CN102630166B - 抗霍乱和肠产毒性大肠杆菌(etec)腹泻的疫苗 - Google Patents

抗霍乱和肠产毒性大肠杆菌(etec)腹泻的疫苗 Download PDF

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Abstract

提供了包含霍乱弧菌(Vibrio cholerae)O1细胞的抗霍乱和/或抗ETEC疫苗，其特征在于所述细胞包含Ogawa和Inaba两种血清型的O1抗原。还提供了用于该疫苗的遗传修饰的霍乱弧菌O1细胞、用于所述修饰的DNA构建体、所述疫苗的用途以及制造疫苗的方法。

Description

抗霍乱和肠产毒性大肠杆菌(ETEC)腹泻的疫苗
发明技术领域
本发明涉及疫苗领域，尤其是抗霍乱和肠产毒性大肠杆菌(enterotoxigenic E.coli，ETEC)腹泻的疫苗。
发明背景
霍乱在世界的大部分地区仍是重要的健康问题。对ETEC也是如此，ETEC是发展中国家人口以及这些国家的游客患腹泻病的主要原因。在许多发展中国家，控制霍乱和其他肠感染的有效的水源和卫生措施并不现实，在这种情况下，疫苗发挥重要的作用。然而，为了做到这一点，它们必须有效、容易获得，而且最重要的是便宜。霍乱疫苗特别是ETEC疫苗在游客中的使用也是医疗需求，并且有非常大的市场。
一种方法是开发口服的全细胞死疫苗(killed whole cell vaccine)。DukoralTM是经口细胞疫苗(oral cell vaccine，OCV)，其显示了高达90％的抗霍乱作用，而且对肠产毒性大肠杆菌(ETEC)引起的腹泻也有显著作用。它包含以四种不同制剂(两种热灭活和两种福尔马林灭活)存在的三种不同霍乱弧菌(V.cholerae)菌株，另外还包含重组产生的霍乱毒素B亚基(rCTB)。该rCTB组分对有效对抗霍乱有显著贡献，而且由于具有诱导针对霍乱毒素(CT)样大肠杆菌不耐热毒素(LT)的交叉中和抗体的能力，它是造成所观察到的针对ETEC腹泻之保护的唯一原因。然而，rCTB是不耐酸的，因此该疫苗(需要通过两次给药给予)必须用碳酸氢盐缓冲液施用。
尽管DukoralTM是唯一国际许可的OCV，具有或不具有CTB组分的该疫苗的复制品目前正在发展中国家(越南、印度和中国)销售。在越南和印度制造的OCV(缺少CTB组分)包含与Dukoral相同的4种细菌组分，以及福尔马林灭活的血清组O139霍乱弧菌菌株这第五种组分。
OCV引起的抗霍乱保护性免疫主要是(如果不完全是的话)基于粘膜产生的抗细胞壁脂多糖O1(O1LPS)抗体，对于包含CTB的Dukoral疫苗，还基于肠内的抗毒素抗体。
由上文显而易见的是，目前本领域霍乱/ETEC疫苗的生产非常不简便，并且尽管已经是有效的，但能使霍乱疫苗更容易获得的真正贡献是在几个水平上将制剂的组成合理化。
在全细胞死疫苗(如DukoralTM)中包含几种不同霍乱弧菌菌株的必要性来自于疫苗代表几种不同霍乱弧菌抗原性变体的需要。目前所用疫苗中的所有保护性菌株均来自O1血清组，直到1993年，在多于200种已鉴定的血清组中，O1血清组是唯一一种已知能导致流行性霍乱的血清组，并且现在它仍是主要的血清组。然而，O1血清组有称为Ogawa和Inaba血清型的两种变体，它们在表面脂多糖(LPS)O-抗原末端糖的甲基化上有区别。已知会发生血清型转换，其中在Ogawa血清型生物可产生Inaba生物。然而，反向转换是罕见的。
尽管尤其是用Inaba(Ogawa也可以)血清型免疫可产生与其他血清型交叉反应的抗体，但它们也产生对保护有显著贡献的血清型特异性抗体。因此，有效的疫苗不仅应诱导交叉反应性抗体，还应产生针对Inaba和Ogawa两种血清型变体的血清型特异性抗体。
已知血清型转换与单基因突变有关。使该基因失活的任何突变导致Ogawa到Inaba的血清型转换。预计可逆转该事件的突变少见得多，尽管Inaba到Ogawa的血清型转换可通过以反式提供相关基因来轻易实现。所涉及的基因(也用表示)编码甲基转移酶，它将O-抗原多糖重复单元的末端perosamine残基甲基化。产生Inaba血清型的该基因的突变几乎总是引入无义密码子的插入、缺失或碱基改变。
已有记录表明在自然环境中存在称为Hikojima的第三种O1变体。Hikojima的特征在于它在其表面表达Ogawa和Inaba两种决定簇，并且与这两种类型的特异性抗血清都发生凝集。Hikojima表型极为罕见，文献中认为它是不稳定的过渡形式。
鉴于此，本发明人开始构建霍乱弧菌的单一疫苗菌株，它能有效代替目前使用的三种菌株。
因此，本发明的一个目的是提供有效的抗霍乱和/或抗ETEC腹泻疫苗，其具有简化的配方和更低的生产成本，而且还理想地在单次施用后产生保护性免疫力。
发明概述
本发明描述了新的霍乱和/或ETEC疫苗的构建、制造方法、制剂和医疗预防用途。
在全中，与已有公认的科学实践一致，名称(斜体)表示基因，而名称(斜体)表示由基因编码的蛋白质。
在第一方面中，提供了包含霍乱弧菌O1细胞的疫苗，其特征在于所述细胞包含Ogawa和Inaba两种血清型的O1抗原。
所述疫苗可包含含有Ogawa和Inaba两种血清型之O1抗原的多种霍乱弧菌O1细胞，而且其中所述细胞中平均10-90％的O1抗原为Ogawa血清型。
