JP2010180227A - 無力化した全菌体免疫原性細菌組成物 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】病原菌に起因する疾患による感染の影響を受けやすい対象に、溶菌欠損バクテリオファージの感染により無力化された病原菌を含む全菌体細菌組成物を投与する段階を含み、該投与は宿主において病原菌に対する免疫応答を誘発するのに効果的な量で行い、病原菌に対する免疫応答を誘発する。
【選択図】なし
Description
本発明は、生きた感染性病原体に類似しているが感染性のない、全菌体不活化免疫原性細菌組成物を産生するための方法および組成物に関する。
有用な抗生物質に対する細菌抵抗性、海外旅行、および新たに同定される感染症が驚くほど増加し、新しい有効なワクチンの必要性が浮き彫りになっている。不活化全菌体ワクチンは、これらの公衆衛生の必要性を満たすために現れたアプローチの重要な要素である。全菌体ワクチンの投与は、細菌感染に対する最もよく研究されたワクチン接種方法の1つである。全菌体ワクチンの特有の利点には、多数の抗原(防御抗原であるが未だ未同定の抗原も含まれる)の提示、非経口以外で与えられた場合に副作用の可能性が最小であること、毒性の可能性がないこと、およびアジュバント様の特性が含まれる。動物モデルおよびヒトでの研究から、全菌体ワクチンを経口的または非経口的に投与した場合の免疫原性が示された。呼吸器、腸内、および全身の細菌感染に対する効果的な防御も示された。不活化全菌体百日咳ワクチンのみが一般市民を免疫するために使用されているが、他の全菌体ワクチンも世界的使用の可能性を有する。
弱毒生ワクチンは、病気を引き起こす(「野生型」)細菌を実験室で改変することにより作製される。米国で入手可能な弱毒生ワクチンには、生ウイルスおよび生菌が含まれる。これらの野生型ウイルスまたは細菌は、通常は繰り返し培養することにより、実験室内で弱毒化されるかまたは弱められる。免疫応答を起こすためには、弱毒化生ワクチンは、ワクチン接種された人の中で複製(増殖)しなければならない。比較的少量のウイルスまたは細菌が与えられ、それが体内で複製し、免疫応答を刺激するほど大きな量に増殖する。バイアル中の生きた生物体を損なうもの(例えば、熱、光)または体内の生物体の複製を妨げるもの(循環する抗体)はどれも、ワクチンを無効にし得る。弱毒化生ワクチンは複製するが、天然の(「野生型」)生物体で起こり得るような疾患を引き起こすことはない。弱毒化生ワクチンが「疾患」を引き起こす場合、それは通常、本来の疾患よりもはるかに軽度であり、副作用として見なされる。弱毒化生ワクチンに対する免疫応答は、自然の感染によっておこる免疫応答と実質的に同一である。免疫系は、弱められたワクチン細菌による感染と野生型細菌による感染との区別をしない。弱毒化生ワクチンは、経口投与される場合以外は、一般に1回投与で有効である。
不活化ワクチンは、全ウイルスもしくは全菌体、またはそのどちらか一方の画分で構成され得る。分画ワクチンは、タンパク質に基づくかまたは多糖体に基づく。タンパク質に基づくワクチンには、トキソイド(不活化細菌毒素)およびサブユニット産物が含まれる。多糖体に基づくほとんどのワクチンは、細菌の純粋な細胞壁多糖体からなる。コンジュゲート多糖体ワクチンは、多糖体をタンパク質に化学的に結合させたワクチンである。この結合により、多糖体はさらに強力なワクチンになる。これらのワクチンは、細菌を培地中で培養した後に、これを熱および/または化学薬品(通常はホルマリン)で不活化することにより、作製される。分画ワクチンの場合には、生物体をさらに処理し、ワクチンに含めるべきそれらの成分(例えば、肺炎球菌の多糖体莢膜)のみを精製する。
本発明は無力化した全菌体細菌を作製するための方法および組成物を提供するが、この細菌は細菌宿主細胞を溶解する能力に欠陥のあるバクテリオファージを用いて作製される。バクテリオファージは、細菌に感染する非常に特異的なウイルスである。大腸菌のような細菌がT4等の溶菌性ファージに感染した後、高分子合成すべての顕著な再編成が起こる。宿主細菌のRNAポリメラーゼ(RNAP)が前初期(IE)遺伝子として知られるファージゲノムの開始部位に結合し、それらを転写する。いくつかのIE遺伝子産物が修飾塩基ヒドロキシルメチルシトシン(HMC)を欠く宿主(細菌)DNAを分解すると同時に、別の産物ADPリボースが細菌のRNAPのαサブユニットに結合し、細菌細胞のプロモーターを認識できないようにする。これにより、宿主遺伝子の転写が停止される。これらの現象は、感染後の最初の3〜5分以内に起こる。
