WO2008140353A1 - Средство, обладающее свойством формировать клеточный иммунитет против мусоbасtеrium tubеrсulоsis h37 rv, способ получения его (варианты), рекомбинантный штамм и средство для диагностики туберкулеза - Google Patents

Средство, обладающее свойством формировать клеточный иммунитет против мусоbасtеrium tubеrсulоsis h37 rv, способ получения его (варианты), рекомбинантный штамм и средство для диагностики туберкулеза Download PDF

Info

Publication number
WO2008140353A1
WO2008140353A1 PCT/RU2008/000270 RU2008000270W WO2008140353A1 WO 2008140353 A1 WO2008140353 A1 WO 2008140353A1 RU 2008000270 W RU2008000270 W RU 2008000270W WO 2008140353 A1 WO2008140353 A1 WO 2008140353A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tuberculosis
antigen
strain
complex
species
Prior art date
Application number
PCT/RU2008/000270
Other languages
English (en)
French (fr)
Other versions
WO2008140353A8 (ru
Inventor
Nikolay Nikolaevich Kislichkin
Original Assignee
Obschestvo S Ogranichennoy Otvestvennostyu "Biotek"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Obschestvo S Ogranichennoy Otvestvennostyu "Biotek" filed Critical Obschestvo S Ogranichennoy Otvestvennostyu "Biotek"
Priority to CN200880024159A priority Critical patent/CN101861166A/zh
Priority to EP08767027A priority patent/EP2156844A4/en
Priority to EA200901503A priority patent/EA014065B1/ru
Publication of WO2008140353A1 publication Critical patent/WO2008140353A1/ru
Publication of WO2008140353A8 publication Critical patent/WO2008140353A8/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/5695—Mycobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2

