermedad diarreica aguda que es el resultado de una infección oral con la bacteria V. cholerae. Tras más de 100 años de investigación del cólera, sigue existiendo la necesidad de una vacuna eficaz y segura contra la enfermedad. Desde 1717, el hombre ha sido testigo de siete pandemias de cólera, las primeras seis fueron causadas por cepas del biotipo Clásico y la actual séptima pandemia se caracteriza por la prevalencia de cepas pertenecientes al biotipo El Tor. Recientemente, a partir de enero de 1991, esta pandemia se extendió a Sudamérica y ha causado más de 25.000 casos de cólera y más de 2.000 muertes en Perú, Ecuador y Chile. En noviembre de 1992, apareció un nuevo serogrupo de V. cholerae en India y Bangladesh, el O139, que muestra un gran potencial epidémico y genera gran preocupación en el mundo en desarrollo. Estas recientes experiencias refuerzan la necesidad de obtener vacunas eficaces contra la enfermedad causada por V. cholerae de los serogrupos O1 (biotipo El Tor) y O139 del cólera.

Dado que a la convalecencia del cólera le sigue un estado de inmunidad de una duración de al menos tres años, se han realizado muchos esfuerzos en la vacunología de Vibrio cholerae para producir vacunas del cólera con microorganismos vivos atenuados, que imiten estrechamente la enfermedad en sus propiedades de inmunización tras la administración oral, pero que no resulten reactogénicos para los individuos que los ingieren (diarrea, vómitos, fiebre). Las vacunas de este tipo implican mutaciones de deleción de todos los genes de las toxinas codificadas por CTX\phi. Por ejemplo, la supresión de la toxina del cólera y de otros genes de toxinas codificados en el profago CTX\phi es una manipulación genética obligatoria durante la construcción de un candidato a vacuna viva (véanse las invenciones de James B. Kaper, documento WO 91/18979 y John Mekalanos, documento WO 9518633 de los años 1991 y 1995, respectivamente).

Este tipo de mutantes ha sido propuesto como vacunas de una dosis oral y, aunque están sustancialmente atenuados y son capaces de generar una respuesta inmunitaria sólida (Kaper J. B. y Levine M., patentes de EE.UU. 06-472.276 y 581.406). No obstante, el principal obstáculo para el uso extendido de dichos mutantes ha sido el elevado nivel de reacciones adversas que producen en los vacunados (Levine y col., Infect. and Immun. Vol. 56, Nº 1, 1988).

Por tanto, la consecución de un grado suficiente de atenuación es el problema principal que se ha de resolver durante la obtención de vacunas vivas eficaces contra el cólera. Existen al menos tres candidatos a vacunas vivas, que han mostrado niveles aceptables de seguridad, es decir un grado suficiente de atenuación y un fuerte potencial inmunogénico. Son V. cholerae CVD103HgR (biotipo Clásico, serotipo Inaba) (Richie E. y col., Vaccine 18, (2000): 2399-2410), V. cholerae Perú-15 (Biotipo El Tor, serotipo Inaba) (Cohen M., y col. (2002) Infection and Immunity, Vol. 70, Not 4, pág. 1965-1970) y V. cholerae 638 (Biotipo El Tor, serotipo Ogawa) (Benítez J. A. y col. (1999), Infection and Immunity, feb; 67 (2); 539-45).

La cepa CVD103HgR es el componente antigénico activo de una vacuna oral viva contra el cólera con licencia en varios países del mundo, las cepas Perú-15 y 638 son otros dos candidatos a vacunas vivas para evaluar en los estudios de campo en un futuro cercano.

No obstante, existe un segundo problema de importancia que se ha de resolver en los candidatos a vacunas vivas atenuadas; uno es la seguridad ambiental, especialmente relacionado con la posible readquisición y diseminación de los genes de la toxina del cólera mediante mecanismos existentes de transferencia horizontal de la información genética entre bacterias. De acuerdo con esto, las cepas de vacunas atenuadas de V. cholerae podrían potencialmente readquirir genes de virulencia fuera de las condiciones controladas del laboratorio, en un acontecimiento de infección con el fago CTX\phi (Waldor M. K. y J. J. Mekalanos, Science 272: 1910-1914) procedente de otros vibrios y más adelante contribuir a su diseminación. Este proceso podría convertirse en relevante durante las campañas de vacunación en las que las personas ingieren miles de millones de bacterias atenuadas y siguen eliminando cantidades similares en sus heces durante al menos 5 días. Una vez que están en el ambiente, las bacterias tienen la posibilidad de adquirir material genético de otras bacterias de la misma o diferentes especies del ecosistema. Por estas razones, actualmente es deseable obtener candidatos a vacunas con ciertas características que prevengan o limiten la adquisición y diseminación de CTX\phi y, especialmente, de los genes que codifican la enterotoxina del cólera. Como consecuencia, este es el campo de la presente invención.

Los virus bacterianos, conocidos como bacteriófagos, tienen un extraordinario potencial de transferencia de genes entre bacterias de las mismas o diferentes especies. Este es el caso del fago CTX\phi (Waldor M. K. y J. J. Mekalanos, Science 272: 1910-1914) en V. cholerae. El CTX\phi lleva los genes que codifican la toxina del cólera en V. cholerae y entra en las bacterias a través de la interacción con pelos de tipo IV, denominados TCP, de pelos corregulados por la toxina. Los TCP están expuestos en la superficie externa de los vibrios. De acuerdo con resultados publicados, en condiciones óptimas de laboratorio el fago CTX\phi alcanza títulos de 10^{6} partículas o menos por ml de cultivo en la fase de saturación; esto permite clasificarlo como un bacteriófago moderadamente prolífico. Igualmente, la expresión del receptor de TCP de este fago tiene condiciones restrictivas para su producción. A pesar de estas limitaciones, la existencia de este par bacteriófago-receptor, limita de algún modo la mejor aceptación de vacunas del cólera con microorganismos vivos, esta es la razón por la cual privar a las bacterias de la puerta de entrada a este fago es una modificación deseable.

Existen dos modos teóricos de prevenir la entrada de CTX\phi en V. cholerae, 1), suprimiendo la expresión de TCP o 2) eliminando los sitios de TCP implicados en la interacción entre el fago y el receptor. Ninguna de las dos formas se ha implementado debido a la esencialidad de los TCP para una adecuada colonización del intestino humano y la provocación de una respuesta inmunitaria protectora. Debe observarse que también se necesitan sitios implicados en la interacción TCP-CTX\phi para el proceso de colonización. (Taylor R. 2000. Molecular Microbiology, Vol. (4), 896-910).

Se han evaluado varias estrategias que contrarrestan la entrada del virus, tales como prevenir la integración del fago en el cromosoma bacteriano y su herencia estable, consistente en la supresión del sitio de integración y en la inactivación del gen recA para evitar la recombinación e integración en otros sitios del cromosoma. (Kenner y col., 1995, J. Infect. Dis. 172: 1126-1129).

Asimismo, recientemente se ha descrito que la entrada de CTX\phi en V. cholerae depende de los genes TOIQRA, aunque esta mutación produce fenotipos sensibles no deseados en los candidatos a vacunas del cólera y no se ha implementado. (Heilpern y Waldor, 2000. J. Bact. 182: 1739).

No se han descrito otros procedimientos que impidan la entrada de fagos que llevan determinantes esenciales de virulencia frente a las cepas vacunales del cólera u otras cepas vacunales.

El principal objeto de la presente invención está relacionado con el fago VGJ\phi y su capacidad para transferir los genes que codifican la toxina del cólera usando la fimbria hemaglutinina sensible a manosa (MSHA) como receptor. Específicamente, consiste en proteger las cepas de vacunas vivas atenuadas de la infección con VGJ\phi mediante la introducción de mutaciones de supresión o modificaciones que impidan el correcto funcionamiento de esta fimbria.

En los conocimientos anteriores de esta fimbria se pueden resumir los aspectos siguientes. El producto génico de mshA se describió inicialmente como la subunidad mayoritaria de un apéndice fimbrial en la superficie de V. cholerae que tenía la capacidad para aglutinar eritrocitos de diferentes especies, siendo esta capacidad inhibida por la manosa (Jonson G. y col. (1991). Microbial Pathogenesis 11: 433-441). Como tal, la MSHA se consideró un factor de virulencia de la bacteria (Jonson G. y col. (1994). Microbial Patogénesis 13: 109-118). De acuerdo con la importancia atribuida, se obtuvieron mutantes deficientes en la expresión de la MSHA para estudiar su posible papel en la virulencia. Se ha demostrado que MSHA, al contrario que TCP, no es necesaria para la colonización del intestino delgado humano por V. cholerae El Tor y 0139 (Thelin KH y Taylor RK (1996). Infection and Immunity 64: 2853-2856). La MSHA también se ha descrito como el receptor del bacteriófago 493 (Jouravleva E. y col. (1998). Infection and Immunity Vol. 66, Not 6, pág. 2535-2539), lo que sugiere que este fago podría estar implicado en la aparición de vibrios O139 (Jouravleva E. y col. (1998). Microbiology 144: 315-324). Más tarde se ha descrito que la fimbria MSHA desempeña un papel en la formación de biopelículas sobre superficies bióticas y abióticas, de modo que contribuyen a la supervivencia de las bacterias fuera del laboratorio y del huésped (Chiavelli D. A. y col. (2001). Appl. Environ Microbiol. Jul; 67 (7): 3220-25 y Watnick P. I. y Kolter R. (1999). Mol. Microbiol. Nov. 34 (3); 586-95). A partir de los datos anteriores se hace evidente que se han realizado varias investigaciones relacionadas con la fimbria MSHA, pero ninguna de ellos define este pelo como el receptor de un fago capaz de transducir de un modo muy eficaz los genes de la toxina del cólera, y no sólo estos genes sino el genoma completo de CTX\phi, que notablemente podría contribuir a su diseminación. Adicionalmente, aunque se ha realizado una extensa búsqueda, no se ha encontrado ninguna invención relacionada con esta fimbria, bien como factor de virulencia o bien como receptor del fago que media la diseminación de CTX\phi.

Por otro lado, es práctica común entre aquéllos que desarrollan vacunas vivas contra el cólera proporcionarlas en forma liofilizadas. Por tanto, estas preparaciones de las bacterias vivas se ingieren tras la administración de una solución de antiácido que regula el pH del estómago y, por tanto, la suspensión bacteriana continúa hacia el intestino sin dañar el estómago y alcanza la colonización en el intestino.

La elaboración de vacunas liofilizadas mejora la conservación de cepas, facilita la preparación de dosis, permite la conservación a largo plazo, limita los riesgos de contaminación y facilita la comercialización y la distribución, sin la necesidad de una cadena de frío, generalmente no disponible en los países en vías de desarrollo.

