CN102824632A

CN102824632A - 霍乱弧菌o1群多糖结合疫苗、其制备方法及应用

Info

Publication number: CN102824632A
Application number: CN2012103378003A
Authority: CN
Inventors: 张静飞; 陈磊; 魏文进; 曹天成; 何金娜
Original assignee: BEIJING MIN HAI BIO-SCIENTIFIC Inc
Current assignee: BEIJING MIN HAI BIO-SCIENTIFIC Inc
Priority date: 2012-09-12
Filing date: 2012-09-12
Publication date: 2012-12-19

Abstract

本发明提供了一种霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗，其为霍乱弧菌O1群表面多糖与蛋白载体的偶联物，所述霍乱弧菌O1群表面多糖为霍乱弧菌O1群的小川型或稻叶型血清型经脱毒后的LPS。本发明还提供所述多糖结合疫苗的制备方法及应用。本发明提供的霍乱弧菌O1多糖结合疫苗新配方制剂具有良好的生物活性，通过粘膜免疫，不良反应率低，更易被潜在用户接受，可有效激发机体产生抗霍乱弧菌O1群细菌抗体和抗霍乱毒素抗体。

Description

霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及疫苗制备领域，具体地说，涉及一种霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗、其制备方法及应用。

背景技术

兼具保护抗原和必要毒力因子的病原菌表面多糖（如：LPS或CPS）是制备多糖疫苗的基础。利用肺炎球菌、脑膜炎球菌、沙门氏菌等表面多糖制备的疫苗已经上市，正发挥着重要的预防作用。然而，多糖疫苗不能激发婴幼儿体内产生相应的保护性抗体；在成人中，多糖疫苗虽然可激发产生高滴度的抗菌抗体，但是激发产生的抗体属Th细胞不依赖性抗原（Ti-Ag），抗体仅为IgM。如果将具有保护性质的细菌表面多糖与蛋白质进行共价结合，则不仅能够解决上述问题，而且多糖蛋白质结合疫苗还可以激发T细胞依赖的抗体应答。

LTB为大肠杆菌不耐热肠毒素的无毒亚单位，可以和大多数哺乳动物细胞膜上的神经结苷脂（GM1）受体结合。LTB可以作为某些半抗原的稳定载体，当它与化学偶联或基因融合的抗原同时进入体内之后，会激起融合表位抗原的免疫原性，使机体产生强烈的免疫反应，达到免疫保护作用。LTB可作为良好的蛋白半抗原和弱抗原的载体，同时还可以赋予半抗原免疫原性，增强弱抗原的免疫原性。同时，LTB与霍乱菌素B亚基（CTB）的氨基酸有80%的同源性，具有相似的免疫原性和免疫调制作用，研究表明，两者皆可引起强的抗毒素反应，与抗原联合使用后可增强免疫反应。

目前，霍乱依然是世界各国重要的公共卫生问题之一，控制霍乱流行的长效机制依赖于良好的个人卫生、无污染饮用水的供应以及恰当的公共卫生设施。然而，短期内在诸多霍乱流行的国家和地区很难通过在这些方面的有效管理使霍乱流行得以控制，再者，临床分离的致病菌株抗药性日趋严重，因此急需有效的霍乱疫苗作为预防霍乱流行的一项公共卫生措施。

现阶段新型霍乱疫苗的研究主要集中在利用口服免疫激发粘膜免疫系统产生抗体，该类口服霍乱疫苗已经经过临床试验，上市销售；另一类多糖结合疫苗在I、II期临床研究中证明有效，成为新型霍乱疫苗研发的新方向，此类疫苗，由灭活的霍乱弧菌细菌菌体和霍乱毒素B亚单位组成（WC/BS)，临床结果显示，该疫苗可为处于霍乱流行区的难民提供有效预防，得到WHO的大力推荐；再一类疫苗为基因重组的CVD103-HgR减毒活疫苗，虽然该疫苗在美国临床试验中显示有60-100%的保护力，然而，疫苗株可能通过水平基因转移或基因重组导致毒力回归，不推荐用于公共卫生防御。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗、其制备方法及应用。

为了实现本发明目的，本发明的一种霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗，其为霍乱弧菌O1群表面多糖与蛋白载体的偶联物，且所述霍乱弧菌O1群表面多糖为霍乱弧菌O1群的小川型或稻叶型血清型经脱毒后的LPS（脂多糖，Lipopolysaccharide）。

前述多糖结合疫苗中，所述霍乱弧菌O1群表面多糖与蛋白载体的重量比为0.2-3:1，优选0.2-2:1，更优选1:1。

前述多糖结合疫苗中，所述的蛋白载体为霍乱毒素B亚单位（Cholera Toxin B subunit，CTB）或大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位（Heat-Labile Toxin B Subunit，LTB）。由于LTB能够调节与自身免疫性疾病（关节炎、糖尿病、多发性硬化症等）有关的Th1型反应，因此LTB比CTB更具优势，优选使用的蛋白载体为LTB。