Definitions

  • the invention relates to the field of biopharmacology, preparative biochemistry, medicine, and for the creation of funds based on the tuberculosis complex produced by the microorganism, which can be used in the treatment and diagnosis of tuberculosis.
  • tubersulosis H37 Ra and transferring fragments of the chromosomal DNA of the causative agent of tuberculosis to the recipient bacteria E. coli XL-Blue. It has been shown that from a specific fragment of the chromosomal DNA of M. tubersulsis H37 Ra, which
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) consists of 1535 base pairs and is part of the plasmid vector pZx7, the synthesis of tuberculosis protein with an approximate mass of 52.0 kDa is possible.
  • This protein is localized on the external membrane of E. coli XL 1-Blue; it gives the recombinant strain the ability to penetrate into HeLa eukaryotic cells and multiply in them, which is typical for pathogenic mycobacteria.
  • the authors do not indicate that this protein is individual (species-specific) and can be used to diagnose the causative agent of tuberculosis.
  • the amino acid sequence of the studied protein has homology both with pathogenic microorganisms (List KochrioposutShis, Shigella, Jer ⁇ pi réelle ps Canalud Desid
  • ⁇ -adaptin (1) a number of human proteins, for example, ⁇ -adaptin (1).
  • the secreted MPT63 protein having a molecular weight of 18.0 kDa, was isolated and characterized from the filtrates of the culture of M. tubersulosis. Analysis of the nucleotide sequence of the mp + 63 gene showed that it has an open reading frame encoding a protein of 159 amino acids and consisting of 29 amino acids of the signal peptide and 130 amino acids of the mature MPT63 protein. Recombinant MPT63 protein from E. coli cells and purified from M. tuberculosis culture filtrates were indistinguishable in serological reactions and had a strong effect on the humoral immunity of guinea pigs infected with a virulent strain of M. tubulixis. It was supposed to use this protein as a specific reagent for the diagnosis of skin testing for tuberculosis, but so far this protein and the protein complex with the signal peptide have not been widely used (2).
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The description and characterization of the 4 major secreted extracellular proteins of M. tuberculosis isolated from non-pathogenic rapidly growing mycobacteria, which have enzymatic activity and are also present in pathogenic strains, is also known. These proteins are supposed to be used for the construction of biological vaccines, since they induce protective immunity, but so far they have not received recognition (3).
  • the objective of the invention is to obtain, by genetic engineering and microbiological methods, a recombinant strain 2-9XL Acipetobaster johpsopii, a producer of a specific tuberculosis complex M. tuberculosis H37 Rv, which can be the basis of a biological vaccine against the causative agent of tuberculosis and a diagnosticum for identifying patients with various tuberculosis diseases and in various stages of the disease.
  • a recombinant strain of 2-9XL Asipetobaster joppsopii obtained by genetic engineering method with subsequent selection of a SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) was proposed microbiological method, which is a producer of a species-specific glycoprotein tuberculosis complex (TB antigen), which is localized on the outer membrane and in the capsular substance of the bacterium and, when isolated, can be used as a basis for obtaining a biological vaccine, diagnostic and medicines.
  • TB antigen species-specific glycoprotein tuberculosis complex
  • the claimed invention is an agent having the property of forming cellular immunity against
  • M. tubersulosis H37 Rv The product contains a species-specific glycoprotein tuberculosis complex M. tubersulosis H37 Rv (TB antigen).
  • variants of the methods for producing the species-specific glycoprotein tuberculosis complex M. tubersulosis H37 Rv (TB antigen), as well as the recombinant strain 2-9XL Acipetobacterium HCP-VKPM-9312, the producer of the species-specific glycoprotein-complex M. tuberculosis 37 M. tuberculosis complex (M. tuberculosis), are claimed. ) and a tool for the diagnosis of tuberculosis containing the above species-specific glycoprotein tuberculosis complex.
  • 2-9XL Asipetobaster johpsopii is a genetically engineered strain obtained by transferring two fragments of chromosomal DNA of M. tubulissis H37 Rv into the R plasmid P. tularepsis in the vector plasmid pRT and subsequent selection using a microbiological method.
  • strain 2-9XL Acipetobaster joppsopii The main properties of strain 2-9XL Acipetobaster joppsopii - super producer of recombinant tuberculosis antigen.
  • Cultural and morphological properties Under light microscopy ( Figures 1, 2 of the drawings. Light microscopy, bacteria 2-9XL Acipetobaster johpsopii. Gram stain (Set of dyes of the company "Serva"). Culture 2-9XL Acipetobacterium cultivated on a cultivated medium agar with 1% glucose and additives, pH 6.6) for three days at +32 0 C. A-Uv. 100X3 ...;
  • the bacterial capsule is stained with red safranin) bacteria are immobile polymorphic small cocciform and rod-shaped cells 0.4-1.0 microns in size. When stained according to Gram, bacteria are resistant to discoloration, which gives the impression of gram-positive staining.
  • Strain 2-9XL aerob grows on simple and rich media (auxotroph) at + 32 0 C, but can grow in the range from + 28 0 C to + 37 0 C.
  • a necessary growth factor of 2-9XL is cysteine.
  • rich media with vitamin and other additives are preferred.
  • bacteria 2-9XL form gray-white colonies with a yellowish tint.
  • growth retardation of up to two days is possible.
  • the size of the colonies can be a SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) reach a diameter of 5-7 mm. If the cups with sowing are kept for 2-3 days in the refrigerator (+4 0 C), 3 colonies acquire a predominantly yellow-gray color.
  • the colonies are convex with uneven edges, not shiny, opaque, when taking a loop, the consistency of the colonies is dense, easily removed from the surface of nutrient agar.
  • strain 2-9XL With successive transfers in dense nutrient media, cultivation at various temperature conditions, after storage in a freeze-dried state, deterioration of the nutritional properties of the growth medium and other adverse conditions, strain 2-9XL becomes unstable and dissociates into other forms. Dissociation is most noticeable after prolonged cultivation of isolated colonies ( Figures 6 to 11 of the drawings). Dissociation of culture 2-9XL Acipetobaster johpsopii according to cultural and morphological characteristics.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Petri dish with dissociated culture 2-9XL. Colony growth of various morphologies during titration of culture from a lyophilized state. FT agar with 1% glucose, cysteine, pH 6.6. Incubation time at + 32 0 C for 10 days, storage in the refrigerator (+ 4 0 C).
  • Figure 6 Petri dish photographed on a white background
  • figure 7 Petri dish photographed on a gray background.
  • Figures 8-11 Enlarged fragments of a Petri dish with colonies 2-9XL of different morphology.
  • Figure 8 (1) Large round white opaque flat with a convex center and a smooth edge shiny colony, can be easily removed from the agar loop;
  • Figure 8 (2) - Small round gray-yellow opaque convex with a smooth edge non-shiny colony, easily removed by loop from agar;
  • Figure 9 The average round gray-yellow-white opaque with a convex well-defined center and a pronounced roller along a smooth edge is not a shiny colony, easily removed by loop from agar;
  • Figure 10 Medium non-round yellow opaque with a pronounced convex center uneven surface and non-shiny colony edge, easily removed by loop from agar;
  • Figure 11 Large, not round, yellow-gray opaque with a pronounced convex center, uneven surface and not brilliant colony with the edge, easily removed by loop from agar).
  • Biochemical properties of strain 2-9XL Bacteria, when grown on solid nutrient media, break down proteins with a specific, non-irritating odor. When grown on rich nutrient media, they are able to synthesize a recombinant SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) tuberculosis antigen. Oxide-positive and catalase-negative. The biochemical properties of the recombinant strain 2–9XL Acipetobacter joppsopii have not been fully studied.
  • Bacteria 2-9XL have very high adhesion (the ability to stick) (See figures 1, 2 of the drawings), which does not allow to verify their agglutinability in the agglutination reaction.
  • the TB antigen in the ultrasonic disintegrates of bacteria and in purified form interacts with the antibodies of the blood serum of people with tuberculosis and does not interact with antibodies in the blood serum of healthy people.
  • the TB antigen does not interact with the antibodies of patients with tuberculosis, since it is not transferred to the nitrocellulose membrane.
  • strain 2-9XL Asipetobacter johpsopii as part of the chromosomal DNA contains at least one insertion of a fragment of the chromosomal DNA M. tubersulosis H37 Rv, but two inserts are possible.
  • Productivity Recombinant strain 2-9XL is a producer of a glycoprotein-derived tuberculosis antigen (TB antigen). Proteins synthesized from a fragment of the chromosomal DNA of M. tubersulosis H37 Rv form a species-specific glycoprotein complex on the outer membrane of the bacterium 2-9XL and in its capsule substance ( Figures 12-14 / drawings).
  • Guinea pigs were immunized subcutaneously in the back to the scapular region with a TB antigen at a dose of 300 ⁇ g / ml with incomplete Freund's adjuvant. Three weeks later, the administration of the drug was repeated.
  • the antibody response in laboratory animals was evaluated 21 days after the last administration of the TB antigen. For this, blood sampling was carried out, serum was obtained and the presence of specific TB antibodies in the diffuse precipitation reaction and by the enzyme immunoassay was checked.
  • the presence of a recombinant TB antigen in animals causes a B-type rearrangement of their immune system.
  • the prolonged presence of the TB antigen or its repeated administration makes the restructuring of the immune system persistent, as indicated by an increase in titers of specific antibodies in the blood serum of animals.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) In patients with tuberculosis of people and bacteria carriers, specific B-cell immunity is determined using TB antigen in enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), on nitrocellulose filters (Immunoblotting, Dot blot) and in other reactions using clinical fluids (blood serum, sputum, pleural fluid, cerebrospinal fluid and others) containing specific antibodies.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assays
  • Dot blot enzyme-linked immunosorbent assays
  • clinical fluids blood serum, sputum, pleural fluid, cerebrospinal fluid and others
  • Serum samples are provided by gos. Research Institute for Standardization and Control of Medical and Biological Preparations L.A. Tarasevich (GISK) and LLC "BIOHOM". 460 people were examined.
  • OP> 0.6 - indicates the presence of antibodies in the blood serum to the causative agent of tuberculosis; 0.3> OP ⁇ 0.6 - doubtful result ("gray zone");
  • OP ⁇ 0.3 - indicates the absence of antibodies to the causative agent of tuberculosis;
  • MBT + - the diagnosis of tuberculosis is confirmed by the release of mycobacteria from the patient;
  • MBT- - the diagnosis of tuberculosis is confirmed by clinical and radiological methods.
  • HIV - human immunodeficiency virus HBV - hepatitis B virus
  • HCV - hepatitis C virus HCV - hepatitis C virus.
  • Comparison drug REPLACEMENT SHEET served dry purified tuberculin (Tuberculum Derumatum sissum) produced by RAO "BIOPREPARAT", St.
  • the TV antigen is very promising as a diagnostic drug for determining the presence of specific T-cell immunity in patients and people infected with tuberculosis and as a biological vaccine.
  • LD 5O value for linear Balb / c mice and Golden hamsters exceeds IxIO 7 microbial cells and 5x10 7 microbial cells, respectively.
  • Strain 2-9XL Asipetobaster johpsopii is avirulent for guinea pigs and rabbits (LD 5 value ( ⁇ IxIO 9 microbial cells per animal).
  • strain 2–9XL Acipetobacter joppsopii can be assigned to the 4th group of microorganisms according to the International Classification.
  • the conditions and composition of the media for storage and maintenance of the strain The museum culture of strain 2-9XL Acipetobaster is stored at a temperature of +4 0 C on the jambs of the FT medium with the addition of glucose and cysteine for up to 2 months, and in the lyophilized state in sucrose-gelatinous medium for up to 5 years.
  • the recombinant strain 2-9XL Acipetobaster joppsopii is cultivated on a dense FT-medium with the addition of glucose and cysteine at + 32 0 C.