优选地，细胞表达的O1抗原中10-90％为Ogawa血清型。更优选地，细胞表达的O1抗原中10-70％为Ogawa血清型。而更优选地，细胞表达的O1抗原中10-50％为Ogawa血清型。更优选地，细胞表达的O1抗原中10-40％为Ogawa血清型。最优选地，细胞表达的O1抗原中10-30％为Ogawa血清型。
所述疫苗的细胞还可包含一种或更多种ETEC定居因子(colonization factor，CF)蛋白，例如CFA/I，CS2或CS5，其中所述CF蛋白以单一菌毛、双菌毛或杂合菌毛的形式表达。
优选地，所述疫苗除包含Ogawa和Inaba两种血清型之O1抗原的霍乱弧菌O1细胞外，不包含任何其他免疫活性全细胞。
优选地，疫苗用于经口施用。优选地，疫苗中的细胞是福尔马林灭活的。
优选地，细胞是遗传修饰的细胞，优选根据本发明第七或第八方面(见下文)进行遗传修饰的细胞。
在第二方面中，提供了根据第一方面的疫苗，其用于预防性免疫，优选用于针对霍乱和/或肠产毒性大肠杆菌感染(ETEC)的预防性免疫。
在第三方面中，提供了诱导预防性免疫力的方法，其包括向待免疫对象施用根据第一方面的疫苗。优选地，所述预防性免疫针抗霍乱和/或肠产毒性大肠杆菌感染(ETEC)。还优选的是，施用是经口完成的。
第四方面，提供了DNA构建体，其包含编码与SEQ ID NO：6有至少70％序列同一性的蛋白的DNA(更优选地至少80％同一性，甚至更优选至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，最优选至少99％同一性)，其与适于在霍乱弧菌O1宿主细胞中诱导蛋白质表达的启动子有效连接，所述DNA构建体的特征在于所编码的蛋白与SEQ IDNO：6相比包含序列改变，相比于与SEQ ID NO：6序列相同的蛋白质的酶活性，所述改变降低所编码蛋白质的酶活性。
优选地，所述序列改变包括替换SEQ ID NO：6的158位丝氨酸残基，更优选地，将SEQ ID NO：6158位的丝氨酸残基替换为甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
在第五方面中，提供了DNA构建体，其包含编码与SEQ ID NO：6有至少70％序列同一性的蛋白的DNA(更优选地至少80％同一性，甚至更优选至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，最优选至少99％同一性)，其与适合在霍乱弧菌O1宿主细胞中诱导蛋白质表达的启动子有效连接，所述构建体的特征在于所述启动子适合在原始为Inaba表型的霍乱弧菌O1宿主细胞(即用该DNA构建体转化前为Inaba的宿主细胞)中诱导所编码的蛋白以这样的水平表达，即其允许宿主细胞同时表达Inaba和Ogawa两种抗原。
优选地，以上方面的启动子是诱导型启动子，例如tac或lac启动子。
优选地，以上方面的DNA构建体是能在宿主细胞内复制的质粒载体，或能整合进宿主细胞染色体的载体。
优选地，以上方面的DNA构建体还包含选择标记，更优选阳性选择标记，例如抗生素抗性基因或代谢选择标记。
在第六方面中，提供了用于在霍乱弧菌O1宿主细胞中进行同源重组的DNA构建体，其特征在于所述构建体适于通过同源重组的方式改变宿主的内源基因。优选地，第六方面的DNA构建体还包含选择标记，更优选阳性选择标记，例如抗生素抗性基因或代谢选择标记。
第七方面，提供了同时表达Inaba和Ogawa两种抗原的霍乱弧菌O1细胞，其特征在于
a.所述宿主细胞的内源基因或其编码的蛋白质是无活性的；
b.所述细胞包含诱导酶活性的表达的重组DNA构建体；以及
其中
c.转基因酶的活性水平使得该细胞同时表达Inaba和Ogawa抗原。
优选地，以上方面的重组DNA构建体是第四至第五方面的DNA构建体。
在第八方面中，提供了同时表达Inaba和Ogawa两种抗原的霍乱弧菌O1细胞，其特征在于
a.所述细胞包含内源基因；和
b.所述细胞包含能调节内源基因表达水平或其产物的酶活性的重组DNA构建体；以及其中
c.调节后的酶活性水平使得该细胞同时表达Inaba和Ogawa抗原。
优选地，以上方面的重组DNA构建体是第六方面的DNA构建体。
优选地，以上方面的细胞表达的O1抗原中10-90％为Ogawa血清型。更优选地，以上方面的细胞表达的O1抗原中10-70％为Ogawa血清型。更优选地，以上方面的细胞表达的O1抗原中10-50％为Ogawa血清型。更优选地，以上方面的细胞表达的O1抗原中10-40％为Ogawa血清型。最优选地，以上方面的细胞表达的O1抗原中10-30％为Ogawa血清型。
优选地，以上方面的细胞还表达一种或多种ETEC定居因子(CF)蛋白，例如CFA/I、CS2或CS5，其中所述CF蛋白以单一菌毛、双菌毛或杂合菌毛的形式表达。
在第九方面中，提供了制造疫苗的方法，其包括以下步骤：
提供包含Ogawa和Inaba两种血清型的O1抗原的霍乱弧菌O1细胞；
和
灭活所述细胞。
优选地，所述灭活通过福尔马林处理或热处理来实施。
优选地，细胞是第七或第八方面的细胞。
在第十方面中，本发明还涉及以单组分(one-unit)组合物形式配制的用于疫苗接种的药盒，其中组合物置于所述药盒的一部分中，说明书置于另一部分中。
发明详述
包含具有Ogawa和Inaba两种血清型之O1抗原的细胞的疫苗