前述多糖结合疫苗中，还含有药用赋形剂，例如乳糖等。

前述多糖结合疫苗中，还含有铝盐佐剂和/或硫柳汞。所述铝佐剂如氢氧化铝、磷酸铝或硫酸铝。

前述多糖结合疫苗在使用时，将疫苗溶于pH值6.0~9.0（优选pH7.0）的缓冲体系中，制成喷雾剂或液体剂；所述缓冲体系为磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐或酒石酸盐缓冲体系。

本发明还提供制备所述霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗的方法，包括以下步骤：1）大规模培养霍乱弧菌后，灭活，离心并收集菌体；2）分离纯化霍乱弧菌O1群LPS；3）脱除LPS中的内毒素成分，透析、过滤、干燥后得纯化的O-SP（O特异多糖，O-specific polysaccharides）；4）用溴化氰活化霍乱弧菌O1群O-SP，以乙二酰肼为间隔剂，碳二亚胺为连接剂，将霍乱弧菌O1群O-SP和载体蛋白进行偶联；5）去除偶联物中的内毒素，分装即得。其中，步骤3）为采用酸（如醋酸）水解法脱除LPS中的类脂A等内毒素成分。

本发明进一步提供所述霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗在制备用于预防或治疗由霍乱弧菌O1群引起的疾病的药物中的应用。

本发明提供的霍乱弧菌O1多糖结合疫苗新配方制剂具有良好的生物活性，通过粘膜免疫，不良反应率低，更易被潜在用户接受，可有效激发机体产生抗霍乱弧菌O1群细菌抗体和抗霍乱毒素抗体。

附图说明

图1为本发明实施例9中霍乱弧菌O1多糖结合疫苗的抗毒抗体检测结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1霍乱弧菌O1群LPS的制备

分别取购自中国医学细菌保藏管理中心的霍乱弧菌（V.cholerae）CMCC 18001（古典生物型、小川血清型）和霍乱弧菌（V.cholerae）CMCC 16012（El Tor生物型、稻叶血清型）冻干工作种子批菌种，经活化、发酵后离心获得霍乱弧菌O1群的菌体，用于制备LPS。

取培养后离心得到的湿菌体100g，加入无热源的双蒸馏水至1000mL，充分混匀后，加入等体积95%的苯酚，用1mol/LNaOH调节pH至7.0，68℃搅拌1h，迅速冷却至10℃，水浴搅拌30min，4℃、8000g离心3h，吸取上清，依次加入终浓度为25%的乙醇、1‰的CaCl₂、3%的醋酸钠，4℃孵育过夜；9000rpm、4℃，离心6h，加入终浓度为75%的乙醇，沉淀过夜；6000rpm、4℃，离心1h，弃上清；加入RNA酶、DNA酶、蛋白酶K，孵育去除核酸、菌体蛋白；再次酚抽提，无热源水充分透析，冷冻干燥，为精制LPS。

实施例2霍乱弧菌O-SP的制备

采用酸水解法脱去LPS组成中的内毒素成分-类脂A后，即得O-SP。

分别取霍乱弧菌CMCC 18001和霍乱弧菌CMCC 16012冻干后的LPS，用1%冰醋酸溶解至终浓度为10mg/mL，沸水浴孵育90min后，冷却至室温，1mol/L NaOH调节pH至7.0，经60000g离心5h后收集上清；4℃，用无热原的双蒸水充分透析，经0.22μm滤膜过滤，真空干燥，即为精制O-SP。

实施例3表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位工程菌的构建

1.1根据NCBI公布的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位编码基因（GenBank登录号：AB011677，其中864-1238为LTB编码基因）人工合成该基因，设计引物，加入核酸内切酶酶切位点，上游引物LTB-F：5’-GATATAGATCTATGAATAAAGTAAAATG-3’（下划线为Bgl II酶切位点），下游引物LTB-R：5’-CCGCTCGAGCTAGTTTTCCATACTGAT-3’（下划线为Xho I酶切位点）；

1.2以人工合成的LTB DNA片段为模板，经PCR扩增获得375bp的大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的编码基因片段（SEQ ID No.1）；

1.3将该目的基因片段用Bgl II和Xho I进行双酶切，与用相同核酸内切酶酶切的表达载体pET-22b进行连接，导入宿主细胞E.coli BL21（DE3），经筛选得到高效分泌表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的工程菌株，命名为E.coli MH-LTB001；

1.4按照《生物制品生产检定用菌毒种管理规程》的要求，建立大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位表达菌株三级菌种库。