「バクテリオファージ」および「ファージ」という用語は本明細書で互換的に用いられるが、細菌に対する特異的親和性を有し細菌に感染する任意の様々なウイルスを意味する。したがってこれらには、大腸菌に感染する大腸菌ファージ(例えば、λファージ、ならびにT偶数ファージ、T2、T4、およびT6)が含まれる。ファージは一般に、感染時に細菌内に注入される遺伝物質DNAまたはRNAを封入するタンパク質外被またはキャプシドからなる。病原性ファージの場合には、宿主DNA、RNA、およびタンパク質の全合成が停止し、ファージゲノムを用いて、宿主の転写および翻訳機構を用いたファージの核酸およびタンパク質の合成が導かれる。次にこれらのファージ成分が自己集合し、新しいファージ粒子を形成する。ファージリゾチームの合成により細菌細胞壁の破壊が起こり、典型的に100〜200個のファージ子孫が放出される。λ等の溶原性ファージもまた、細胞感染時にこの溶菌化サイクルを示すが、より頻繁に、ファージが細菌宿主DNAに組み込まれプロファージとして存続する溶原性を誘導する。一般に、本発明の関心対象のバクテリオファージは、溶原性ファージではなく溶菌性ファージである。
次には本発明のワクチンに有用となる無力化細菌の作製に有用なLys欠損ファージは、任意の野生型バクテリオファージ、好ましくは溶菌性ファージから作製され得る。したがって、本発明の方法および組成物は、任意の種々の細菌に特異的である任意の種々のLys欠損バクテリオファージの開発に応用でき、したがって幅広い種類の細菌感染の治療に有用である。本発明を用いて任意の種々の全菌体細菌ワクチンを作製することができ、そのワクチンが予防的または治療的に、および単独または他の治療法(補助的または独立型)と組み合わせて細菌感染に使用され得ることを意図する。
1. 以下を含むがそれらに限定されない、腸内細菌科の臨床的に重要な全メンバー:
a. 大腸菌(ATCCファージ#23723-B2)を特に関心対象とする、エシェリキア属の臨床的に重要な全菌株;
b. 肺炎桿菌(ATCCファージ#23356-B1)を特に関心対象とする、クレブシエラ属の臨床的に重要な全菌株;
c. 志賀赤痢菌(ATCCファージ#11456a-B1)を特に関心対象とする、シゲラ属の臨床的に重要な全菌株;
d. S. アボルタスエクイ(abortus-equi)(ATCCファージ#9842-B1)、チフス菌(ATCCファージ#19937-B1)、ネズミチフス菌(ATCCファージ#19585-B1)、S. ニューポート(newport)(ATCCファージ#27869-B1)、パラチフスA菌(ATCCファージ#12176-B1)、パラチフスB菌(ATCCファージ#19940-B1)、S. ポツダム(potsdam)(ATCCファージ#25957-B2)、S. ポルラム(pollurum)(ATCCファージ#19945-B1)を含む、サルモネラ属の臨床的に重要な全菌株;
e. 最も顕著にはS. マルセッセンス(ATCCファージ#14764-B1)である、セラチア属の臨床的に重要な全菌株;
f. 最も顕著にはペスト菌(ATCCファージ#11953-B1)である、エルシニア属の臨床的に重要な全菌株;
g. 最も顕著にはE. クロアカ(ATCCファージ#23355-B1)である、エンテロバクター属の臨床的に重要な全菌株;
2. 最も顕著にはE. フェカリス(ATCCファージ#19948-B1)およびE. フェシウム(ATCCファージ#19953-B1)である、臨床的に重要な全エンテロコッカス属;
3. 最も顕著にはインフルエンザ菌(例示的なファージは、世界保健機構(WHO)または公的に入手可能とする他の研究所から入手できる)である、ヘモフィルス属の臨床的に重要な全菌株;
4. 最も顕著には結核菌(ATCCファージ#25618-B1)、M. アビウム-イントラセルラー、M. ボビス、およびライ菌(例示的なファージは、国立公衆衛生環境研究所、オランダ、ビルトーベン経由でWHOから市販されている)ある、臨床的に重要な全マイコバクテリア属;
5. 淋病菌(Nisseria gonorrhoeae)および 髄膜炎菌(N. meningitidis)(例示的なファージは、WHOまたは他の供給源から公的に入手可能である);
6. 緑膿菌(ATCCファージ#14203-B1)を特に関心対象とする、臨床的に重要な全シュードモナス属;