Aunque se considera que V. cholerae es un microorganismo muy sensible al proceso de liofilización, se sabe que algunos aditivos potencian la supervivencia de la cepa. Por tanto, la conservación de la cepa de vacuna CVD103HgR Clásica Inaba, el Centro para el Desarrollo de Vacunas, Universidad de Maryland, EE.UU., el Instituto Suizo de Sueros y Vacunas, de Berna (ISSVB), han desarrollado una formulación, véase (Vaccine 8, 577-580, 1990, S. J. Cryz Jr., M. M. Levine, J. B. Koper, E. Fürer y B) que principalmente contiene azúcares y aminoácidos. La formulación está compuesta de sacarosa, aminoácidos y ácido ascórbico y, después del proceso de liofilización, se añaden lactosa y aspartamo.

En un trabajo sobre conservación mediante liofilización de la cepa salvaje 569B Clásica Inaba, publicado en Cryo-Letters 16, 91-101 (1995) por Thin H., T. Moreira, L. Luis, H. García, T. K. Martino y A. Moreno, se comparó el efecto de diferentes aditivos sobre la viabilidad y el aspecto final tras la liofilización y después de la conservación a diferentes temperaturas de esta cepa de V. cholerae. Se ha demostrado que las pérdidas de viabilidad fueron inferiores a 1 orden logarítmico tras 3 días de conservación a 45ºC.

En la invención CU 22 847 se reivindica un procedimiento de liofilización en el que las formulaciones contienen una combinación de proteínas purificadas o leche desgrasada con la adición de polímeros y/o glicina, además de peptona bacteriológica o hidrolizado de caseína y sorbitol, con buenos resultados para la viabilidad de las cepas de Vibrio cholerae de diferentes serogrupos, biotipos y serotipos. Las bacterias liofilizadas conservan su viabilidad tras ser disueltas en una solución tampón de bicarbonato sódico 1,33% usada para regular el pH del estómago.

Toda formulación de vacuna del cólera que se supone que se va a usar en los países en vías de desarrollo deberían tener ciertos requisitos, tales como poseer una composición sencilla, ser fáciles de preparar y manipular, ser fáciles de disolver y tener un buen aspecto tras su disolución. Además, también sería deseable no requerir bajas temperaturas de conservación y tolerar altas temperaturas de conservación al menos durante periodos cortos de tiempo, así como la presencia accidental de oxígeno y humedad en el contenedor. Además, también es necesaria una selección adecuada de la composición de la formulación que permite la conservación de Vibrio cholerae de diferentes serogrupos, biotipos y serotipos. Por último, también es sorprendente que una formulación sin ingredientes derivados de bovinos nos permite estar de acuerdo con las autoridades reguladoras internacionales en relación con el uso de componentes bovinos debido al síndrome de encefalopatía espongiforme bovina.

Descripción de la invención

La presente invención propone una nueva generación de vacunas vivas atenuadas para inmunizar contra el cólera mediante la modificación de sus propiedades, mejorando específicamente su seguridad biológica durante la colonización de seres humanos y más tarde en el ambiente, fuera de los laboratorios.

La presente invención nacida de la necesidad de proteger las vacunas de cólera vivas de la infección con el bacteriófago CTX\phi, que contiene los genes de la toxina del cólera, y también para alterar la potencial diseminación de este fago a partir de candidatos a vacunas vivas del cólera. Específicamente, nació del descubrimiento y caracterización del fago VGJ\phi en nuestro laboratorio.

El VGJ\phi es un bacteriófago filamentoso aislado de V. cholerae O139, pero tiene una capacidad infecciosa sobre V. cholerae O1 de todos los serotipos y biotipos y también sobre otras cepas de V. cholerae O139. La secuencia de esta fago no se describió en la secuencia genómica completa de V. cholerae, lo que indica que este fago no estaba presente en la cepa N16961 (O1, El Tor Inaba). De una amplia lista de cepas de V. cholerae O1 existentes en nuestro laboratorio, ninguna de ellas tenía secuencias homólogas a VGJ4\phi, mientras que las cepas MO45, SG25-1 y MDO12C, de V. cholerae O139 sí las tenían.

El fago VGJ\phi infecta a V. cholerae a través de la fimbria MSHA. Cuando este fago entra en la bacteria, puede replicarse o integrarse en una región cromosómica específica. Este es un fago muy activo que alcanza 10^{11} partículas ml^{-1} en los sobrenadantes del cultivo.

En el documento Ehara. M. y col. Characterization of filamentous phages of vibrio cholerae 0139 and 01. FEMS Microbiology letters. 1997 Vol. 154, página 239-301 se describe la caracterización de fagos filamentosos en 01 y 0139 de Vibrio cholerae, incluido el fago fs1, que es similar en un 96% en sus primeros 1712 nucleótidos a VGJ\phi (SEC ID Nº 1), no obstante su receptor es VCF en lugar de MSHA.

La característica más importante de este fago, en virtud del cual se expide la siguiente solicitud de invención, es su capacidad para llevar a cabo una transducción especializada del fago CTX\phi y, en consecuencia, de los genes de la toxina del cólera. Este proceso se produce mediante recombinación específica de sitio entre el genoma de CTX\phi y de VGJ\phi, seguida por la encapsulación y exportación de ambos genomas en la cápside de VGJ\phi. Esta partícula viral híbrida se denominó HybP\phi. Un cultivo de bacterias infectadas con ambos, CTX\phi y de VGJ\phi, producen 10^{11} partículas ml^{-1} de VGJ\phi y 10^{7}-10^{8} partículas ml^{-1} de HybP\phi, que es al menos 100 veces mayor que los títulos obtenidos con CTX\phi solo.

También es importante entender, para el propósito de esta solicitud, que el receptor del fago CTX\phi es TCP, que requiere condiciones especiales para su expresión, mientras que el receptor de VGJ\phi es la fimbria MSHA, un antígeno que se expresa abundantemente en todas las condiciones de cultivo estudiadas y que también se produce en el ambiente. Además, otros vibrios producen la MSHA que incrementa el riesgo de transmisión, incluso a otras especies bacterianas.

También es importante saber que, una vez que un huésped nuevo se infecta con HybP\phi, una proporción estable de partículas en el intervalo de 10^{7}-10^{8} ml^{-1} tiene lugar en la fase de saturación, de modo que este fago híbrido tiene un elevado potencial de transmisión y diseminación de los genes de la toxina del cólera.

Otro aspecto de gran interés para el propósito de esta invención es que los genes de la toxina del cólera en HybP\phi son suficientemente activos para producir 50 ng ml^{-1} de toxina durante el cultivo in vitro y que la infección de una cepa atenuada con invierte a la virulencia según se evalúa mediante el modelo de cólera en ratón lactante.

De acuerdo con estos datos, un objetivo principal de la presente invención es describir las mutaciones adicionales realizadas en las vacunas vivas de cólera para impedir su infección con VGJ\phi o HybP\phi, así como la necesidad de usar vacunas vivas del cólera en las que esté ausente el genoma de VGJ\phi para evitar la diseminación de CTX\phi mediada por VGJ\phi, en el caso de la readquisición de CTX\phi.

Un ejemplo de esta mutación es una mutación espontánea estable, que conduce a la falta de expresión de la fimbria MSHA en la superficie celular. De este modo, el VGJ\phi o su fago derivado, HybP\phi no podría infectar a tales vacunas.

Otro ejemplo de esta mutación es una mutación supresora en el gen estructural de la subunidad proteica mayor de esta fimbria (Mas).

El uso de candidatos a vacunas vivas de cólera en los que el genoma de VGJ\phi esté ausente podrían conseguirse simplemente buscando hibridación de ADN en diferentes cepas para identificar cuáles no tienen fragmentos homólogos a VGJ\phi descrito en esta invención, aunque podrían aplicarse otras metodologías conocidas para eliminar VGJ\phi de una cepa infectada.

Ejemplos de vacunas vivas del cólera para realizar las mutaciones específicas mencionadas antes son cepas vacunales que no son capaces de reaccionar con una sonda específica de VGJ\phi y de las que se ha demostrado en la técnica anterior que tienen niveles aceptables de reactogenicidad en estudios con voluntarios. El genotipo de estas cepas incluye mutaciones supresoras del fago CTX\phi, dejando un RS1 remanente y la inactivación insercional del gen hap con el gen celA. Tales cepas se construyen por medio de procedimientos tradicionales de supresión del profago CTX\phi en cepas epidémicas de V. cholerae, seguidos por la inactivación del gen de hemaglutinina proteasa (hap) para el inserto del gen marcador celA en su secuencia. Véase el artículo científico de Robert y col., Vaccine, Vol. 14 Nº 16, 1517-22, 1996), el artículo científico de Benítez J. A. y col. (1999), Infection and Immunity. Feb; 67 (2): 539-45 y la solicitud de invención WO 9935271A3, de Campos y col., 1997. Otras cepas con estas características y que además tienen mutaciones autotróficas también son útiles para obtener las cepas con las características de interés de la presente invención.

De acuerdo con la descripción del párrafo anterior, un objetivo principal de esta invención es proteger el uso de mutaciones supresoras o espontáneas que conducen a la ausencia de la fimbria MSHA en la superficie de los vibrios y, de este modo, impiden que las vacunas vivas del cólera readquieran y diseminen los genes de la toxina del cólera por medio de la infección con el fago híbrido, HybP\phi.

Entre las inclusiones preferidas de esta invención están cualquier cepa de vacuna viva del cólera de los biotipos y serotipos existentes o cualquier cepa no toxigénica de otros serotipos emergentes con manipulaciones genéricas que supriman el genoma del fago CTX\phi, inactivan el gen hap, combinado con cualquier otra mutación, por ejemplo la introducción de algunas auxotrofias (para lisina o metionina) y que también tengan las características propuestas en la presente invención.

Entre las inclusiones preferidas también se encuentran el uso de vacunas vivas de cólera bien toleradas, mejoradas por la imposibilidad de adquirir CTX\phi en un acontecimiento mediado (por) VGJ\phi y por la ausencia de VGJ\phi que disminuye el riesgo de dispersión de CTX\phi, como sistema de liberación para presentar antígenos heterólogos al sistema inmunitario de la mucosa.

Para obtener estos mutantes en la expresión de la fimbria MSHA, los autores han usado varias técnicas de biología molecular que no son objeto de protección del presente documento.

La presente invención también describe los procedimientos para preservar y liofilizar estas cepas con el propósito de ser capaz de preparar vacunas vivas que presentan una reconstitución rápida y adecuada después de la liofilización sin que afecte su viabilidad cuando se están reconstituyendo en una solución de bicarbonato sódico 1,33%.