  • the recombinant strain 2-9XL grows poorly in liquid culture media and quickly loses the ability to produce TB antigen. Therefore, the biomass build-up for the subsequent isolation of the TB antigen is carried out only on solid nutrient media.
  • the matrix culture is grown on the jambs at + 32 0 C for 2-3 days, then the bacteria are washed off with physiological saline and one or two mattresses are sown from one pigtail.
  • Mattresses SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) incubated in a thermostat at + 32 0 C for 3-4 hours, then the grown biological mass is washed off with distilled water and centrifuged to remove soluble components of the nutrient medium. Recombinant TB antigen is released from the biological mass purified from the components of the nutrient medium.
  • Example 1 Obtaining a species-specific glycoprotein tuberculosis complex (TB antigen) from a recombinant strain 2-9XL Acipetobacter j ohpsopii.
  • pH 6.6 consisting of cardiac cerebral agar, hydrolyzed hemoglobin, cysteine and glucose in appropriate proportions or FT-agar pH 6.6 (Production of FSUE SSC PM, Obolensk, Russia) with the addition of cysteine and glucose loops make culture 2-9XL. Inoculation is incubated in an incubator at + 32 0 C for two days. The two-day culture is washed off with physiological saline and a suspension of bacteria is prepared at a concentration of 5x10 9 microbial cells (m.k.) in one milliliter.
  • the bacterial population of the recombinant strain 2-9XL with small changes in the composition of the SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) nutrient medium, temperature, or other conditions can quickly dissociate into forms that do not produce TB antigen. When stained according to Gram, these bacteria are gram-negative, bacteria producing TB antigen are resistant to discoloration and look like gram-positive (figures 1, 2 of the drawings). In the grown biomass 2-9XL, the number of gram-negative bacteria should not exceed 5-10%].
  • the suspension of bacteria washed off the mattress is centrifuged ("Weightkmap" G2-21, USA) at 9000 rpm for 30 minutes.
  • the supernatant containing soluble components of the nutrient medium is discarded, and the precipitate is suspended in 40 ml of chilled deionized water, and all subsequent procedures are done at + 4 ° C.
  • the culture is treated with 2-9XL 0.5N NaOH solution, bringing the pH to 6, 0 to 9.0
  • the dissolution of the capsule of bacteria that contains the species-specific recombinant TB antigen is carried out fractionally, adding NaOH in small portions and thoroughly mixing the suspension for several hours.
  • the bacterial suspension thus treated is left in the refrigerator (+4 0 C) overnight (15-16 hours).
  • the obtained first portion of the preparation of capsules 2-9XL in the cold is neutralized with a 0.5N trichloroacetic acid (TCA) solution to pH 6.0 and, since it contains a sufficiently large number of bacteria, it is centrifuged at 15000 rpm for a SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 40 minutes. The sediment is discarded and the supernatant acidified
  • TCA 0.5N TCA to pH 3.0-3.5.
  • the TB antigen is collected in the complex and begins to precipitate.
  • the drug is left in the refrigerator (+4 0 C) at night (15-16 hours).
  • the TCA precipitate deposited overnight in this solution can be stored at + 4 ° C for up to two weeks without losing the specific activity of the TB antigen present in it.
  • a second portion of the drug is left in the refrigerator to form a TB antigen precipitate.
  • the precipitate is dissolved in 1-2 ml of PBS buffer (0.0067M KH 2 PO 4 , 0.0067M Na 2 HPO 4 , 0 ⁇ 38M NaCl, 0.0027M KCl pH 7.0).
  • PBS buffer solution contains predominantly species-specific TB antigen ( Figure 12 of the drawings. Electrophoresis of the TB antigen of the recombinant strain 2-9XL Acipetobaster jophsopii. 16% SDS-PAAG protein electrophoresis of the recombinant strain 2-9XL. 60-17 Ov. 60. glycine buffer pH 8.3.
  • M - markers 67.0 kDa; 45.0 kDa; 25.0 Sha; 17.0 kDa; 12.3 kDa.
  • the arrow indicates the double protein of the TB antigen, which does not exhibit specific activity;
  • TCA trichloroacetic acid
  • the arrow indicates the TB antigen in the assembly. This protein complex exhibits specific activity.), which already exhibits specific activity, but requires additional purification).
  • the TCA precipitate that has fallen overnight can be stored at +4 0 C for up to two weeks without losing the specific activity of the TB antigen present in it.
  • the next day a second portion of the drug is dissolved in 1-2 ml of PBS buffer. It contains predominantly species-specific TB antigen.
  • the TB antigens of the first and second portions are combined and subjected to further purification.
  • Example is the most economical production of TB antigen from the recombinant strain 2-9XL Acipetobaster joppsopii, but it does not exclude the possibility of obtaining it in any other way (Destruction of bacteria using ultrasound or by freezing-thawing, or otherwise , followed by the concentration of TB antigen).
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Example 2. Obtaining a species-specific glycoprotein tuberculosis complex (TB antigen) from the recombinant strain 2-9XL Asipetobaster steroid.
  • a dense nutrient medium (kosyachki) with a pH of 6.6, consisting of cardiac cerebral agar, hydrolyzed hemoglobin, cysteine and glucose in appropriate proportions or FT agar pH 6.6 (Production of FSUE SSC PM, Obolensk, Russia) make inoculation loop culture 2-9XL. Inoculation is incubated in an incubator at + 32 0 C for three days. A three-day culture is washed off with physiological saline and a suspension of bacteria is prepared at a concentration of 5x10 9 microbial cells (m.k.) in one milliliter.
  • microbial cells m.k.
  • the resulting suspension is sown on mattresses at the rate of one joint for 1-2 mattresses (400.0 ml of culture medium is poured into one mattress). Inoculation is incubated in an incubator at + 32 0 C for three days. From one mattress, a three-day culture of 2-9XL is washed off with 30 ml of physiological saline. A smear for light microscopy is prepared from the suspension of the washed culture and stained with Gram (Monitoring for the presence of TB antigen in recombinant bacteria 2-9XL). The suspension of bacteria washed off the mattress is centrifuged
  • the 2-9XL bacterial suspension was centrifuged at 12,000 rpm for 40 minutes.
  • the supernatant partially dissolved capsule of the recombinant strain 2-9XL 3 containing the TB antigen
  • the precipitate bacteria 2-9XL, which have preserved and not preserved the capsule.
  • To the precipitate add 40 ml of deionized water and repeat the procedure for dissolving the capsule, obtaining a second portion of the drug.
  • the second portion of the preparation is neutralized with a 0.5N trichloroacetic acid solution (TCA) to a pH of 6.0, and then ammonium sulfate [(NSCHSOJ up to 30% saturation, added overnight at +4 0 C to precipitate.
  • TCA 0.5N trichloroacetic acid solution
  • ammonium sulfate [(NSCHSOJ up to 30% saturation, added overnight at +4 0 C to precipitate.
  • the next the preparation of TB antigen precipitated during 100% precipitation with ammonium sulfate is centrifuged at 12,000 rpm for 40 minutes, the supernatant is discarded, the precipitate is dissolved in 2.0 ml of PBS buffer, pH 7.0 (based on one mattress ) and dialyzed against a large volume of PBS buffer.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) During the day, the volumes of the PBS buffer are changed at least three times to completely remove ammonium sulfate from the
  • the second portion of the preparation containing 30% ammonium sulfate is centrifuged at 12,000 rpm for 40 minutes and the precipitate is discarded, the supernatant is saturated with 100% ammonium sulfate and left overnight at +4 0 C.
  • M markers 67.0 kDa; 45.0 kDa; 25.0 kDa; 17.0 kDa; 12.3 kDa.
  • the TB antigens of the first and second portions are combined and subjected to further purification.
  • a species-specific glycoprotein tuberculosis complex SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) (TB antigen) from the recombinant strain 2-9XL is possible not only by precipitation of it from alkaline lysates with trichloroacetic acid to a pH of 3.5-4.0, as shown in Example 1. It is possible to use methods of precipitation of TB antigen using various salts for example, ammonium sulfate or other methods, eluates contain purified TB antigen with a molecular weight of 55.0 to 75.0 kDa and the presence of carbohydrates from 20% to 50%.
  • Example 3 Purification of a species-specific glycoprotein tuberculosis complex (TB antigen) obtained from the recombinant strain 2-9XL Acipetobaster ojpsopii.
  • the total carbohydrate content is determined by the phenolic method 151.
  • the eluates contain purified TB antigen with a molecular weight of 55.0 to 75.0 kDa and the presence of carbohydrates from 20% to 50%.
  • Specific tuberculous recombinant antigens are stored at +4 0 C in freeze-dried condition.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The presence of purified TB antigen and its structure obtained by the above method are recorded in SDS-PAAG electrophoresis gel ( Figure 14 of the drawings. Electrophoresis of TB antigen of recombinant strain 2-9XL Acipetobacter johnsopii. 17% SDS-PAAG complex of recombinant 2 recombinant electrophoresis 9XL by Lamley 60-17 Ov 60 minutes Tris-glycine buffer pH 8.3.
  • M - markers 67.0 kDa; 45.0 kDa; 25.0 kDa; 17.0 kDa; 12.3 kDa.
  • the vertical arrows indicate the TB antigen in the assembly. This protein complex exhibits specific activity.
  • the side arrows indicate the components of the protein complex).
  • Obtaining purified TB antigen is possible not only by fractionation of macromolecules by gel filtration using various carriers as a matrix, but also by ion exchange chromatography.
  • Example 4 The use of purified species-specific TB antigen in the diagnosis of human tuberculosis.
  • test system which is an indirect enzyme-linked immunosorbent assay with phase separation, where 96-well plates are used as a solid support.
  • the substrate for ELISA is a tuberculosis antigen obtained from recombinant strain 2-9X by chromatographic fractionation.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) 100 ⁇ l of antigen in concentration are added to the wells of the plate.
  • reaction mixture was incubated for 1 hour at 37 ° C, after which the cells were washed five times with PBS-Twep 20.
  • a substrate solution was prepared by adding 3 ⁇ l of 30% H 2 O 2 to 10 ml of freshly prepared
  • the plate is incubated at +37 ° C for one hour, 100 ⁇ l of 1% SDS are added to stop the enzymatic reaction, and the light absorption at 405 nm is measured on a Bio-Rad vertical model 680 photometer. The results are compared with a vertical well blank series in which there was serum that did not contain specific antibodies.
  • the purified recombinant TB antigen interacts only with the blood serum antibodies of people with tuberculosis and does not interact with the blood serum antibodies of healthy people.
  • the recombinant 2-9XL TB antigen can be used for diagnostic purposes on a solid phase carrier, nitrocellulose membrane and other test systems that identify specific antibodies that are produced by the human body for the presence or propagation of the M. tuberculosis pathogen in it. tubersulosis H37 Rv.
  • Specific antibodies produced by humans in response to the penetration and development of the causative agent of tuberculosis in them can be found not only in blood serum, but also in other clinical fluids (sputum, exudate, urine, and so on).
  • Monoclonal antibodies or hyperimmune sera of various animals obtained on purified recombinant TB antigen can be used in diagnostic methods when searching in human clinical fluids (sputum, exudate, material
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) microbiopsies and so on) both mycobacterium tuberculosis and their specific components.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биофармакологии, препаративной биохимии, медицине и касается создания средства на основе туберкулезного комплекса, продуцируемого микроорганизмом, которое может найти применение в профилактике, лечении и диагностике туберкулеза. Безопасный для человека, животных и окружающей среды рекомбинантный штамм 2-9XL Асinеtоbасtеr jоhnsоnii в составе свой хромосомы содержит фpaгмeнт(ы) хромосомной ДНК M. tubеrсulоsis H37 Rv, при помощи которого одновременно синтезируются несколько белков, формирующих во внешней мембране и капсульном веществе бактерии стабильный видоспецифический туберкулезный гликопротеиновый комплекс. Простота работы с рекомбинантным штаммом 2-9XL, использование стандартных сред, стабильность синтеза видоспецифического туберкулезного комплекса, экономичная безопасная технология выделения и очистки туберкулезного комплекса делают данный микроорганизм перспективным продуцентом средства, обладающего свойством формировать T- и В- клеточный иммунитет против возбудителя M. tubеrсulоsis.