实施例4大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位制备

1.1种子液制备将实施例3制备的工作种子批菌种接种于新鲜LB液体培养基，37℃培养过夜制备种子液，供发酵罐接种用；

1.2细菌发酵发酵培养可选择适宜大肠杆菌生长的培养基，可流加甘油等作为补充碳源。当细菌生长到OD_600nm=10时，加入终浓度为0.2mmol/L的IPTG诱导目的蛋白产生，继续培养4~6h后，停止培养；

1.3分离纯化调节发酵液pH值至6.5，6500rpm、4℃连续离心发酵液，收集菌体，用pH6.0的磷酸缓冲液洗涤菌体2-3次，匀浆破碎，8000rpm、4℃连续离心，去除沉淀、收集上清，用≤3kD的超滤膜浓缩LTB溶液，并进行离子交换层析纯化，用含1mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱目标蛋白，在280nm波长下检测层析峰，收集目标峰，得到LTB溶液。

1.4过滤、保存纯化后的LTB溶液用0.22μm微孔滤膜进行除菌过滤，分装于大瓶中，于2～8℃保存备用。

实施例5霍乱弧菌O1群O-SP与LTB偶联物的制备

采用相同的方法分别制备霍乱弧菌O1群小川型和稻叶型LPS偶联物。

将霍乱弧菌O1群两种O-SP，分别用0.005mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）稀释至10mg/mL，按多糖与溴化氰（1g/mL，溶于乙腈）1:1的质量比进行混合，用NaOH调节pH值至10.5，室温孵育1h；调节pH值至8.5，加入终浓度为0.1mol/L的乙二酰肼反应10~20min，4℃孵育过夜。过夜体系使用Sephadex G-25柱进行层析，收集V0峰，冻干备用。

衍生后的多糖与载体蛋白LTB按0.8:1的质量比混合，用1.0mol/LHCl调节pH值至5.5，加入与多糖等量的碳二亚胺室温下孵育1h。用Sepharose 4FF凝胶层析，纯化O-SP-LTB偶联物，收集V₀峰，再经0.22μm滤膜除菌过滤，获得O-SP-LTB偶联物。

参照《中华人民共和国药典》（2010年版）规定的方法检定蛋白含量、分子大小、鉴别试验、内毒素含量及无菌试验等，项目合格后储存于2-8℃备用。

实施例6霍乱弧菌O1群O-SP与CTB偶联物的制备

将霍乱弧菌O1群两种O-SP，分别用0.005mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.2）稀释至10mg/mL，按多糖与溴化氰（1g/mL，溶于乙腈）1:1的质量比进行混合，用NaOH调节pH值至10.5，室温孵育1h；调节pH值至8.5，加入终浓度为0.1mol/L的乙二酰肼反应10~20min，4℃孵育过夜。次天，用含5mmol/L EDTA的磷酸缓冲液（pH7.5）超滤换液，衍生后的多糖与载体蛋白CTB按0.75:1的质量比混合，调pH值至5.5，加入与多糖等量的碳亚二胺室温下孵育2~4h。用Sepharose 4FF凝胶层析，纯化荚膜多糖-DT偶联物，收集V₀峰，再经0.22μm滤膜除菌过滤，获得获得O-SP-CTB偶联物。

实施例7霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗的制备（蛋白载体为LTB）

用0.005mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）稀释实施例5制备的O-SP-LTB偶联物，加入硫柳汞，疫苗组分以多糖质量计，含量为2.5×（1±30%）μg/ml，调节pH值至7.0。

实施例8霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗的制备（蛋白载体为CTB）

用0.005mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）稀释实施例6制备的O-SP-CTB偶联物，加入硫柳汞，疫苗组分以多糖质量计，含量为2.5×（1±30%）μg/ml，调节pH值至7.0。

实施例9霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗的效果检测

将体重为12-16g雌性小白鼠随机分组，每组15只，分别用上述O-SP-LTB偶联物、未偶联的O-SP、LTB、O-SP混合物（即小川型和稻叶型）于第1、14、28天进行免疫，同时设生理盐水对照组。

每组小鼠共免疫3次，每只小鼠每针次免疫剂量为2.5μgO-SP-LTB偶联物或2.5μgO-SP混合物或相同剂量的多糖与LTB的混合物，注射体积为0.1mL，于第1、14、28天进行皮下免疫，同时设生理盐水对照组。末次免疫2周后眼眶取血，制备血清。TTC法检测杀弧菌抗体，试验方法参照霍乱防治手册（第五版）。

抗毒抗体滴度提高8倍或更高具有临床意义。抗毒抗体试验结果如图1所示，除生理盐水对照组外，O-SP-LTB偶联物、未偶联的O-SP、LTB和O-SP混合物都可激发小鼠产生抗霍乱毒素抗体，其中O-SP-LTB偶联物，即多糖-蛋白质结合疫苗产生的抗体滴度升高效果尤其显著（p<0.05）。

