KR100509817B1 - 비브리오불니피쿠스의감염예방을위한경구용백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비브리오 불니피쿠스 (Vibrio vulnificus) 균주의 용균물을 함유한 비브리오 불니피쿠스 병원균에 대한 경구 투여용 분말 백신, 과립 백신 또는 이의 장용피 과립 백신에 관한 것이다. 본 발명에 따른 경구용 백신의 주요 공통항원은 세포외막 단백질들로서 경구백신 제조에 사용한 동종 혈청형 또는 이종의 모든 혈청형의 비브리오 불니피쿠스 균주에 대해 특이적인 반응성을 보이는 혈청 IgG 항체를 높은 수준으로 유도하며, 항혈청을 사용한 수동면역 시험에서 모든 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주에 대해 매우 우수한 교차 방어능을 갖는다.

Description

비브리오 불니피쿠스의 감염 예방을 위한 경구용 백신{Oral Vaccine for Prevention of Vibrio vulnificus Infection}

본 발명의 목적은 비브리오 불니피쿠스(Vibrio vulnificus)에 의한 감염을 예방하기 위한 경구 투여용 백신을 제공하는데 있다.

비브리오 불니피쿠스는 강하구나 연안의 바닷물에 주로 서식하는 정상적인 세균총으로 호염성 세균이다. 비브리오 불니피쿠스는 비브리오과의 비브리오 속에 속하는 그람 음성의 간균으로 전세계의 해안에 널리 분포하며 사람에 대한 병원균으로 잘 알려져 있다. 비브리오 불니피쿠스가 자연환경에서 정상적으로 생존하기 위해서는 다양한 생물학적, 생리 화학적 인자들이 관여하는데 주로 수온, 염분의 농도, 산도 및 유기물의 양 등이 증식과 생존기간에 많은 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.[Appl. Environ. Microbiol. 44, 820, 1982]

분리 초기에는 비브리오 파라헤모리티쿠스(V. parahemolyticus)와 생화학적 성상이 비슷하여 장염 비브리오로 인식되기도 하였으나, 사카자키(Sakazaki)등이 최초로 비브리오 바이오 타입 6330으로 분류하였고, 그 후 미국의 CDC (Center for Disease Control)에서 락토스-양성 비브리오(lactose-positive vibrio)인 L⁺ 비브리오, lac 비브리오로 인식되어 베넥케아 불니피카(Beneckea vulnifica)로 불리다가 현재는 비브리오 불니피쿠스로 불리어지고 있다[Lancet 2, 903, 1979]. 비브리오 불니피쿠스는 라이첼트(Richelt)등과 홀리스(Hollis) 등에 의하여 처음으로 인체 병원균으로 보고되었다. 국내에서는 1979년 전남 해안지방에 피부 괴저병으로 10명이 사망하여 그 원인균으로 처음 알려지게 되었으며 현재까지도 매년 여름 사망자가 발생하고 있다.

비브리오 불니피쿠스의 감염경로는 크게 두 가지로 보고되어 있다. 첫째는 세균에 오염된 생선회, 굴 및 피조개 등의 해산물을 비위생적인 방법으로 처리하여 날것으로 먹었을 때, 산과 알카리에 저항성이 강한 생리화학적 특성으로 쉽게 위액을 거쳐서 소장에서 증식하게 된다. 따라서, 16 내지 24시간 이후에 식중독과 같은 초기 증세를 보이다가 균이 혈액 속으로 침입하여 생육, 증식함으로써 패혈증을 일으켜 혈구파괴와 중독증으로 사망을 초래하게 되는데 치사율은 60% 이상에 달한다. 특히, 패혈증은 주로 간염환자, 만성 알코올 중독자, 당뇨병 환자 및 40대 이후의 간 질환이 있는 사람과 신체 허약자에게 많이 발생하는 것으로 알려지고 있다. 또 다른 경로는 피부의 상처를 통해 감염하여 6시간에서 4일간 사이의 잠복기를 거친 후에 팔, 다리의 피부에 붉은 반점, 부종, 농포가 생기면서 주위로 퍼져 나가고 시간이 경과하면서 수포와 괴사 등이 생긴다. 이때, 신속한 치료처치가 이루어지지 않을 경우에 근염이나 괴사성 근막염으로 이행되며 이차적으로 패혈증이 발생하면 저혈압이나 다양한 형태의 피부병변이 나타나게 된다.

비브리오 불니피쿠스의 병원성 인자는 정확하게 밝혀지지 않았으나, 현재까지 밝혀진 것으로는 siderophore 생산[Infect. Immun. 41, 644, 1983]과 혈액내의 철이온의 농도 증가에 따른 병원성 발현[Infect. Immun. 32, 1193, 1981], 세포독소[Infect. Immun. 33, 583, 1981], 외독소인 사이토라이신[Infect. Immun. 48, 62, 1985] 등이 있으며 그외에도 세포외 효소로서 콜라게나제, 엘라스타제와 같은 단백 분해효소[Infect. Immun. 35, 1155, 1982]와 아밀라제, 뮤시나제, 포스포리파제, 키티나제 등도 있는 것으로 보고되었다.

또한, 비브리오 불니피쿠스의 감염에 또 다른 주요 발병 인자는 캡슐성 폴리사카라이드 (capsular polysaccharide, CPS), 내독소인 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)가 있다. 사멸된 비브리오 불니피쿠스 균의 열에 약한 CPS 또는 테타누스-톡소이드에 연결된 CPS는 비브리오 불니피쿠스의 감염을 방어하는 능력이 있는 것으로 밝혀졌다[Infect. Immun. 63, 2906, 1995; Infect. Immun. 64, 2220, 1996; Infect. Immun. 45, 537, 1984]. 또한, 그람 음성 세균의 주요 세포 표면 성분인 LPS는 높은 면역원성을 지니고 있으며 LPS에 대한 항체는 그람 음성 세균의 감염에 대해 방어작용이 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, LPS는 독성으로 인하여 백신으로 사용하는데 제약을 받고 있다. 또한, CPS 및 LPS의 혈청형 특이성 때문에 모든 혈청형에 대한 예방효과를 갖는 이상적인 백신을 개발하는 것이 현실적으로 매우 어려운 실정이다.

비브리오 불니피쿠스의 표면항원을 이루는 중요한 세 가지 부분은 캡슐성분(CPS)과 LPS 그리고 세포외막 단백질(outer membrane protein, OMP)이다[Can. J. Microbiol. 30, 703, 1984]. 그리고 비브리오 불니피쿠스의 표면항원의 일부가 보체작용에 저항성을 나타내며, 사람의 다형핵 백혈구(Polymorphonuclear leukocyte, PMNL)와 대식세포(macrophage)의 식균작용에도 저항성을 가지게 한다는 것이 밝혀졌다[J. Infect. Dis. 144, 244, 1981]. 이와 같이, 비브리오 불니피쿠스의 병원성에 있어 표면항원의 중요성이 시사됨에 따라 이 구성 성분들을 이용하여 백신 후보항원 및 치료제 개발에 관한 많은 연구가 시작되었다. 대장균(E. coli)이나 살모넬라(Samonella)와 같은 그람음성 세균의 세포외막 단백질은 물질 수송기구의 역할을 담당하는 것으로 밝혀져 있다. 그리고, 병원성 균주에 있어서는 장에서의 균 부착 등과 같은 상피세포 침투기구로서의 역할이 보고되었다[Infect. Immun. 60, 4848, 1992; Infect. Immun. 62, 4594, 1994]. 열이나 pH의 변화에 대한 세균 자체의 방어 기작에도 세포외막 단백질이 매우 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다[Infect. Immun. 62, 5624, 1994; Infect. Immun. 62, 4252, 1994].

비브리오 속과 같은 병원성 균주에 있어서는 비브리오 콜레라(V. cholerae)를 중심으로 세포외막 단백질의 역할이 부각되기 시작했다. 또한, 비브리오 감염에 있어 특정한 세포외막 단백질에 대해 항체가 생성되는 것이 보고되면서 이에 대한 백신 생산을 위한 연구가 활발히 진행되고 있다[J. Med. Microbiol. 39, 135, 1993].

백신을 개발함에 있어서, 우선적으로 고려되어야 할 점은 안전성 및 효능, 즉 면역원성 및 방어능력이며, 후차적으로 고려되어야 할 것으로는 예방접종이 집단에 적용하는 프로그램이기 때문에 저장 및 사용의 편리성 및 생산비용도 중요한 변수이다. 이러한 관점에서, 경구용 백신은 비경구용 백신에 비하여 제조하기가 간편할 뿐만 아니라 취급 및 투여가 용이한 이상적인 형태의 백신 제제이다. 그러나, 단백질 공통항원을 가지고 경구용 백신을 제조함에 있어 한가지 큰 문제점은 단백질이 위 및 장내 단백질 분해 효소에 의해 파괴되어 높은 유효 항체 생성을 위한 일관된 면역 반응을 나타내지 못한다는 사실이다.

