JP6178384B2 - コレラおよび毒素原性大腸菌(etec)下痢に対するワクチン - Google Patents
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Description
本発明は、ワクチン、特に、コレラおよび毒素原性大腸菌(E. coli)(ETEC)下痢に対するワクチンの分野に関する。
コレラは、未だ世界の大部分の地域における重要な健康問題である。発展途上国ならびにこれらの国への旅行者においてみられる下痢性疾患の主要原因であるETECもまた然りである。多くの発展途上国において、コレラおよび他の腸管感染症の防除に有効な水および衛生的な措置は現在のところ実現不可能であり、この状況では、ワクチンが重要な役割を果たすことになる。しかし、そのためには、ワクチンが有効であり、容易に入手でき、何よりも安価であることが必要である。また、旅行者におけるコレラワクチンおよび特にETECワクチンの使用に関しては、医学的ニーズおよび非常に大きな商業的市場もある。
a.該宿主細胞の内因性wbeT遺伝子またはそのコードされるタンパク質が不活性であること;
b.該細胞が、WbeT酵素活性の発現を誘導する組換えDNA構築物を含むこと;ならびにここで、
c.トランスジェニックWbeT酵素活性のレベルが、稲葉型抗原および小川型抗原を該細胞が同時に発現するようなレベルであること
を特徴とする。
a.該細胞が、内因性wbeT遺伝子を含むこと;ならびに
b.該細胞が、内因性wbeT遺伝子の発現レベルまたはその産物の酵素活性を調節することができる組換えDNA構築物を含むこと;ならびにここで、
c.WbeT酵素活性の調節されたレベルが、稲葉型抗原および小川型抗原を該細胞が同時に発現するようなレベルであること
を特徴とする。
小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を含むコレラ菌O1細胞を提供する段階;ならびに
該細胞を死滅させる段階
を含む、ワクチンを製造するための方法が提供される。
[本発明1001]
コレラ菌(Vibrio cholerae)O1細胞を含むワクチンであって、該細胞が小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を含むことを特徴とする、ワクチン。
[本発明1002]
小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を含む複数のコレラ菌O1細胞を含む前記ワクチンであって、該細胞のO1抗原の平均で10〜90%が小川血清型である、本発明1001のワクチン。
[本発明1003]
前記細胞がCFA/I、CS2、またはCS5などの1種または複数種のETEC定着因子(CF)タンパク質をさらに含み、該CFタンパク質が一重線毛、二重線毛、またはハイブリッド線毛のいずれかとして発現される、前記本発明のいずれかのワクチン。
[本発明1004]
小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を含むコレラ菌O1細胞のほかには、免疫学的に活性なさらなる全細胞を全く含まないことを条件とする、前記本発明のいずれかのワクチン。
[本発明1005]
経口投与用である、前記本発明のいずれかのワクチン。
[本発明1006]
前記細胞がホルマリンによって不活化されている、前記本発明のいずれかのワクチン。
[本発明1007]
前記細胞が、本発明1022〜1027のいずれかの細胞である、前記本発明のいずれかのワクチン。
[本発明1008]
予防的免疫化において使用するための、前記本発明のいずれかのワクチン。
[本発明1009]
コレラおよび/または毒素原性大腸菌感染症(ETEC)に対する予防的免疫化において使用するための、前記本発明のいずれかのワクチン。
[本発明1010]
免疫化しようとする対象に本発明1001〜1009のいずれかのワクチンを投与する段階を含む、予防的免疫を誘導するための方法。
[本発明1011]
前記予防的免疫が、コレラおよび/または毒素原性大腸菌感染症(ETEC)に対するものである、本発明1011の方法。
[本発明1012]
前記投与が経口的に行われる、本発明1010または1011の方法。
[本発明1013]
コレラ菌O1宿主細胞においてタンパク質発現を誘導するのに適したプロモーターに機能的に連結された、SEQ ID NO:6に対して少なくとも70%の配列同一性を有するWbeTタンパク質をコードするDNAを含む、DNA構築物であって、該コードされるWbeTタンパク質が、SEQ ID NO:6と同一の配列を有するタンパク質の酵素活性と比べて該コードされるタンパク質の酵素活性を低下させる、SEQ ID NO:6に対する配列改変を含むことを特徴とする、DNA構築物。