7. 黄色ブドウ球菌(ATCCファージ#27690-B1)、表皮ブドウ球菌(例示的なファージは、ロンドンのコリンデール研究所(Colindale Institute)経由でWHOから公的に入手可能である)を特に関心対象とする、臨床的に重要な全スタフィロコッカス属;
8. 肺炎連鎖球菌(例示的なファージは、WHOまたは他の供給源から公的に入手可能である)を特に関心対象とする、臨床的に重要な全ストレプトコッカス属;および
9. コレラ菌(ATCCファージ#14100-B1)。
多くの種類のバクテリオファージによる宿主細菌細胞の溶菌は、少なくとも2つの異なるタンパク質セットに依存している(Youngら、Microbiol. Rev. 56, 430 (1992))。細菌細胞壁の分解は、リシンによって達成される。最もよく研究された例は、T4のe遺伝子産物であるリゾチーム(Tsugitaら、J. Biol. Chem. 243, 391 (1968))およびλのRタンパク質であるトランスグリコシラーゼ(Garrettら、Mol. Gen. Genet. 182, 326 (1981))である。多くのバクテリオファージのリシン遺伝子は、この10年に同定され特徴づけられた。これらには、バクテリオファージT7のリシン(Inouyeら、Biol. Chem. 248, 7247 (1973))、ネズミチフス菌ファージP22由来のgp 19(Rennellら、Virol. 143, 280 (1985))、グラム陽性菌ラクトコッカス・ラクチスおよび枯草菌の2つのファージ由来のphi 29 gp 15(Garveyら、Nucleic Acids Res. 14, 10001 (1986))、肺炎球菌バクテリオファージCp-1(Garcia ら、J. Virol. 61, 2573 (1987))、シュードモナスファージf6(Caldenteyら、Biochim. Biophys. Acta 1159, 44 (1992))、バクテリオファージP2のK遺伝子(Ziermannら、J. Bacteriol. 176, 4974 (1994))、バクテリオファージP1の遺伝子17(Schmidtら、Bacteriol. 178, 1099 (1996))、リステリア菌バクテリオファージリシンPly 511およびPly 518(Gaengら、Appl. Environ. Microbiol. 66, 2951 (2000))、および乳酸桿菌属に感染する多数のファージ(Shearmanら、Appl. Environ. Microbiol. 60, 3063 (1994); Henrichら、J. Bacteriol. 177, 723 (1995))が含まれる。
リシン欠損ファージは、本発明による溶菌欠損ファージの提供に適合している任意の様々な方法によって作製され得る。好ましくはLys欠損ファージは、バクテリオファージのゲノムを改変し、バクテリオファージが野生型リシン(Lys)タンパク質を欠損するようにするか、またはバクテリオファージが誘導性のプロモーターに機能的に結合された機能的なリシンを含むようにすることによって、作製される。または、バクテリオファージはリシンのレベルが低く、したがって溶菌速度が遅く、細菌に感染し細菌宿主の複製を阻害するが溶菌速度が遅いファージをスクリーニングすることにより選択することができ、例えばバクテリオファージは細菌宿主の静菌剤として働くが、ファージのリシン系が欠損していない野生型ファージと関連する速度またはレベルで細菌宿主細胞を溶菌しない。
他の態様において、リシン遺伝子に所望の欠陥を有するLys欠損ファージは、マーカーレスキュー技法を用いて作製される。マーカーレスキューの技法はこれまで、ファージの変異をマッピングするため、およびプラスミドにクローニングされたファージ遺伝子から人工的に作製された変異をファージゲノムに移行させるために、頻繁に用いられてきた(Volkerら、Mol. Gen. Genet. 177, 447 (1980))。この技法を使用する典型的な例は、T4ファージの組み立ておよび成熟に関与する遺伝子を同定する用途である。具体的には、T4ファージの組み立ておよび成熟遺伝子20〜22を含む制限断片をプラスミドにクローニングし、突然変異を誘発し、次に、T4 20/21 am(アンバー)二重変異を有するプラスミドを保有する大腸菌の感染により、変異をファージゲノムに組換え戻す(Volkerら、前記、1980)。そのプラスミドと組換えを起こしたファージ子孫は、組換えファージの選択を可能にするsu-宿主(アンバーサプレッサーを欠いている)上にプレーティングすることによって選択された。次に、これらのam+ファージは、遺伝子20および21の所望の温度感受性変異について非選択関にスクリーニングされた。