Description

Средство, обладающее свойством формировать клеточный иммунитет против Мусоbасtеrium tubеrсulоsis H37 Rv, способ получения его (варианты), рекомбинантный штамм и средство для диагностики туберкулеза.
Изобретение относится к области биофармакологии, препаративной биохимии, медицине и касается создания средства на основе туберкулезного комплекса, продуцируемого микроорганизмом, которое может найти применение в лечении и диагностике туберкулеза.
Важным звеном в решении проблемы туберкулеза является создание биологических вакцин и разработка методов быстрой и недорогой диагностики. Очевидно, что необходимо идентифицировать в возбудителе туберкулеза такие белки и формируемые ими комплексы, которые отвечали бы самым современным требованиям для достижения этих целей. У биологических вакцин основным критерием является безопасность для человека, наряду с высокой эффективностью, у диагностических препаратов — чувствительность и специфичность. Главными направлениями решения поставленной задачи являются: а) клонирование генов микобактерий в безопасном реципиенте и изучение свойств синтезируемых туберкулезных белков, б) выделение из микобактерий белков и их комплексов с последующей характеристикой свойств. В литературе описана возможность создания геномной библиотеки M. tubеrсulоsis H37 Ra и передачи фрагментов хромосомной ДНК возбудителя туберкулеза в реципиентные бактерии E. соli ХLl-Вluе. Показано, что с определенного фрагмента хромосомной ДНК M. tubеrсulоsis H37 Ra, который
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) состоит из 1535 пар оснований и находится в составе плазмидного вектора pZx7, возможен синтез туберкулезного белка с приблизительной массой 52,0 kDа. Этот белок локализуется на внешней мембране E. соli ХL 1-Blue, наделяет рекомбинантный штамм возможностью проникать внутрь эукариотических клеток HeLa и размножаться в них, что характерно для патогенных микобактерий. Однако авторами не указывается, что данный белок является индивидуальным (видоспецифичным) и может быть использован для диагностики возбудителя туберкулеза. Наоборот, аминокислотная последовательность изученного белка имеет гомологию как с патогенными микроорганизмами (Listеriа mопосуtоsis, Shigеllа, Jеrsiпiа рsеudоtubеrсulоsis), так и с рядом белков человека, например, β-адаптином (1).
Из фильтратов культуры M. tubеrсulоsis выделен и охарактеризован секретируемый белок MPT63, имеющий молекулярную массу 18,0 kDа. Анализ нуклеотидной последовательности mp+63 гена показал, что он имеет открытую рамку считывания, кодирующую белок из 159 аминокислот и состоящую из 29 аминокислот сигнального пептида и 130 аминокислот зрелого MPT63 белка. Рекомбинантный MPT63 белок из клеток E. соli и очищенный из культуральных фильтратов M. tubеrсulоsis были неразличимы в серологических реакциях и оказывали сильное воздействие на гуморальный иммунитет морских свинок, инфицированных вирулентным штаммом M. tubеrсulоsis. Предполагалось использовать этот белок в качестве специфического реагента для диагностики кожного тестирования при заболевании туберкулезом, однако до настоящего времени этот белок и комплекс белка с сигнальным пептидом не нашли широкого применения (2).
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Известно также описание и характеристика 4 главных секретируемых внеклеточных белков M. tubеrсulоsis, выделенных из непатогенных быстро растущих микобактерий, которые обладают ферментативной активностью и присутствуют также в патогенных штаммах. Эти белки предполагается использовать для конструирования биологических вакцин, так как они индуцируют защитный иммунитет, однако до настоящего времени они не получили признания (3).
Таким образом, к настоящему времени не создан генно- инженерный микроорганизм, который мог бы синтезировать туберкулезные видоспецифические белки или их комплексы, пригодные для использования в диагностических целях или являться основой для создания биологической вакцины. Белки, выделяемые из патогенного штамма M. tubеrсulоsis или не патогенных микобактерий, также до настоящего времени не позволяют создать на их основе высокоспецифичные и чувствительные диагностические препараты или сконструировать биологические вакцины.
Задача изобретения заключается в получении генно- инженерным и микробиологическим способом рекомбинантного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii - продуцента специфического туберкулезного комплекса M. tubеrсulоsis H37 Rv, который может быть основой биологической вакцины против возбудителя туберкулеза и диагностикума для выявления больных туберкулезом людей с самыми разными формами заболевания и в различных стадиях болезни.
Для решения поставленной задачи предложен рекомбинантный штамм 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii, полученный генно- инженерным способом с последующей селекцией ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) микробиологическим способом, являющийся продуцентом видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса (ТБ-антигена), который локализован на внешней мембране и в капсульном веществе бактерии и при выделении может быть использован как основа для получения биологической вакцины, диагностических и лекарственных средств.
Технический результат — получение высокоспецифичных и чувствительных препаратов.
Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.
Заявлено изобретение, представляющее собой средство, обладающее свойством формировать клеточный иммунитет против
M. tubеrсulоsis H37 Rv. Средство содержит видоспецифический гликопротеиновый туберкулезный комплекс М.tubеrсulоsis H37 Rv (ТБ-антиген).
Кроме того, заявлены варианты способов получения видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса М.tubеrсulоsis H37 Rv (ТБ-антиген), а также рекомбинантный штамм 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii VKPM-9312 - продуцент видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса М.tubеrсulоsis H 37 Rv (ТБ-антигена) и средство для диагностики туберкулеза, содержащее вышеуказанный видоспецифический гликопротеиновый туберкулезный комплекс.
2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii является генно-инженерным штаммом, полученным путем передачи в бактерии R-формы F. tulаrепsis в составе векторной плазмиды рRТ двух фрагментов хромосомной ДНК M. tubеrсulоsis H37 Rv и последующей селекции микробиологическим способом.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) До настоящего времени при клонировании генов возбудителя туберкулеза (ТБ) в составе векторных плазмид использовали бактерий-хозяев, которые могли синтезировать только единичные белки ТБ. Выделение и изучение генно-инженерных белков ТБ (как и природных белков возбудителя туберкулеза) не привели к желаемому результату - созданию биологических вакцин, лекарственных препаратов, высоко специфичных и чувствительных диагностикумов. Поэтому в мире продолжаются поиски новых белков микобактерий, с помощью которых возможно решение поставленных задач.
Вероятно, данное направление может быть ошибочным, так как видоспецифичность возбудителя туберкулеза формируется на уровне комплекса из нескольких белков (не менее трех), часть из которых должна быть гликозилирована, то есть содержать полисахаридную часть.
Показано, что при передаче фрагментов ДНК M. tubеrсulоsis H37 Rv в составе векторной плазмиды рRТ в реципиент R-форму F. tulаrепsis и последующей селекции трансформанта определенным микробиологическим способом перенесенные фрагменты (фрагмент) встраиваются в хромосомную ДНК бактерии-реципиента и вызывают синтез туберкулезного полипептида. Первоначально этот полипептид формирует в бактерии-хозяине специфический рекомбинантный туляремийно-туберкулезный комплекс, связываясь с туляремийными белками, имеющими более высокую молекулярную массу. Однако, данная конструкция, вероятно, для бактерии-хозяина неудобна и при дальнейшей селекции рекомбинантного штамма начинается синтез ТБ-белков более высокой молекулярной массы, которые замещают туляремийные.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) При такой серьезной «peкoнcтpyкции» в бактерии происходят не только изменения биохимических и фенотипических свойств рекомбинантного микроорганизма (по ряду свойств он становится похож на туберкулезные микобактерии), но меняется также и структура ДНК бактерии.
Заключение о видовой принадлежности штамма «9xa» (2-9XL) с помощью анализа 16S РНК получено в ВКПМ ФГУП ГосНИИГенетика.
Анализ последовательностей 16S рРНК показал, что исследуемый штамм, заявленный как «9xa» (2-9XL), принадлежит к виду бактерий Асiпеtоbасtеr jоhпsопii, причем со штаммом Асiпеtоbасtеr jоhпsопii strаiп 42 гомология составляет 99% .
Основные свойства штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii - суперпродуцента рекомбинантного туберкулезного антигена. Культурально-морфологические свойства: При световой микроскопии (Фигуры 1, 2 чертежей. Световая микроскопия , бактерий 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii. Окраска по Граму (Набор красителей фирмы "Sеrvа"). Культура 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii выращена на туляремийной среде (FТ-агар с 1% глюкозой и добавками, рН 6,6) в течение трех суток при +320C. А-Ув. 100X3...;
B~100X9,ЗX... (Микроскоп "Биoмeд-2, Россия). На представленных рисунках хорошо видно, что рекомбинантные бактерии 2-9XL устойчивы к обесцвечиванию и склонны к агрегации (склеиванию).
Капсула бактерий окрашивается сафранином в красный цвет) бактерии представляют собой неподвижные полиморфные мелкие кокковидные и палочковидные клетки размерами 0,4-1,0 мкм. При окраске по Граму бактерии устойчивы к обесцвечиванию, что производит впечатление грамположительного окрашивания.
Образуют разнообразные по размерам и форме скопления клеток, ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) что указывает на их высокую степень агрегации (склеивания).
Агрегация бактерий связана с образованием специфической капсулы, которая хорошо прокрашивается сафранином. При утрате рекомбинантного туберкулезного антигена бактерии становятся истинно грамотрицательными.
Штамм 2-9XL аэроб растет на простых и богатых средах (ауксотроф) при +320C, однако может расти в интервале от +280C до +370C. При росте бактерий на простых средах культура прекращает синтез рекомбинантного туберкулезного антигена. Необходимым фактором роста 2-9XL является цистеин. Для максимального синтеза специфической капсулы, содержащей рекомбинантный туберкулезный aнтигeн,jпpeдпoчтитeльны богатые среды с витаминными и другими добавками.
В качестве стимулятора роста бактерий и формирования специфической капсулы возможно добавление в питательную среду 1% суспензии автоклавированных бактерий 2-9XL и (или) 10% автоклавированного капсульного вещества. Наиболее удобны для выращивания рекомбинантного штамма 2-9XL питательные среды, используемые для выращивания туляремии, чумы, бруцеллеза и так далее. Посев культуры на питательные среды выдерживают в термостате от двух до семи суток. При росте бактерий 2-9XL появляется характерный специфический не раздражающий запах. Штамм 2-9XL плохо растет на жидких питательных средах и быстро теряет способность продуцировать рекомбинантный туберкулезный антиген.
На плотных питательных средах бактерии 2-9XL образуют колонии серо-белого цвета с желтоватым отливом. При титровании культуры до отдельных изолированных колоний возможна задержка роста до двух суток. По мере роста размеры колоний могут ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) достигать диаметра 5-7 мм. Если чашки с посевом выдержать 2-3 -е суток в холодильнике (+40C)3 колонии приобретают преимущественно желто-серую окраску. Колонии выпуклые с неровными краями, неблестящие, непрозрачные, при взятии петлей консистенция колоний плотная, легко снимается с поверхности питательного агара. При титровании культуры 2-9XL на плотных питательных средах невозможно приготовить стандартную взвесь из-за высокой способности клеток к склеиванию (спонтанная агглютинация), поэтому титр бактерий не соответствует стандартному разведению (Фигуры 3, 4, 5 чертежей. Кулыурально- морфологические свойства 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii. Изолированные колонии рекомбинантного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii, выросшие на FТ-агаре с цистеином и 1% глюкозой, рН 6,6 в течение трех суток при +320C. Хранение в холодильнике (40C) в течение пяти суток. Фигура 3 - обычный фон; фигуры 4, 5 — белый фон. Фигура 5 - Увеличенный фрагмент чашки Петри).
Стабильность популяции штамма 2-9XL.