[本発明1014]
前記配列改変が、SEQ ID NO:6の158位のセリン残基の置換を含む、本発明1013のDNA構築物。
[本発明1015]
前記配列改変が、SEQ ID NO:6の158位のセリン残基のグリシン、プロリン、トレオニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンへの置換を含む、本発明1014のDNA構築物。
[本発明1016]
コレラ菌O1宿主細胞においてタンパク質発現を誘導するのに適したプロモーターに機能的に連結された、SEQ ID NO:6に対して少なくとも70%の配列同一性を有するWbeTタンパク質をコードするDNAを含む、DNA構築物であって、該プロモーターが、最初は稲葉表現型であるコレラ菌O1宿主細胞における該コードされるWbeTタンパク質の発現を、該宿主細胞による稲葉型抗原および小川型抗原両方の同時発現を可能にするようなトランスジェニックWbeTタンパク質の発現レベルまで誘導するのに適していることを特徴とする、DNA構築物。
[本発明1017]
前記プロモーターが、tacプロモーターまたはlacプロモーターなどの誘導性プロモーターである、本発明1013〜1016のいずれかのDNA構築物。
[本発明1018]
宿主細胞において複製が可能なプラスミドベクター、または宿主細胞において染色体組込みが可能なベクターである、本発明1013〜1017のいずれかのDNA構築物。
[本発明1019]
選択マーカーをさらに含む、本発明1013〜1018のいずれかのDNA構築物。
[本発明1020]
相同組換えを用いた宿主の内因性wbeT遺伝子の改変に適合化されていることを特徴とする、コレラ菌O1宿主細胞における相同組換えのためのDNA構築物。
[本発明1021]
選択マーカーをさらに含む、本発明1020のDNA構築物。
[本発明1022]
以下を特徴とする、稲葉型抗原および小川型抗原の両方を同時に発現するコレラ菌O1細胞:
a.宿主細胞の内因性wbeT遺伝子またはそのコードされるタンパク質が不活性であること;
b.該細胞が、WbeT酵素活性の発現を誘導する組換えDNA構築物を含むこと;ならびにここで、
c.トランスジェニックWbeT酵素活性のレベルが、稲葉型抗原および小川型抗原を該細胞が同時に発現するようなレベルであること。
[本発明1023]
前記組換えDNA構築物が本発明1013〜1019のいずれかのDNA構築物である、本発明1022のコレラ菌O1細胞。
[本発明1024]
以下を特徴とする、稲葉型抗原および小川型抗原の両方を同時に発現するコレラ菌O1細胞:
a.該細胞が、内因性wbeT遺伝子を含むこと;ならびに
b.該細胞が、内因性wbeT遺伝子の発現レベルまたはその産物の酵素活性を調節することができる組換えDNA構築物を含むこと;ならびにここで、
c.WbeT酵素活性の調節されたレベルが、稲葉型抗原および小川型抗原を該細胞が同時に発現するようなレベルであること。
[本発明1025]
前記組換えDNA構築物が本発明1020または1021のDNA構築物である、本発明1024のコレラ菌O1細胞。
[本発明1026]
前記細胞によって発現されるO1抗原の10〜90%が小川血清型である、本発明1022〜1025のいずれかのコレラ菌O1細胞。
[本発明1027]
前記細胞がCFA/I、CS2、またはCS5などの1種または複数種のETEC定着因子(CF)タンパク質をさらに発現し、該CFタンパク質が一重線毛、二重線毛、またはハイブリッド線毛のいずれかとして発現される、本発明1022〜1026のいずれかのコレラ菌O1細胞。
[本発明1028]
a.小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を含むコレラ菌O1細胞を提供する段階;ならびに
b.該細胞を死滅させる段階
を含む、ワクチンを製造するための方法。
[本発明1029]
死滅段階がホルマリン処理によって実施される、本発明1028の方法。
[本発明1030]
前記細胞が本発明1022〜1027のいずれかの細胞である、本発明1028または1029の方法。
小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を有する細胞を含むワクチン