또한, 대부분의 세균 감염은 점막조직을 통해서 숙주에 접근하게 되는데, 이를 효과적으로 예방하기 위해서는 점막과 전신 면역반응을 유도할 수 있는 경구백신의 개발이 절실하게 필요하다. 또한 경구백신 제제는 비경구백신 제제(근육주사, 피하주사 등)에 비해 일반적으로 사람 및 동물에 있어서 부작용(side-effects)이 거의 없으며 많은 용량도 자유롭게 투여할 수 있는 장점을 지니고 있다. 그러나, 정제 또는 조 정제된 항원의 경구투여는 위 와 장내의 분해효소에 의해 분해되기 때문에 높은 유효 항체의 유도에 효과적이지 않다. 이러한 문제점을 극복하기 위해서 콜레라 독소의 B-소단위[Infect. Immun. 59, 996, 1991], 유전자 재조립 세균벡터[Adv. Exp. Med. Biol. 327, 165, 1992] 또는 생분해 미세입자(biodegradable microspheres )[Immunology 73, 239, 1991]를 사용하는 경구 전달 체계가 널리 연구되고 있다. 현재 개발중인 이들 경구 전달체계는 제조방법이 매우 복잡하며 그로인한 백신의 제조원가도 높아서 저가의 범용적인 경구백신을 생산하는 데에 커다란 문제점을 지니고 있다.

따라서, 비브리오 불니피쿠스 병원균에 대한 백신을 다량으로 제조할 수 있고 전신적 면역 반응을 유도할 수 있는 경구용 제제가 절실히 요구되어 왔으며, 마침내 본 발명에 이르러 비브리오 불니피쿠스 균주에 대한 경구용 백신이 개발되었다.

상술하면, 본 발명을 통하여 비브리오 불니피쿠스 균을 대량 배양하고 유효 공통항원인 세포외막 단백질을 포함한 균체의 용균물을 마이크로플루이다이저(Microfluidizer M-110 EH, Microfludics Corporation, U.S.A.)를 사용하여 최적의 항체 생성유도를 위해 일정한 크기의 입자로 만들어 비브리오 불니피쿠스의 감염방어를 위한 경구용 백신 항원을 제조하였다.

경구용 백신 항원을 토끼에 경구 투여하고 항체 생성능, 서로 다른 혈청형간 교차반응 정도 및 공통항원의 규명을 ELISA 시험법 및 웨스턴 블롯 방법으로 확인하였고, 생성된 항혈청이 동종 또는 이종의 비브리오 불니피쿠스에 대하여 감염 방어 효과를 보이는 지는 수동면역 시험을 통해 확인하였다.

본 발명은 비브리오 불니피쿠스 O4 혈청형 균주의 용균물을 백신 항원으로서 함유하는 비브리오 불니피쿠스 병원균에 대한 감염 예방 경구투여용 백신을 제공한다.

또한, 본 발명은 비브리오 불니피쿠스 O1 혈청형 균주의 용균물을 백신 항원으로서 함유하는 비브리오 불니피쿠스 병원균에 대한 감염 예방 경구투여용 백신을 제공한다.

또한, 본 발명은 비브리오 불니피쿠스 O1, 02, 03, 04, 05 및 07 혈청형 균주의 용균물을 백신 항원으로서 함유하는 비브리오 불니피쿠스 병원균에 대한 감염 예방 경구투여용 백신을 제공한다.

본 발명의 경구투여용 백신은 분말, 과립 및 장용피 과립의 제제를 포함한다.

본 발명에 따른 경구용 백신은 모든 균주의 공통항원인 세포외막 단백질을 백신항원으로 사용하기 때문에 백신제제에 사용하지 않은 이종의 비브리오 불니피쿠스 0-항원 혈청형 균주들 간에도 높은 교차 반응성을 나타낸다. 다시 말해서, 본 발명에 따른 비브리오 불니피쿠스 O4 혈청형 균주의 용균물을 백신 항원으로서 함유하는 경구용 백신은 동종의 비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주는 물론 다른 이종의 비브리오 불니피쿠스 01, 02, 03, 05, 06, 07, 08 및 09 혈청형 균주에 대해 반응성인 혈청 IgG 항체를 높은 수준으로 유도한다. 또한, 본 발명에 따른 비브리오 불니피쿠스 O1 혈청형 균주의 용균물을 백신 항원으로서 함유하는 경구용 백신은 동종의 비브리오 불니피쿠스 01 혈청형 균주는 물론 다른 이종의 비브리오 불니피쿠스 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08 및 09 혈청형 균주에 대해 반응성인 혈청 IgG 항체를 높은 수준으로 유도한다. 또한, 본 발명에 따른 비브리오 불니피쿠스 01, 02, 03, O4, 05 및 07 혈청형 균주의 용균물을 백신 항원으로서 함유하는 경구용 백신은 동종의 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주는 물론 다른 이종의 비브리오 불니피쿠스 06, 08 및 09 혈청형 균주에 대해 반응성인 혈청 IgG 항체를 높은 수준으로 유도한다.

본 발명에 따른 경구용 백신은 비경구용 백신에 의해 유도된 것과 비교하여 거의 대등한 수준의 전신적 면역 반응을 유도한다.

따라서, 본 발명에 따른 경구용 백신은 사용의 편리성, 면역원성 및 방어효능에 있어서 우수함이 명백하다.

본 발명의 경구 투여용 백신은 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주를 각각 대량 배양하여 일정 온도에서 용해하여 용균물을 만들고, 마이크로플루다이저를 사용하여 일정한 크기의 입자로 제조하고 동결건조 후에 3 종류의 서로 다른 제형인 분말, 과립 또는 장용피 과립 제제로 제형하여 제조된다.

본 발명의 경구 투여용 백신을 위한 비브리오 불니피쿠스 균주 항원물은 5 ㎛이하의 입자로 구성되는 것이 백신의 효능을 위해 바람직하다.

다른 관점에서, 본 발명은 비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주를 용해시키고, 용균물을 마이크로플루이다이저에 통과시켜 입자크기를 5 ㎛이하로 균일하게 만든 다음, 이를 분말화, 과립화 또는 장용피화하여 비브리오 불니피쿠스 병원균에 대한 감염 예방 경구투여용 백신을 제조하는 방법.

본 발명은 비브리오 불니피쿠스 01 혈청형 균주를 용해시키고, 용균물을 마이크로플루이다이저에 통과시켜 입자크기를 5 ㎛이하로 균일하게 만든 다음, 이를 분말화, 과립화 또는 장용피화하여 비브리오 불니피쿠스 병원균에 대한 감염 예방 경구투여용 백신을 제조하는 방법.

또한, 본 발명은 비브리오 불니피쿠스 01, 02, 03, 04, 05 및 07 혈청형 균주를 용해시키고, 용균물을 마이크로플루이다이저에 통과시켜 입자크기를 5 ㎛이하로 균일하게 만든 다음, 이를 분말화, 과립화 또는 장용피화하여 비브리오 불니피쿠스 병원균에 대한 감염 예방 경구투여용 백신을 제조하는 방법.

이하 실시예를 통해 본 발명을 예시한다. 그러나, 이들 실시예가 본 발명을 한정하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

실시예

제조실시예 1

본 발명의 경구 투여용 백신을 제조하기 위해서 비브리오 불니피쿠스의 균주를 적절한 배지에서 1차 및 2차 종배양하고, 이를 150 L의 Chemap 발효조(스위스)에서 대량 배양한 다음 100℃에서 2시간 동안 열처리하여 생균을 사멸시키는 동시에 세포 용해성 독성성분을 불활화시켜 일차 용균물을 제조한다. 상기에서 얻어진 일차 용균물을 최초 배양부피의 10배 정도 농축하는 동시에 주사용 생리식염수로 한외여과하여 색소 및 기타 0.2 ㎛이하의 성분을 제거하여 최종 용균물을 만든다. 얻어진 최종 용균물은 마이크로플루다이저를 사용하여 10,000 psi로 수회 통과하여 일정한 크기의 입자로 제조하고 동결건조 후에 분쇄기를 사용하여 분쇄한 다음 100 메쉬(mesh) 체에 통과시켜서 하기에 상술한 3 종류의 서로 다른 제형인 분말, 과립 또는 장용피 과립 제제로 제형하여 제조된다.