También es objeto de la invención que por medio de la selección adecuada de los componentes, las formulaciones liofilizadas garantizan que las vacunas vivas del cólera no disminuyen su viabilidad menos de 1 orden logarítmico como consecuencia de la conservación, con independencia del serogrupo, el serotipo o el biotipo o de las mutaciones que tienen, aunque se liofilizaran por separado o se mezclaran como parte de una misma preparación.

Entre los componentes de la formulación que están presentes son lactosa (L), peptona (P), extracto de levadura y sorbitol (S). La concentración total no debería superar el 10%.

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Ejemplo 1

Descubrimiento y características del fago VGJ\phi

El fago VGJ\phi se descubrió como elemento transmisible extracromosómico en las preparaciones de ADN total de Vibrio cholerae SG25-1, una cepa 0139 aislada en Calcuta, India, en 1993 y amablemente donada por el profesor Richard A. Finkelstein. En experimentos sencillos se mostró la transmisibilidad de este elemento. Sobrenadantes del cultivo sin células de la cepa donante que portan el elemento se cultivaron en condiciones estándar como medio LB (NaCl 10 g/l, triptona 10 g/l y extracto de levadura 5 g/l) y se pudieron transferir a una cepa receptora que no contenía ningún elemento extracromosómico, un elemento genético del mismo tamaño y mapa de restricción que el que estaba presente en la cepa donante. La propiedad de transmisión sin contacto directo entre donante-receptor es típica en los fagos.

Ensayos de infección: Las cepas donantes se cultivaron hasta una densidad óptica de 600 nm igual a 0,2. Una alícuota del cultivo se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum de tamaño de poro para eliminar las bacterias. La esterilidad del filtrado se confirmó mediante el cultivo de una alícuota en placas LB e incubación durante la noche a 37ºC. Después de comprobar la ausencia de unidades formadoras de colonias se usaron 100 \mul de sobrenadantes sin células o diluciones seriadas para infectar 20 \mul de un cultivo fresco de la cepa receptora. La mezcla se incubó durante 20 minutos a temperatura ambiente y se sembró en medio LB sólido o líquido a 37ºC durante la noche. La infección se confirmó por la presencia de forma replicativa (FR) y ADN monocatenario (ADNss) de VGJ\phi en los vibrios infectados.

Purificación del fago VGJ\phi: La purificación de las partículas del fago se realizó con 100 ml del cultivo de la cepa de Vibrio cholerae 569B (clásica, Inaba) infectada con VGJ\phi. Esta cepa se usó porque contiene un profago CTX\phi defectivo. Las células se centrifugaron a 8000 x g durante 10 minutos. El sobrenadante se filtró a través de una membrana de 0,22 \mum. Las partículas del fago en el filtrado se precipitaron mediante la adición de NaCl y polietilenglicol 600 hasta una concentración final de 3 y 5%, respectivamente. La mezcla se incubó en hielo durante 30 minutos y se centrifugó a 12.000 x g durante 20 minutos. Se desechó el sobrenadante y el sedimento que contenía el fago se suspendió en 1 ml de solución salina tamponada con fosfato.

Caracterización de VGJ\phi: Las partículas de VGJ\phi precipitadas conservaban la capacidad de infectar la cepa 569B y eran estables en solución PBS durante al menos 6 meses a 4ºC.

Después de la purificación de las partículas del fago, se extrajo el ADN genómico usando una solución de fenol-cloroformo. El análisis de este ADN mostró resistencia a la digestión con ribonucleasa H, lo que indica que el genoma es ADN y no ARN (datos no mostrados) y también era resistente al tratamiento con diferentes enzimas de restricción pero sensibles al tratamiento con Mung-Bean y nucleasa S1 (datos no mostrados), lo que indica que el genoma del fago consiste en ADNss. Un análisis de electroforesis en presencia de naranja acridina demostró resultados similares a los anteriores. El naranja acridina intercalado en el ADN bicatenario (ADNds) tiene un color verde fluorescente, mientras que es naranja fluorescente cuando se intercala en ADNss. Como cabe esperar, el ADN genómico tenía un color naranja fluorescente, lo que indica su naturaleza monocatenaria (datos no mostrados) y el ADN plasmídico observado en las células infectadas tenía un color verde fluorescente. Lo que indica que consiste en ADNds.

Identidad entre el genoma de VGJ\phi y la forma replicativa intracelular. El análisis de tipo Southern blot llevado a cabo usando el genoma de VGJ\phi como sonda mostró una identidad genética entre los elementos cromosómicos de la cepa donante SG25-1 y la cepa 569B infectada. Este resultado confirma que el ADNss del genoma viral se produce a través de la FR citoplásmica y al mismo tiempo sugiere que el VGJ\phi es un fago filamentoso que usa el mecanismo de replicación de círculo rodante para producir el ADNss genómico que se ensambla y exporta en las partículas de fago.

La FR, aislada de la cepa 569B infectada, se mapeó mediante análisis de restricción. El mapa obtenido mostró que el tamaño del genoma del fago (aproximadamente 7500 b) y el patrón de restricción electroforético eran diferentes a los de los fagos filamentosos específicos de V. cholerae indicados previamente. Estos resultados indicaron que el fago aislado de SG25-1 no se había descrito anteriormente y se designó VGJ\phi.

Titulación de VGJ\phi. Para ajustar las suspensiones de fagos, el procedimiento fue el mismo que el ensayo de infección, pero las células de la cepa indicadora se sembraron en una capa de agar blando (0,4%) sobre placas con LB sólido. Las placas se incubaron durante la noche a 37ºC y se contaron las placas opacas observadas (focos de infección).

Este ensayo reveló que un cultivo de 569B infectado con VGJ\phi puede producir hasta 3x10^{11} partículas de fagos por ml de cultivo, lo que es inusualmente elevado en comparación con otros fagos filamentosos descritos de V. cholerae como el CTX\phi, lo que produce un máximo de 10^{6} partículas por ml.

Microscopia electrónica. Diferentes cantidades de partículas de VGJ\phi se tiñeron negativamente con una solución de acetato de uranilo al 4% (m/v) y se observaron sobre rejillas formvar preparadas de forma reciente en un microscopio de barrido electrónico JEM 200EX (JEOL, Japón). La observación confirmó que las partículas de fago tenían una forma filamentosa (Fig.1).

Construcción y titulación de VGJ-Kn\phi. La FR de VGJ\phi se linealizó a través de su sitio único Xbal. Se insertó un fragmento de ADN que contenía el origen de replicación R6K y un casete de resistencia a kanamicina del plásmido pUC4K en el sitio Xbal de VGJ\phi. Esta FR recombinante se introdujo en V. cholerae 569B y las partículas del fago se designaron VGJ-Kn\phi.

La cepa donante 569B infectada con VGJ-Kn\phi se cultivó hasta una DO_{600}= 2,0. Una alícuota del cultivo se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum de tamaño de poro para eliminar las bacterias. La esterilidad de la suspensión sin células se comprobó mediante la siembra de una alícuota de 50 \mul en una placa con LB sólido e incubación durante la noche a 37ºC. se usaron alícuotas de 100 \mul de la suspensión de fago sin células o diluciones de la misma infectar 20 \mul de un cultivo fresco de la cepa receptora (aproximadamente 10^{8} células). La mezcla se incubó a TA durante 20 minutos para permitir la infección. Posteriormente, las mezclas se sembraron en medio LB sólido suplementado con kanamicina (50 \mug/ml) y las placas se incubaron durante la noche a 37ºC. Las colonias que crecen en presencia del antibiótico adquirieron su resistencia a Kn debido a la infección con el fago marcado VGJ-Kn\phi. Varias de estas colonias se comprobaron para detectar la presencia de la FR de VGJ-Kn\phi mediante purificación del ADN plasmídico y su análisis de restricción.

El ensayo de titulación realizado mediante este procedimiento concordaba con los obtenidos por el de las placas opacas con VGJ\phi, lo que muestra que un cultivo de 569B infectadas por VGJ-Kn\phi produce aproximadamente 2 x 10^{11} partículas de fago VGJ-Kn\phi por mililitro de cultivo.

Secuencia de nucleótidos: La secuencia de nucleótidos de VGJ\phi consistió en 7542 nucleótidos y tenía un contenido de G+C de 43,39%. Los ORF codificados se identificaron y compararon con las bases de datos de proteínas.

La organización genómica de VGJ\phi fue similar a la del fago filamentoso previamente caracterizado, tal como fagos del grupo Ff (M13, fd y f1) de E. coli y otros fagos filamentosos de V. cholerae (CTX\phi, fs1, fs2 y VSK) y V. parahemolyticus (Vf12, Vf33 y VfO3k6). VGJ\phi no tiene un gen homólogo del gen IV de los fagos del grupo Ff, que sugiere que VGJ\phi podría usar una porina del huésped para ensamblar y exportar sus partículas del fago similares al fago CTX\phi.

La secuencia de nucleótidos de VGJ\phi reveló que VGJ\phi es un pariente cercano de los fagos fs1 y VSK, y comparten varios ORF altamente homólogos y exhiben 82,8 y 77,8% de homología de ADN con VSK y fs1. No obstante, hay áreas genómicas altamente divergentes y que no comparten ORF entre ellos. Además, el tamaño del genoma es diferente y no se ha descrito antes que fs1 y VSK es capaz de transducir los genes de la toxina del cólera.

La secuencia de nucleótidos de VGJ\phi también reveló la presencia de dos sitios homólogos a las secuencias att que se sabe que funcionan en fagos filamentosos integradores. Estos sitios de VGJ\phi están parcialmente solapados y en direcciones opuestas. Esta organización también se encontró en los fagos Cf1c, Cf16-v1 y (\phiLF de X. campestris, así como Vf33 y VfO3k6 de V. parahemolyticus y VSK de V. cholerae. Todos estos fagos, excepto Vf33 y VSK se integran en el cromosoma de sus huéspedes por el sitio att presente en la hebra negativa de la forma replicativa de estos fagos.

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Ejemplo 2

Identificación del receptor de VGJ\phi

Generalmente, los fagos filamentosos usan pelos de tipo IV como receptores para infectar a sus huéspedes. Los fagos filamentosos específicos de V. cholerae previamente indicados usan pelos TCP o MSHA como receptores. Por tanto, se usaron dos mutantes de la cepa C6706 de El Tor para estos pelos, KHT52 (\DeltatcpA10) y KHT46 (\DeltamshA) para identificar si alguno de ellos era el receptor de VGJ\phi. Aunque la cepa parenteral C6706 y su KHT52 mutante en TCP eran sensibles a la infección con VGJ\phi, la KHT46 mutante en MSHA era completamente resistente al fago, lo que indica que MSHA era el receptor de VGJ\phi. La complementación de la cepa KHT46 con el gen estructural mshA salvaje (de la C6706 parental) llevada a cabo con el plásmido Pjm132 restableció la sensibilidad del fago, lo que confirma que MSHA es el receptor de VGJ\phi. La resistencia o sensibilidad a VGJ\phi se evaluó por la ausencia o presencia de la forma replicativa en cultivos de la cepa receptora analizada tras el ensayo de infección.