O139血清型のコレラ菌もコレラを引き起こし得るが、世界中のコレラ全体の98%超はO1型コレラ菌によって引き起こされる。O1血清型には2つのサブタイプ/血清型、すなわち小川型および稲葉型がある。小川サブタイプから稲葉サブタイプへの血清型スイッチングは比較的高い頻度で発生するのに対し、逆の変換は稀である。血清型スイッチングの基本原理は、LPS合成経路の変異であり、これによりO1抗原の構造が変化する。有効なワクチンは、その組成中に小川型株および稲葉型株の両方を含む必要がある。なぜならこれらのLPSは血清学的に異なっており、共通のエピトープおよび異なるエピトープのどちらも防御に寄与するからである。
本発明は、好ましくはコレラおよび/または毒素原性大腸菌感染症(ETEC)に対する予防的免疫化における上記ワクチンの使用を開示する。好ましくは、ワクチンは、経口投与または舌下投与される。
a.小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を含むコレラ菌O1細胞を提供する段階;ならびに
b.ホルマリン処理または熱処理などによって該細胞を死滅させる段階
を含む、ワクチンを製造するための方法が開示される。
ワクチン中に含まれる、小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を含むコレラ菌細胞は、原則的には、彦島表現型の天然株から得ることができる。しかし、本発明者らが知っている限りでは、そのような株は極めて稀であり、そのような株は現在のところ一般の人々には入手不可能である。文献では、このような天然株は不安定であるとも記載されており、そのため、これらはワクチンの工業的生産用にはあまり有望ではない。
a)酵素活性の低い変異WbeTタンパク質を、稲葉表現型の宿主において高レベルで発現させてもよく;
b)酵素活性の高いWbeTタンパク質を、稲葉型宿主において低レベルで発現させてもよく;または
c)小川型宿主の内因性WbeT遺伝子を、例えば相同組換えを用いて変異させ、得られるタンパク質の活性を適切に低下させてもよい。
d)稲葉型宿主の内因性WbeT遺伝子を、例えば相同組換えを用いて置換もしくは改変し、該遺伝子によって産生されるタンパク質の活性を適切に上昇させてもよい。
上記から明らかであるように、本発明のワクチン(または正確に言えば、ワクチンのベースとなる細胞)はまた、稲葉血清型および小川血清型両方のO1抗原の発現の組み合わせに加えて、改善された他の特徴も含んでよい。特に、これらの細胞は、実施例7で実証するように、一重線毛、二重線毛、またはハイブリッド線毛のいずれかとして発現される、CFA/I、CS2、またはCS5などの1種または複数種のETEC定着因子(CF)タンパク質を発現してよい。ワクチン用の細胞中にこのようなCFタンパク質を含めることは、ETECに対する防御的免疫を誘導するために特に有用である。
小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を発現するように遺伝的に改変されたコレラ菌JS1569株(稲葉型)を含むワクチンが、小川型LPSおよび稲葉型LPSと反応する異なる比率の抗体で抗体応答を起こすかどうかを、ELISAにおいて、JS1569稲葉型親株による免疫化後の抗体応答と比べて検査した。
GenBankにおける彦島株由来のwbeT遺伝子の1エントリには、タンパク質の158位のセリンをプロリンに変換する変異(S158P)が存在するが、同じ変異は、稲葉血清型であると同定された株においても記載されている(それぞれ、GenBankアクセッション番号FJ619106およびDQ401028)。プライマーwbeT1 EcoRI
およびwbeT2 HindIII
を用いてO1 El Tor小川型VX44945株から野生型wbeT遺伝子を増幅し、Eco31Iでこれを消化して、pAF1()に由来する発現ベクター中にクローニングし、ここで、クローニングされた遺伝子は、EcoRIおよびHindIIIで消化しておいた強力な合成tacプロモーターの制御下に置かれた。この遺伝子の配列を、プライマーwbe1
およびwbe2
を用いたプラスミドのDNA配列決定によって確認した。
およびwbeT m1
を合成した。これら2つのオリゴヌクレオチドを等モル量で混合し、室温で一晩、アニールさせた。過剰なデオキシリボヌクレオチド3リン酸の存在下でT4 DNAポリメラーゼを用いて短いwbeT m3プライマーを伸長させることにより、完全長二重鎖DNAを作製した。得られた断片をBsp119IおよびVan91Iで消化し、同じ酵素で消化したpML-wbeTtac(SEQ ID NO:7)に連結した。連結したDNAを用いて、市販のエレクトロコンピテントな大腸菌株DH12S(Invitrogen)を形質転換させた。抗生物質選択を行わずにインキュベートした後、アンピシリン(100μg/ml)を追加した選択的LB寒天プレート上に少量のアリコートを塗布した。残りの細胞を新鮮なLBブロスで25mlに希釈した。最終濃度が100μg/mlとなるようにアンピシリンを添加し、クローンライブラリーを得るために培養物を37℃で一晩増殖させた。得られた培養物のアリコートに最終濃度が17%となるようにグリセロールを追加し、-70℃で保存した。他のアリコートはプラスミドDNAを調製するために使用した。