백신 제조 및 생화학적·면역학적 분석 등을 위해 사용한 비브리오 불니피쿠스 균주는 혈청형이 서로 다른 9개의 균주를 사용하였다. 사용한 균주는 ATCC 27562(V. vulnificus O1), JNIH D 3894(V. vulnificus O2), JNIH E 240 (V. vulnificus O3), JNIH 1115-80(V. vulnificus O4), JNIH E-571(V. vulnificus O5), JNIH 91-81(V. vulnificus O6), JNIH 1338-80 (V. vulnificus O7), JNIH 191-87(V. vulnificus O8) 및 JNIH 189-87(V. vulnificus O9) 이다. API 20 E 키트 (Bio Merieux S.A., France)를 사용하여 각 균주를 동정하였고 그들의 생화학 및 혈청 특성에 대해 성상을 확인하였다. 비교 균주로는 비브리오 파라헤모리티쿠스(V. parahemolyticus)와 비브리오 미미쿠스(V. mimicus)를 사용하였다. 9개의 서로 다른 혈청형의 비브리오 불니피쿠스 균주를 1% 식염이 첨가된 BHI(Brain Heart Infusion, Difco) 한천 평판배지에서 배양하여 API 킷트로 생화학적 성상을 확인한 결과 모두 비브리오 불니피쿠스임을 확인하였다. 또한, 질산염 환원 실험과 핵산 분해효소 생산, 용혈활성 등을 확인하였다(표 1).

[표 1]

비브리오 불니피쿠스의 생화학적 특징

가. 비브리오 불니피쿠스 O4 혈청형 균주의 배양

비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주를 경구용 백신 제조를 위한 생산 균주로 사용하였다. 04 혈청형 균주를 백신 항원 제조에 사용한 주된 이유는 국내외에서 사람 감염에 있어서 이 혈청형이 대략 전체 감염의 65% 이상의 높은 빈도를 보이기 때문이다[대한미생물학회지 26. 403, 1991]. 비브리오 불니피쿠스 균주는 37℃에서 3×YPS (0.9% 효모추출액, 3% 펩톤, 1% NaCl) 한천 평판에서 배양한 후 20℃에 보관하거나 유리 앰풀에 동결건조하여 4℃에 저장해 두었다.

비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주의 최적 성장 조건을 결정하기 위하여 비브리오 불니피쿠스 균주를 다양한 조건하에 37℃에서 플라스크내 50 ml의 액체배지에서 배양하였다. 균주의 배양을 위한 배지의 최적 pH의 범위는 5.0 내지 9.0이다. NaCl 농도범위는 1 내지 4%이며 그 이상의 농도에서는 성장이 저해된다. 또한, YPS 배지에 탄소원으로서 1%의 갈락토즈, 유당 또는 자당을 보충하면 성장에 영향을 미치지 않으나 1%의 과당, 포도당 및 맥아당은 성장속도를 현저히 떨어뜨리므로 사용해서는 안된다(도 1). 또한, 고속의 교반 및 높은 통기도의 유지는 세균의 성장을 촉진시킨다.

대량 발효를 위해 상기에 서술한 최적의 배양조건하에서 최적 대수기 성장단계에 있는 비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주의 5L 종배양물을 150 L의 Chemap 발효조(스위스)에서 소포제로서 0.005% 네오린 400 (Korea Polyol, Korea)을 함유한 100 L의 신선한 3×YPS 배지에 접종하였다. 배양물을 8 내지 10 시간동안 37℃에서 0.25 v/v/min의 통기조건하에 250 rpm으로 교반시키면서 배양하면서, 1시간 또는 2시간의 간격으로 분광광도계로 600nm에서 배양물의 흡광도를 측정하였다. 배양 결과 최종 흡광도는 600nm에서 최저 10 이었다(도 2).

나. 비브리오 불니피쿠스 O4 혈청형 균주의 전용균물

(whole cell lysate) 제조

비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주를 배양후, 균체를 발효조에서 100℃로 2시간동안 끓여 균주를 사멸시키는 동시에 세포용해성 독소를 불활성화시켰다. 전용균물을 사르토콘(Sartocon) II 시스템 (Sartorius, Germany)으로 옮기고 0.2 ㎛ 필터상에서 한외여과하여 원배양용적의 10분의1로 농축하였다. 그런다음, 용균물을 최종 용적이 8 리터가 될 때까지 100 리터의 주사용 생리식염수로 연속적으로 여과하여 세척한 후 동결건조하고 사용할 때까지 4℃에 저장해 두었다. 동결건조후, 최종 생산량은 건식 중량 기준으로 최소 450 g이다. 80 g씩의 건조된 각 비브리오 불니피쿠스 용균물을 800 ml의 멸균 주사용수에 용해시킨 다음에 M-110 EH 마이크로플루이다이저에 5,000 내지 15,000 psi로 2회 이상 통과시켰다. 그러나, 높은 항체 형성을 유도하기 위해서는 일정하면서도 균일한 5 ㎛ 이하의 입자 크기를 제조하는 것이 중요한데 이때 최적의 조건은 10,000 psi에서 3 내지 5회 반복 통과시켜 제조하는 것이 바람직하다. 백신 항원을 제조한 다음 동결건조한 후에 분쇄에 의한 분말화 또는 하기에 상술한 제조방법에 의한 과립화 및 이를 장용피 과립화하여 경구용 백신 제제로 사용하였다.

다. 비브리오 불니피쿠스 백신의 과립 및 장용피 과립의 제조

유동층 과립 제조기(SPIR-A-FLOW; Freund Industrial, Japan)를 사용하여 비브리오 불니피쿠스 분말제제를 다음과 같이 과립화하였다. 80 g의 분말제제에 해당하는 800 ml의 M-110 EH 마이크로플루이다이저를 통과시킨 백신 항원 용액을 준비한 다음에 결합제로서 약 20% 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈 (Pharmacoat 9603, Pharmacia, USA) 수용액 중에 현탁시켰다. 결합제의 제조를 위해서 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈 70g을 330g의 멸균 증류수에 첨가하고 100℃에서 10분간 끓여서 완전히 용해시킨 다음에 상기의 백신 항원 용액에 교반하면서 서서히 가하여 혼합하였다. 이 혼합용액을 100메쉬의 체로 통과시킨 다음 통과된 현탁액을 8.5 ml/분의 속도로 핵(core)으로서 650 g의 옥수수 전분에 분무하여 과립을 제조하였다. 이때 주입 공기 온도는 70 내지 80℃, 과립 온도는 25 내지 30℃, 회전자 속도는 300 rpm이었다.

일차로 제조한 60 메쉬 이상의 과립체 400 g을 유동층 과립제조기에서 6% 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈 프탈레이트 55 (Shin-Etsu Chemical Co., Japan) 코팅용액(120 g HPMCP 55, 1472 g 에탄올, 368 g 증류수, 20 g Talc, 20 g 세실 알코올, 미량의 지시색소)으로 장용피하였다. 이때, 피복조건은 15 ml/분의 액체 분무 속도, 62℃의 주입 공기 온도, 35℃의 과립 온도 및 300 rpm의 회전자 속도를 이용하였다.

과립을 일련의 체를 통과시켜 과립 크기의 분포를 측정하였다. 과립중 크기가 60 내지 80 메쉬인 과립은 전체 과립의 약 61%이었으며, 장용피 과립의 81%는 40 내지 80 메쉬였다. 또한, 장용피 과립의 내산성 및 유사 장액에서의 붕해성에 대해 시험하였다. 이를 위해 0.5 g의 장용피 과립을 50 ml의 유사 위장액 (0.2% NaCl, 0.24% HCl, pH 1.2) 또는 유사 장액 (0.05 M KHPO₄, 0.23 N NaOH, pH 6.8)중에 현탁시키고 실온에서 2시간동안 교반하였다. 과립으로부터 방출된 단백질을 바이오라드 단백질 검정 키트 (Biorad, USA)를 사용하여 측정하였다. 유사 장액에서 방출된 단백질에 대한 유사 위액중에서 장용피 과립에 남아있는 단백질의 백분율이 장용피 과립의 위내산성 지수로서 사용되었으며 그 지수는 98.8%로 장용피 코팅의 효율이 매우 높은 것을 확인하였다.

제조실시예 2

가. 비브리오 불니피쿠스 O1 혈청형 균주의 배양

비브리오 불니피쿠스 01 혈청형 균주를 경구용 백신 제조를 위한 생산 균주로 사용하였다. 01 혈청형 균주를 백신 항원 제조에 사용한 주된 이유는 국내외에서 사람 감염에 있어서 O4 혈청형 균주 다음으로 높은 빈도를 보이기 때문이다.

비브리오 불니피쿠스 01 혈청형 균주의 최적 성장 조건은 O4 혈청형 균주와 유사하므로 실시예 1에서 사용한 동일한 배지 및 배양조건을 사용하여 배양하였다.