При последовательных пересевах на плотных питательных средах, выращивании при различных температурных режимах, после хранения в лиофильно высушенном состоянии, ухудшении питательных свойств среды для выращивания и других неблагоприятных условиях, штамм 2-9XL становится не стабильным и диссоциирует в другие формы. Диссоциация наиболее заметна после длительного выращивания изолированных колоний (Фигуры 6 - 11 чертежей). Диссоциация культуры 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii по культурально-морфологическим признакам.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Чашка Петри с диссоциациированной культурой 2-9XL . Рост колоний различной морфологии при титровании культуры из лиофильно высушенного состояния. FТ-агар с 1% глюкозой, цистеином, рН 6,6. Время инкубации при +320C 10 суток, хранение в холодильнике (+40C).
Фигура 6 — Чашка Петри сфотографирована на белом фоне; фигура 7 — Чашка Петри сфотографирована на сером фоне.
Фигуры 8-11 - Увеличенные фрагменты чашки Петри с колониями 2-9XL различной морфологии. Фигура 8 (1) — Крупная круглая белая непрозрачная плоская с выпуклым центром и ровным краем блестящая колония, легко снимется с агара петлей;
Фигура 8 (2) — Маленькая круглая серо-желтая непрозрачная выпуклая с ровным краем не блестящая колония, легко снимается петлей с агара;
Фигура 9 — Средняя круглая серо-желто-белая непрозрачная с выпуклым хорошо обозначенным центром и выраженным валиком по ровному краю не блестящая колония, легко снимается петлей с агара; Фигура 10 — Средняя не круглая желтая непрозрачная с выраженным выпуклым центром неровной поверхностью и краем не блестящая колония, легко снимается петлей с агара;
Фигура 11 — Крупная не круглая желто-серая непрозрачная с выраженным выпуклым центром неровной поверхностью и краем не блестящая колония, легко снимается петлей с агара).
Биохимические свойства штамма 2-9XL. Бактерии при росте на плотных питательных средах расщепляют белки с выделением специфического не раздражающего запаха. При росте на богатых питательных средах способны синтезировать рекомбинантный ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) туберкулезный антиген. Оксидазоположительные и каталазоотрицательные. Биохимические свойства рекомбинантного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii до конца не изучены.
Иммунохимические свойства. Бактерии 2-9XL обладают очень высокой адгезивностью (способностью склеиваться) (См. фигуры 1, 2 чертежей), что не позволяет проверить их агглютинабельность в реакции агглютинации.
В реакциях иммунодиффузии (РИД) и иммуноэлектрофореза с экспериментальными сыворотками, • полученными на ультразвуковые дезинтеграты микобактерий вирулентного штамма туберкулеза M. tubеrсulоsis H37 Rv, антигены рекомбинантных бактерий 2-9XL не формируют линий преципитации. Вероятно, это связано с тем, что антитела на рекомбинантный ТБ-антиген возникают только в процессе развития инфекции в организме человека или животных и их титр не бывает большим. В случае выращивания микобактерий на питательных средах и последующей инактивации их ацетоном (или другими жесткими бактерицидными препаратами) этот антиген разрушается, и поэтому на него нельзя получить специфические антитела. В иммуноферментном анализе (ИФА) ТБ- антиген в ультразвуковых дезинтегратах бактерий и в очищенном виде взаимодействует с антителами сывороток крови больных туберкулезом людей и не взаимодействует с антителами в сыворотках крови здоровых людей. В иммунноблотинге ТБ-антиген не взаимодействует с антителами больных туберкулезом, так как не переносится на нитроцеллюлозную мембрану.
Отношение к Фагам данного вида. Для рекомбинантного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii до настоящего времени собственные фаги не обнаружены.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Генетические особенности. Штамм 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii в составе хромосомной ДНК содержит как минимум одну вставку фрагмента хромосомной ДНК M. tubеrсulоsis H37 Rv, но возможны и две вставки. Продуктивность . Рекомбинантный штамм 2-9XL является продуцентом туберкулезного антигена (ТБ-антигена) гликопротеиновой природы. Белки, синтезирующиеся с фрагмента хромосомной ДНК M. tubеrсulоsis H37 Rv, формируют на внешней мембране бактерии 2-9XL и в ее капсульном веществе видоспецифический гликопротеиновый комплекс (Фигуры 12 -14 / чертежей).
При получении ультразвуковых дезинтегратов бактерий (УЗД) этот комплекс разбивается и присутствует в виде нескольких белков. При концентрировании УЗД трихлоруксусной кислотой белки ТБ-антигена собираются в специфический рекомбинантный туберкулезный комплекс. При щадящем выделении рекомбинантного ТБ-антигена из бактерий 2-9XL его молекулярная масса в денатурирующем SDS-PAAG находится в интервале от 55,0 до 75,0 kDа (Фигуры 12 - 14 чертежей). На представленный гликопротеиновый комплекс у лабораторных животных формируется длительный напряженный B- и Т-клеточный иммунитет против M. tubеrсulоsis H37 Rv.
При изучении антителопродукции (формирования В-клеточного иммунитета) на рекомбинантный ТВ-антиген проводили иммунизацию морских свинок и кроликов с целью получения гипериммунных сывороток. Для иммунизации использовали кроликов весом 2,5-3 кг. 1 мл ТБ-антигена в концентрации 1 мг, смешанный с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда, вводили подкожно в отдел спины в области лопаток. Иммунизацию ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) повторяли три раза с недельным интервалом и двукратным увеличением дозы. По окончании первичного цикла иммунизации через 4 недели проводили внутримышечно повторное введение препаратов, начиная с 2 мг и, кратно увеличивая дозу, до 8 мг. Иммунизацию морских свинок проводили подкожно в отдел спины в область лопаток ТВ-антигеном в дозе 300 мкг/мл с неполным адъювантом Фрейнда. Через три недели введение препарата повторяли.
Антительный ответ у лабораторных животных оценивали через 21 день после последнего введения ТВ-антигена. Для этого проводили забор крови, получали сыворотку и проверяли наличие специфических ТВ-антител в реакции диффузной преципитации и иммуноферментным методом.
Показано, что выработка специфических антител происходит уже после первичного введения препарата. При дальнейших инъекциях титры антител в сыворотках возрастали. По завершению циклов иммунизации были получены гипериммунные сыворотки с высоким содержанием ТВ-антител. В иммуноферментном анализе с использованием ТВ-антигена, взятого для иммунизации, титры антител у морских свинок составили 1 : 6400, а у кроликов - 1 : 409600 и выше, в реакции диффузной преципитации титры были 1 :8 и 1:16-1 :32 соответственно.
Таким образом, присутствие рекомбинантного ТВ-антигена в организме животных вызывает перестройку их иммунной системы по В-типу. Длительное присутствие ТБ-антигена или повторное его введение делает перестройку иммунной системы стойкой, на что указывает возрастание титров специфических антител в сыворотках крови животных.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) У больных туберкулезом людей и бактерионосителей специфический В-клеточный иммунитет определяется с помощью ТБ-антигена в иммуноферментных тест-системах (ИФА), на нитроцеллюлозных фильтрах (Иммуноблотинг, Дот-блот) и в других реакциях с использованием клинических жидкостей (сыворотка крови, мокрота, плевральная жидкость, спиномозговая жидкость и другие), содержащих специфические антитела.
Изучение образцов сывороток крови больных туберкулезом и здоровых людей на наличие специфических антител представлено в Таблице 1.
Таблица 1. Определение наличия антител к возбудителю туберкулеза человека в образцах сывороток крови разных групп людей иммуноферментным методом (Метод определения представлен в Примере 4).
Figure imgf000015_0001
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Figure imgf000016_0001
Примечание: Образцы сывороток представлены Гос. НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (ГИСК) и ООО «БИOHOM». Обследовано 460 человек. OП>0,6 — указывает на наличие антител в сыворотках крови к возбудителю туберкулеза; 0,3>OП<0,6 — сомнительный результат («cepaя зoнa»); OП<0,3 — указывает на отсутствие антител к возбудителю туберкулеза; МБТ + — диагноз «тyбepкyлeз» подтвержден выделением микобактерий от больного; МБТ- - диагноз «тyбepкyлeз» подтвержден клинико- рентгенологическими методами. ВИЧ - вирус иммунодефицита человека; ВГВ - вирус гепатита В; ВГС - вирус гепатита С.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Выводы: 1. Из 227 образцов сывороток крови больных туберкулезом в 71,4% обнаружены антитела к возбудителю туберкулеза M. tubеrсulоsis H37 Rv.
2. В 45 образцах сывороток крови доноров (здоровых людей) не обнаружено антител к возбудителю туберкулеза M. tubеrсulоsis
H37 Rv.
3. В группах риска в образцах сывороток крови наличие антител к возбудителю туберкулеза M. tubеrсulоsis H37 Rv варьирует от 2,3% до 18,2%. Изучение специфической активности ТВ-антигена в формировании Т-клеточного иммунитета проводили путем постановки кожных туберкулиновых проб на морских свинках. Для этого группам морских свинок вводили туберкулезную вакцину BCG (внутрикожно по 0,5 мг в 0,2 мл разводящей жидкости) и взвеси микробных клеток вирулентных штаммов Мусоbасtеrium tubеrсulоsis H37RV, R1RV, а также атипичных штаммов M. kапsаssi, M. mаrirmm (внутрибрюшинно в дозе 106 микробных клеток на животное). Через 4 недели после инфицирования, опытных и контрольных морских свинок использовали для постановки внутрикожной пробы Манту по общепринятой методике /ИНСТРУКЦИЯ по применению аллергена туберкулезного очищенного сухого для накожного, подкожного и внутрикожного применения (сухого очищенного туберкулина). Главное управление лечебно-профилактической помощи Минздрава СССР. Москва. 11 августа 1986 г./ Концентрация препаратов, вводимых внутрикожно, составляла 10 мкг по общему белку в 100 мкл разводящей жидкости. Специфическую аллергическую реакцию замедленного типа в виде местной реакции возникающего клеточного инфильтрата (папулы) учитывали в миллиметрах через 24 часа. Препаратом сравнения ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) служил сухой очищенный туберкулин (Тubеrсuliшm dерurаtum siссum) производства РАО "БИОПРЕПАРАТ", Санкт-
Петербургского НИИ Вакцин и Сывороток- PPD-L-2 (доза для внутрикожного ввeдeния-25 ТЕ). Результаты экспериментов показали, что ТВ-антиген, полученный из рекомбинантного штамма 2-9XL, вызывает местную кожную реакцию у сенсибилизированных свинок (реакция гиперчувствительности замедленного типа), причем некоторые из них по размерам папулы (12- 15мм) были сопоставимы с референс- препаратом. Отмечена достоверная разница в размерах кожной реакции у животных, . инфицированных вирулентным туберкулезным штаммом, атипичными штаммами и BCG, что указывает на видовую специфичность ТВ-антигена. Но, в отличие от туберкулина, местная аллергическая реакция в ответ на внутрикожное введение ТБ-антигена возникала и у части контрольных животных, что, вероятно, связано с недостаточной очисткой ТВ-антигена, как сложного гликопротеинового комплекса. Однако, очевидно, что на исследуемый ТБ-антиген формируется стойкий видоспецифический Т-клеточный иммунитет. Следовательно, ТВ-антиген весьма перспективен как диагностический препарат для определения наличия специфического Т-клеточного иммунитета у больных и инфицированных туберкулезом людей и как биологическая вакцина.
Патогенность для лабораторных животных. Рекомбинантный штамм 2-9XL не обладает остаточной вирулентностью для всех видов лабораторных животных.
Согласно «3aключeнию по проверке на остаточную вирулентность лиофильно высушенной культуры штамма 2-9XL
Асiпеtоbасtеr johnsonii», проведенному в НИЦ Токсикологии и ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) гигиенической регламентации биопрепаратов, значение LD5O для линейных мышей Ваlb/с и золотистых хомяков превышает IxIO7 микробных клеток и 5x107 микробных клеток соответственно. Штамм 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii авирулентен для морских свинок и кроликов (значение LD5(^IxIO9 микробных клеток на животное).
Таким образом, на основании показателя остаточной вирулентности (патогенности) штамм 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii может быть отнесен к 4-й группе микроорганизмов по Международной классификации.
Копии «3aключeния по проверке на остаточную вирулентность лиофильно высушенной культуры 2-9XL Acinetobacter» НИЦ ТБП прилагаются.
Условия и состав сред для хранения и поддержания штамма. Музейная культура штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr хранится при температуре +40C на косяках FТ-среды с добавками глюкозы и цистеина до 2 месяцев, а в лиофильно высушенном состоянии в сахарозо-желатиновой среде до 5 лет.
Среда для культивирования. Рекомбинантный штамм 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii культивируется на плотной FТ-среде с добавками глюкозы и цистеина при +320C.