尽管血清组O139的霍乱弧菌也可引起霍乱，但全世界所有霍乱中98％以上是由霍乱弧菌O1引起的。O1血清组有两种亚型/血清型——Ogawa和Inaba。Ogawa到Inaba亚型的血清型转换发生频率相对高，而相反的转换是罕见的。血清型转换的基础是LPS合成通路中的突变，其导致O1抗原结构的改变。有效的疫苗需要在其组成中包含Ogawa和Inaba两种菌株，因为它们的LPS在血清学上是不同的，具有提供保护作用的相同和不同的表位。
公开了包含表达Ogawa和Inaba两种血清型之O1抗原的霍乱弧菌O1细胞的疫苗，由于在制造疫苗时不需要对每个表型使用不同的细胞，它有简化生产的优势。由于使用单一类型的细胞只需一种类型的灭活处理，所以疫苗制造也被简化。
使用基于单一霍乱弧菌菌株(表达不同量的Ogawa和Inaba两种血清型)的本发明疫苗进行的免疫产生交叉反应性抗体和针对Ogawa和Inaba两种抗原的类型特异性抗体(见实施例1)。
优选地，细胞中平均10-90％的O1抗原为Ogawa血清型。Inaba抗原优选以高于Ogawa抗原的量存在(即超过50％)，这是由于Inaba抗原可引发针对Ogawa的一定水平的血清型交叉保护，而Ogawa抗原仅可引发针对自身的保护。
还可通过整合以下特征来改进疫苗对ETEC的效力，即细胞还表达一种或更多种ETEC定居因子(CF)蛋白(例如CFA/I、CS2或CS5)，其中所述CF蛋白以单一菌毛、双菌毛或杂合菌毛的形式表达(详见下文)。
优选地，上述疫苗除包含Ogawa和Inaba两种血清型的O1抗原的霍乱弧菌O1细胞外，不包含任何其他免疫活性全细胞。然而，上述疫苗还可以以与DukoralTM类似的方式包含重组CTB。
疫苗优选经口施用，但也可注射施用。优选地，疫苗包含福尔马林灭活的含有Ogawa和Inaba两种血清型之O1抗原的霍乱弧菌O1细胞。
优选地，疫苗包含遗传修饰的霍乱弧菌O1细胞，优选如下所述的这种遗传修饰霍乱弧菌O1细胞。
本发明的疫苗可以是疫苗组合物，其包含一种或更多种可药用的赋形剂、载体、稀释剂和佐剂。
本发明疫苗组合物的制备是本领域技术人员公知的。合适的可药用载体和/或稀释剂包括任何和所有常规溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、水溶液、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延缓剂等等。这些介质和试剂在药物活性物质中的使用是本领域公知的，例如在Remington′sPharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Company，Pennsylvania，USA中有描述。任何常规基质或试剂除非与活性成分不相容，否则均考虑用在本发明药物组合物中。补充性活性成分也可被掺入组合物中。
优选地，经口使用的疫苗组合物每毫升可包括108-1014个细胞，更优选每毫升1010-1012个细胞，最优选每毫升约1011个细胞。
经口使用的疫苗组合物可配制为食品、饮料或饲料添加剂(用于免疫动物)。
疫苗组合物可包含本领域已知的佐剂，或可没有任何佐剂。
疫苗的使用
本发明公开了上述疫苗在预防性免疫(优选地针对霍乱和/或肠产毒性大肠杆菌感染(ETEC))中的用途。优选地，疫苗是经口或舌下施用。
本发明还公开了诱导预防性免疫力的方法，其包括对待免疫对象施用上述疫苗。优选地，预防性免疫力是针对霍乱和/或肠产毒性大肠杆菌感染(ETEC)的。优选地，施用通过经口或舌下进行。施用也可通过注射进行。
所述疫苗优选地用于免疫人和其他哺乳动物，例如宠物(猫、狗等)或农场动物(例如牛、马、绵羊、山羊、猪等)。
优选地，疫苗以每剂量108-1014个细胞经口施用，更优选每剂量1010-1012个细胞，最优选每剂量约1011个细胞。
免疫方案可由单次施用组成或可包含两次或更多次施用。在一个优选的实施方案中，诱导保护性免疫力的初始免疫方案包含第一施用和第二施用，时间间隔至少7天但不超过约2个月。初始免疫方案后，可通过以短于3年的时间间隔(优选短于2年的时间间隔)加强施用来使保护性免疫力保持所期望的时间。在第一施用完成后至少1年内不进行加强施用可以是优选的。
疫苗制造方法
公开了疫苗制造方法，其包括以下步骤：
a.提供包含Ogawa和Inaba两种血清型的O1抗原的霍乱弧菌O1细胞；和
b.灭活所述细胞，例如通过福尔马林处理或热处理。
优选地，所述灭活通过福尔马林处理实施。优选地，所述细胞是遗传修饰的细胞，优选如下所述。
除具有能使用单一灭活(灭活)方法的优势外，所述疫苗可用已知标准方案制造，例如DukoralTM制造方案。用于疫苗制造的遗传修饰细胞和获得该细胞的DNA构建体
原则上，疫苗中所包含的含有Ogawa和Inaba两种血清型的O1抗原的霍乱弧菌细胞可从具有Hikojima表型的天然菌株获得。然而，据本发明人所知，这种菌株是非常罕见的，而且目前公众不能获得这样的菌株。在文献中，这种天然的菌株还被描述为不稳定的，使得它们在疫苗工业生产中使用的希望不大。
因此，本发明人已通过基因改造衍生出表达Ogawa和Inaba两种血清型的O1抗原的霍乱弧菌细胞，并且获得了具有稳定Hikojima表型的新菌株。此方式衍生的细胞还具有可使用任何期望菌株(例如已知的和良好表征的疫苗菌株)作为起点的优点，大大简化了生产并且将GMP生产和监管批准所需的实验流程化。