대량 발효를 위해 제조실시예1 에서 서술한 최적의 배양조건하에서 최적 대수기 성장단계에 있는 비브리오 불니피쿠스 01 혈청형 균주의 5L 종배양물을 150 L의 Chemap 발효조(스위스)에서 소포제로서 0.005% 네오린 400 (Korea Polyol, Korea)을 함유한 100 L의 신선한 3×YPS 배지에 접종하였다. 배양물을 8 내지 10 시간동안 37℃에서 0.25 v/v/min의 통기조건하에 250 rpm으로 교반시키면서 배양하면서, 1시간 또는 2시간의 간격으로 분광광도계로 600nm에서 배양물의 흡광도를 측정하였다. 배양 결과 최종 흡광도는 600nm에서 최저 10 으로 O4 혈청형 균주와 유사한 결과를 얻었다.

나. 비브리오 불니피쿠스 O1 혈청형 균주의 전용균물

(whole cell lysate) 제조

비브리오 불니피쿠스 01 혈청형 균주를 배양후, 균체를 발효조에서 100℃로 2 시간동안 끓여 균주를 사멸시키는 동시에 세포용해성 독소를 불활성화시켰다. 전용균물을 사르토콘(Sartocon) II 시스템 (Sartorius, Germany)으로 옮기고 0.2 ㎛ 필터상에서 한외여과하여 원배양용적의 10분의1로 농축하였다. 그런다음, 용균물을 최종 용적이 8 리터가 될 때까지 100 리터의 주사용 생리식염수로 연속적으로 여과하여 세척한 후 동결건조하고 사용할 때까지 4℃에 저장해 두었다. 동결건조후, 최종 생산량은 건식 중량 기준으로 최소 430 g이다. 80 g씩의 건조된 각 비브리오 불니피쿠스 용균물을 800 ml의 멸균 주사용수에 용해시킨 다음에 M-110 EH 마이크로플루이다이저에 5,000 내지 15,000 psi로 2회 이상 통과시켰다. 그러나, 높은 항체 형성을 유도하기 위해서는 일정하면서도 균일한 5 ㎛ 이하의 입자 크기를 제조하는 것이 중요한데 이때 최적의 조건은 10,000 psi에서 3 내지 5회 반복 통과시켜 제조하는 것이 바람직하다. 백신 항원을 제조한 다음 동결건조한 후에 분쇄기를 이용하여 분쇄한 다음에 100메쉬의 체로 걸러내고 이를 경구백신의 분말화 제제로 사용하였다.

제조실시예 3

가. 비브리오 불니피쿠스 01, 02, 03, 04, 05 및 07 혈청형 균주의 배양

모든 비브리오 불니피쿠스 균주를 37℃하에 3 x YPS (0.9% 효모추출액, 3% 펩톤, 1% NaCl) 한천 평판에서 성장시킨후 20℃로 유지해두거나 유리 앰풀에 동결건조하여 4℃로 저장해 두었다. 최적의 성장 조건을 조성하기 위하여 비브리오 불니피쿠스 균주를 다양한 조건하에 37℃에서 플라스크내 500 ml의 액체배지에서 배양하였다. 다량의 발효를 위해 대수기 성장단계에 있는 각 균주의 5 리터 종배양물을 150 리터 Chemap 발효조 (스위스)에서 소포제로서 0.005% 네오린 400 (Korea Polyol, Korea)을 함유한 100 리터의 신선한 3 x YPS에 접종하였다. 배양물을 6 내지 14시간동안 0.25 v/v/min으로 통기하면서 250 rpm으로 교반시키면서 동시에 배양하였다. 1시간 또는 2시간의 간격으로 분광광도계로 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이의 결과는 하기 표 2 및 도 11에 나타나 있다.

나. 비브리오 불니피쿠스 전용균물(whole cell lysate)의 제조

배양후, 세포를 발효조에서 100℃로 2시간동안 끓여 균주를 사멸시키고 세포융해성 독소를 불활성화시켰다. 전용균물을 사르토콘 (Sartocon) II 계 (Sartorius, Germany)로 옮기고 0.2 ㎛ 필터상에서 한외여과하여 원배양용적의 10분의1로 농축하였다. 그런다음, 용균물을 최종 용적이 8 리터가 될 때까지 100 리터의 주사용 생리식염수로 세척한 후 동결건조하고 사용할 때까지 4℃에 저장해 두었다. 동결건조후, 최종 생산량은 하기 표1에 나타나 있듯이 건식 중량 기준으로 360 내지 540 그램이다. 50 그램씩의 건조된 각 비브리오 불니피쿠스 용균물을 500 ml의 증류수중에 용해시키고 혼합한 다음 M-110 EH Microfluidizer (Microfluidics Corp., USA)에 10,000 psi로 2회 통과시켰다. 용균물 현탁액을 직접 근육내 주사하거나 과립형 백신 제제로 제형하여 사용하였다.

[표 2]

비브리오 불니피쿠스 균주의 대량배양

다. 비브리오 불니피쿠스 백신의 과립 제조

SPIR-A-FLOW (Freund Industrial, Japan)를 사용하여 비브리오 불니피쿠스 용균물을 다음과 같이 과립화하였다. 용균물을 20% 하이드록시프로필메틸 셀룰로즈 (Pharmacoat 9603, Pharmacia, USA) 수용액중에 현탁시키고 이 현탁액을 8.5 ml/분의 속도로 분무하여 핵으로서 옥수수 전분을 가진 과립을 형성하였다. 이때 주입 공기 온도는 70 내지 80℃, 과립 온도는 25 내지 30℃, 회전자 속도는 300 rpm이었다. 과립을 SPIR-A-FLOW에서 6% 하이드록시프로필 메틸셀룰로즈 프탈레이트 55 (Shin-Etsu Chemical Co., Japan) 용액으로 장용피하였다. 이때, 피복조건은 15 ml/분의 액체 분무 속도, 62℃의 주입 공기 온도, 35℃의 과립 온도 및 300 rpm의 회전자 속도를 이용하였다.

과립을 일련의 체를 통과시켜 과립 크기의 분포를 측정하였다. 과립의 약 61%는 크기가 60 내지 80 메쉬였으며 장용피 과립의 81%는 40 내지 80 메쉬였다. 또한, 장용피 과립을 내산성 및 유사 장액에서의 붕해성에 대해 시험하였다. 이를 위해 0.5 g의 장용피 과립을 50 ml의 유사 위장액 (0.2% NaCl, 0.24% HCl, pH 1.2) 또는 유사 장액 (0.05 M KHPO₄, 0.23 N NaOH, pH 6.8)중에 현탁시키고 실온에서 2시간동안 교반하였다. 과립으로부터 방출된 단백질을 바이오라드 단백질 검정 키트 (Biorad, USA)를 사용하여 측정하였다. 유사 장액에서 방출된 단백질에 대한 유사 위액중에 장용피 과립에 남아있는 단백질의 백분율이 위내산성의 지수로서 결정되었으며 그 지수는 98.8%였다.

실험실시예 1

가. 면역화 및 항체 검정

삼육동물(한국)에서 구입한 체중 2.2 내지 2.3 Kg의 건강한 일본산 흰 토끼에 10 mg의 용균물에 상응하는 분말, 과립 및 장용피 과립의 3 가지 비브리오 불니피쿠스 백신항원을 4일 간격으로 5회 경구 투여하여 면역화하였다. 경구투여를 위해서 분말, 과립 및 장용피 과립을 각각 3 ml의 주사용 멸균 증류수 및 0.5% 카르복시 메틸셀룰로즈 현탁액 (pH 2.5)에 현탁하고 튜브를 사용하여 토끼에 투여하였다. 백신 투여시와 백신투여 후에 일정시간 간격으로 귀 정맥으로부터 혈액을 채취하고 1시간 동안 실온에 방치하였다가 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청은 사용할 때까지 -70℃로 동결 보관해 두었다.

