ES2616912T3 - Vacuna contra la diarrea debida a E. coli enterotoxigénica (ETEC) y el cólera - Google Patents

Abstract

Vacuna que comprende una célula de Vibrio cholerae O1, caracterizada porque dicha célula comprende antígenos O1 de los serotipos tanto Ogawa como Inaba, en la que la vacuna comprende múltiples células de Vibrio cholerae que comprenden antígenos O1 de los serotipos tanto Ogawa como Inaba, y en la que, en promedio, el 10-90% de los antígenos O1 de las células son del serotipo Ogawa.

Description

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fenotipo deseado.

Muchas mutaciones diferentes de la proteína WbeT pueden dar como resultado potencialmente una proteína adecuadamente activa, y tales variantes mutadas puede obtenerlas fácilmente el experto en la técnica usando métodos bien conocidos en la técnica mediante mera experimentación de rutina, basándose en las enseñanzas en el presente documento. Tanto si se obtiene una célula del fenotipo deseado expresando la proteína WbeT mutada o no, puede analizarse fácilmente por el experto en la técnica, usando, por ejemplo, los métodos dados a conocer en el ejemplo 5. Los inventores han identificado serina 158 en la proteína WbeT (SEQ ID NO: 6) como residuo adecuado para modular la actividad. Por tanto, las mutaciones comprenden preferiblemente una sustitución en la serina 158, más preferiblemente sustitución de serina 158 por glicina, prolina, valina, leucina, alanina, treonina, metionina, triptófano, arginina o fenilalanina. Lo más preferiblemente, la serina 158 se sustituye por glicina, prolina, treonina, fenilalanina o triptófano.

Proteína(s) de factor de colonización (CF) de ETEC

Tal como resulta evidente a partir de lo anterior, la vacuna de la invención (o más bien las células en las que se basa la vacuna) también puede comprender otras características potenciadas además de la expresión combinada de antígenos O1 del serotipo tanto Inaba como Ogawa. En particular, las células pueden expresar una o más proteínas de factor de colonización (CF) de ETEC, tales como CFA/I, CS2 o CS5, en las que dicha(s) proteína(s) de CF se expresa(n) o bien como fimbrias únicas, dobles o bien híbridas, tal como se demuestra en el ejemplo 7. La inclusión de tales proteínas de CF en las células de la vacuna es especialmente útil para inducir inmunidad protectora contra ETEC.

La expresión “que comprende” tal como se usa en el presente documento debe entenderse que incluye, pero no se limita a, los puntos establecidos.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que han de entenderse como no limitativos.

Ejemplo 1. Preparación y pruebas de una vacuna que comprende células de Vibrio cholerae que comprenden antígenos O1 de los serotipos tanto Ogawa como Inaba

Se sometió a prueba si una vacuna que comprende bacterias de V. cholerae de la cepa JS1569 (Inaba) que se habían modificado genéticamente para expresar antígenos O1 de los serotipos tanto Ogawa como Inaba daría lugar a una respuesta de anticuerpos con una proporción diferente de anticuerpos que reaccionan con LPS de Ogawa e Inaba en ELISA en comparación con la respuesta de anticuerpos tras la inmunización con la cepa Inaba JS1569 original.

Las bacterias del ejemplo 2 (véase a continuación) se inactivaron con formalina y se usaron para la inmunización. Se realizó la inactivación con formalina de bacterias y las inmunizaciones orales y los métodos de ensayo tal como se describió anteriormente (Nygren E, Li BL, Holmgren J, Attridge SR. Infect Immun. Agosto de 2009; 77(8):3475-84). Resumidamente, se inmunizaron ratones Balb/c en 3 rondas a intervalos de 2 semanas con dos dosis diarias de 3x108 células inactivadas con formalina (junto con un adyuvante para la cepa WbeT), y una semana tras la última inmunización se sacrificaron los ratones y se recogió suero y se sometió a prueba para obtener los títulos de anticuerpo IgG/IgM combinados en placas de ELISA recubiertas con LPS o bien de Inaba o bien de Ogawa.

Los resultados se presentan en la tabla a continuación y muestran en contraposición a la cepa Inaba JS1569 original que dio lugar a una respuesta de anticuerpos con un título anti-Inaba ligeramente más alto que anti-Ogawa, la vacuna Wbe S158S de tipo natural/JS1569 dio lugar a una respuesta de anticuerpos con un título anti-Ogawa mucho más alto que anti-Inaba, aunque todavía dio lugar a una modesta formación de anticuerpos anti-Inaba específicos:

Suero inmunológico

Títulos de Inaba/Ogawa (razón)

Frente a JS1569

10290/5060 (2:1)

El mismo absorbido con Ogawa

2940/160 (18:1)

Frente a Wbe S158S de tipo natural/JS1569

36000/365000 (1:10)

El mismo absorbido con Inaba

1600/49000 (1:30)

El mismo absorbido con Ogawa

1700/2500 (1:1,5)

Estos hallazgos se confirmaron cuando se administraron inmunizaciones por vía subcutánea sin adyuvante. En una marcada diferencia con respecto a la inmunización con la cepa Inaba JS1569 original y más similar a la inmunización con la cepa de referencia Ogawa A457, la inmunización con JS1569 WbeT dio lugar a suero inmunológico con una fuerte proporción de anticuerpos específicos de Ogawa, tal como se muestra en la tabla a continuación.