本发明人在本文中证明，获得期望Hikojima表型的关键因素是获得合适的酶活性水平。在该上下文中“合适”是指细胞的酶活性水平不会低到使细胞具有基本纯的Inaba表型，也不会高到使细胞具有基本纯的Ogawa表型。
在本发明的情况下，优选细胞上10-90％的O1抗原为Ogawa型(因而剩余的是Inaba型)。更优选地，细胞上10-80％的O1抗原的为Ogawa型，更优选10-50％，更优选10-40％，最优选20-30％。
如以下实施例中所示，上述合适的Hikojima表型可以利用重组DNA技术，通过几种不同策略获得：
a)可以在具有Inaba表型的宿主中以高水平表达有低酶活性的突变体蛋白。
b)可以在Inaba宿主中以低水平表达有高酶活性的蛋白；或
c)可突变Ogawa宿主的内源基因(例如通过同源重组)，以使所得的蛋白质有适当降低的活性。
d)Inaba宿主的内源基因可以被替换或改变(例如通过同源重组)，以使该基因产生的蛋白质有适当增加的活性。
本发明公开了通过上述各个策略获得的细胞，以及适于通过上述各个策略获得细胞的DNA构建体。
通过本文的教导，对技术人员是显而易见的是，通过上述策略获得期望水平的表达可由多种不同方法实现。例如，转基因的表达水平可通过使用诱导型启动子(例如cat、lac或tac)来调节，从而该表达水平可以在宿主细胞培养期间通过调整宿主细胞接触的诱导物的水平来调节。
或者，几种弱和强组成型启动子也是已知的并且可以与用于与适当修饰的蛋白联合使用。弱启动子可用于组成型诱导高活性(例如野生型；SEQ ID NO：6)蛋白的极低水平表达。相反地，强组成型启动可用于诱导低活性蛋白(例如突变的蛋白，优选如下所述的那些)的高水平表达。
质粒和染色体整合的转基因都可用于本发明的细胞中，以获得期望表型。
蛋白的许多不同突变可能产生具有适当活性的蛋白质，根据本文的教导，技术人员通过本领域公知方法仅用常规实验可以容易地获得这种突变变体。技术人员可以容易地分析(例如用实施例5中公开的方法)通过表达突变的蛋白是否能获得期望表型的细胞。本发明人已鉴定出蛋白(SEQ ID NO：6)的158位丝氨酸是调节活性的合适残基。因此，突变优选地包括158位丝氨酸的替换，更优选地将158位丝氨酸替换为甘氨酸、脯氨酸、缬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、精氨酸或苯丙氨酸。最优选地，将158位丝氨酸替换为甘氨酸、脯氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸或色氨酸。
ETEC定居因子(CF)蛋白
从上文显而易见的是，除联合表达Inaba和Ogawa两种血清型的O1抗原外，本发明的疫苗(或作为该疫苗基础的细胞)还可以包括其他增强的特性。特别地，细胞可以表达一种或更多种ETEC定居因子(CF)蛋白，例如CFA/I、CS2或CS5，其中所述CF蛋白以单一菌毛、双菌毛或杂合菌毛的形式表达，如实施例7中所述。疫苗细胞中包含的这种CF蛋白对诱导针对ETEC的保护性免疫力特别有用。
所有本文引用的参考文献通过整体引用并入本文。
本文用词“包含”应理解为包括但不仅限于所示项目。
本发明通过下面的实施例进一步说明，其被视为非限制性的。
实施例1制备和测试包含Ogawa和Inaba两种血清型之O1抗原的霍乱弧菌细胞的疫苗
通过ELISA测试与用JS1569 Inaba亲本菌株免疫后的抗体应答相比，包含已被遗传修饰为表达Ogawa和Inaba两种血清型之O1抗原的霍乱弧菌细菌菌株JS1569(Inaba)的疫苗是否可引起这样的抗体应答，即有与Ogawa和Inaba LPS反应的不同比例的抗体。
将实施例2(见下文)的细菌用福尔马林灭活并用于免疫。福尔马林细菌灭活和经口免疫以及测定方法的实施如前所述(Nygren E，Li BL，Holmgren J，Attridge SR.Infect Immun.2009 Aug；77(8)：3475-84)。简言之，用两次3×108个福尔马林灭活细胞(与WbeT菌株的佐剂一起)的日剂量免疫Balb/c小鼠，进行3轮，间隔2周，最后一次免疫后一周处死小鼠，收集血清，在Inaba或Ogawa LPS包被的ELISA板上测试组合的IgG/IgM抗体效价。
结果见下表，结果表明JS1569 Inaba亲本菌株引起的抗体应答中抗Inaba抗体比抗Ogawa抗体效价稍高，与之不同，JS1569/野生型WbeS158S疫苗引起的抗体应答中抗Ogawa抗体比抗Inaba抗体效价高得多，但它也引起了适度的抗Inaba特异性抗体的形成：
  免疫血清   Inaba/Ogawa效价(比率)
  对JS1569   10290/5060(2∶1)
  同样的用Ogawa吸附   2940/160(18∶1)
  对JS1569/野生型Wbe S158S   36000/365000(1∶10)
  同样的用Inaba吸附   1600/49000(1∶30)
  同样的用Ogawa吸附   1700/2500(1∶1.5)
无佐剂皮下免疫证实了这些发现。与用JS1569 Inaba亲本菌株免疫明显不同而与用Ogawa A457参照菌株免疫更为相似的是，用JS1569WbeT免疫产生了具有极大比例的Ogawa特异性抗体的免疫血清，如下表所示。
  免疫血清  Inaba效价  Ogawa效价   Inaba/Ogawa比率