토끼에 세 가지 제형의 백신을 경구 투여한 후에 유도된 항체 역가를 백신제조에 사용한 동종의 비브리오 불니피쿠스 균주 O4 혈청형에 대해 엘리사 (ELISA)로 측정하였다. 비브리오 불니피쿠스 균주를 6시간 배양한 후 56℃에서 2시간 동안 가열 불활화시키고, 10 mM 인산염 완충용액 (10 mM PBS, pH 7.2)으로 600nm에서 흡광도가 0.1이 되도록 조정하였다. 이 세포 현탁액 100 ㎕를 96-웰 마이크로 플레이트에 12-16 시간 반응시켜 각 웰에 코팅하였다. 각 웰을 300 ㎕의 1% 소혈청 알부민으로 2시간동안 항원이 결합되지 않은 부분에 반응시켜 부착시키고 0.05% 트윈 20을 함유한 10 mM 인산염 완충용액(10mM PBST, pH 7.2)으로 3회 세척하였다. 10 mM 인산염 완충용액(10mM PBS, pH 7.2)으로 1,600배 희석한 각 제형의 토끼 항혈청 100 μl를 첨가하고 37℃에서 2시간 반응시켰다. 다시, 0.05% 트윈 20을 함유한 10 mM 인산염 완충용액(10 mM PBST, pH 7.2)으로 3회 세척후 결합된 IgG 항체를 고추냉이 퍼옥시다제 (horseradish peroxidase, Accurate, USA)와 결합된 염소 항-토끼 IgG 항체로 검출하였다. o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(Sigma, USA)를 발색반응의 기질로서 사용하고 분광광도계로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이의 결과는 도 3에 나타나 있으며, 분말, 과립 및 장용피 과립 제제를 투여한 토끼 항혈청 모두가 시간이 경과함에 따라 백신 항원에 대해서 높은 항체역가를 보여주었다. 그러나, 분말제형이 과립 및 장용피 과립 제형보다 약간 우수한 항체 역가를 보이는데 이는 과립 및 장용피 과립 제조시 높은 온도에서 반응시키는 제조공정이 들어감에 따라서 공통항원인 세포외막 단백질의 부분적인 변성으로 인하여 분말제형보다 항체역가가 낮게 나타난 것으로 추정된다.

나. 항체의 교차반응성

본 발명에 따라 비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주로부터 제조된 분말 제형의 백신항원을 경구 투여한 후에 면역화된 토끼로부터 일정시간 간격으로 혈액을 채취하고 1:1600 희석비에서 ELISA로 여러 가지 0-항원 혈청형 균주에 대해 혈청 IgG 항체 반응을 측정하였다. 도4에 나타나 있듯이, 분말제형의 경구 투여는 동종의 04 혈청형에 대해 유도된 역가와 유사한 정도로 이종의 01, 02, 03, 05, 06, 07, 08 및 09에 대해서도 높은 역가의 항체를 유도하였다. 따라서 상기에 언급한 분말, 과립 및 장용피 과립의 경구투여에 의해 유도된 혈청 IgG 항체의 유사한 수준(도 3)으로 미루어 과립 및 장용피 과립 백신의 경우도 분말 백신과 유사한 정도의 교차반응성을 보일 것이다. 따라서, 본 발명의 분말 백신에 의해 유도된 항체는 시험한 동종 및 이종의 모든 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주에 대해서 유사한 정도로 우수한 항원-항체 결합 반응성을 나타내었다.

다. 경구백신 제제내의 공통 항원 분석

(1) 세포외막 단백질의 분리

본 발명에 있어서 3가지 경구 백신 제제의 주성분이 공통항원인 세포외막 단백질로 되어 있으며 또한 서로 다른 비브리오 불니피쿠스의 혈청형 균주들에 대한 교차 반응성도 세포외막 단백질에 기인함을 입증하기 위해서 비브리오 불니피쿠스의 각 혈청형 균주로부터 동일한 방법으로 세포외막 단백질을 분리, 정제하여 항원 분석에 사용하였다.

세포외막 단백질의 분리, 정제방법은 다음과 같다. 10 mM TEAN(10 mM Tris·HCl, 1 mM EDTA, 0.15 M NaCl, 0.05% 나트륨 아자이드, pH 7.5) 완충용액에 현탁된 균체를 초음파 파쇄기(SONICATOR; 출력 8, 30초×10회)로 초음파 처리하여 파쇄하였다. 그리고, 파쇄되지 않은 균체를 4,500×g에서 20분간 원심분리하여 제거하였다. 이후, 얻어진 상등액을 45,000×g에서 1시간 동안 초원심분리하여 막 침전물과 상등액의 원형질 단백으로 분리하였다. 막 침전물을 1% N-라우로일사코신(C₁₅H₂₉NO₃, Sigma)이 첨가된 10 mM TEAN 완충용액에 현탁시켜 37℃에서 5시간 이상 방치하였다. 이것을 60% 슈크로스 구배상에서 초원심분리기로 100,000×g에서 1시간 동안 초원심분리하여 용해성 내막 단백질과 불용성 외막 단백질을 분리하였다. 세포외막 단백질 분획을 다시 10 mM TEAN 완충용액에 현탁한 다음 세척하여 정제하였다.

(2) ELISA 분석

비브리오 불니피쿠스의 04 혈청형 균주로부터 제조한 분발 백신항원을 토끼에 면역하여 얻어진 항혈청에 순수 분리한 세포외막 단백질에 대한 항체가 존재하는지를 확인하기 위하여 ELISA를 수행하였다.

비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주를 56℃에서 2시간 동안 열처리하여 불활화시킨 전세포를 10mM 인산염 완충용액(10 mM PBS, pH 7.2)으로 ml당 1×10⁵ 세포로 조정한 항원과 04 혈청형 균주로부터 분리하여 10 mM 인산염 완충용액(10 mM PBS, pH 7.2)에 20 mg/ml 농도로 조정한 세포외막 단백질 항원을 각각 100 μl씩 96-웰 마이크로 플레이트의 10개 웰에 12-16시간 반응시켜 코팅하였다. 각 웰을 300 μl의 1% 소혈청 알부민으로 2시간 동안 항원이 결합되지 않은 부분에 반응하여 부착시키고 0.05% 트윈 20을 함유한 10 mM 인산염 완충용액(10 mM PBST, pH 7.2)으로 3회 세척하였다. 여기에 10 mM 인산염 완충용액(10 mM PBS, pH 7.2)으로 1,600배 희석한 토기 항혈청 100 μl를 첨가하고 37℃에서 2시간 반응시켰다. 다시 0.05% 트윈 20을 함유한 10 mM 인산염 완충용액(10 mM PBST, pH 7.2)으로 3회 세척 후 결합된 IgG 항체를 고추냉이 퍼옥시다제와 결합된 염소 항-토끼 IgG 항체로 검출하였다. o-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(Sigma, USA)를 발색반응의 기질로서 사용하고 분광광도계로 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며 10개 웰의 측정치를 평균값으로 표시하였으며 그 결과는 표 2에 나타나 있다. 비브리오 불니피쿠스 04 혈청형의 분말 백신으로 면역화한 토끼 항혈청의 세포외막 단백질 항원과 전세포 항원에 대한 반응성을 ELISA 방법으로 분석한 결과(표 3), 세포외막 단백질 항원이 전세포 항원에 비해 2배 이상의 높은 항체와의 반응성을 나타냈다. 따라서, 분리한 세포외막 단백질 항원이 전세포 항원보다 더 많은 에피토프를 제공하는 우수한 백신 항원임을 확인하였다.

[표 3]

ELISA를 이용한 분말 백신에 대한 토끼 항혈청의 전세포 항원과 세포외막 단백질 항원과의 역가 비교시험

(3) 웨스턴 면역블롯 분석

전기영동장치(Hoeffer Mighty Small SE245)를 이용하여 여러 0-혈청형 균주로부터 분리한 세포외막 단백질을 4%의 농축겔(stacking gel)과 12%의 분리겔(running gel)을 사용하여 150 볼트에서 1 시간 30분동안 전기영동을 실시하였다. 이동 완충용액으로 채워진 용기(Hoeffer Scientific Co. Ltd.)에서 30 볼트의 전기로 하룻밤 동안 니트로셀룰로스(Bio-rad) 막에 옮겼다. 이것을 세척 완충용액(0.05% 트윈-20이 첨가된 10 mM 인산염 완충용액, pH 7.2)으로 세척하고 10 mM 인산염 완충용액에 5% 탈지우유(skim milk)가 첨가된 반응 완충액으로 차단시킨 후 일차 항체로서 04 혈청형 균주의 분말 백신을 경구투여한 토끼의 항혈청으로 2시간 반응시키고, 다시 고추냉이 퍼옥시다제가 결합된 2차 항체로 1시간 반응시켰다. 기질용액은 5 ml의 에탄올에 20 mg의 4-클로로-1-나프톨을 녹인 후에 45 ml의 50 mM 트리스 완충용액(pH 7.5)에 혼합하고 여기에 50 μl의 과산화수소를 첨가하여 제조하였고, 기질용액과 니트로셀룰로즈 막을 5분동안 반응시켜 발색한 다음 확인하였다.

분말 제제의 경구투여 후에 얻어진 토끼 항혈청으로 9종의 0-혈청형 균주의 세포외막 단백질에 대하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과(도 5), 모든 혈청형에서 약 30 KDa의 주 단백질을 포함한 8개 이상의 많은 세포외막 단백질에 대해 높은 반응성을 지닌 항체가 생긴 것을 확인하였다. 그러므로, 본 발명에 있어서, 마이크로플루이다이저를 통과하여 5 μm 이하의 균일한 크기로 제조된 분말 백신 제제의 세포외막 단백질을 경구 투여시에 높은 항체의 생성을 유도하며 모든 0-혈청형 균주의 세포외막 단백질에 대하여 교차반응성이 있음을 확인하였다.