Lys欠損ファージはその宿主細菌内で複製し組み立てることができるが、本質的に宿主を溶菌し子孫ファージを効率的に放出することができない。治療用のLys欠損ファージを作製するためには、改変されたファージを細菌宿主から放出することが必要である。Lys欠損ファージがリシン遺伝子が誘導性プロモーターの下流にあるファージである場合には、細菌宿主の溶菌は、ファージを誘導性プロモーターを活性化する薬剤に接触させ、それによってリシンの産生を誘導し結果として宿主細菌細胞の溶菌を誘導することにより、達成され得る。
本発明の溶菌欠損バクテリオファージはまた、欠陥のあるリシン遺伝子を有するファージだけでなく、Lys遺伝子以外の欠陥またはLys遺伝子に加えたさらなる欠陥により溶菌機構に欠陥があるファージも包含する。例えば、リシン遺伝子にのみに欠陥があるのではなく、リシン遺伝子およびホリン遺伝子の両方を欠失または改変し、ファージ内および溶菌系において非機能的にすることが可能である。そのような欠陥ファージは、細菌宿主内のヘルパープラスミド上で欠損したまたは欠陥のある溶菌系成分を発現することにより、産生され得る。Martinら(J. Bacteriol. 180, 210 (1998))によって、肺炎球菌ファージCp-1のホリンおよびリシンの両方を大腸菌内で同時に発現させることにより、細胞の溶菌が起こることが示された。上記と同様の戦略を用いて、産生段階中の組換えによる野生型ファージの産生を回避することが可能である。
任意の種々の病原菌を用いて、本発明に従って無力化全菌体細菌ワクチンを作製することができる。例示的な病原菌は、対応するバクテリオファージ(既知である場合には)とともに上記した病原体である。
細菌によって発現される抗原性分子に対する抗体を産生するためには、その細菌は異種タンパク質を発現させるようにまたは内因性タンパク質を過剰発現させるように遺伝子操作されてよく、種々の宿主動物が、溶菌欠損ファージの感染により無力化された細菌を含む無力化全菌体免疫原性組成物の注入によって免疫され得る。
本発明の無力化全菌体免疫原性細菌組成物に対して作製された抗体は、診断上の免疫測定、受動免疫療法、および抗イディオタイプ抗体の作製において有望な用途を有する。1つの態様において、抗体を作製するために用いられる組成物は、異種タンパク質を発現するようにまたは内因性タンパク質を過剰発現するように遺伝子操作された細菌を含む。
本発明のワクチンは、任意の適切な方法で製剤化され得る。一般に、本発明のワクチンは、経口、経鼻、経鼻咽頭、非経口、経腸、経胃、局所、経皮、皮下、筋肉内に、錠剤、固形物、粉末、液体、エアロゾル形態で、局所的または全身的に、賦形剤を添加するかまたは添加せずに投与され得る。非経口で投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者に周知または明白であると考えられるが、Remigton’s Pharmaceutical Science, 第15版、Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980)等の出版物により詳細に記載されている。
両端に130個のさらなるヌクレオチドを伴うバクテリオファージT4のリゾチーム(e)遺伝子のヌクレオチド配列が、Owenら(J. Mol. Biol. 165, 229, 1983)によって報告された。e遺伝子の上流および下流の100ヌクレオチドに相当するDNAをPCRによって単離し、アンピシリン耐性プラスミドpUC18に、唯一の制限部位(XbaIおよびPst I)を用いてその2つの部位の間にクローニングする(Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.)。野生型タンパク質よりも蛍光が40倍明るい緑色蛍光タンパク質(GFP)の変異型の遺伝子を含むDNAカセットを、gfpを保有するプラスミドpmut2からXba I-Pst I断片として作製し(Cormack, B.P.、Valdivia, R.H.、およびFalkow, S、Gene 173, 33, 1996)、pUC18中のリゾチーム遺伝子の上流と下流配列の間に挿入する(pGG8)。