  JS1569 Inaba   480   260   1.8∶1
  用Ogawa A457吸附JS1569   180   60   3∶1
  用1569 WbeT吸附JS1569   240   60   4∶1
  A457 Ogawa   660   1940   1∶1.9
  用Inaba 1569吸附A457   240   1020   1∶4.3
  用JS1569 WbeT吸附A457   180   40   1.8∶1
  JS1569 WbeT   420   1580   1∶3.8
  用Ogawa A457吸附WbeT   150   60   2.5∶1
  用Inaba JS1569吸附WbeT   180   920   1∶5.1
 用JS1569 WbeT吸附WbeT   120   100   1.2∶1
实施例2通过表达突变蛋白进行遗传修饰的表达Ogawa和Inaba两种血清型的O1抗原的霍乱弧菌细胞：突变蛋白质的基于质粒的表达
在Hikojima菌株的基因的单个GenBank条目中，蛋白质158位的丝氨酸突变为脯氨酸(S158P)，尽管在鉴定为Inaba血清型的菌株(GenBank登录号分别为FJ619106和DQ401028)中也发现了相同的突变。用引物wbeT1 EcoRI(SEQ ID NO：1 5′-CCCGGTCTCGAATTCCTGCATCTGCAAGTTGATTCTGTATG-3′)和wbeT2 HindIII(SEQ IDNO：2
5′-CCCGGTCTCAAGCTTATAGTGAACTCTTCGGAAATGTCTG-3′)，从O1 El Tor Ogawa菌株VX44945中扩增野生型基因，用Eco31I消化并克隆入已被EcoRI和HindIII消化的来自pAF1()的表达载体，其中克隆的基因置于强的合成tac启动子的控制下。通过用引物wbe1(SEQ ID NO：35′-CTGCATCTGCAAGTTGATTCTGTATG-3′)和wbe2(SEQ ID NO：45′-ATAGTGAACTCTTCGGAAATGTCTG-3′)对质粒进行DNA测序来确定基因的序列。
野生型基因的DNA序列见SEQ ID NO：5，野生型蛋白序列见SEQ ID NO：6。
表达野生型的质粒(PML-wbeTtac)全序列见SEQ ID NO：7。
为了构建在基因产物的158位氨基酸带有突变的突变体文库，合成了寡核苷酸wbeT m3(SEQ ID NO：85′-GCGCGCCAGAACTTGGCTATTTTTAACC-3′)和wbeT m1(SEQ IDNO：95’-GGGGGTTCGAAGTTTATGAGTTTGATAATAGGGTGNNBTCATTATATTTTCAAAAAAATACAGACATAGCAGATAAGGTTAAAAATAGCCAAGTTCTGGCGCGC-3’)。将这两个寡核苷酸以等摩尔量混合，在室温下退火过夜。在存在过量的脱氧核糖核苷酸三磷酸的情况下，通过用T4DNA聚合酶延伸短wbeT m3引物来生成全长双链DNA。产生的片段用Bsp119I和Van91I消化并连接至用同样酶消化的(SEQID NO：7)中。连接的DNA用于转化市售的电感受态大肠杆菌菌株DH12S(Invitrogen)。在无抗生素选择下进行孵育后，将细胞的小等分试样涂布在补充有氨苄青霉素(100μg/ml)的选择性LB琼脂平板上。其余的细胞用新鲜LB培养液稀释至25ml。加入终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素，在37℃过夜培养培养物以获得克隆文库。向所得培养物的等分试样中补充终浓度为17％的甘油并储存于-70℃。其他等分试样用于制备质粒DNA。
将LB琼脂平板上获得的菌落挑取至新平板，培养菌落以制备质粒DNA。对质粒进行测序以确定基因是否带有突变。从文库获得的突变体有以下几种：S158G、S158P、S158V、S158I、S158L、S158A、S158T、S158M、S158W、S158R、S158C和S158F。此外，分离了野生型基因和158位带有终止信号TGA的基因。
分离不同的质粒并用于转化O1的经典Inaba菌株JS1569。该菌株具有突变的基因，其蛋白质219位的甘氨酸(GGA)变为终止密码子(TGA)，产生截短的无活性产物(SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11)。
还有其他多态性，它们未显示出任何重要意义。
通过引入不同重组质粒产生的不同菌株在诱导条件(存在1mMIPTG)下培养时表达不同水平的Ogawa抗原。基于凝集测定来评估表型，在一些情况下使用抑制ELISA(见实施例5中材料和方法的描述)评估。野生型基因产生几乎完全的血清型转换，而其他基因(例如S158P和S158G)与Ogawa特异性抗血清有轻微但可检测的凝集反应，也与Inaba特异性抗血清有凝集反应(因此具有Hikojima血清型)。一些突变体与Ogawa特异性抗血清没有可检测到的活性(S158I和S158C)，而另一些突变体有中间程度的凝集(S158T、S158F和S158W)。
结果明确地表明，基因产物的突变(尤其是158位的突变)产生酶活性改变的蛋白质。目前还没有可靠的测定来直接定量地测定这些突变体与野生型相比的酶活性水平，但可以如实施例5中那样容易地评估相关最终结果。总之，除S158C和S158I之外的所有突变体都能在一定程度上回补宿主菌株的Inaba表型。