Технологические особенности при культивировании.
Рекомбинантный штамм 2-9XL плохо растет в жидких питательных средах и быстро теряет способность продуцировать ТБ-антиген. Поэтому наращивание биомассы для последующего выделения ТБ- антигена проводят только на плотных питательных средах.
Матричную культуру выращивают на косячках при +320C в течение 2-3 -х суток, затем смывают бактерии физиологическим раствором и с одного косячка засевают один - два матраса. Матрасы ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) инкубируют в термостате в при +320C в течение 3-4-xcyтoк, затем выросшую биологическую массу смывают дистиллированной водой и центрифугированием освобождаются от растворимых компонентов питательной среды. Из очищенной от компонентов питательной среды биологической массы начинают выделение рекомбинантного ТБ-антигена.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами: Пример 1. Получение видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса (ТБ-антигена) из рекомбинантного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr j оhпsопii .
На плотную питательную среду (косячки) рН 6,6, состоящую из сердечно-мозгового агара, гидролизованного гемоглобина, цистеина и глюкозы в соответствующих пропорциях или FТ-агара рН 6,6 (Производство ФГУП ГНЦ ПМ, Оболенск, Россия) с добавлением цистеина и глюкозы петлей делают посев культуры 2-9XL. Посев инкубируют в термостате при +320C в течение двух суток. Двухсуточную культуру смывают физиологическим раствором и готовят суспензию бактерий в концентрации 5x109 микробных клеток (м.к.) в одном миллилитре. [Получение суспензии бактерий 2- 9XL весьма сложно, так как культура смывается хлопьями, которые при перемешивании очень плохо разбиваются]. Для получения большого количества биологической массы полученную суспензию высевают на матрасы из расчета один косячок на 1-2 матраса (В один матрас наливают 400,0 мл питательной среды). Посев инкубируют в термостате при +32 С в течение трех суток. С одного матраса трехсуточную культуру 2-9XL смывают 30 мл физиологического раствора. Из взвеси смытой культуры готовят мазок для световой микроскопии и окрашивают его по Граму. [Популяция бактерий рекомбинантного штамма 2-9XL при небольших изменениях состава ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) питательной среды, температурного режима или иных условий может быстро диссоциировать в формы, которые не продуцируют ТБ-антигена. При окраске по Граму эти бактерии грамотрицательные, бактерии-продуценты ТБ-антигена - устойчивы к обесцвечиванию и выглядят как грамположительные (фигуры 1, 2 чертежей). В выросшей биомассе 2-9XL количество грамотрицательных бактерий не должно превышать 5-10%].
Суспензию смытых с матраса бактерий центрифугируют ("Весkmап" G2-21, USA) при 9000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость, содержащую растворимые компоненты питательной среды, отбрасывают, а осадок суспендируют в 40 мл охлажденной деионизованной воды, и все последующие процедуры делают при +40C. Далее проводят обработку культуры 2-9XL 0,5N раствором NaOH, доводя рН от 6,0 до 9,0. Происходящее при этом растворение капсулы бактерий, содержащих видоспецифический рекомбинантный ТБ-антиген, ведут дробно, добавляя NaOH небольшими порциями и тщательно перемешивая суспензию в течение нескольких часов. Обработанную таким образом суспензию бактерий оставляют в холодильнике (+40C) на ночь (15-16 часов). На следующий день суспензию бактерий 2-9XL центрифугируют при 12000 об/мин в течение 40 минут. Водную фракцию, содержащую растворенную капсулу рекомбинантного штамма 2-9XL, отделяют от осадка. В связи с неполным растворением капсулы повторяют процедуру обработки осадка щелочью в той же последовательности.
Полученную первую порцию препарата капсулы 2-9XL на холоду нейтрализуют 0,5N раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) до рН 6,0 и, так как он содержит достаточно большое количество бактерий, центрифугируют при 15000 об/мин в течение ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 40 минут. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость закисляют
0,5N ТХУ до рН 3,0-3,5. При этом ТБ-антиген собирается в комплекс и начинает выпадать в осадок. Препарат оставляют в холодильнике (+40C) на ночь (15-16 часов). Выпавший за ночь ТХУ- осадок в этом растворе может храниться при +40C до двух недель без утраты специфической активности находящегося в нем ТБ-антиген. На ночь в холодильнике оставляют вторую порцию препарата для формирования осадка ТБ-антигена.
На третий день первую порцию препарата с выпавшим осадком центрифугируют при 9000 об/мин в течение 30 минут. Надосадок отбрасывают. Из расчета на один матрас осадок растворяют в 1-2 мл РВS-буфере (0,0067M KH2PO4, 0,0067M Na2HPO4, 0Д38M NaCl, 0,0027M KCl рН 7,0). В растворе РВS-буфера содержится преимущественно видоспецифический ТБ-антиген (фигура 12 чертежей. Электрофорез ТБ-антигена рекомбинантного штамма 2- 9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii. 16% SDS-PAAG электрофорез белков рекомбинантного штамма 2-9XL. 60-17Ov. 60 минут. Трис- глициновый буфер рН 8,3.
M - маркеры: 67,0 kDа; 45,0 kDа; 25,0 Ша; 17,0 kDа; 12,3 kDа. 1 — Белки ультразвукового дезинтеграта 2-9XL. Стрелкой указан двойной белок ТБ-антигена, который не проявляет специфической активности; 2 — Белки ультразвукового дезинтеграта, переосажденного трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Стрелкой указан ТБ-антиген в сборке. Этот белковый комплекс проявляет специфическую активность.), который уже проявляет специфическую активность, но требует дополнительной очистки).
С оставленной на ночь второй порцией препарата повторяют все необходимые процедуры (нейтрализуют 0,5N ТХУ до рН 6,0, освобождаются от оставшихся клеток, закисляют 0,5N ТХУ до рН ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 3,0-3,5 и раствор с выпадающим осадком оставляют на ночь).
Выпавший за ночь ТХУ-осадок, может храниться при +40C до двух недель без утраты специфической активности находящегося в нем ТБ-антигена. На следующий день вторую порцию препарата растворяют в 1-2 мл РВS-буфера. Он содержит преимущественно видоспецифический ТБ-антиген.
Наличие ТБ-антигена, полученного вышеописанным способом, регистрируют в SDS-PAAG электрофорезном геле (Фигура 12 чертежей).
ТБ-антигены первой и второй порций объединяют и подвергают дальнейшей очистке.
В результате проведенных экспериментов установлено, что: а) рекомбинантный видоспецифический ТБ-антиген локализуется во внешних структурах бактерий 2-9XL (внешняя мембрана и капсульное вещество) и может быть выделен и сконцентрирован путем вышеописанных процедур, б) при проведении вышеописанных процедур бактерии рекомбинантного штамма 2-9XL практически не разрушаются и доля получаемого ТБ-антигена достаточно высока в сравнении с другими, присутствующими в растворе белками, липидами и полисахаридами бактерий. Таким образом, можно считать, что приведенный Пример является наиболее экономичным получением ТБ-антигена из рекомбинантного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii, но он не исключает возможности получения его любым другим способом (Разрушение бактерий с помощью ультразвука или путем замораживания-оттаивания, или иным способом, с последующей концентрацией ТБ-антигена).
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Пример 2. Получение видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса (ТБ-антигена) из рекомбинантного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii.
На плотную питательную среду (косячки) с рН 6,6, состоящую из сердечно-мозгового агара, гидролизованного гемоглобина, цистеина и глюкозы в соответствующих пропорциях или FТ-агара рН 6,6 (Производство ФГУП ГНЦ ПМ, Оболенск, Россия) петлей делают посев культуры 2-9XL. Посев инкубируют в термостате при +320C в течение трех суток. Трехсуточную культуру смывают физиологическим раствором и готовят суспензию бактерий в концентрации 5x109 микробных клеток (м.к.) в одном миллилитре.
Полученную суспензию высевают на матрасы из расчета один косячок на 1-2 матраса (В один матрас наливают 400,0 мл питательной среды). Посев инкубируют в термостате при +320C в течение трех суток. С одного матраса трехсуточную культуру 2- 9XL смывают 30 мл физиологического раствора. Из взвеси смытой культуры готовят мазок для световой микроскопии и окрашивают его по Граму (Контроль наличия ТБ-антигена в рекомбинантных бактериях 2-9XL). Суспензию смытых с матраса бактерий центрифугируют
("Весkmап" G2-21, USA) при 9000 об/мин в течение 30 минут. Надосадочную жидкость, содержащую растворимые компоненты питательной среды, отбрасывают, а осадок суспендируют в 40 мл охлажденной деионизованной воды и все последующие процедуры делают при +40C. Далее проводят обработку культуры 2-9XL 0,5N раствором NaOH, доводя рН от 6,0 до 9,0. Происходящую при этом процедуру растворения капсулы бактерий, содержащих видоспецифический рекомбинантный ТБ-антиген, ведут дробно, добавляя NaOH небольшими порциями и тщательно перемешивая ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) суспензию в течение нескольких часов. Обработанную таким образом суспензию бактерий оставляют в холодильнике (+40C) на ночь (15-16 часов).
На второй день суспензию бактерий 2-9XL центрифугируют при 12000 об/мин в течение 40 минут. Надосадочную жидкость (частично растворенную капсулу рекомбинантного штамма 2-9XL3 содержащую ТВ-антиген), отделяют от осадка (бактерии 2-9XL, сохранившие и не сохранившие капсулу). К осадку добавляют 40 мл деионизованной воды и повторяют процедуру растворения капсулы, получая вторую порцию препарата.
Полученный препарат капсулы 2-9XL нейтрализуют 0,5N раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) до рН 6,0, а затем добавляют сульфат аммония [(NЩhSОJ до 30% насыщения. Раствор оставляют на ночь при +40C для выпадения осадка. На следующий день препарат центрифугируют при 12000 об/мин в течение 40 минут. Осадок отбрасывают (он, преимущественно, содержит целые бактерии и их крупные фрагменты). К надосадочной жидкости, содержащей преимущественно ТБ-антиген, добавляют сульфат аммония до 100% насыщения. Препарат оставляют на ночь при +4°C для выпадения осадка.
Вторую порцию препарата капсулы 2-9XL нейтрализуют 0,5N раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) до рН 6,0, а затем добавляют сульфат аммония [(NЩЬSОJ до 30% насыщения, оставляют на ночь при +40C для выпадения осадка. На следующий день препарат ТБ-антигена, выпавшего в осадок при 100% осаждении сульфатом аммония, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 40 минут. Надосадок отбрасывают, осадок растворяют в 2,0 мл РВS-буфера рН 7,0 (из расчета на один матрас) и диализуют против большого объема РВS-буфера. ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) В течение суток объемы РВS-буфера меняют не менее трех раз для полного удаления из диализного мешка сульфата аммония.
Вторую порцию препарата, содержащего 30% сульфата аммония, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 40 минут и осадок отбрасывают, надосадок насыщают до 100% сульфатом аммония и оставляют на ночь при +40C.
На следующий день препарат второй порции ТБ-антигена, выпавшего в осадок при 100% осаждении сульфатом аммония, центрифугируют при 12000 об/мин в течение 40 минут. Надосадок отбрасывают, осадок растворяют в 2,0 мл РВS-буфера рН 7,0 (из расчета на один матрас) и диализуют против большого объема РВS- буфера.
В течение суток объемы РВS-буфера меняют не менее трех раз для полного удаления из диализного мешка сульфата аммония. Присутствие сконцентрированного ТБ-антигена в РВS-буфере после диализа первой и второй порций препарата контролируют в SDS-PAAG электрофорезе (Фигура 13 чертежей. Электрофорез ТБ- антигена рекомбинантного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii. 16% SDS-PAAG электрофорез белкового комплекса 2-9XL, выделенного сульфатным переосаждением. 60-17Ov. 60 минут. Трис-глициновый буфер рН 8,3. M - маркеры: 67,0 kDа; 45,0 kDа; 25,0 kDа; 17,0 kDа; 12,3 kDа. 1-2 - Белки очищенного ТБ-антигена на Sерhаdех G200. Стрелками указан белковый ТБ-антигена в сборке. Этот белковый комплекс проявляет специфическую активность).
ТБ-антигены первой и второй порций объединяют и подвергают дальнейшей очистке.
Таким образом, получение и концентрирование видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) (ТБ-антигена) из рекомбинантного штамма 2-9XL возможно не только с помощью осаждения его из щелочных лизатов трихлоруксусной кислотой до рН 3,5-4,0, как показано в Примере 1. Возможно использование методов осаждения ТБ-антигена с помощью различных солей, например, сульфата аммония или иных методов, элюаты содержат очищенный ТБ-антиген с молекулярной массой от 55,0дo 75,0 кДа и наличием углеводов от 20% до 50%.