このカセット中のGFPを発現するためのプロモーターおよびターミネーターは、それぞれ5'末端でT4ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子frdの初期プロモーター(Rosenberg, M.およびCourt, D、 Ann. Rev. Genet. 13, 319, 1979)に、3'末端でT4の遺伝子44と45の間に位置する転写ターミネーター(Bacteriophage T4、Mathews、Kutter、Mosig、およびBerget編、American Society for Microbiology, Washington, DC, 1983, 299ページのSpicerおよびKonigsberg)に置換する。frdプロモーターは、T4に感染した細菌細胞において最初に発現される、T4プロモーターの前初期クラスのものである。このプロモーターからの転写には、宿主のRNAポリメラーゼが用いられる。
肺炎連鎖球菌ファージCp-1の2遺伝子溶菌系がクローニングされ、大腸菌で発現された(Martinetら、J. Bacteriol. 180, 210 (1998))。鋳型としてCp-1 DNAを用いたPCRにより、cpl1(リシン)遺伝子またはカセットcph1-cpl1(ホリン-リシン)遺伝子を含むDNA断片が作製されるが、遺伝子はそれぞれ自身のリボソーム結合部位を保持している。プラスミドpNM185(Mermodら、J. Bacteriol. 167, 447 (1986))にクローニングするため、適切なオリゴヌクレオチドを使用し、Sac II およびSac I制限部位をPCR断片の5'および3'末端に作製する。cpl1遺伝子またはcph1およびcpl1遺伝子を含むカセットを、TOLプラスミドのメタ経路オペロンの正に制御されるプロモーター(Pm)の制御下で発現させる。Pmからの遺伝子の転写は、3-メチル安息香酸等のエフェクター分子が存在する場合にのみ、xylS調節遺伝子の産物によって特異的に誘導される。cpl1またはcph1-cpl1カセットを保有するpNM185プラスミドによる大腸菌HB101細胞の形質転換を、RbCl法(Sambrook, J.ら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版、Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989))により行う。形質転換した大腸菌HB101細胞をLBブロスまたは他の適切な培地中で培養し、Lys欠損ファージを接種する。適切な時点で、2 mM 3-メチル安息香酸の添加によりpNM185プラスミド上のcpl1またはcph1-cpl1カセットの発現を誘導し、Lys欠損ファージ子孫の放出を起こす。
材料および方法
タグDNAポリメラーゼ、dNTP、仔ウシ腸ホスファターゼ、制限酵素、プライマー、およびT4 DNAリガーゼは、Bangalore Genei Pvt. Ltd(BGPL)、バンガロールから入手した。pRSETベクターは、Invitrogen Ltd, USAから入手した。
T4のリシン遺伝子のPCR増幅は、以下のプライマーを使用しBGPLから入手した野生型T4ファージを用いて行った:
リシン遺伝子をレポーター遺伝子で妨げるため、GFP遺伝子を選択した。まず、BGPLのGFP教育キット中のpUC-GFPプラスミドから、以下のプライマーを用いてGFP遺伝子を増幅した:
次に、pRSETA-GFPクローンのGFP断片を、EcoR1で部分消化したpGMB011(上記で作製したpRSETB-T4Lベクター)にサブクローニングした。形質転換体をGMB5/GMB6を用いたPCRによりスクリーニングし、続いてhisタグ付加リシン-GFP融合タンパク質の少量発現によって確認した。上記クローンからHisタグ付加リシン-GFP融合タンパク質が発現され(42 KDa)(図2、レーン3および4を参照のこと)、それはUV下で蛍光を示し、このことからGFP遺伝子がこの構築物内で完全な形であることが示された。
プラスミドpGMB021を含むDH5α細胞に野生型T4ファージを2.5 m.o.i.で感染させた。この高い感染効率により、全細胞が少なくとも1個のファージに感染することが確実になる。40分間インキュベートした後、クロロホルム(1%)を添加し、溶菌液を遠心分離した。上清を分離し、残ったクロロホルムを蒸発させるために室温で30分間通気した。
6〜8週齡の雄および雌のスイスアルビノマウスに、108 cfuで100%の死亡率をもたらす病原大腸菌株を腹腔内に注射した。マウスはすべて48時間以内に死亡した。