实施例3通过表达突变蛋白进行遗传修饰的表达Ogawa和Inaba两种血清型的O1抗原的霍乱弧菌细胞：突变的染色体插入
用实施例2中产生的突变基因替换JS1569菌株中截短的染色体基因。用引物wbeT1 BlgII(SEQ ID NO：1)和wbeT2 BglII(SEQ ID NO：2)扩增相关的突变基因。扩增片段用BglII消化并连接入已用BamHI消化的自杀载体pMT-SUICIDE(SEQ ID NO：12)。这是一个小的基于R6K的自杀载体，由M.Lebens在本实验室中构建，其带有氯霉素抗性基因和来自宽宿主范围质粒RP4的转移起点(oriT)，在辅助质粒(pNJ5000；Grinter NJ，Gene.1983 Jan-Feb；21(1-2)：133-43)帮助下，该转移起点允许质粒接合转移至霍乱弧菌菌株。
在生成的克隆中，基因(S158G和野生型)均以与cat基因相反的方向插入了克隆基因。这种载体的序列由SEQ ID NO：13(带有野生型基因；S158G构建体除编码残基158的核苷酸外均相同)示例。
将产生的质粒接合入JS1569菌株，根据氯霉素和利福平抗性进行选择。由于质粒没有对于质粒丢失的反式选择，其通过同源重组插入染色体中产生质粒分隔开的该基因的串联拷贝。根据重组发生的位置，克隆有不同的表型(见实施例5)。
已获得野生型基因的菌株(1342)有明确的Hikojima表型。抑制ELISA显示，其表达的存在于菌株表面的Ogawa LPS仅为获得S158G突变所表达的15％。后一菌株(1356)实际上是Ogawa菌株，其与Ogawa特异性抗血清强烈凝集，但与Inaba特异性抗血清完全不凝集。
但这些菌株很稳定；它们保留了其LPS血清型，而且即使在没有选择的情况下仍保留了氯霉素抗性，这表明质粒不容易丢失。
用wbe1和2引物(分别为SEQ ID NO：3和4)进行的PCR和测序表明，菌株中有两个基因在宿主中存在的基因和引入的基因之间的变化位点上发生了变化。用引物wbeTfor 87＞(SEQ ID NO 14：5′-CGGTGCAAACGTTGGAACTTTCTG-3′)和wbeT rev 51＜(SEQ IDNO 15：5′-GGAAAACAATGCCATCCAAATTCGC-3′)(仅在存在基因的串联拷贝时允许扩增)扩增和测序成功扩增了近端基因的3’端(从87位氨基酸)和远端基因的5’端(直到51位氨基酸)以及中间的质粒。用wbeTfor 87＞引物测序表明，在菌株1342中，与天然启动子相邻的基因是截短的宿主基因。远端基因有野生型序列但是没有启动子。这样的排列产生Hikojima表型，因为野生型基因由潜在启动子以非常低的水平表达。
在Ogawa菌株1356中，排列是不同的。重组使天然基因由天然的启动子表达，而突变S158G基因被置于远端，因此无任何可识别的启动子。两个基因拷贝看来都已失去了219位的终止密码子，但这种突变对表型没有明显的影响。
实施例4通过表达低水平的天然蛋白质进行遗传修饰的表达Ogawa和Inaba两种血清型的O1抗原的霍乱弧菌细胞
与在实施例2中所述对突变进行的实验相结合注意到，即使在不诱导的时候，带有野生型的对照质粒也能部分地回补JS1569菌株中的突变基因。即使在野生型基因存在的情况下这样也产生Hikojima血清型，这表明该表型还可通过限制表达水平来实现；在这种情况下是通过持续抑制tac启动子和仅允许在无诱导剂存在时发生突破性表达。
在实施例3中，克隆1342有由潜在启动子表达的染色体整合的野生型基因，其产生Hikojima血清型。这些结果证实，野生型基因在极低水平的表达可产生Hikojima血清型。
实施例5遗传修饰的霍乱弧菌细胞的表型的表征
在LB琼脂平板上培养霍乱弧菌菌株JS1569(Inaba)，其被改造为包含编码野生型甲基化酶蛋白(JS1569/S158S菌株)的质粒，或编码突变基因(编码带有158位S到G(JS1569/S158G)或S到A(JS1569/S158A)突变的蛋白质)的质粒，分别用Inaba和OgawaO抗原特异性抗体测试单菌落的凝集。
这些抗体这样获得：首先分别用纯化的Ogawa和Inaba LPS免疫兔，然后用福尔马林灭活的异源血清型细菌来彻底吸附血清以除去交叉反应的抗体。吸附后，Ogawa特异性抗血清与参照的Ogawa血清型霍乱弧菌细胞强烈凝集，但不凝集Inaba细胞，对Inaba特异性血清则相反。
凝集测试按照标准方法进行。简言之，将测试菌株新鲜平板上的单菌落悬浮于50-100μL生理盐水缓冲液中，取10μL混悬液置于显微镜载片上。然后加入10μL适当稀释的特异性抗血清，通过将载玻片来回倾斜长达5分钟使其与细胞混合，直到凝集清晰可见。每次测定都与由Inaba和Ogawa参照菌株细胞组成的阴性和阳性对照比较。
此外，对每个测试菌株进行自发凝集的对照实验，其中由缓冲液代替血清。结果见下表，结果表明，包含编码野生型蛋白之质粒的JS1569/S158S菌株的血清型已完全由Inaba转换为Ogawa；带有158S到G突变的JS1569/S158G菌株有Ogawa的强表达，但也可检测到Inaba反应性；而带有158 S到A突变的JS1569/S158A仅有极少的Ogawa反应性。