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JS1569 Inaba

480 260 1,8:1

JS1569 abs con Ogawa A457

180 60 3:1

JS1569 abs con 1569 WbeT

240 60 4:1

A457 Ogawa

660 1940 1:1,9

A457 abs con Inaba 1569

240 1020 1:4,3

A457 abs con JS1569 WbeT

180 40 1,8:1

JS1569 WbeT

420 1580 1:3,8

WbeT abs con Ogawa A457

150 60 2,5:1

WbeT abs con Inaba JS1569

180 920 1:5,1

WbeT abs con JS1569 WbeT

120 100 1,2:1

Ejemplo 2: Células de Vibrio cholerae genéticamente modificadas que expresan antígenos O1 de los serotipos tanto Ogawa como Inaba mediante la expresión de proteína WbeT mutada: expresión basada en plásmidos de proteína WbeT mutada

En una única entrada en GenBank del gen wbeT de una cepa Hikojima hay una mutación que convierte una serina en prolina en la posición 158 de la proteína (S158P) aunque la misma mutación se ha descrito en una cepa identificada como perteneciente al serotipo Inaba (números de registro de GenBank FJ619106 y DQ401028, respectivamente). Habiendo amplificado el gen wbeT de tipo natural a partir de la cepa O1 El Tor Ogawa VX44945 con los cebadores wbeT1 EcoRI (SEQ ID NO: 1 5’-CCCGGTCTCGAATTC CTGCATCTGCAAGTTGATTCTGTATG3’) y wbeT2 HindIII (SEQ ID NO: 2 5’-CCCGGTCTCAAGCTTATAGTGAACTCTTCGGAAATGTCTG-3’), se digirió con Eco31I y se clonó en un vector de expresión derivado de pAF1 () en el que el gen clonado se colocó bajo el control del promotor tac de síntesis potente que se había digerido con EcoRI y HindIII. La secuencia del gen se confirmó mediante secuenciación de ADN del plásmido con los cebadores wbe1 (SEQ ID NO: 3 5’-CTGCATCTGCAAGTTGATTCTGTATG-3’) y wbe2 (SEQ ID NO: 4 5’-ATAGTGAACTCTTCGGAAATGTCTG-3’).

La secuencia de ADN del gen wbeT de tipo natural se muestra en SEQ ID NO: 5 mientras que la proteína de tipo natural se muestra en SEQ ID NO: 6.

La secuencia completa del plásmido (pML-wbeTtac) que expresa wbeT de tipo natural se muestra en SEQ ID NO: 7.

Para construir la biblioteca de mutantes de wbeT que porta mutaciones en la posición de aminoácido 158 del producto génico, se sintetizaron los oligonucleótidos wbeT m3 (SEQ ID NO: 8 5’-GCGCGCCAGAACTTGGCTATTTTTAACC-3’) y wbeT m1 (SEQ ID NO: 9 5’-GGGGGTTCGAAGTTTATGAGTTTGATAATAGGGTGNNBTCATTATATTTTCAAAAAAATACA GACATAGCAGATAAGGTTAAAAATAGCCAAGTTCTGGCGCGC-3’). Los dos oligonucleótidos se mezclaron en cantidades equimolares y se permitió que hibridaran a temperatura ambiente durante la noche. Se preparó ADN bicatenario de longitud completa mediante extensión del cebador corto wbeT m3 usando ADN polimerasa de T4 en presencia de trifosfatos de desoxirribonucleótido en exceso. El fragmento resultante se digirió con Bsp119I y Van91I y se ligó en pML-wbeTtac (SEQ ID NO: 7) digerido con las mismas enzimas. El ADN ligado se usó para transformar la cepa de E. coli electrocompetente obtenida comercialmente DH12S (Invitrogen). Tras la incubación sin selección con antibiótico, se extendió una pequeña alícuota de las células sobre una plaga de agar LB selectivo complementado con ampicilina (100 µg/ml). El resto de las células se diluyó hasta 25 ml con caldo LB nuevo. Se añadió ampicilina hasta una concentración final de 100 µg/ml y se hizo crecer el cultivo durante la noche a 37ºC para obtener una biblioteca de clones.

Se complementaron alícuotas del cultivo resultante con glicerol hasta una concentración final del 17% y se almacenaron a -70ºC. Se usaron otras alícuotas para preparar ADN de plásmido.

Se recogieron las colonias obtenidas sobre la placa de agar LB sobre una nueva placa y se cultivaron las colonias para preparar ADN de plásmido. Los plásmidos se secuenciaron para determinar si los genes wbeT portaban mutaciones. Los mutantes de wbeT obtenidos a partir de la biblioteca son los siguientes: S158G, S158P, S158V, S158I, S158L, S158A, S158T, S158M, S158W, S158R, S158C y S158F. Adicionalmente, se aislaron el gen de tipo natural y un gen con la señal de terminación TGA en la posición 158.

Se aislaron los diferentes plásmidos y usaron para transformar la clásica cepa Inaba O1 JS1569. Esta cepa tiene un gen wbeT mutante cambiándose la glicina (GGA) en la posición 219 de la proteína a un codón de terminación (TGA) dando como resultado un producto truncado e inactivo (SEQ ID NO: 10 y SEQ ID NO: 11).

Hay otros polimorfismos que no parecen tener ninguna importancia.

Las diferentes cepas generadas por la introducción de los diferentes plásmidos recombinantes expresaron diferentes niveles del antígeno Ogawa cuando se hicieron crecer en condiciones inductoras (en presencia de IPTG 1 mM). El fenotipo se evaluó basándose en ensayos de aglutinación y en algunos casos usando ELISA de inhibición (véase el ejemplo 5 para la descripción de materiales y métodos). El gen de tipo natural dio lugar a un cambio de serotipo casi

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