Para dar un título numérico de las partículas que se translucen en cada caso se usó un ensayo de infección con VGJ\phi-kn como se ha descrito previamente, lo que tiene como resultado lo siguiente:

La cepa parental C6706 y su derivado KHT52 mutante en TCP fueron sensibles a la infección con VGJ\phi-kn y, como las cepas indicadoras mostraron títulos de 10^{11} unidades formadoras de placas (UFP), mientras que KHT46, un mutante en MSHAM fue completamente resistente al fago, menos de 5 UFP/ml, tras su infección con la misma preparación de VGJ\phi-kn. La complementación de la cepa KHT46 con el gen estructural mshA salvaje restableció la sensibilidad del fago. Estos resultados confirman que una mutación que impide la expresión de pelo MSHA confiere resistencia a la infección por VJG\phi.

Se realizaron otros ensayos para comparar la capacidad de HybP\phi y CTX\phi para infectar las cepas Clásica y El Tor, usando sus variantes resistentes a kanamicina. Véanse los resultados en la Tabla 1.

Como se ha descrito anteriormente, el fago CTX\phi se obtuvo mediante la inserción de un casete de resistencia a kanamicina del plásmido pUC4K (Amersham Biosciencies), en el único sitio de restricción, Notl, de la forma replicativa CTXCl\phi.

El fago HypP\phi se obtuvo durante un ensayo de infección en el que el sobrenadante del cultivo sin células de la cepa 569b coinfectada con CTX\phi-Kn y VG\phi-kn se usó para infectar la cepa receptora KHT52. Las células de esta cepa que portan la resistencia a kanamicina, originalmente llevada por CTX\phi-Kn y proporcionada a HypP\phi, se purificaron y continuaron produciendo partículas virales de HypP\phi al sobrenadante.

Para comprobar la eficacia de la infección del fago híbrido en los vibrios clásico y el Tor se usaron suspensiones de CTX\phi-Kn y VG\phi-kn del mismo título (1-5x10^{5} partículas/ml) para infectar las cepas receptoras 569B (Clásica) y C7258 (El Tor). En ambos casos, las cepas receptoras se cultivaron en condiciones óptimas para la expresión de TCP, el receptor de CTX\phi. El ensayo se realizó del siguiente modo, 200 \mul de la preparación de fago puro se mezclaron con 20 \mul (aproximadamente 10^{8} células) de un cultivo fresco de una cepa receptora durante 20 minutos a temperatura ambiente, se sembraron en placas con medio LB sólido suplementado con kanamicina y se incubaron durante la noche a temperatura ambiente.

Los números de colonias que llevan el gen de resistencia a Kn en su genoma son el resultado de las infecciones de los fagos y muestran la capacidad de cada fago para infectar diferentes cepas en condiciones de laboratorio de rutina. Dichos resultados se exponen en la Tabla 1.

TABLA 1 Titulación de los fagos CTX\phi-Kn e híbrido (HybP\phi-Kn) EN 569B y C7258

100

Como se muestra en la Tabla 1, el fago híbrido transluce los genes de la TC con más eficacia que CTX\phi, el vehículo habitual de estos genes. Estos resultados destacan la importancia de la transmisión de CTX\phi mediada por VGJ\phi entre las cepas de Vibrio cholerae y subraya su relevancia considerando la ubicuidad de MSHA, el receptor funcional en estas cepas bacterianas.

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Ejemplo 3

Movilización de CTX\phi, su mecanismo y reversión a virulencia

La infección de las cepas de V. cholerae O1 u O139 que portan un fago CTX\phi activo con VGJ\phi da lugar a la producción de partículas infecciosas que llevan el genoma del fago CTX\phi insertado en el genoma de VGJ\phi. Estas partículas de fagos híbridos se han designado HybP\phi. Los títulos de HybP\phi se evaluaron por medio del uso de un fago híbrido, que porta un marcador de kanamicina (HybP\phi-Kn), empleando diferentes cepas como indicadores. Los títulos resultantes se muestran en la Tabla 1.

El HybP\phi-Kn se purificó a partir de preparaciones derivadas de la cepa 569B (HybP\phi-Kn) y se secuenció la hebra sencilla para determinar las uniones entre CTX\phi y VGJ\phi. La estructura cointegrada se muestra gráficamente en la Figura 2 y las secuencias de nucleótidos de las uniones entre ambas secuencias, lo que explica el mecanismo por el cual VGJ\phi transluce CTX\phi hacia otras cepas de V. cholerae. HybP\phi-Kn entra en V. cholerae usando el mismo receptor que VGJ\phi, es decir MSHA.

La cepa 1333 de V. cholerae es un clon atenuado descrito en la técnica anterior, similar a las cepas que eran útiles para obtener el derivado de la presente invención. Esta cepa es un derivado de la cepa patogénica C6706. Como se muestra en la figura 4, la inoculación de 10^{5} unidades formadoras de colonias de la cepa 1333 en ratones lactantes no tiene un efecto letal, incluso cuando está colonizando durante los 15 días posteriores. Varios experimentos para determinar la virulencia demostraron el efecto de la infección por HybP\phi-Kn sobre la reversión a la virulencia. Aunque una dosis de 10^{5} UFC de la cepa 1333 no tiene un efecto letal, las cepas C6706 y 1333 (HybP\phi-Kn) tienen perfiles de letalidad muy similares y no permiten la supervivencia de ratones inoculados más allá del quinto día (Figura 4).

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Ejemplo 4

Expresión constitutiva del receptor de VGJ\phi, la fimbria MSHA, en diferentes condiciones de cultivo

Para estudiar la expresión de MSHA, la subunidad mayor de la fimbria MSHA, se cultivaron las cepas C7258, C6706 y CA401 de V. cholerae en diferentes medios. Los medios usados fueron: LB Ph 6,5 (NaCl, 10 g/l; tristona bacteriológica, 10 g/l; extracto de levadura, 5 g/l); AKl (peptona bacteriológica, 15 g/l; extracto de levadura, 4 g/l; NaCl, 0,5 g/l; NaHCO3, 3 g/l), TSB (digestión pancreática de caseína, 17 g/l; digestión con papaína de semilla de soja, 3,0 g/l; NaCl, 5 g/l; fosfato dibásico de potasio, 2,5 g/l; glucosa, 2,5 g/l), medio dulbecco (glucosa, 4,5 g/l; HEPES, 25 mm; piridoxina, HCl, HaHCO_{3}), medio de hibridoma sin proteínas (formulación sintética sin suero ni proteínas suplementado con NaHCO3, 2,2 g/l; glutamina, 5 mg/l); rojo fenol, 20 g/l) y Syncase (NaH2PO4, 5 g/l; KH2PO4, 5 g/l; casaminoácidos, 10 g/l; sacarosa, 5 g/l y NH4Cl, 1,18 g/l). En todos los casos se inoculó una colonia en 50 ml de caldo de cultivo y se cultivó en un agitador rotatorio durante 16 horas a 37ºC, con la excepción de la condición AKI en la que las cepas se cultivaron primero a 30ºC en forma estática durante 4 horas y, más tarde, en agitador rotatorio a 37ºC durante 16 horas. En cada caso, la biomasa bacteriana se recogió mediante centrifugación y se usó para preparar lisados celulares. Cantidades equivalentes de lisados celulares se analizaron mediante Western Blot con el anticuerpo monoclonal 2F12F1 para la inmunodetección de mshA. La cepa mutante en MSHA KHT46 se usó como control negativo del experimento. Todas las cepas estudiadas, a excepción de la cepa control negativo KHT46, mostraron capacidad para producir MSHA en todas las condiciones de cultivo analizadas. Igualmente, dichas cepas cultivadas en las condiciones previas tienen la capacidad de hemaglutinar eritrocitos de pollo (sensibles a manosa) en el mismo título o superior a 1:16 y son infectados con eficiencia por VGJ\phi-Kn, exhibiendo títulos superiores a 10^{10} partículas por mililitro de cultivo.

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Ejemplo 5

Obtención de mutantes espontáneos deficientes en expresión de MSHA y evaluación de la resistencia a la infección

La cepa KHT46, un mutante de supresión de MSHA, derivada de C6706 de V. Cholerae (O1, la por, Inaba), muestra un estado refractario a la infección con los fagos VGJ\phi, VGJ\phi-Kn e híbrido HybP\phi. No obstante, esta es una cepa patogénica que no es propiedad de los autores de la presente solicitud ni de la persona jurídica que la presentó, el Centro Nacional de Investigación Científica, en La Habana, Cuba.

Para obtener los mutantes espontáneos deficientes en la expresión de MSHA superficial de la presente solicitud, se usó un mutante de supresión en los genes de la toxina del cólera que durante el/proceso de obtención resultaron afectados en su capacidad para ensamblar MSHA en la superficie celular. Dichos mutantes, aunque capaces de producir la subunidad estructural de MSHA, no la ensamblan en su superficie y, por tanto, no tienen títulos detectables de hemaglutinación sensible a manosa, ni absorben la actividad de un anticuerpo monoclonal específico contra la MSHA en un ELISA de competición. Dado que este fenotipo es notablemente, estos mutantes se manipularon genéticamente después para introducir una mutación de inserción en el gen de la hemaglutinina proteasa siguiendo el procedimiento descrito en la patente WO 99/35271 "V. cholerae vaccine candidates and the methods of their constructing" de Campos y col., y en el artículo de Roberts, Vaccine, vol. 14 nº 16, 15717-22, 1996. Los mutantes resultantes se denominaron JCG1 y JCG02, ambos del serogrupo O1, biotipo El Tor, serotipo Ogawa.