라. 항혈청의 방어 검정

면역화된 토끼의 항혈청의 방어 효능을 수동 면역화 실험으로 평가하였다. Charles River(일본)로부터 구입한 생후 5주된 ICR 숫컷 마우스의 여러 군 (각 군당 20 마리로 구성)에 분말, 과립 및 장용피 과립 경구 백신으로 면역화된 토끼의 항혈청 0.3 ml를 복강 주사하였다. 음성대조군에는 0.3 ml의 생리식염수 또는 토끼 면역전 혈청을 주사하였다. 2시간 후 마우스를 04 혈청형 균주(LD₅₀ = 1.3×10⁶ cfu)의 대략 10 LD₅₀에 해당하는 1.3×10⁷cfu의 생균으로 복강내 감염시키고 감염 후 5일 동안 관찰하였다. 이의 결과는 각 군에 총 마우스의 수에 대하여 생존한 마우스의 수를 대조함으로써 방어 백분율로서 표시하였으며 이 실험 결과는 하기 표 4에 나타나 있다.

[표 4]

마우스에서 3 종류의 비브리오 불니피쿠스 백신 제형으로 면역화된 토끼 항혈청의 감염 방어 효능시험

음성 대조군의 경우는 5%의 마우스 생존률을 보였고, 면역전 혈청(preimmune sera)을 투여한 경우에는 10%의 생존율을 나타내었다. 그러나, 분말 백신항원의 경구투여에 의해 얻어진 토끼 항혈청의 경우는 100%의 생존율을 보였고, 과립 및 장용피 과립의 경우에는 95%의 생존율을 나타내었다. 따라서 3가지 서로 다른 경구 백신 제제로부터 면역화된 토끼 항혈청은 매우 우수한 감염 방어 효과가 있음을 확인하였다.

마. O4 혈청형 균주의 분말 경구백신에 대한 토끼 항혈청의 이종 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주에 대한 교차 감염 방어효과 시험

분말 경구 백신에 대해 면역화된 토끼의 항혈청을 가지고 이종의 비브리오 불니피쿠스 균주에 대한 교차 방어 효능을 수동 면역화 실험으로 평가하였다. Charles River(일본)로부터 구입한 생후 5주된 ICR 수컷 마우스의 여러 군(각 군당 8마리로 구성)에 분말 경구 백신에 대해 면역화된 토기 항혈청 0.3 ml을 복강 주사하였다. 2 시간 후 마우스를 01, 02, 03, 04(양성 대조군, 동종균주), 05, 06, 07, 08 및 09 혈청형 균주로 각각 10 LD₅₀에 해당하는 균을 복강내 감염시키고 감염 후 5일 동안 관찰하였다. 음성 대조군에는 0.3 ml의 주사용 생리식염수를 투여하고 동일조건에서 2 시간 후에 04 혈청형 균주로 복강내 감염시킨 다음의 생존율로 나타내었다. 이의 결과는 각 군에 감염시킨 마우스의 총 수에 대하여 생존한 마우스의 총 수를 대조함으로써 방어 백분율로서 표시하였으며 실험 결과는 아래 표 5에 나타나 있다.

[표 5]

마우스에서 O4 혈청형 균주의 분말 백신항원으로 면역화된 토끼 항혈청의 이종 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주들에 대한 교차 방어 효능 시험

음성 대조군의 경우는 5%의 마우스 생존율을 보였고, 동종의 혈청형 균주로 감염시킨 양성 대조군의 경우는 100%의 완전한 생존율을 보였으며 통계학적으로도 매우 유의성이 있음을 확인하였다. 이 조건하에서 이종의 혈청형 균주에 대한 감염방어 효과는 공격 균주의 혈청형에 따라서 약간의 생존율의 차이는 보이나 87%에서 100%의 생존율을 나타내었으며 본 발명에서의 경구백신 제제가 모든 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주에 대해 감염 방어가 가능한 매우 우수한 백신임을 확인하였다.

바. 경구 백신 제제의 안전성 시험

비브리오 불니피쿠스 O4 혈청형 균주의 경구용 분말백신 항원에 대한 안전성을 확인하고자 급성 독성시험을 수행하였다. 급성 독성시험은 비브리오 불니피쿠스 백신이 토끼에게서 높은 항체생성을 보인 투여용량인 5 mg/kg의 400배와 1600배에 해당하는 2000 mg/kg과 8000 mg/kg의 용량으로 생후 5주령인 웅성 Charles River 마우스 (일본)에 경구투여한 다음 7일간 사망률, 체중측정 및 임상증상을 관찰하였다. 각 항원은 50 mg/ml 및 200 mg/ml의 농도로 1 % 메칠 셀룰로우스에 현탁 후 1 ml 씩 마우스 경구투여용 존대(sonde)를 사용하여 투여하였다.

비브리오 불니피쿠스 백신의 급성독성 시험에서는 폐사 예 및 별다른 이상 생화학적, 혈액학적 이상소견을 관찰할 수 없었다. 따라서, 비브리오 백신의 항체생성 효과를 보인 5 mg/kg의 1600배인 8000 mg/kg까지 경구 투여하여도 전혀 독성을 나타내지 않아 본 발명의 비브리오 불니피쿠스 경구백신은 매우 안전함을 확인하였다.

실험실시예 2

가. 면역화 및 항체 검정

삼육동물(한국)에서 구입한 체중 2.2 내지 2.3 Kg의 건강한 일본산 흰 토끼에 10 mg의 용균물에 상응하는 비브리오 불니피쿠스 O1 혈청형 균주의 분말 백신항원을 4일 간격으로 5회 경구 투여하여 면역화하였다. 경구투여를 위해서 분말 백신항원을 3 ml의 주사용 멸균 증류수 및 0.5% 카르복시 메틸셀룰로즈 현탁액 (pH 2.5)에 현탁하고 튜브를 사용하여 토끼에 투여하였다. 백신 투여시와 백신투여 후에 일정시간 간격으로 귀 정맥으로부터 혈액을 채취하고 1시간 동안 실온에 방치하였다가 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청은 사용할 때까지 -70℃로 동결 보관해 두었다.

토끼에 분말 제형의 백신을 경구 투여한 후에 유도된 항체 역가를 백신제조에 사용한 동종의 비브리오 불니피쿠스 균주 O1 혈청형에 대해 엘리사 (ELISA)로 측정하였다. 엘리사 (ELISA) 법은 실험실시예 1 에서 사용한 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

이의 결과는 도 6에 나타나 있으며, 분말 백신 항원을 경구 투여한 토끼에서 얻어진 항혈청은 시간이 경과함에 따라 백신 항원에 대해서 높은 혈청 IgG 역가를 보여주었다. 이는 비브리오 불니피쿠스 O4 혈청형 균주에 대한 분말 백신항원을 경구 투여한 경우와 매우 유사한 면역 반응성을 나타내었다.

나. 항체의 교차반응성

본 발명에 따라 비브리오 불니피쿠스 01 혈청형 균주로부터 제조된 분말 제형의 백신항원을 경구 투여한 후에 면역화된 토끼로부터 일정시간 간격으로 혈액을 채취하고 1:1600 희석비에서 ELISA로 여러 가지 0-항원 혈청형 균주에 대해 혈청 IgG 항체 반응을 측정하였다. 도 7에 나타나 있듯이, 분말제형의 경구 투여는 동종의 01 혈청형에 대해 유도된 역가와 유사한 정도로 이종의 02, 03, O4, 05, 06, 07, 08 및 09에 대해서도 높은 역가의 항체를 유도하였다. 따라서, 본 발명의 분말 백신에 의해 유도된 항체는 시험한 동종 및 이종의 모든 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주에 대해서 유사한 정도로 우수한 항원-항체 결합 반응성을 나타내었다.