Пример 3. Очистка видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса (ТБ-антигена), полученного из рекомбинантного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr j оhпsопii.
Дальнейшую очистку специфического туберкулезного антигена 2-9X проводят путем фракционирования макромолекул гель-фильтрацией при низком давлении с использованием в качестве матрицы Сефадекса G-200. Объединенные сконцентрированные ТБ-антигены в PBS- буфере, полученные путем осаждения лизатов 0,5 N ТХУ или 100% осаждением сульфатом аммония (Пример 2.), наносят на колонку размером 25x600. В качестве элюента используют 50 mМ раствор Трис-НСl, рН 7,5, с добавлением 100 mМNаСl, скорость элюции- 25 мл/час. Пики собирают, измеряют белок по методу, описанному Брэдфордом /4/. Общее содержание углеводов определяют фенольным методом 151. В зависимости от способа осаждения ТБ- антигена из растворенной капсулы микробной клетки (Пример 1 и 2), объема наносимого образца и концентрации белка элюаты содержат очищенный ТБ-антиген с молекулярной массой от 55,0дo 75,0 кДа и наличием углеводов от 20% до 50%.
Специфические туберкулезные рекомбинантные антигены хранят при +40C в лиофильно высушенном состоянии.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Наличие очищенного ТБ-антигена и его структуру, полученного вышеописанным способом, регистрируют в SDS- PAAG электрофорезном геле (Фигура 14 чертежей. Электрофорез ТБ-антигена рекомбинантного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii. 17% SDS-PAAG электрофорез рекомбинантного белкового ТБ-комплекса 2-9XL по Лэмли. 60-17Ov. 60 минут. Трис- глициновый буфер рН 8,3.
M - маркеры: 67,0 kDа; 45,0 kDа; 25,0 kDа; 17,0 kDа; 12,3 kDа. 1-2 - Белки очищенного ТБ-антигена на Sерhаdех G200. Вертикальными стрелками указан ТБ-антиген в сборке. Этот белковый комплекс проявляет специфическую активность. Боковыми стрелками указаны компоненты белкового комплекса).
Получение очищенного ТБ-антигена возможно не только путем фракционирования макромолекул гель-фильтрацией с использованием в качестве матрицы различных носителей, но и с помощью ионообменной хроматографии.
Пример 4. Использование очищенного видоспецифического ТБ- антигена в диагностике туберкулеза человека.
При латентных, хронических и острых формах заболевания человека туберкулезом в его крови формируются антитела, являющиеся специфическими для данного возбудителя - M. tubеrсulоsis H37 Rv, что позволяет проводить диагностику заболевания по указанному признаку.
Для поиска специфических антител используют тест-систему, которая представляет собой непрямой иммуноферментный анализ с разделением фаз, где в качестве твердого носителя используют 96- луночные планшеты. Подложкой для ELISA служит туберкулезный антиген, полученный из рекомбинантного штамма 2-9X путем хроматографического фракционирования.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) В лунки планшет вносят по 100 мкл антигена в концентрации
10 мкг/мл в фосфатном буфере и инкубируют 18 ч при комнатной температуре. Ячейки троекратно отмывают забуференным физиологическим раствором, рН 7,2, (ЗФР) с 0,05% Тwееп 20 и «зaбивaют» в течение часа 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в ЗФР. После троекратной отмывки в лунки 1-го вертикального ряда планшета вносят по 100 мкл нативной сыворотки крови, не содержащей специфических антител в разведении 1 :200 (отрицательный контроль), а с 3-го по 12-й вертикальные ряды - ЗФР в том же объеме.
Затем в каждую лунку 2-го вертикального ряда добавляют по 200 мкл исследуемых сывороток в разведении 1 :100 и восьмиканальной автоматической пипеткой титруют двукратным шагом, из последнего ряда удаляют 100 мкл. Для разведения сывороток использовали ЗФР рН 7,2. Планшеты инкубируют 1 час при 37° С. В качестве положительного контроля используют сыворотку крови с заведомо известным высоким титром специфических антител (калибровка). Одну из лунок планшета (последнюю) отводят для контроля субстрата, прибавляя к 10 мкл конъюгата 100 мкл субстрата. После удаления несвязавшихся антител пятикратной отмывкой планшета ЗФP-0,05%Tween 20 в объеме 170 мкл к иммуноглобулинам добавляют для вторичного связывания по 100 мкл антивидовых IgG антител к иммуноглобулинам A, M, G, конъюгированных пероксидазой хрена (Sigmа), в рабочем разведении 1 :5000.
Реакционную смесь инкубируют 1 час при 370C, после чего ячейки пятикратно отмывают ЗФР-Тwееп 20. Раствор субстрата готовят добавлением 3 мкл 30% H2O2 к 10 мл свежеприготовленного
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) 0,04% хромогена AzBTS (АрliНеm) в O5IM цитратно-фосфатном буфере, рН 5,0 и по 100 мкл раствора добавляют в каждую лунку.
Для проявления цветной реакции планшету инкубируют при +370C в течение часа, вносят по 100 мкл 1% SDS для остановки ферментативной реакции и измеряют величину светоадсорбции при 405 нм на вертикальном фотометре фирмы Вiо-Rаd, модель 680. Результаты сравнивают с бланком лунок вертикального ряда, в которых находилась сыворотка, не содержащая специфических антител. Очищенный рекомбинантный ТБ-антиген взаимодействует только с антителами сывороток крови больных туберкулезом людей и не взаимодействует с антителами сывороток крови здоровых людей.
Таким образом, рекомбинантный ТБ-антиген 2-9XL можно использовать в диагностических целях на твердофазном носителе, нитроцеллюлозной мембране и в других тест-системах, с помощью которых идентифицируются специфические антитела, которые вырабатываются организмом человека на присутствие или размножение в нем возбудителя туберкулеза - M. tubеrсulоsis H37 Rv. Специфические антитела, вырабатываемые человеком в ответ на проникновение и развитие в нем возбудителя туберкулеза, могут быть не только в сыворотке крови, но и в других клинических жидкостях (мокроте, экссудате, моче и так далее).
Полученные на очищенный рекомбинантный ТБ-антиген моноклональные антитела или гипериммунные сыворотки различных животных (кроликов, мышей, морских свинок и другие) можно использовать в диагностических методах при поиске в клинических жидкостях человека (мокрота, экссудат, материал при
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) микробиопсии и так далее) как микобактерий туберкулеза, так и их специфических компонентов.
Приведенные выше примеры выделения и использования рекомбинантного видоспецифического туберкулезного антигена, полученного из безопасного для человека и животных генно- инженерного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii указывают на то, что данный микроорганизм найдет широкое применение в здравоохранении и медицине как источник полезного продукта, используемого в диагностике, профилактике и лечении туберкулеза человека.
Учитывая свойства рекомбинантного штамма Асiпеtоbасtеr jоhпsопii 9XL, данный микроорганизм депонирован 29.11.05 года во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика за индексом VKPM B-9312.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) Список литературы:
1. S. Аrrudа, G. Воmfim. R. Rпights, T. Нuimа-Вуrоп, L. W. Rilеу "Сlопiпg оf M. tubеrсulоsis DNA Frаgmепt Аssосiаtеd with Епtrу апd Survivаl Inside CeIIs". "Sсiепсе", 1993, N261 (5127), р. 1454- 1457.
2. С. Мапса, К. Lуаsсhепkо, Н.G. Wikеr, D. Usаi, R. Соlапgеli, М.L. Gешiаrо. "Моlесulаr Сlопiпg, Рurifiсаtiоп апd Sеrоlоgiсаl Сhаrасtеrizаtiоп оf MPT63, а Nоvеl Апtigеп Sесrеtеd bу Мусоbасtеrium tubеrсulоsis. 3. G. Наrt, Ваi-уu Lее, M. А. Ноrwitz. "Нigh-Lеvеl Неtеrоlоgоus Ехрrеssiоп апd Sесrеtiоп iп Rарidlу Grоwiпg Nопраthоgепiс Мусоbасtеriа оf Fоur Маjоr Мусоbасtеrium tubеrсulоsis Ехtrасеllulаr Рrоtеiпs Сопsidеrеd То Be Lеаdiпg Vассiпе Сапdidаtеs апd Drug Таrgеts. "Iпfесtiоп апd Immuпitу", Juпе 1997, р. 2321-2328.
4. Вrеdfоrd. Апаl. Вiосhеm. 72, 248 (1976), а также Апаl. Вiосhеm. 86,142 (1978 )
5. Ф. Герхардт "Методы общей бактериологии" 1984, т.2.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Рекомбинантный штамм 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii VKPM-9312 -продуцент видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса М.tubеrсulоsis H 37 Rv (ТБ-антигена), депонирован в ВКПМ ФГУП ГосНИИГенетика.
2. Способ получения видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса Мусоbасtеriшп tubеrсulоsis H 37 Rv (ТБ- антигена), характеризующийся тем, что культуру рекомбинантного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii выращивают на питательной среде при 320C в течение 2-3-x суток, смывают физиологическим раствором, полученную суспензию бактерий центрифугируют, осадок суспендируют в воде при + 40C, обрабатывают раствором NaOH до рН 6,0-9,0, через 15-16 часов полученную суспензию центрифугируют, осадок подвергают повторной процедуре обработки раствором NaOH, а надосадочную жидкость, содержащую растворенную капсулу бактерий штамма 2-9 XL, нейтрализуют 0,5 N раствором ТХУ до рН 6,0, центрифугируют, к надосадочной жидкости добавляют 0,5 N раствор ТХУ до рН 3,0- 3,5, раствор выдерживают 15-16 часов до получения комплекса ТБ- антигена, при этом с порцией осадка, повторно обработанного раствором NaOH, проводят нейтрализацию раствором ТХУ с вышеуказанной последовательностью, 1-й и 2-й растворы с комплексом ТБ-антигена, выпавшим после обработки ТХУ, центрифугируют, полученные осадки, содержащие ТБ-антиген, растворяют в РВS-буфере, растворы объединяют и подвергают очистке путем фракционирования гель-фильтрацией на Сефадексе G-200 или с помощью ионообменной хроматографии, элюаты содержат очищенный ТБ-антиген с молекулярной массой от 55,0 до
75,0 кДа и наличием углеводов от 20% до 50%.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
3. Способ получения видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса Мусоbасtеriшп tubеrсulоsis H 37 Rv (ТБ- антигена), характеризующийся тем, что культуру рекомбинантного штамма 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii выращивают на питательной среде при 320C в течение 3-х суток, смывают физиологическим раствором, полученную суспензию бактерий центрифугируют, осадок суспендируют в воде при + 40C, обрабатывают раствором NaOH до рН 6,0-9,0, через 15-16 часов полученную суспензию центрифугируют, осадок подвергают повторной процедуре обработки раствором NaOH, а надосадочную жидкость, содержащую растворенную капсулу бактерий штамма 2-9 XL, нейтрализуют 0,5 N раствором ТХУ до рН 6,0, добавляют сульфат аммония до 30% насыщения, выдерживают при + 40C, центрифугируют, к надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до 100% насыщения, выдерживают при + 40C, при этом с порцией осадка повторно обработанного раствором NaOH, проводят нейтрализацию с помощью ТХУ и осаждения сульфатом аммония в вышеуказанной последовательности, два осадка, полученные после 100 насыщения сульфатом аммония, растворяют в PBS буфере рН 7,0, диализируют против большого объема PBS буфера, сконцентрированные растворы, содержащие ТБ-антиген, объединяют и подвергают очистке путем фракционирования гель- фильтрацией на Сефадексе G-200 или с помощью ионообменной хроматографии, элюаты содержат очищенный ТБ-антиген с молекулярной массой от 55,0 до 75,0 кДа и наличием углеводов от 20% до 50%.
4. Средство для формирования В- и Т-клеточного иммунитета против Мuсоbасtеrium tubеrсulоsis H 37 Rv, содержащее видоспецифический гликопротеиновый туберкулезный комплекс
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26) (ТБ-антиген) Мусоbасtеrium tubеrсulоsis H37 Rv, продуцируемый штаммом 2-9XL Асiпеtоbасtеr jоhпsопii, охарактеризованном в п.l.
5. Средство для диагностики туберкулеза, содержащее видоспецифический гликопротеиновый туберкулезный комплекс (ТБ-антигена) Мусоbасtеrium tubеrсulоsis H 37 Rv, полученный способом по п. 2.
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
PCT/RU2008/000270 2007-05-10 2008-04-29 Средство, обладающее свойством формировать клеточный иммунитет против мусоbасtеrium tubеrсulоsis h37 rv, способ получения его (варианты), рекомбинантный штамм и средство для диагностики туберкулеза WO2008140353A1 (ru)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200880024159A CN101861166A (zh) 2007-05-10 2008-04-29 展示形成对抗结核分枝杆菌H37 Rv的细胞免疫性质的制剂、其（变体）制备方法、重组菌株及用于结核病诊断的制剂
EP08767027A EP2156844A4 (en) 2007-05-10 2008-04-29 PRODUCT CAPABLE OF FORMING CELLULAR IMMUNITY AGAINST MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS H37 RV, MANUFACTURING METHOD THEREOF (AND VARIANTS), RECOMBINANT STRAIN AND PRODUCT FOR DIAGNOSING TUBERCULOSIS
EA200901503A EA014065B1 (ru) 2007-05-10 2008-04-29 Средство, обладающее свойством формировать клеточный иммунитет против mycobacterium tuberculosis h37 rv, способ получения его (варианты), рекомбинантный штамм и средство для диагностики туберкулеза