JCG01 y JCG02 mostraron un estado refractario a la infección con el fago VGJ\phi-Kn, una variante del fago VGJ\phi que porta un marcador de resistencia a kanamicina. Una suspensión de VGJ\phi-Kn que tenía un título probado de \sim1011 unidades por ml no muestra la capacidad para infectar dichas cepas (títulos no detectables, inferiores a 5 unidades por ml). Este estado refractario a la infección con VGJ\phi-Kn se corresponde con un título muy bajo de hemaglutinación en las cepas JCG01 y JCG02 (1:2) con respecto a su cepa parental (1:32) además de un deterioro total en la hemaglutinación dependiente de MSHA. Igualmente, Las células enteras de estos mutantes tenían una capacidad nula para inhibir la interacción del anticuerpo monoclonal anti-MSHA (2F12F1) frente a MSHA fijado sobre la fase sólida en un ELISA de competición. No obstante, ambas cepas produjeron la subunidad estructural mayor de MshA, de acuerdo con experimentos de inmunotransferencia, lo que indica que la proteína no se ensambla correctamente en la superficie celular, aunque se produce. Estos mutantes permitieron probar el concepto de esta invención y pasar para obtener mutantes de supresión.

Obtención de mutantes de supresión en el gen mshA a partir de otros candidatos a vacuna del cólera. Para obtener mutantes de supresión en el gen estructural mshA, dos segmentos del genoma de V. cholerae N16961 de -1200 pares de base por cada flanco del gen estructural mshA se amplificaron por medio de la reacción en cadena de la polimerasa usando los oligonucleótidos siguientes: CNC-8125, ATG ATC GTG AAG TCG ACT ATG (21 mer); CNC-8126 CAG CAA CCG AGA ATT HERE ATC ACC ACG (27 mer); CNC-8127, ATT, CTC GGT TGC TGG AAC TGC TTG TG (26 mer); y CNC-8128, GCT CTA GAG TAT TCA CGG TAT TCG (24 mer). Los fragmentos amplificados se clonaron de forma independiente y se ensamblaron in vitro para generar el clon p\DeltamshA. Este clon contiene estos fragmentos en el mismo orden y orientación en el que se encuentran en el cromosoma bacteriano; sólo la región codificadora del gen mshA se ha suprimido del interior de la secuencia. El fragmento que porta la supresión se subclonó desde el plásmido previo en forma de un fragmento De SalI/Xba I en el vector suicida pCVD442 para obtener el plásmido pS\DeltamshA.

El plásmido pS\DeltamshA se usó para suprimir el gen mshA cromosómico en las cepas vacunales de V. cholerae por medio de una metodología tradicional de sustitución alélica. Para ello, el pS\DeltamshA se introdujo en la cepa SM 10lpir de E. coli y se mobilizó hacia V. cholerae por medio de un procedimiento de conjugación bacteriana. Los clones resultantes se seleccionaron según su resistencia al antibiótico ampicilina en placas con medio LB suplementado con ampicilina (100 mg/ml). La mayoría de estos clones surgen debido a la integración del plásmido en el cromosoma del vibrio receptor por medio de un acontecimiento de recombinación homóloga entre uno de los fragmentos adyacentes al gen mshA del cromosoma y el del plásmido pS\DeltamshA, tras lo cual originan un cointegrado entre ambos. Este acontecimiento se verificó por medio de un experimento Southern blot, en el que el ADN total de 10 clones se digirió con la enzima de restricción SmaI e hibridó con una sonda obtenida del plásmido pS\DeltamshA (inserto Sal I/Xba I). Los clones de nuestro interés son aquéllos que producen una banda de 21.000 pares de bases. Un control similar de la cepa parental en este experimento produjo una banda de 13.000 pares de bases. Los clones adecuados se conservaron inmediatamente en glicerol LB a -70ºC. Después, 3 de ellos se cultivaron en ausencia de la presión selectiva del antibiótico para dejar que un acontecimiento de recombinación homóloga eliminara la duplicación genética existente. Esto se puede producir por medio de supresión de la estructura genética original (gen mshA intacto) y sustitución por una copia mutada presente en el plástico (gen mshA suprimido) como se muestra en la figura 3. -os clones en los que el gen mutado sustituyeron al gen intacto se analizaron mediante Southern blot y se identificaron mediante la presencia de una banda de 12.000 pares de bases. Por último, los clones en los que el gen mshA estaba suprimido se seleccionaron y conservaron de forma adecuada como candidatos a vacunas (congelación a -80ºC en medio LB suplementado con glicerol al 20%). este procedimiento se realizó con cada clon en el que se construyó un mutante de supresión de mshA.

Caracterización serológica. Tras la introducción de cada mutación en las cepas vacunales descritas en este documento se comprobó cada derivado para determinar la correcta expresión del lipopolisacárido correspondiente al serotipo original. Para ello, se recogieron las células de una placa fresca, se resuspendieron en solución salina (NaCl, 0,9%) e inmediatamente se examinaron con un suero de aglutinación adecuado específico para los vibrios Ogawa, Inaba o 0139.

La mayor respuesta inmunitaria generada por una vacuna anti-cólera es contra el LPS, por lo que la expresión del antígeno correspondiente a cada una de las cepas presentadas en esta invención se confirmó mediante aglutinación con antisuero específico.

Ensayo de aglutinación en ratones lactantes. El ensayo de colonización en ratones lactantes (Herrington y col., J. Exper. Med. 168: 1487-1492, 1988) se usó para determinar la capacidad de colonización de cada cepa. Por vía orogástrica se administró un inóculo de 10^{5}-^{106} vibrios en un volumen de 50 ml a grupos de al menos 5 ratones lactantes. Tras 18-24 horas a 30ºC se sacrificó a los ratones, se extrajo el intestino y se homogeneizó, y se sembraron diluciones en medios adecuados para el crecimiento de mutantes.

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TABLA 2 Capacidad colonizante de las cepas vacunales de la presente invención

1

2

3

Todas las cepas mostraron una capacidad de colonización adecuada para su uso como candidatos a vacunas vivas. La colonización es necesaria para generar una fuerte respuesta inmunológica porque la multiplicación local de las bacterias incrementa la duración de la interacción con el sistema inmunitario mucoso. En este caso, aunque no existe un modelo perfecto para el cólera, el de ratones lactantes da un enfoque adecuado a lo que puede ser la posterior colonización de cada cepa en seres humanos.

Ensayo de motilidad. Las células de una colonia bien aislada se cargan en la punta de un asa de platino a partir de una placa maestra hacia una placa para la detección de motilidad (LB, agar 0,4%), introduciendo la punta del asa 2-3 mm en el agar. El diámetro de dispersión de cada colonia en el agar blando hasta 30ºC se mide a las 24 horas de incubación. Una cepa bacteriana que alcanza un diámetro de 3 mm o menos desde el punto de inoculación se considera no móvil. Una cepa bacteriana que crece en un diámetro más allá de 3 mm se considera móvil. Resultó que todas las cepas incluidas en esta invención eran móviles.

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Ejemplo 6

Procedimientos para seleccionar y construir los candidatos a vacuna útiles como cepas de partida a modificar por el procedimiento descrito en la presente invención

Cinco cepas patogénicas en nuestra colección se seleccionaron como microorganismo de partida debido a su falta de hibridación con secuencias de VGJ\phi. Estas cepas son V. cholerae C7258 (O1, El Tor, Ogawa, Perú, 1991), C6706 (O1, El Tor, Inaba, Perú, 1991), CRC266 (O139, La India, 1999), CA385 (clásico, Ogawa) y CA401 (clásico, Inaba).

Los procedimientos descritos en este ejemplo no son el sujeto de la presente invención. en su lugar constituyen una detallada descripción de los procedimientos usados para obtener cepas atenuadas que son el sustrato para construir los mutantes reivindicados en la presente invención. Estos mutantes caracterizados porque son refractarios a la infección por VGJ\phi y el híbrido VGJ\phi::CTX\phi se obtienen mediante los procedimientos descritos en los ejemplos 4 y 5.

Más adelante, los inventores describen los plásmidos suicidas usados para introducir diferentes grupos de mutaciones en V. cholerae mediante sustitución alélica antes de que sean adecuados para su modificación mediante los procedimientos de la presente invención. El lector debe observar que las cepas reivindicadas en la presente invención tienen, además de la mutación que altera la correcta expresión de la fimbria MSHA (a), una mutación de deleción de los genes de la enterotoxina del cólera o todo el profago CTX\phi Y (b) el gen de la hemaglutinina proteasa interrumpido con el gen de la endoglucanasa A de Clostridium thermocellun. También pueden tener adicional y opcionalmente mutaciones en los genes (c) lysA, (d) metF, (e) VC0934 (que codifica una glicosil transferasa) y (f) thyA.

(a)

Para construir cepas atoxigénicas mediante inactivación de los genes de la enterotoxina del cólera o deleción del profago CTX\phi, el plásmido suicida usado fue pJAF (Benítez y cols., 1996, Archives of Medical Research, Vol. 27, Nº 3, pág. 275-283). Este plásmido se obtuvo a partir del plásmido pBB6 (Baudry y cols., 1991, Infection and Immunity 60: 428), que contiene un inserto de 5,1 kb de V. cholerae 569B que codifica ace, zot, ctxA y ctxB. Debido a la ausencia de secuencias RS1 en 3' del operón ctxAB en los vibrios de tipo clásico, en este plásmido el sitio de restricción EcoR I en 3' en la copia de ctxAB está en el ADN adyacente de la función no definida. El plásmido pBB6 se modificó mediante deleción del fragmento interno Scal para crear el plásmido pBSCT5, que ahora contiene una región recombinante privada de los genes funcionales zot y ctxA. Después, el Pstl de pBSCT5 se mutó en EcoRI mediante inserción de un ligante de EcoRI para obtener pBSCT64 y el fragmento EcoRI resultante se subclonó en el sitio EcoRI de pGP704 para objeter pAJF.

(b)

Para construir cepas afectadas en la expresión de HA/P se usó el plásmido suicida pGPH6. Este plásmido se construyó en diferentes etapas. Primera, el plásmido pCH2 (Hase y Finkelstein, 1991, J. Bacteriology 173: 3311-3317) que contiene el gen hap en un fragmento HindIII de 3,2 kb de V. cholerae 3083 se linealizó a través del sitio StuI, que está situado en la secuencia codificadora hap. El fragmento de hindi de 3,2 kb que contenía el gen celA se escindió del plásmido pCT104 (Cornet y col., 1983, Biotechnology 1:589-594) y se subclonó en el sitio StuI de pCH2 para obtener pAHC3. El inserto que contiene el pAHC3, que contiene el gen hap inactivado de forma insercional con el gen celA, se subclonó como fragmento HindIII en un derivado de pUC19 que tiene el sitio de múltiple clonación flanqueado por sitios BgIII para obtener pIJHCI. El fragmento BgII de este plásmido se subclonó en pGP704 para originar pGPH6, que contiene un fragmento de 6,4 kb con la estructura genética hap::celA, en la que el gen hap no es funcional.