다. 경구백신 제제내의 공통 항원 분석

(1) 세포외막 단백질의 분리

세포외막 단백질의 분리는 실험실시예 1 의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

(2) 웨스턴 면역블롯 분석

전기영동장치(Hoeffer Mighty Small SE245)를 이용하여 여러 0-혈청형 균주로부터 분리한 세포외막 단백질을 4%의 농축겔(stacking gel)과 12%의 분리겔(running gel)을 사용하여 150 볼트에서 1 시간 30분동안 전기영동을 실시하였다. 이동 완충용액으로 채워진 용기(Hoeffer Scientific Co. Ltd.)에서 30 볼트의 전기로 하룻밤 동안 니트로셀룰로스(Bio-rad) 막에 옮겼다. 이것을 세척 완충용액(0.05% 트윈-20이 첨가된 10 mM 인산염 완충용액, pH 7.2)으로 세척하고 10 mM 인산염 완충용액에 5% 탈지우유(skim milk)가 첨가된 반응 완충액으로 차단시킨 후 일차 항체로서 01 혈청형 균주의 분말 백신을 경구 투여하다 토끼의 항혈청으로 2시간 반응시키고, 다시 고추냉이 퍼옥시다제가 결합된 2차 항체로 1시간 반응시켰다. 기질용액은 5 ml의 에탄올에 20 mg의 4-클로로-1-나프톨을 녹인 후에 45 ml의 50 mM 트리스 완충용액(pH 7.5)에 혼합하고 여기에 50 μl의 과산화수소를 첨가하여 제조하였고, 기질용액과 니트로셀룰로즈 막을 5분동안 반응시켜 발색한 다음 확인하였다.

01 혈청형 균주의 분말 제제를 경구투여 후에 얻어진 토끼 항혈청으로 9종의 0-혈청형 균주의 세포외막 단백질에 대하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과(도 8), 모든 혈청형에서 약 30 KDa의 주 단백질을 포함한 8개 이상의 많은 세포외막 단백질에 대해 높은 반응성을 지닌 항체가 생긴 것을 확인하였다. 그러므로, 본 발명에 있어서, 마이크로플루이다이저를 통과하여 5 μm 이하의 균일한 크기로 제조된 분말 백신 제제의 세포외막 단백질을 경구 투여시에 높은 항체의 생성을 유도하며 모든 0-혈청형 균주의 세포외막 단백질에 대하여 교차반응성이 있음을 확인하였다. 또한, 04 혈청형 균주의 분말 제제를 경구투여 후에 얻어진 토끼 항혈청으로 9종의 0-혈청형 균주의 세포외막 단백질에 대하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과와 거의 유사한 결과를 얻었으며 이는 본 발명에 있어서 세포외막 단백질을 공통항원으로 있음을 분명하게 보여주고 있다.

다. 항혈청의 방어 검정

면역화된 토끼의 항혈청의 방어 효능을 수동 면역화 실험으로 평가하였다. Charles River(일본)로부터 구입한 생후 5주된 ICR 숫컷 마우스의 여러 군 (각 군당 20 마리로 구성)에 분말 경구백신으로 면역화된 토끼의 항혈청 0.3 ml를 복강 주사하였다. 음성대조군에는 0.3 ml의 생리식염수 또는 토끼 면역전 혈청을 주사하였다. 2시간 후 마우스를 01 혈청형 균주(LD₅₀ = 8.6×10⁶ cfu)의 대략 10 LD₅₀에 해당하는 8.6×10⁷cfu의 생균으로 복강내 감염시키고 감염 후 5일 동안 관찰하였다. 이의 결과는 각 군에 총 마우스의 수에 대하여 생존한 마우스의 수를 대조함으로써 방어 백분율로서 표시하였으며 이 실험 결과는 하기 표 7에 나타나 있다.

[표 7]

마우스에서 비브리오 불니피쿠스 O1 혈청형 균주의 분말 경구백신 제형으로 면역화된 토끼 항혈청의 감염 방어 효능시험

음성 대조군의 경우는 0%의 마우스 생존률을 보였고, 면역전 혈청(preimmune sera)을 투여한 경우에는 10%의 생존율을 나타내었다. 그러나, 분말 백신항원의 경구투여에 의해 얻어진 토끼 항혈청의 경우는 95%의 생존율을 보였다. 따라서 경구 백신 제제로부터 면역화된 토끼 항혈청은 매우 우수한 감염 방어 효과가 있음을 확인하였다.

라. O1 혈청형 균주의 분말 경구백신에 대한 토끼 항혈청의 이종 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주에 대한 교차 감염 방어효과 시험

분말 경구 백신에 대해 면역화된 토끼의 항혈청을 가지고 이종의 비브리오 불니피쿠스 균주에 대한 교차 방어 효능을 수동 면역화 실험으로 평가하였다. Charles River(일본)로부터 구입한 생후 5주된 ICR 수컷 마우스의 여러 군(각 군당 8마리로 구성)에 분말 경구 백신에 대해 면역화된 토기 항혈청 0.3 ml을 복강 주사하였다. 2 시간 후 마우스를 01(양성대조군, 동종균주), 02, 03, 04, 05, 06, 07, 08 및 09 혈청형 균주로 각각 10 LD₅₀에 해당하는 균을 복강내 감염시키고 감염 후 5일 동안 관찰하였다. 음성 대조군에는 0.3 ml의 주사용 생리식염수를 투여하고 동일조건에서 2 시간 후에 비브리오 불니피쿠스 01 혈청형 균주로 복강내 감염시킨 다음의 생존율로 나타내었다. 이의 결과는 각 군에 감염시킨 마우스의 총 수에 대하여 생존한 마우스의 총 수를 대조함으로써 방어 백분율로서 표시하였으며 실험 결과는 아래 표 8에 나타나 있다.

[표 8]

마우스에서 O1 혈청형 균주의 분말 백신항원으로 면역화된 토끼 항혈청의 이종 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주들에 대한 교차 방어 효능 시험

음성 대조군의 경우는 0%의 마우스 생존율을 보였고, 동종의 혈청형 균주로 감염시킨 양성 대조군의 경우는 100%의 완전한 생존율을 보였으며 통계학적으로도 매우 유의성이 있음을 확인하였다. 이 조건하에서 이종의 혈청형 균주에 대한 감염방어 효과는 공격 균주의 혈청형에 따라서 약간의 생존율의 차이는 보이나 O4형 유래 분말 경구백신 제제와 유사하게 87%에서 100%의 생존율을 나타내었다. 따라서 본 발명에서의 경구백신 제제가 모든 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주에 대해 감염 방어가 가능한 매우 우수한 백신임을 확인하였다.

마. 경구 백신 제제의 안전성 시험

비브리오 불니피쿠스 O1 혈청형 균주의 경구용 분말백신 항원에 대한 안전성을 확인하고자 급성 독성시험을 수행하였다. 급성 독성시험은 비브리오 불니피쿠스 백신이 토끼에게서 높은 항체생성을 보인 투여용량인 5 mg/kg의 400배와 1600배에 해당하는 2000 mg/kg과 8000 mg/kg의 용량으로 생후 5주령인 웅성 Charles River 마우스 (일본)에 경구 투여한 다음 7일간 사망률, 체중측정 및 임상증상을 관찰하였다. 각 항원은 50 mg/ml 및 200 mg/ml의 농도로 1 % 메칠 셀룰로우스에 현탁 후 1 ml 씩 마우스 경구투여용 존대(sonde)를 사용하여 투여하였다.

비브리오 불니피쿠스 백신의 급성독성 시험에서는 폐사 예 및 별다른 이상 생화학적, 혈액학적 이상소견을 관찰할 수 없었다. 따라서, 비브리오 백신의 항체생성 효과를 보인 5 mg/kg의 1600배인 8000 mg/kg까지 경구 투여하여도 전혀 독성을 나타내지 않아 본 발명의 비브리오 불니피쿠스 경구백신은 매우 안전함을 확인하였다.

실험실시예 3

가. 면역화 및 항체 검정

삼육동물. (한국)에서 구입한 체중 2.2 내지 2.3 Kg의 일본산 흰 토끼를 용균물 10 mg에 상응하는 제조실시예 3의 비브리오 불니피쿠스 백신으로 4일 간격으로 5회 면역화하였다. 근육내 면역화의 경우, 0.2 ml의 용균물 현탁액 (50 mg/ml)을 사용하였다. 경구투여의 경우, 과립 및 장용피 과립을 각각 3 ml의 증류수 및 0.5% 카르복시 메틸셀룰로즈 현탁액 (pH 2.5)에 현탁하고 튜브를 사용하여 토끼에 투여하였다. 백신 투여와 동시에 일정기간 동안 귀 정맥으로부터 4일 간격으로 혈액 샘플을 채취하고 1시간 동안 실온에 방치하였다가 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청은 사용할때까지 -70℃로 동결 보관해 두었다.