JS1569株の短縮型染色体wbeT遺伝子を、実施例2で作製した変異遺伝子で置換した。プライマーwbeT1 BlgII(SEQ ID NO:1)およびwbeT2 BglII(SEQ ID NO:2)を用いて、関連する変異遺伝子を増幅させた。増幅された断片をBglIIで消化し、BamHIで消化しておいた自殺ベクターpMT-SUICIDE(SEQ ID NO:12)に連結した。これは、M. Lebensが本発明者らの研究室で構築したR6Kベースの小型自殺ベクターであり、クロラムフェニコール耐性遺伝子と広宿主域プラスミドRP4由来の伝達起点(oriT)とを有し、ヘルパープラスミド(pNJ5000; Grinter NJ, Gene. 1983 Jan-Feb;21(1-2):133-43)の助けを借りてプラスミドがコレラ菌株に接合伝達されることを可能にするものである。
およびwbeT rev 51<;
を用いた増幅および配列決定によって、近位の遺伝子(アミノ酸87番目から)の3'末端およびアミノ酸51番目までの遠位の遺伝子の5'末端ならびに間に挟まれたプラスミドを増幅することに成功した。wbeTfor 87>;プライマーを用いた配列決定により、1342株では、天然のプロモーターに隣接したwbeT遺伝子が短縮型の宿主遺伝子であることが示された。遠位の遺伝子は野生型配列を有していたがプロモーターは有さなかった。野生型遺伝子が潜在的プロモーターから極めて低いレベルで発現されていたため、この配置により彦島表現型が得られた。
実施例2で説明した変異wbeTに関する実験に関連して、野生型wbeTを有する対照プラスミドが、JS1569株の変異遺伝子を、それが誘導されていない場合でさえ部分的に補完できることに注目した。これにより、野生型遺伝子の存在下でさえ彦島血清型がもたらされたことから、発現レベルを制限することによって(この場合、tacプロモーターを抑制されたままにし、かつ誘導因子の非存在下で起こる突破的(breakthrough)発現のみを可能にすることによって)、該表現型を実現できることも実証された。
野生型WbeTメチラーゼタンパク質(JS1569/S158S株)または158位にS→G(JS1569/S158G株)もしくはS→A(JS1569/S158A株)の変異を有するWbeTタンパク質をコードする変異wbeT遺伝子のいずれかをコードするプラスミドを含むように改変しておいたコレラ菌JS1569株(稲葉型)をLB寒天プレート上で増殖させ、稲葉型O抗原および小川型O抗原にそれぞれ特異的な抗体による凝集について、単一コロニーを試験した。
上記の実施例で提示した株は安定であり、所望の表現型を明らかに有しているが、彦島表現型を得る代替的な方法とは、内因性遺伝子において正確な(true)遺伝子置換を実施することである。内因性の活性なwbeT遺伝子産物の158位における適切な変異(上記のとおり)もまた、活性を減弱させ、したがって彦島血清型をもたらす。これにより、実施例5および最適な免疫原性特性に関する免疫化実験においてのように彦島型発現について試験できる、様々な小川型発現レベルを有する一連の変異体が生じると考えられる。
大腸菌TOP10株およびコレラ菌JS1569株が、ETECの主要定着因子の内の1つ、すなわちCFA/I線毛をそれらの表面で発現できることが最近示された(Tobias J, Lebens M, Bolin I, Wiklund G, Svennerholm AM. Vaccine. 2008 Feb 6;26(6):743-52)。CFA/Iを含む発現ベクターをエレクトロポレーションにより上記株に導入した後、ドットブロットアッセイ法によって表面での発現を検出した。
Claims (20)
- コレラ菌(Vibrio cholerae)O1宿主細胞においてタンパク質発現を誘導するのに適したプロモーターに機能的に連結された、SEQ ID NO:6に対して少なくとも90%の配列同一性を有するWbeTタンパク質をコードするDNAを含む、DNA構築物であって、以下を特徴とする、DNA構築物:
a.該DNA構築物によってコードされるWbeTタンパク質が、SEQ ID NO:6に対する配列改変を含むこと;
b.該配列改変が、SEQ ID NO:6の158位のセリン残基の、グリシン、プロリン、トレオニン、フェニルアラニン、またはトリプトファンへの置換を含むこと;および
c.該置換が、SEQ ID NO:6と同一の配列を有するタンパク質の酵素活性と比べて、該DNA構築物によってコードされるタンパク質の酵素活性を低下させること。 - 前記プロモーターが、tacプロモーター、lacプロモーター、または誘導性プロモーターである、請求項1記載のDNA構築物。
- 宿主細胞において複製が可能なプラスミドベクター、または宿主細胞において染色体組込みが可能なベクターである、請求項1または2記載のDNA構築物。
- 選択マーカーをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のDNA構築物。
- 請求項1〜4のいずれか一項記載のDNA構築物が、相同組換えを用いた宿主の内因性wbeT遺伝子の改変に適合化されていることを特徴とする、コレラ菌O1宿主細胞における相同組換えのためのDNA構築物。
- 請求項1〜5のいずれか一項記載のDNA構築物をコレラ菌O1細胞に導入する段階
を含む、稲葉型抗原および小川型抗原の両方を同時に発現するコレラ菌O1細胞を調製する方法。 - 以下を特徴とする、稲葉型抗原および小川型抗原の両方を同時に発現するコレラ菌O1細胞:
a.該細胞の内因性wbeT遺伝子またはそのコードされるタンパク質が不活性であること;
b.該細胞が、WbeT酵素活性の発現を誘導する組換えDNA構築物を含むこと;
c.該組換えDNA構築物が、請求項1〜4のいずれか一項記載のDNA構築物であること;ならびにここで、
d.該DNA構築物によってコードされるWbeTタンパク質の酵素活性のレベルが、稲葉型抗原および小川型抗原を該細胞が同時に発現するようなレベルであること。 - 以下を特徴とする、稲葉型抗原および小川型抗原の両方を同時に発現するコレラ菌O1細胞:
a.該細胞の内因性wbeT遺伝子が、請求項5記載のDNA構築物を用いた相同組換えによって改変されていること;ならびにここで、
b.該DNA構築物によってコードされるWbeTタンパク質の酵素活性のレベルが、稲葉型抗原および小川型抗原を該細胞が同時に発現するようなレベルであること。 - 前記細胞によって発現されるO1抗原の10〜90%が小川血清型である、請求項7または8記載のコレラ菌O1細胞。
- 前記細胞が1種または複数種のETEC定着因子(CF)タンパク質をさらに発現する、請求項7〜9のいずれか一項記載のコレラ菌O1細胞。
- a.小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を含むコレラ菌O1細胞を提供する段階であって、該細胞が請求項7〜10のいずれか一項記載の細胞である、段階;ならびに
b.該細胞を死滅させる段階
を含む、ワクチンを製造するための方法。 - 死滅段階がホルマリン処理によって実施される、請求項11記載の方法。
- コレラ菌(Vibrio cholerae)O1細胞を含むワクチンであって、該細胞が小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を含み、かつ請求項7〜10のいずれか一項記載の細胞であることを特徴とする、ワクチン。
- 小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を含む複数のコレラ菌O1細胞を含む前記ワクチンであって、該細胞のO1抗原の平均で10〜90%が小川血清型である、請求項13記載のワクチン。
- 前記細胞が1種または複数種のETEC定着因子(CF)タンパク質をさらに含む、請求項13または14記載のワクチン。
- 小川血清型および稲葉血清型両方のO1抗原を含むコレラ菌O1細胞のほかには、免疫学的に活性なさらなる全細胞を全く含まないことを条件とする、請求項13〜15のいずれか一項記載のワクチン。
- 経口投与用である、請求項13〜16のいずれか一項記載のワクチン。
- 前記細胞がホルマリンによって不活化されている、請求項13〜17のいずれか一項記載のワクチン。
- 予防的免疫化において使用するための、請求項13〜18のいずれか一項記載のワクチン。
- コレラおよび/または毒素原性大腸菌感染症(ETEC)に対する予防的免疫化において使用するための、請求項13〜19のいずれか一項記載のワクチン。
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