  菌株   WbeT编码质粒  与抗Ogawa抗体的凝集  与抗Inaba抗体的凝集
  JS1569 Inaba   无   -   +++
  Cairo 50 Ogawa   无   +++   -
  A457 Ogawa   无   +++   -
  JS1569/S158S   WbeT S158S野生型   +++   (+)
  JS1569/S158G   WbeT S158G   ++   ++
  JS1569/S158A   WbeT S158A   (+)   +++
测试福尔马林灭活的相同菌株的细菌与相同血清的凝集时证实了这些结果。用ELISA抑制法测试福尔马林灭活细菌的细菌表面Inaba和Ogawa抗原的定量表达时也证实并扩展了这些结果。该方法如下进行：通过用5μg/ml纯化Ogawa LPS的PBS溶液(每孔100μl)孵育过夜用Ogawa LPS包被高结合的Greiner Bio-one平板。从200微升OD600为1.00的福尔马林灭活细菌开始，在PBS中进行7个梯度的5倍稀释(最低到1∶15625)，第八个空白管不含细胞。将150微升的各个稀释液与被PBS，0.2％BSA适当稀释的等量抗Ogawa血清混合。在室温孵育样品1小时，不振摇。包被的板用PBS清洗两次，在37℃下用200μL/孔的PBS，0.1％BSA封闭30分钟。20,000×g离心5分钟以从混悬液中除去细胞，将100微升上清液加至到封闭的板。所有板都包含既没有细胞也没有抗Ogawa血清的PBS，0.1％BSA空白，所有样品均一式两份。在室温下孵育板1小时，然后用PBS，0.05％吐温20清洗三次。每孔加入100微升用PBS，0.1％BSA，0.05％吐温20适当稀释的山羊抗兔IgG，在室温下孵育1小时。用PBS，0.05％吐温20清洗平板三次，之后加入0.1％邻苯二胺(OPD)和0.012％H2O2的0.1M柠檬酸(pH4.5)底物溶液。10分钟后测得490nm处的吸光度。
外推出导致50％抑制的细菌稀释度，以及细菌稀释为1∶25时吸光度的抑制百分比，结果见下表。结果表明，包含编码野生型的基因的JS1569/S158S菌株能有效抑制特异性抗Ogawa血清，而包含具有单个突变的基因的菌株也可以以中度活性(JS1569/S158G)或仅可检测的程度(JS1569/S158A)抑制抗Ogawa血清：
  菌株   50％抑制的稀释度  1∶25稀释度的抑制％
  JS1569 Inaba   ＜＜1∶1   0
  A457 Ogawa   1∶60   65
  JS1569/S158G   1∶70   70
  JS1569/S158S   1∶1   20
分别基于编码和S158G的质粒得到JS1569的两种重组衍生株1356(野生型)和1342(S158G)，其中突变的基因已稳定地插入染色体中，获得了出乎意料但稳定的表型。对这些菌株的解释和描述见以上实施例。对这些菌株和适当的参照菌株进行菌落印迹，以测定Ogawa表达。将包含突变基因的菌株与Inaba和Ogawa对照菌株一起点种(patch out)在LB琼脂平板上并在37℃培养过夜。将用PBS浸湿的硝酸纤维素膜施加于长出菌落的平板上，并在室温放置15分钟。在纸上干燥膜5分钟，之后在室温用10ml PBS中的1％牛血清白蛋白(BSA)封闭20分钟，封闭两次。弃去封闭液，替换为在10ml含有0.1％BSA和0.05％吐温20的PBS中适当稀释的抗Ogawa血清。于室温在摇床上孵育膜2小时。然后用含0.05％吐温20的PBS清洗膜三次，之后加入在0.1％BSA的PBS，0.05％吐温20中的与辣根过氧化物酶缀合的山羊抗兔IgG(Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.)，在室温下轻柔振摇孵育2小时。
在进一步用PBS，0.05％吐温20洗三次，单独用PBS洗一次之后，用0.05％4-氯-1-萘酚和0.015％H2O2(在含500mM NaCl和16.7％甲醇的20mM Tris-HCl中，pH7.5)使膜显色15分钟。然后用自来水彻底洗净并放在纸上晾干。对显色的膜拍摄数码照片，并用计算机系统测量染色密度。
表中的结果显示，1356菌株表达的Ogawa抗原几乎与Ogawa参照菌株的一样多，而1342菌株表达Ogawa抗原的量小得多。用如上所述通过抑制ELISA测试福尔马林灭活的菌株制备物中Ogawa抗原的定量表达时，这些研究结果被进一步证实，结果见下表：
  菌株   斑点印迹密度单位/mm2   50％抑制的稀释度
  A457 Ogawa   12700   1∶60
  JS1569 Inaba   0   ＜＜1∶1
  1356   10000   1∶80
  1342   4500   1∶7
实施例6遗传修饰内源基因以获得Hikojima血清型
尽管上述实施例中给出的菌株稳定且明显具有期望表型，获得Hikojima表型的一种替代方式是在内源基因中进行真正的基因替换。内源活性基因产物中158位的适当突变(如以上公开的)也导致活性降低，从而形成Hikojima血清型。这将产生Ogawa表达水平不同的一系列突变体，可以对它们进行如实施例5的Hikojima表达测试和测试最佳免疫原特性的免疫实验。