세 가지 제형의 백신 (용균물 현탁액, 과립 및 장용피)에 의해 유도된 항체 역가를 비브리오 불니피쿠스 01 및 04 혈청형 균주에 대해 엘리사 (ELISA)로 측정하였다. 6시간 배양한 후 56℃에서 2시간동안 가열 불활화시키고 인산염 완충용액 (PBS)에서 O.D._600nm 0.1로 조정된 100 μl의 세포 현탁액으로 미세 평판의 개개 웰을 코팅하였다. 웰을 300 μl의 1% 소혈청 알부민으로 2시간동안 항원이 결합되지 않은 부분에 반응하여 부착시키고 0.05% 트윈 20을 함유한 PBS로 3회 세척하였다. 연속적으로 2배씩 희석된 토끼 항혈청 100 μl를 첨가하고 37℃에서 2시간 배양하였다. 3회 세정후 결합된 IgG 항체를 고추냉이 퍼옥시다제 (Accurate, USA)와 결합된 염소 항-토끼 IgG 항체로 검출하였다. O-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드 (Sigma, USA)를 발색반응의 기질로서 사용하고 분광광도계로 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이의 결과는 도 9 및 도 10에 각각 나타나 있다.

바. 항체의 교차반응성

제조실시예3에서 형성된 용균물로 면역화된 토끼로부터 최초 접종후 25일째 혈액 샘플을 채취하고 1:1600 희석비에서 엘리사로 각종 혈청형 세포에 대해 혈청 IgG 항체 반응을 측정하였다. 도 12에 나타나 있듯이, 근육내주사 및 장용피 과립의 경구 투여는 혈청형 01, 02, 04, 05, 08 및 09에 대해 고 역가를 유도하고, 혈청형 06 및 07에 대해서는 장용피 과립의 투여에 의한 역가는 근육내 주사에의해 유도된 역가의 60%에 이르렀다. 일반적인 과립의 경구 투여에 의한 면역화는 장용피에 의해 유도된 혈청 IgG 항체 수준의 60 내지 90%에 달하였다. 또한, 본 발명의 과립 및 장용피 과립 백신에 의해 유도된 항체는 모든 혈청형 균주에 대하여 강하게 반응하였다.

바. 항혈청의 방어 검정

면역화된 토끼의 항혈청의 방어 효능을 수동적 면역화 실험으로 평가하였다. Charles River (일본)으로부터 구입한 생후 5주된 ICR 숫컷 마우스의 여러 그룹 (개개 그룹당 8 마리로 구성)을 면역화된 토끼의 항혈청 0.3 ml로 복강 주사하였다. 대조 그룹으로서, 마우스를 0.3 ml의 생리식염수 또는 토끼 전-면역 혈청으로 주사하였다. 2 시간후 마우스를 4.7 x 10 cfu의 O-항원 혈청형 4 균주로 복강내 감염시키고 감염후 5일 동안 관찰하였다. 이의 결과는 각 그룹에 감염시킨 마우스의 총 수에 대하여 생존한 마우스의 수를 대조함으로써 방어 백분율로서 표시되었으며 하기 표 9에 나타나 있다.

[표 9]

마우스에서 비브리오 불니피쿠스 백신으로 면역화된 토끼의 항혈청의 면역치료 효능

이상의 실험 실시예에서 볼 수 있듯이, 본 발명에 따라 제조된 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주의 용균물을 함유한 경구 투여용 백신은 모든 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주에 대해 탁월한 감염 예방능을 발휘함을 알 수 있다. 또한, 기존의 비경구 백신제제보다 제조 방법이 매우 간단하며 그로 인한 제조비용도 매우 저렴하므로 백신 접종자에게 저가로 공급이 가능하며 투여가 용이하다. 따라서 예방 백신의 주된 목적인 집단에 적용하는 프로그램에 잘 부합되도록 고안된 이상적인 경구 백신제제임을 알 수 있다.

도 1은 여러 종류의 당이 비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주의 성장에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다(■ 대조군; ◆ 과당; ▲ 갈락토즈; ● 포도당; □ 유당; ○ 맥아당; ◇ 자당).

도 2는 대규모 발효시에 비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주의 성장 패턴을 보여주는 그래프이다.

도 3은 비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주의 용균물을 토끼에 세 가지 제형으로 투여하여 유도된 혈청 IgG 역가를 보여주는 그래프이다(■ 분말의 경구투여; ▲ 과립의 경구 투여; ● 장용피 과립의 경구투여).

도 4는 비브리오 불니피쿠스 O4 혈청형 균주의 분말 제형을 토끼에 투여한 다음 생성된 항혈청의 여러가지 비브리오 불니피쿠스 O-항원 혈청형 균주에 대한 교차반응성을 보여주는 그래프이다(■ 01형; ◆ 02형; ▲ 03형; ● 04형; □ 05형; ◇ 06형; △ 07형; ○ 08형; ▽09 형).

도 5는 비브리오 불니피쿠스 O4 혈청형 균주의 분말 백신을 경구 투여 후에 얻어진 토끼 항혈청을 이용한 서로 다른 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주의 세포외막 단백질과의 웨스턴 블롯에 의한 반응성을 보여주는 사진이다.

도 6은 비브리오 불니피쿠스 01 혈청형 균주의 용균물을 토끼에 투여하여 유도된 혈청 IgG 역가를 보여주는 그래프이다.

도 7은 비브리오 불니피쿠스 O1 혈청형 균주의 분말 제형을 토끼에 투여한 다음 생성된 항혈청의 여러가지 비브리오 불니피쿠스 O-항원 혈청형 균주에 대한 교차반응성을 보여주는 그래프이다(■ 01형; ◆ 02형; ▲ 03형; ● 04형; □ 05형; ◇ 06형; △ 07형; ○ 08형; ▽09 형).

도 8은 비브리오 불니피쿠스 O1 혈청형 균주의 분말 백신을 경구 투여 후 얻어진 토끼 항혈청을 이용한 서로 다른 비브리오 불니피쿠스 혈청형 균주의 세포외막 단백질과의 웨스턴 블롯에 의한 반응성을 보여주는 사진이다.

보여주는 그래프이다.

도 9은 비브리오 불니피쿠스 01 혈청형 균주의 용균물을 토끼에 세 가지 제형으로 투여하여 유도된 혈청 IgG 역가를 보여주는 그래프이다(■ 장용피 과립의 경구투여; ▲ 현탁액으로 근육내 주사; ● 과립으로 경구투여).

도 10은 비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주의 용균물을 토끼에 세 가지 제형으로 투여하여 유도된 혈청 IgG 역가를 보여주는 그래프이다(■ 장용피 과립의 경구투여; ▲ 현탁액으로 근육내 주사; ● 과립으로 경구투여).

도 11은 대규모 발효 스케일에서의 비브리오 불니피쿠스 균주의 성장 패턴을 보여주는 그래프이다 (■ O1 혈청형 균주; □ O2 혈청형 균주; ● O3 혈청형 균주; ○ O4 혈청형 균주; ▲ O5 혈청형 균주; △ O7 혈청형 균주).

도 12는 토끼에 세가지 제형으로 투여된 비브리오 불니피쿠스 01, 02, 03, 04, 05 및 07형 백신에 의해 여러 가지 비브리오 불니피쿠스 O-항원 혈청형 1 내지 9 균주에 대해 나타난 항체의 교차반응성을 보여주는 막대그래프이다 (□ 대조군; ▤ 과립의 경구 투여; ■ 장용피 과립의 경구 투여; ▩ 근육내 주사).

Claims (7)

1. 비브리오 불니피쿠스 균주의 세포외막 단백질을 유효성분으로 함유하는 비브리오 불니피쿠스 병원균에 대한 감염 예방 경구투여용 백신.
2. 제1항에 있어서, 상기 세포외막 단백질이 비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주의 세포외막 단백질, 비브리오 불니피쿠스 01 혈청형 균주의 세포외막 단백질 또는 비브리오 불니피쿠스 01, 02, 03, 04, 05 및 07 혈청형 균주의 세포외막 단백질을 백신 항원으로서 함유하는 비브리오 불니피쿠스 병원균에 대한 감염 예방 경구투여용 백신.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 분말, 과립 또는 장용피 과립의 형태인 경구투여용 백신.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포외막 단백질의 크기가 1~5 ㎛인 경구투여용 백신.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 동종의 비브리오 불니피쿠스 균주뿐만 아니라 이종의 비브리오 불니피쿠스 균주들 간에 교차반응 및 교차방어능을 갖는 경구투여용 백신.
6. 비브리오 불니피쿠스 균주의 용균물을 마이크로플루이다이저에 통과시켜 입자크기를 1~5 ㎛로 균일하게 하는 단계; 세포외막 단백질을 분리하는 단계; 분말화, 과립화 또는 장용피화하는 단계를 포함하는 비브리오 불니피쿠스 병원균에 대한 감염 예방 경구투여용 백신을 제조하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 세포외막 단백질이 비브리오 불니피쿠스 04 혈청형 균주의 세포외막 단백질, 비브리오 불니피쿠스 01 혈청형 균주의 세포외막 단백질 또는 비브리오 불니피쿠스 01, 02, 03, 04, 05 및 07 혈청형 균주의 세포외막 단백질인 방법.