(c) y (d)

Al construir mutantes en los genes lysA o metF se usaron los plásmidos pCVlysA\Delta1 o pCVM\DeltaClal. Para construir estos plásmidos, los genes lysA y metF se amplificaron mediante PCR de V. cholerae C7258 usando un par de oligonucleótidos para cada gen. Las secuencias de nucleótidos se adquirieron de Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, Ciudad de La Habana, Cuba. Las secuencias de nucleótidos de los cebadores fueron: (lysA): (P 6488) 5'-GTA AAT CAC GCT ACT AAG-3' y (P 6487) 5'AGA AAA ATG GAA ATGC-3' y (metF): (P 5872) 5'-AGA GCA TGC GGC ATG GC-3' y (P 5873) 5'-ATA CTG CAG CTC GTC GAA ATG GCG-3'. Los amplicones se clonaron en los plásmidos pGEM®T (Promega) y pIJ2925 (Janssen y cols., 1993, Gene 124: 133-134), lo que condice a la obtención de los plásmidos recombinantes pGlysA3 y pMF29, que contienen copias activas de los genes lysA y metF, respectivamente. La identidad de cada gen se comprobó mediante secuenciación de los nucleótidos.

\quad

Los genes lysA y metF clonados se mutaron in vitro mediante deleción de los respectivos fragmentos internos claI (246 pares de bases) y Pstl/Accl (106 pares de bases), respectivamente. En el último de los casos la estrategia se diseñó para mantener el marco de lectura abierto que conduzca a un producto génico inactivo para evitar ejercer efectos polares durante y después de la construcción de un mutante lysA de V. cholerae. Cada gen inactivado se clonó en forma de un fragmento BgI II en el vector suicida pCVD442 para la posterior introducción en los candidatos a la vacuna del cólera de interés. El plásmido suicida que contiene el alelo de lysA se denominó pCVlysA\Delta1 y el que contiene el alelo de metF se denominó pCVM\DeltaClal.

(e)

Al construir mutantes del gen VC0934, los inventores han construido y usado el plásmido suicida pCVD\Delta34. Al hacer esto, el gen VC0934 se amplificó mediante PCR usando como molde ADN total de la cepa N16961 y los cebadores: 5'-GCA TGC GTC TAG TGA TGA AGG-3' Y 5'-TCT AGA CTG TCT TAA TAC GC-3'. El amplicón se clonó en el plásmido pGEM5Zf vector T para obtener el plásmido pGEM34; se realizó una deleción de 270 pares de bases dentro de la secuencia codificadora de VC0934 usando las enzimas de restricción Narl/BglII. Después de lavar los extremos con klenow y la posterior recircularización, el plásmido obtenido se denominó pG34. el gen inactivo resultante se subclonó en el vector suicida pCVD442 diferido con SalI y SphI para obtener el plásmido pCV\Delta34. Este plásmido se usó para realizar la sustitución alélica del gen salvaje.

(f)

Al construir mutantes defectivos en la expresión de thyA se construyó y se usó el plásmido suicida pEST. Las etapas para construir este plásmido comprendieron la clonación del gen thyA de V. cholerae C7258 en pbBR322 como fragmento de ADN cromosómico EcoRI-HindIII, para obtener pVT1 (Valle y col., 2000, Infection and Immunity 68, Nº 11, pág. 6411-6418). Un fragmento interno de 300 pares de bases del gen thyA, comprendido entre los sitios BgIII y Mlul, se delecionó de este plásmido para obtener pVMT1. Esta deleción eliminó el fragmento de ADN que codifica los aminoácidos 7 a 105 de la proteína codificada timidilato sintasa. El gen thyA mutado se escindió en forma de un fragmento EcoRI-HindIII, los extremos se convirtieron en romos y después se clonaron en el sitio SmaI de pUC19 en la misma orientación que el gen de la \beta-galactosidasa para obtener pVT9. El gen resultante se subclonó en forma de un fragmento SacI de pVT9 a pCDV442 y el plásmido obtenido se denominó pEST. Este constructo final se usó para realizar la sustitución alélica del gen salvaje en las cepas de interés.

Los vectores suicidas descritos son un sistema modular que se puede usar para introducir una mutación secuencial en los candidatos a vacuna de V. cholerae.

La sustitución alélica con los genes codificados por estos vectores se realiza siguiendo la secuencia de etapas que se indica a continuación:

En la primera etapa, el vector suicida que contiene el alelo de elección entre los descritos se transfiere mediante conjugación del donante E. coli SM10\lambdapir al receptor V. cholerae, siendo este último el sujeto de la modificación planeada. Este acontecimiento se efectúa para producir un cointegrado resistente a ampicilina. Los clones resultantes del acontecimiento de conjugación se seleccionan de este modo en placas con LB suplementado con ampicilina (100 \mug/ml).

El procedimiento para esta primera etapa es el siguiente. La cepa donante SM10\lambdapir transformada con el vector suicida de interés se cultiva en una placa con medio LB (NaCl, 10 g/l; tristona bacteriológica, 10 g/l y extracto de levadura, 5 g/l) suplementado con ampicilina (100 \mug/ml), y la cepa receptora, la cepa de V. cholerae que se va a modificar, se cultiva en una placa con LB. Las condiciones de crecimiento son 37ºC durante la noche. Una única colona del donante y una del receptor se siembran en una placa nueva con LB. La cepa donante se siembra en primer lugar en una dirección y el receptor (V. cholerae) en segundo lugar en la orientación opuesta. Esta siembra perpendicular y superpuesta garantiza que ambas cepas crecen en estrecho contacto. En la etapa siguiente, las placas se incuban a 37ºC durante 12 horas, se recogen en 5 ml de NaCl (0,9%) y 200 \mul de diluciones 10^{2}, 10^{3}, 10^{4} y 10% se diseminan en placas con LB-ampicilina-polimixina B, para seleccionar los clones de V. cholerae que se habían transformado con el plásmido suicida y contraseleccionar el donante E. coli SM10\lambdapir. Diez de estos clones resultante de cada procedimiento se conservan congelados a -80ºC en LB-glicerol al 20% para su análisis en la segunda etapa.

En la segunda etapa se realiza una hibridación Southern blot con una sonda específica del gen sometido al proceso de mutación; esto se efectúa para detectar la estructura del cointegrado correcto entre los clones conservados en la etapa anterior. Los clones en los que el plásmido suicida se integró en la diana correcta mediante recombinación homóloga se identifican por la presencia de una estructura cromosómica concreta. Esta estructura contiene una copia del gen salvaje y una del alelo mutado separado únicamente por las secuencias del vector plasmídico. Esta estructura concreta produce un patrón de hibridación específico en el Southern blot con la sonda específica que permite su identificación. Los clones adecuados se conservan congelados a -80ºC en LB glicerol.

Esta segunda etapa comprende las siguientes subetapas: en primer lugar, el ADN total de cada clon obtenido en la primera etapa se aísla de acuerdo con un procedimiento tradicional (Ausubel y col., Short Protocols in Molecular Biology, tercera edición, 1992, unidad 2.4, página 2-11, protocolo básico). El ADN total de la cepa progenitora se aísla como control. Después, el ADN total de los diez clones de la cepa progenitora se digiere con las enzimas de restricción adecuadas, que se mencionarán más adelante en el documento. Un \mug del ADN se digiere de cada clon y la cepa madre se somete a electroforesis más adelante en calles paralelas de un gel de agarosa. El contenido en ADN del cel se transfiere a membranas en condiciones alcalinas (Ausubel y col.s, Short protocols in Molecular Biology, tercera edición, 1992, unidad 2.4, página 2-30, protocolo alternativo 1).

Las transferencias se fijan mediante incubación a 80ºC durante 15 minutos. Los sitios libres en la membrana se bloquean después mediante prehibridación y después se someten a sondas con la sonda específica para cada mutación.

A continuación se presentan detalles de la enzima de restricción, la sonda (marcada con digoxigenina usando el procedimiento de cebado aleatorio) y el tamaño del fragmento de hibridación que identifica la estructura deseada para el cointegrado de cada clon de acuerdo con el gen diana:

a) Para los mutantes de supresión de los genes del fago CTX\phi, el ADN total de los clones se digiere con la enzima de restricción Hind III y una vez en la membrana se hibrida con una sonda obtenida a partir del fragmento Pst I-EcoRI del plásmido pBB6. Los clones de interés son los que tienen la estructura genética que origina dos bandas en el Southern blot, una de 10.000 pares de bases y otra de 7.000 pares de bases. Como control, la cepa parental origina una única banda de 17.000 pares de bases en el mismo experimento de Southern blot.

b) Para los mutantes de supresión del gen hap, el ADN total de los clones se digiere con la enzima de restricción Xho I y una vez en la membrana se hibrida con una sonda obtenida a partir del fragmento Hind de 3.200 pares de bases presente en el plásmido pCH2. Los clones de interés son los que tienen la estructura genética que origina una única banda en el Southern blot, de 16.000 pares de bases. Como control, la cepa parental genera una única banda de 6.000 pares de bases en el mismo experimento de Southern blot.

c) Para los mutantes de supresión del gen lysA, el ADN total de los clones se digiere con la enzima de restricción Xho I y una vez en la membrana se hibrida con una sonda obtenida a partir del fragmento Sph I/Sma I del plásmido pCVlysAD1, que contenía el gen mutado lysA. Los clones de interés son los que tienen la estructura genética que origina una única banda en el Southern blot, de 12.500 pares de bases. Como control, la cepa parental genera una única banda de 5.200 pares de bases en el mismo experimento de Southern blot.

d) Para los mutantes de supresión del gen metF el ADN total de los clones se digiere con la enzima de restricción Nco I y una vez en la membrana se hibrida con una sonda obtenida a partir del fragmento BgI II de pCVDClal que contenía el gen metF mutado. Los clones de interés son los que tienen la estructura genética que origina una única banda en el Southern blot, de 12.000 pares de bases. Como control, la cepa parental genera una única banda de 5.000 pares de bases en el mismo experimento de Southern blot.

e) Para los mutantes de supresión del gen VC0934, el ADN total de los clones se digiere con la enzima de restricción Ava I y una vez en la membrana se hibrida con una sonda obtenida a partir del fragmento Sal I/Sph I de pcVDD34 que contenía el gen mutado de VC0934. Los clones de interés son los que tienen la estructura genética que origina dos bandas en el Southern blot, una de 1600 o 1,900 pares de bases y otra de 8.200 o 7.900 pares de bases. Como control, la cepa parental genera una única banda de 3.500 pares de bases en el mismo experimento de Southern
blot.

f) Para los mutantes de supresión del gen thyA, el ADN total de los clones se digiere con la enzima de restricción Bstx I y una vez en la membrana se hibrida con una sonda obtenida a partir del fragmento Sac I de pEST1, que contenía el gen mutado thyA. Los clones de interés son los que tienen la estructura genética que origina una única banda en el Southern blot, de 9.600 pares de bases. Como control, la cepa parental genera una única banda de 2.400 pares de bases en el mismo experimento de Southern blot.