*観察された死は、体内の損なわれた細菌細胞に由来したと考えられるエンドトキシンの影響である可能性がある。これは、免疫に少数の無力化細胞を使用することおよび最初の免疫から2週間後に追加投与を繰り返すことによって、回避することが可能である。さらに、投与前に無力化細菌細胞を洗浄することによっても、この問題を排除することができる。
異なる群において生存したマウス中の抗体の存在を調べるため、これらのマウスを曝露投与から7日後に屠殺し、血清を回収した。血清は、負の対照である暴露しない賦形剤対照群マウスからも回収した。大腸菌443細胞に対する反応性について、血清試料を調べた。マイクロプレートウェルにコーティングした捕獲のための大腸菌細胞調製品(株# MTCC443)およびレポーターとしてのアルカリホスファターゼに結合した抗マウスIgGを用いた標準のELISA型式により、血清中の抗大腸菌抗体の存在が確認された。使用した6匹の負の対照血清のOD値の平均値に対して、マウスは抗大腸菌抗体について「陽性」としてスコアリングされた。
Claims (15)
- 病原菌に起因する疾患による感染の影響を受けやすい対象に無力化した全菌体細菌組成物を投与する段階を含み、組成物は溶菌欠損バクテリオファージの感染により無力化された病原菌を含み、該投与は宿主において病原菌に対する免疫応答を誘発するのに効果的な量で行われる、
病原菌に対する免疫応答を誘発する方法。 - 病原菌が、マイコバクテリア属、スタフィロコッカス属、ビブリオ属、エンテロバクター属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、ヘモフィルス属、ナイセリア属、シュードモナス属、シゲラ属、セラチア属、サルモネラ属、ストレプトコッカス属、クレブシエラ属、およびエルシニア属からなる群より選択される属のものである、請求項1記載の方法。
- 溶菌欠損バクテリオファージがLys欠損バクテリオファージである、請求項1記載の方法。
- 病原菌に起因する疾患の影響を受けやすい対象に無力化した全菌体細菌ワクチンを投与する段階を含み、ワクチンは溶菌欠損バクテリオファージの感染により無力化された病原菌を含み、該投与は宿主において病原菌に対する免疫応答を誘発するのに効果的な量で行われる、
病原菌に起因する疾患に対して対象にワクチン接種する方法。 - 溶菌欠損バクテリオファージの感染により無力化された病原菌が、内因性抗原を過剰発現するように遺伝子操作される、請求項4記載の方法。
- 病原菌が、マイコバクテリア属、スタフィロコッカス属、ビブリオ属、エンテロバクター属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、ヘモフィルス属、ナイセリア属、シュードモナス属、シゲラ属、セラチア属、サルモネラ属、ストレプトコッカス属、クレブシエラ属、およびエルシニア属からなる群より選択される属のものである、請求項4記載の方法。
- 溶菌欠損バクテリオファージがLys欠損バクテリオファージである、請求項4記載の方法。
- 無力化した全菌体細菌組成物を対象に投与する段階を含み、組成物は溶菌欠損バクテリオファージの感染により無力化された病原菌を含み、該投与は宿主において細菌内または細菌上に存在する抗原に対する免疫応答を誘発するのに効果的な量で行われる、
抗原に対する免疫応答を誘発する方法。 - 抗原が細菌にとって内因性の細菌抗原である、請求項8記載の方法。
- 抗原が組換え抗原である、請求項8記載の方法。
- 組換え抗原が細菌にとって外因性である、請求項10記載の方法。
- 溶菌欠損バクテリオファージがLys欠損バクテリオファージである、請求項8記載の方法。
- 無力化細菌および薬学的に許容される賦形剤を含み、無力化細菌は溶菌欠損バクテリオファージによる病原菌の感染によって作製される組成物。
- 病原菌が、マイコバクテリア属、スタフィロコッカス属、ビブリオ属、エンテロバクター属、エンテロコッカス属、エシェリキア属、ヘモフィルス属、ナイセリア属、シュードモナス属、シゲラ属、セラチア属、サルモネラ属、ストレプトコッカス属、クレブシエラ属、およびエルシニア属からなる群より選択される属のものである、請求項13記載の組成物。
- 溶菌欠損バクテリオファージがLys欠損バクテリオファージである、請求項13記載の組成物。
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