如前所述，pMT-SUICIDE载体缺乏合适的反选择基因，已证实其难以分离已丢失质粒并保留期望基因和表型的衍生物。为此，构建了新的自杀载体，其带有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的sacB基因，使已丢失质粒的菌株在含有蔗糖的平板上进行选而分离，这是由于sacB基因产物在革兰氏阴性细菌中的表达是致死的，仅有因基因的两个拷贝之间同源重组而丢失质粒的细胞所形成的菌落能存活。质粒pMT Suicide/sacB(SEQ ID NO：16)比具有相同功能的类似质粒小得多，而且使用起来容易得多。
野生型和多种突变基因已被克隆进新载体，而且如之前那样接合进JS1569菌株和其他菌株，例如合适的Ogawa菌株。
为了使获得正确克隆的机会最大化，在选择候选菌株以进一步选择已将质粒重组出去的菌株前，将分析由转接实验产生的部分二倍体的基因排列。
实施例7杂合CFA/I+CS2的表达
最近已证明，大肠杆菌Top10和霍乱弧菌JS1569菌株可在其表面表达ETEC的主要定居因子之一，即CFA/I菌毛(Tobias J，Lebens M，I，Wiklund G，Svennerholm AM.Vaccine.2008Feb 6；26(6)：743-52)。含有CFA/I的表达载体电穿孔进入上述菌株之后，用斑点印迹测定检测到在表面的表达。
最近还证明，大肠杆菌TOP10二者表达杂合菌毛，其包含CFA/I和CS2(即另一ETEC主要定居因子)的主要亚基(Tobias J，SvennerholmAM，Holmgren J，Lebens M.Appl Microbiol Biotechnol.2010 Jul；87(4))。
因此，我们研究了在霍乱弧菌JS1569中表达相同杂合菌毛的可行性。如所述用表达载体pJT-CFA/I-CotA对菌株进行电穿孔(Tobias等，2008，supra；Tobias J，Holmgren J，Hellman M，Nygren E，Lebens M，Svennerholm AM.Vaccine.2010 Aug 20.[Epub ahead of print])。
然后将50个菌落(克隆)划线涂布在两个补充有氯霉素(12.5μg/ml)和IPTG(1mM)的LB平板上，然后在37℃孵育过夜。然后将1∶6抗CFA/I的特异性单克隆抗体(MAb)和10∶3抗CS2的MAb用于菌落印迹测定(Tobias等，2010，同上)，以检测霍乱弧菌JS1569上杂合CFA/I-CotA菌毛的表面表达。然后将印迹显色，表明所有50个测试的霍乱弧菌JS1569克隆上杂合CFA/I-CS2菌毛的表面表达信号均为阳性。
因此，可以在已被改造为表达Ogawa和Inaba两种血清型的O1抗原的相同细胞中联合表达抗原性杂合菌毛。

Claims (16)

1.同时表达Inaba和Ogawa两种抗原的霍乱弧菌O1细胞，其特征在于：
a.所述细胞包含内源wbeT基因；和
b.所述细胞包含能调节所述内源wbeT基因的酶活性的重组DNA构建体；以及其中
c.调节后的WbeT酶活性水平使得所述细胞同时表达Inaba和Ogawa抗原；
其中，所述DNA构建体适于通过同源重组来改变霍乱弧菌细胞的内源wbeT基因；
其中所述内源wbeT基因的改变包括替换SEQ ID NO:6的158位丝氨酸残基。
2.权利要求1的霍乱弧菌O1细胞，其中所述重组DNA构建体是适于通过同源重组来改变宿主的内源wbeT基因的DNA构建体。
3.权利要求1或2的霍乱弧菌O1细胞，其中所述细胞表达的O1抗原中10-90％为Ogawa血清型。
4.权利要求1至3中任一项的霍乱弧菌O1细胞，其中所述细胞还表达一种或更多种ETEC定居因子蛋白，其中所述定居因子蛋白以单一菌毛、双菌毛或杂合菌毛的形式表达。
5.由权利要求1-4中任一项的霍乱弧菌O1细胞获得的疫苗，其包含霍乱弧菌(Vibrio cholerae)O1细胞，其特征在于所述细胞包含Ogawa和Inaba两种血清型的O1抗原。
6.制造权利要求5之疫苗的方法，其包括以下步骤：
a.提供包含Ogawa和Inaba两种血清型之O1抗原的霍乱弧菌O1细胞；和
b.灭活所述细胞，其中
所述灭活通过福尔马林处理来实施，
所述细胞是权利要求1至4中任一项的细胞。
7.权利要求5的疫苗，其中所述疫苗包含多种含有Ogawa和Inaba两种血清型O1抗原的霍乱弧菌O1细胞，而且其中所述细胞平均10-90％的O1抗原为Ogawa血清型。
8.权利要求5的疫苗，其中所述细胞还包含一种或更多种ETEC定居因子蛋白，其中所述定居因子蛋白以单一菌毛、双菌毛或杂合菌毛的形式表达。
9.权利要求5的疫苗，前提是除了包含Ogawa和Inaba两种血清型之O1抗原的霍乱弧菌O1细胞外，所述疫苗不包含任何其他免疫活性全细胞。
10.权利要求5的疫苗，其中所述疫苗用于经口施用。
11.权利要求5的疫苗，其中所述细胞是福尔马林灭活的。
12.权利要求5的疫苗，其用于预防性免疫。
13.权利要求12的疫苗，其用于针对霍乱和/或肠产毒性大肠杆菌感染(ETEC)的预防性免疫。
14.权利要求13的疫苗在制备用于诱导预防性免疫力的药物中的用途。
15.权利要求14的用途，其中所述预防性免疫力针对霍乱和/或肠产毒性大肠杆菌感染(ETEC)。
16.权利要求15的用途，其中所述药物用于经口施用。
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