En la tercera etapa del procedimiento, 3 clones de interés que portan un cointegrado con una de las estructuras previas, se cultivan en ausencia de la presión selectiva con antibiótico para permitir la pérdida del vector suicida por medio de recombinación homóloga y la amplificación de los clones resultantes. En dichos clones, la pérdida del vector suicida va con la pérdida de una de las dos copias del gen, el mutado o el salvaje, de la donación genética de la bacteria.

En una cuarta etapa del procedimiento, las diluciones de los cultivos previos se extienden en placas para obtener colonias aisladas, que después se replican hacia placas suplementadas con ampicilina para evaluar qué clones son sensibles a ampicilina. Dichos clones, sensibles a ampicilina, se conservan para congelar, como se ha descrito previamente.

En una quinta etapa, por medio de un estudio de Southern blot con sondas específicas para cada uno de los genes de interés (que se describe en a, b, c, d y f), se verifica qué clones conservaban en el cromosoma la copia mutada del alelo de interés. Estos clones de interés se expanden para crear un banco de trabajo y llevar a cabo su última caracterización, así como la introducción de las modificaciones objeto de protección en la presente solicitud de invención.

En los párrafos siguientes, los autores detallan la enzima de restricción, la sonda y los tamaños de los fragmentos de hibridación que identifican la estructura deseada en cada uno de los mutantes, de acuerdo con cada uno de los genes sujeto de modificación:

a)

Para analizar los mutantes en el profago CTX\phi, el ADN total se digiere con la endonucleasa de restricción Hind III. Una vez en la membrana se hibrida con una sonda derivada del fragmento Pst I-EcoR I del plásmido pBB6. Son clones de interés aquéllos que no producen bandas de hibridación en el Southern blot.

b)

Para los mutantes con el alelo inactivado de hap, el ADN total de los clones se digiere con la enzima de restricción Xho I y una vez en la membrana se hibrida con una sonda derivada de los 3.200 pares del fragmento de Hind III de 3.200 pares de bases del plásmido pCH_{2} que codifica el gen hap. Los clones de interés son aquéllos que producen una única banda en el Southern blot, de aproximadamente 9.000 pares de nucleótidos.

c)

Para los mutantes en el gen lysA, el ADN total se digiere con la enzima de restricción Xho I y una vez en la membrana se hibrida con una sonda derivada del fragmento Sph I/Sma I aislado del plásmido pCV\DeltalysA, que contiene el gen mutado lysA. Los clones de interés son los que tienen la estructura genética que produce una única banda en el Southern blot, de aproximadamente 5.000 pares de nucleótidos.

d)

Para los mutantes con deleciones en el gen metF, el ADN total de los clones se digiere con la enzima de restricción Nco I y una vez en la membrana se hibrida con una sonda derivada del fragmento BgI II contenido en el plásmido pCVM\DeltaClal, que contiene el gen metF mutado. Los clones de interés son los que tienen la estructura genética que conduce a una única banda de 4.700 pares de bases en el Southern blot.

e)

Para los mutantes en el gen VC0934, el ADN total de los clones se digiere con la enzima de restricción Ava I y las transferencias se hibridan con una sonda obtenida del fragmento Sal I/Sph I de pcVD\Delta34, que contiene el gen mutado de VC0934 obtenido in vitro. Los clones de interés son los que tienen la estructura que conduce a una única banda de 3,200 pares de bases en el Southern blot.

f)

Para los mutantes en el gen thyA, el ADN total de los clones se digiere con la enzima de restricción Bstx I y las transferencias se hibridan con una sonda obtenida del fragmento Sac I de pEST1, que contiene el gen thyA. Los clones de interés son los que tienen la estructura genética que conduce una única banda en el Southern blot de aproximadamente 2.100 pares de bases.

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Ejemplo 7

Procedimientos para preservar las cepas vacunales por medio de liofilización

En el ejemplo siguiente se cultivaron los microorganismos en caldo LB a 37ºC con una agitación orbital de 150 a 250 rpm hasta alcanzar la fase logarítmica. Las células se recogieron mediante centrifugación a 5000 y 8000 rpm a 4ºC durante 10-20 minutos y después se mezclaron con las formulaciones que muestran buenas características de protección del microorganismo, de modo que la concentración celular estaba entre 10^{8} y 10^{9} células ml^{-1}. Para cada matraz de tipo 10R se dispensaron 2 ml. El ciclo de liofilización comprendió una congelación profunda del material, un secado principal manteniendo cada producto entre -30ºC y -39ºC por espacio de 8 a 12 horas y un secado secundario a temperaturas entre 18ºC y 25ºC durante no más de 12 horas. La pérdida de viabilidad se definió como la diferencia logarítmica de las UFC/ml antes y después de la liofilización o antes y después de la conservación del material liofilizado, que siempre se disuelve en una solución al 1,33% de bicarbonato sódico.

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Formulación L+E+S

Las cepas BLR01, JCG03 y ESP05 se procesaron mediante el proceso de liofilización descrito anteriormente en una formulación del tipo L (5,0%), e (2,0%) y S (2,0%). La congelación se realizó a -60ºC. Durante el secado principal, la temperatura del producto se mantuvo a -32ºC durante 10 horas y en el secado secundario la temperatura se mantuvo a 22ºC durante 12 horas. La disolución del material liofilizado en una solución de 1,33% de bicarbonato sódico fue instantánea. La pérdida de viabilidad calculada inmediatamente después de la disolución con respecto a la concentración de las células vivas antes de la liofilización dio como resultado 0,30, 0,43 y 0,60 órdenes logarítmicos para BRL01, JCG03 y ESP05, respectivamente.

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Comparación de las formulaciones L+P+S y L+E+S con la de leche desgrasada+peptona+sorbitol.

La cepa JCG03 se liofilizó usando dos formulaciones: el tipo L (6,0%), P (2,0%) y S (2,0%) y el otro tipo L (5,5%), E (1,8%) y S (1,6%). Esta cepa también se liofilizó en una formulación de 6,0% de leche desgrasada, 2,0% de peptona y 2,0% de sorbitol en forma de una formulación de comparación. La congelación se realizó a -60ºC. Durante el secado principal, la temperatura del producto se mantuvo a -33ºC durante 12 horas y en el secado secundario la temperatura se mantuvo a 20ºC durante 14 horas. La disolución del material liofilizado en una solución de 1,33% de bicarbonato sódico fue instantánea cuando el proceso de liofilización tuvo lugar en las formulaciones del tipo L+P+S o L+E+S y ligeramente más lenta cuando se liofilizó en la formulación de comparación. La pérdida de viabilidad calculada inmediatamente después de la disolución con respecto a la concentración de células vivas antes de la liofilización resultó 0,48, 0,52 y 0,55 órdenes logarítmicos para L+P+S, L+E+S y las formulaciones de comparación, respectivamente, significativamente similares.

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Efectos de la humedad y el oxígeno

La cepa JCG03 liofilizada en las tres formulaciones mencionadas en el párrafo anterior se expuso inmediatamente después de ser liofilizada a la acción simultánea de la humedad y el oxígeno. Esto se consiguió confinando las muestras durante 3 días a 25ºC en una atmósfera en desecadores de vidrio estériles, bajo una humedad relativa del 11% (creada mediante una solución saturada de cloruro de litio). La pérdida de viabilidad en L+P+S, L+E+S y las formulaciones de comparación resultaron 1,61, 1,10 y 3,43 órdenes logarítmicos, respectivamente, lo que muestra que las formulaciones objeto de esta invención garantizan una protección mayor frente a la humedad y el oxígeno que la formulación de comparación.

Efecto de la temperatura de conservación.

Las cepas TLP01, JCG01 y ESP05 se liofilizaron en una formulación del tipo L (5,5%), E (2,0%) y S (2,0%). La congelación se realizó a -58ºC. Durante el secado principal, la temperatura del producto se mantuvo a -30ºC durante 12 horas y en el secado secundario la temperatura se mantuvo a 20ºC durante 14 horas. La disolución en una solución de 1,33% de bicarbonato sódico fue instantánea. La pérdida de viabilidad calculada inmediatamente después de la disolución con respecto a la concentración de células vivas antes de la liofilización dio como resultado 0,43, 0,55 y 0,44 órdenes logarítmicos en TLP01, JCG01 y ESP05, respectivamente. El material liofilizado se conservó 1 año bien a 8ºC o a -20ºC. La Tabla 3 muestra los resultados de pérdida de viabilidad obtenidos.

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TABLA 3 Pérdida de viabilidad (1 año de conservación)

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4

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Ejemplo 8

Cepas de la presente invención y sus características

Las cepas de la presente invención se han depositado en la Belgium Coordinated Collection of Microorganisms (BCCM). Laboratorium voor Microbiologie-Bacterienverzameling (LMG):

Vibrio cholerae JCG01 (LMG P-22149)

Vibrio cholerae JCG02 (LMG P-22150)

Vibrio cholerae JCG03 (LMG P-22151)

Vibrio cholerae KMD01 (LMG P-22153)

Vibrio cholerae KMD02 (LMG P-22154)

Vibrio cholerae KMD03 (LMG P-22155)

Vibrio cholerae JCG04 (LMG P-22152)

Vibrio cholerae ESP01 (LMG P-22156)

Vibrio cholerae ESP02 (LMG P-22157)

Vibrio cholerae ESP03 (LMG P-22158)

Vibrio cholerae RAF01 (LMG P-22159)

Vibrio cholerae TLP01 (LMG P-22160)

Vibrio cholerae TLP02 (LMG P-22161) y

Vibrio cholerae TLP03 (LMG P-22162)

\newpage

Se describen en la Tabla 4.

TABLA 4 Cepas vacunales de la presente invención

5

6

7

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Microfotografía del fago VGJ\phi. Aumento x 32.000. El fago VGJ\phi se purificó de los sobrenadantes de Vibrio cholerae 569B infectado.

Figura 2. Diagrama del genoma del fago híbrido HybP\phi-kn, que tiene una elevada potencialidad para la transmisión de la toxina del cólera.

Figura 3. Esquema de la manipulación genética usada para suprimir el gen mshA de los candidatos a vacuna contra V. cholerae y el vector suicida usado durante el procedimiento.

Figura 4. Supervivencia de ratones lactantes inoculados con una cepa atenuada y su derivada infectada con HybP\phi-kn que revertió su virulencia.