以霍乱弧菌O1型菌株569B为指示菌株，进行杀弧菌抗体试验，抗体滴度提高4倍或更高具有临床意义。如表1所示，多糖结合疫苗激发产生了显著的杀弧菌抗体滴度（p<0.05），多糖混合物虽然也可产生部分抗菌抗体，但不足以保护细菌的侵袭。

表1结合疫苗杀弧菌抗体检测结果

实施例10霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗口服免疫效果检测

将体重为18-22g BALB/c小鼠，随机分组，每组10只，分别用上述O-SP-LTB偶联物、未偶联的O-SP、LTB、O-SP混合物（即小川型和稻叶型）于第0、7、28天进行免疫，同时设生理盐水对照组。按1mg/kg（O-SP/体重）给药，灌胃三次，每次间隔1周，最后一次免疫后7-10天眼眶放血制备血清。ELISA试验检测抗毒抗体和抗菌抗体。试验方法参照霍乱防治手册（第五版）。

抗毒抗体结果判断：将免疫组小鼠血清和对照组小鼠血清进行检测，抗毒抗体血清稀释200倍，抗菌抗体血清稀释100倍，用生理盐水对照组的小鼠血清为阴性对照，抗毒抗体检测以50μg/ml rCTB包被酶标板，抗菌抗体检测以2.0×10¹⁰CFU/ml的灭活V.choleraeCMCC93-3菌液包被酶标版，进行酶联免疫吸附试验，测得的OD值求平均值（X），计算对照组小鼠血清OD值的X+3SD，选取免疫组小鼠血清系列稀释度中OD值大于对照组X+3SD的最大稀释倍数，以此最大稀释倍数除以对照组血清稀释倍数得到免疫组小鼠抗体滴度。

表2ELISA方法检测霍乱弧菌O139疫苗激发的抗毒抗体滴度

表3ELISA方法检测霍乱弧菌O139疫苗激发的抗菌抗体滴度

表4ELISA法检测霍乱弧菌O139疫苗激发的几何平均滴度

实验组别	抗毒抗体几何平均滴度	抗菌抗体几何平均滴度
			O-SP-CTB	1∶7.46	1∶4.92
O-SP-LTB	1∶6.06	1∶5.27
			CTB	1∶5.27	1∶1.62
LJB	1∶4.92	1∶1.62
			O-SP混合物	1∶2	1∶2
生理盐水	/	/

结合疫苗的抗毒抗体结果(表2)、抗毒抗体结果(表3)以及统计学结果(表4)显示，O-SP经过与蛋白偶联后，无论抗毒抗体还是抗菌抗体，都比单组份的抗原免疫有了一定程度的提升。特别是，与CTB、LTB偶联后，显示出了良好的粘膜免疫效果，不过LTB的偶联物显示出了更好的抗菌抗体滴度。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗，其为霍乱弧菌O1群表面多糖与蛋白载体的偶联物，其特征在于，所述霍乱弧菌O1群表面多糖为霍乱弧菌O1群的小川型或稻叶型血清型经脱毒后的LPS。

2.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗，其特征在于，所述霍乱弧菌O1群表面多糖与蛋白载体的重量比为0.2-3:1。

3.根据权利要求1所述的多糖结合疫苗，其特征在于，所述的蛋白载体为霍乱毒素B亚单位或大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位。

4.根据权利要求3所述的多糖结合疫苗，其特征在于，所述的蛋白载体为大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位。

5.根据权利要求1-4任一项所述的多糖结合疫苗，其特征在于，其还含有药用赋形剂。

6.根据权利要求1-4任一项所述的多糖结合疫苗，其特征在于，其还含有铝佐剂和/或硫柳汞。

7.根据权利要求1-4任一项所述的多糖结合疫苗，其特征在于，使用时，将疫苗溶于pH值6.0~9.0的缓冲体系中，制成喷雾剂或液体剂；所述缓冲体系为磷酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐或酒石酸盐缓冲体系。

8.制备权利要求1-4任一项所述霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）大规模培养霍乱弧菌后，灭活，离心并收集菌体；

2）分离纯化霍乱弧菌O1群LPS；

3）脱除LPS中的内毒素成分，透析、过滤、干燥后得纯化的O-SP；

4）用溴化氰活化霍乱弧菌O1群O-SP，以乙二酰肼为间隔剂，碳二亚胺为连接剂，将霍乱弧菌O1群O-SP和载体蛋白进行偶联；

5）去除偶联物中的内毒素，分装即得。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤3）为采用酸水解法脱除LPS中的类脂A。

10.根据权利要求1-7任一项所述霍乱弧菌O1群多糖结合疫苗在制备用于预防或治疗由霍乱弧菌O1群引起的疾病的药物中的应用。