Ventajas

La presente invención nos proporciona una metodología para proteger a los candidatos a vacuna contra el cólera con microorganismos vivos a partir de la readquisición de genes de la toxina del cólera y otras toxinas del bacteriófago CTX\phi mediada por el fago VGJ\phi y, por tanto, de la conversión a virulencia mediante este mecanismo.

Igualmente nos proporciona la información necesaria para garantizar que los candidatos a vacuna contra el cólera con microorganismos vivos no diseminarán CTX\phi, en el caso de que estos candidatos a vacuna readquieran CTX\phi, mediante una transducción especializada con el fago VGJ\phi.

La presente invención nos proporciona la aplicación de mutantes de MSHA como candidatos a vacuna contra el cólera con microorganismos vivos, que exhiben un incremento en su seguridad ambiental debido a la resistencia a la infección con CTX\phi mediada por VGJ\phi.

Esta invención nos proporciona una nueva característica a tener en mente durante el diseño y la construcción de candidatos a vacuna contra el cólera con microorganismos vivos para mejorar su seguridad ambiental, es decir que tales vacunas no pueden extender los genes de CTX\phi mediada por VGJ\phi, en el caso de readquisición.

La característica anterior podría aplicarse a los candidatos a vacuna contra el cólera con microorganismos vivos ya producidos, que han demostrado un nivel aceptable de reactogenicidad en estudios con voluntarios para reducir su potencial impacto ambiental.

Esta invención también proporciona formulaciones para preservar mediante liofilización todos los candidatos a vacuna contra el cólera con microorganismos vivos mencionados en lo que antecede y también mejorar sus capacidades para tolerar el resto de oxígeno y humedad en el contenedor.

Estas formulaciones también garantizan la instantánea reconstitución de polvo del candidato a vacuna liofilizada contra el cólera con microorganismos vivos en tampón de bicarbonato sódico, lo que facilita la manipulación, protege las vacunas durante este proceso y mejora las características organolépticas, específicamente relacionadas con el aspecto visual de los comprimidos liofilizados y los productos reconstituidos.

Una de las formulaciones proporcionadas en el presente documento para conservación y liofilización de los candidatos a vacuna contra el cólera con microorganismos vivos carece de los componentes bovinos normalmente añadidos a muchas formulaciones para liofilizar vacunas humanas.

<110> Centro Nacional de Investigaciones Científicas

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<120> Cepas atenuadas de Vibrio cholerae con mejores características de seguridad biológica en forma liofilizada para vacunación oral

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<130> VGJphi

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<141> 2004-02-20

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<150> CU 2003-0039

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<151> 2003-02-20

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<150> CU 2003-0084

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<151> 2003-04-17

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<160> 1

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<170> Patente versión 3.1

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<210> 1

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<211> 7542

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<212> ADN

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<213> Fago filamentoso de Vibrio cholerae

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<220>

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<221> ORF359 CDS

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<222> (1)..(1077)

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<223> Similar a la proteica de replicación pII de otros fagos filamentosos

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<220>

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<221> ORF 112 CDS

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<222> (1085)..(1420)

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<223> Proteína hipotética

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<220>

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<221> ORF81 CDS

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<222> (1433)..(1675)

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<223> Proteína hipotética

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<220>

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<221> ORF44 CDS

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<222> (1690)..(1821)

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<223> Similar a la proteína principal de la cápside, pVIII, de otros fagos filamentosos

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<220>

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<221> ORF29 CDS

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<222> (1839)..(1925)

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<223> Proteína hipotética

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<220>

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<221> ORF493 CDS

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<222> (1954)..(3432)

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<223> Similar a una proteína menor de la cápside, pIII, de otros fagos filamentosos

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<220>

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<221> ORF80 CDS

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<222> (3510)..(3749)

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<223> Proteína hipotética

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<220>

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<221> ORF384 CDS

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<222> (3755)..(4906)

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<223> Similar a una proteína del ensamblaje. pI, de otros fagos filamentosos

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<220>

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<221> ORF104 CDS

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<222> (5232)..(5543)

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<223> Similar a una proteína del ensamblaje, pI, de otros fagos filamentosos

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<220>

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<221> ORF67 CDS

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<222> (7328)..(7528)

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<223> Proteína hipotética

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<220>

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<221> ORF 136 CDS

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<222> (6105)..(6112)

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<223> Cadena complementaria

\hskip1cm

Regulador putativo de la transcripción I

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<220>

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<221> ORF154 CDS

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<222> (6439)..(6900)

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<223> Cadena complementaria

\hskip1cm

Regulador putativo de la transcripción I

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<220>

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<221> ORF58 CDS

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<222> (6439)..(6900)

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<223> Cadena complementaria Proteína hipotética

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 1

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8

9

10

11

12

13

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LISTADO DE SECUENCIAS

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<110> Centro Nacional de Investigaciones Científicas

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<120> Cepas atenuadas de vibrio cholerae con mejores características de seguridad biológica en forma liofilizada para la vacunación oral

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> VGJphi

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\vskip0.400000\baselineskip

<141> 2004-02-20

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> CU 2003-0039

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-02-20

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> CU 2003-0084

\vskip0.400000\baselineskip

<151> 2003-04-17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<160> 1

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<170> Patente versión 3.1

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<210> 1

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<211> 7542

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<212> ADN

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<213> Fago filamentoso de Vibrio cholerae

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<220>

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<221> ORF359 CDS

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<222> (1)..(1077)

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<223> Similar a la proteína de replicación, pII, de otros fagos filamentosos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> ORF 112 CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1085)..(1420)

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<223> Proteína hipotética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> ORF81 CDS

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<222> (1433)..(1675)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína hipotética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> ORF44 CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1690)..(1821)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Similar a la proteína principal de la cápside, pVIII, de otros fagos filamentosos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> ORF29 CDS

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<222> (1839)..(1925)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína hipotética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> ORF493 CDS

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<222> (1954)..(3432)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Similar a una proteína menor de la cápside, pIII, de otros fagos filamentosos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> ORF80 CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3510)..(3749)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína hipotética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> ORF384 CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3755)..(4906)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Similar a una proteína del ensamblaje, pI, de otros fagos filamentosos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> ORF104 CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5232)..(5543)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Similar a una proteína del ensamblaje, pI, de otros fagos filamentosos

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> ORF67 CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7328)..(7528)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Proteína hipotética

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> ORF136 CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6105)..(6112)

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<223> Cadena complementaria

\hskip1cm

Regulador putativo de la transcripción I

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> ORF154 CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6439)..(6900)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Cadena complementaria

\hskip1cm

Regulador putativo de la transcripción I

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> ORF58 GDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6439)..(6900)

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<223> Cadena complementaria Proteína hipotética

\vskip1.000000\baselineskip

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<400> 1

14

15

16

17

18

19

Claims (7)

1. Cepas vivas atenuadas de Vibrio cholerae caracterizadas porque

- carecen de secuencias de la secuencia de ADN de un bacteriófago filamentoso aislado de Vibrio cholerae O139, denominado fago VGJ\phi (SEC ID Nº 1) en sus genomas para alterar la formación del fago recombinante híbrido VGJ\phi::CTX\phi y prevenir la posterior diseminación de los genes de la toxina del cólera de CTX\phi a través de este nuevo fago, y

- tienen al menos una mutación que comprende la inactivación de un gen esencial para la biogénesis de MSHA, el receptor del fago VGJ\phi, o una deleción introducida en el gen mshA que codifica la subunidad estructural de la fimbria MSHA, con el fin de prevenir la reversión a la virulencia de dichas cepas por la infección con el fago recombinante híbrido VGJ\phi::CTX\phi;

2. Cepas vivas atenuadas de Vibrio cholerae de acuerdo con la reivindicación 1, en las que dicha mutación es una mutación espontánea.

3. Cepas vivas atenuadas de Vibrio cholerae de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, procedentes de una o más de las cepas siguientes de vibrio cholerae (serogrupo O1 o 139, biotipo El Tor y serotipo Ogawa o Inaba), depositadas en la Belgium Coordinated Collection of Microorganisms (BCCM). Laboratorium voor Microbiologie-Bacterienverzameling (LMG):

\quad

Vibrio cholerae JCG01 (LMG P-22149), serogrupo 01, biotipo El Tor, serotipo Ogawa,

\quad

Vibrio cholerae JCG02 (LMG P-22150), serogrupo 01, biotipo El Tor, serotipo Ogawa,

\quad

Vibrio cholerae JCG03 (LMG P-22151), serogrupo 01, biotipo El Tor, serotipo Ogawa,

\quad

Vibrio cholerae KMD01 (LMG P-22153), serogrupo 01, biotipo El Tor, serotipo Ogawa,

\quad

Vibrio cholerae KMD02 (LMG P-22154), serogrupo 01, biotipo El Tor, serotipo Ogawa,

\quad

Vibrio cholerae KMD03 (LMG P-22155), serogrupo 01, biotipo El Tor, serotipo Ogawa,

\quad

Vibrio cholerae JCG04 (LMG P-22152), serogrupo 01, biotipo El Tor, serotipo Ogawa,

\quad

Vibrio cholerae ESP01 (LMG P-22156), serogrupo 01, biotipo El Tor, serotipo Ogawa,

\quad

Vibrio cholerae ESP02 (LMG P-22157), serogrupo 01, biotipo El Tor, serotipo Ogawa,

\quad

Vibrio cholerae ESP03 (LMG P-22158), serogrupo 01, biotipo El Tor, serotipo Inaba,

\quad

Vibrio cholerae RAF01 (LMG P-22159), serogrupo 01, biotipo El Tor, serotipo Inaba,

\quad

Vibrio cholerae TLP01 (LMG P-22160), serogrupo 0139,

\quad

Vibrio cholerae TLP02 (LMG P-22161), serogrupo 0139,

\quad

Vibrio cholerae TLP03 (LMG P-22162), serogrupo 0139.

4. Formulaciones liofilizadas que comprenden cepas vivas atenuadas de Vibrio cholerae de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 y una combinación de lactosa, sorbitol y peptona, o lactosa, sorbitol y extracto de levadura, a una concentración total no superior al 10%.

5. Formulaciones liofilizadas de acuerdo con la reivindicación 4, que comprenden cepas vivas atenuadas de Vibrio cholerae y una combinación de lactosa 6,0%, peptona 2,0% y sorbitol 2,0% o lactosa 5,0%, extracto de levadura 2,0% y sorbitol 2.0%.

6. Uso de las cepas vivas atenuadas de Vibrio cholerae de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en la fabricación de vacunas vivas atenuadas contra el cólera orales con mejor seguridad ambiental.

7. Uso de Formulaciones liofilizadas de acuerdo con las reivindicaciones 4 ó 5, en la fabricación de vacunas vivas atenuadas contra el cólera orales con mejor seguridad ambiental.