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2007117342 2007-05-10
RU2007117342/13A RU2341288C1 (ru) 2007-05-10 2007-05-10 СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ СВОЙСТВОМ ФОРМИРОВАТЬ КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ ПРОТИВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS H37 Rv, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЕГО (ВАРИАНТЫ), РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ И СРЕДСТВО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Publications (2)

Publication Number Publication Date
WO2008140353A1 true WO2008140353A1 (ru) 2008-11-20
WO2008140353A8 WO2008140353A8 (ru) 2009-07-16

Family

ID=40002430

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2008/000270 WO2008140353A1 (ru) 2007-05-10 2008-04-29 Средство, обладающее свойством формировать клеточный иммунитет против мусоbасtеrium tubеrсulоsis h37 rv, способ получения его (варианты), рекомбинантный штамм и средство для диагностики туберкулеза

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP2156844A4 (ru)
CN (1) CN101861166A (ru)
EA (1) EA014065B1 (ru)
RU (1) RU2341288C1 (ru)
UA (1) UA96488C2 (ru)
WO (1) WO2008140353A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101603017B (zh) * 2009-06-05 2012-07-04 天津科技大学 一种约氏不动杆菌lp28以及利用该菌制备低温碱性脂肪酶的方法
CN103675293B (zh) * 2013-11-25 2015-10-28 广东体必康生物科技有限公司 Rv3872、Rv0164和/或Rv1926c蛋白在制备诊断活动性肺结核的产品中的用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB860305A (en) * 1958-06-12 1961-02-01 Yamamura Yuichi Tuberculin active peptide
RU2237090C1 (ru) * 2003-04-24 2004-09-27 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Способ генетического типирования штаммов микобактерий туберкулезного комплекса
RU2262351C1 (ru) * 2003-12-26 2005-10-20 ООО "Фирма "БиоМедИнвест" Вакцинная композиция для профилактики и лечения туберкулезной инфекции и генетические конструкции для получения действующих компонентов этой композиции
US7112663B1 (en) * 1998-04-16 2006-09-26 Institut Pasteur Method for isolating a polynucleotide of interest from the genome of a mycobacterium using a BAC-based DNA library, application to the detection of mycobacteria
CN1869239A (zh) * 2006-06-01 2006-11-29 南京农业大学 一种融合蛋白的酵母表达载体及其基因工程产品

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB860305A (en) * 1958-06-12 1961-02-01 Yamamura Yuichi Tuberculin active peptide
US7112663B1 (en) * 1998-04-16 2006-09-26 Institut Pasteur Method for isolating a polynucleotide of interest from the genome of a mycobacterium using a BAC-based DNA library, application to the detection of mycobacteria
RU2237090C1 (ru) * 2003-04-24 2004-09-27 Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН Способ генетического типирования штаммов микобактерий туберкулезного комплекса
RU2262351C1 (ru) * 2003-12-26 2005-10-20 ООО "Фирма "БиоМедИнвест" Вакцинная композиция для профилактики и лечения туберкулезной инфекции и генетические конструкции для получения действующих компонентов этой композиции
CN1869239A (zh) * 2006-06-01 2006-11-29 南京农业大学 一种融合蛋白的酵母表达载体及其基因工程产品

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP2156844A4 *

Also Published As

Publication number Publication date
RU2341288C1 (ru) 2008-12-20
UA96488C2 (ru) 2011-11-10
CN101861166A (zh) 2010-10-13
EA200901503A1 (ru) 2010-04-30
WO2008140353A8 (ru) 2009-07-16
EP2156844A4 (en) 2010-12-29
EA014065B1 (ru) 2010-08-30
EP2156844A1 (en) 2010-02-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102836425B (zh) 包含潜伏感染阶段期间所表达的抗原的结核疫苗
KR100331358B1 (ko) 그룹B스트렙토코커스의많은균주들에대한면역성을제공하는세포표면단백질인Rib단백질,그단백질의정제방법,시약키트및제약조성물
Thomas et al. Studies on primary atypical pneumonia. II. Observations concerning the relationship of a non-hemolytic streptococcus to the disease
CN102238960B (zh) 制造疫苗的方法
CN109182167B (zh) 一种高效价结核菌素皮试诊断试剂(ppd)生产工艺
AU2005288678A1 (en) Immunogenic glycopeptides for diagnosing pathogenic microorganisms infections
KR100951057B1 (ko) 면역특이단백질 항원을 사용하는 우결핵 특이 효소면역진단키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법
US3636192A (en) Meningococcal polysaccharide vaccines
Shinoda et al. Inhibitory effect of capsular antigen of Vibrio vulnificus on bactericidal activity of human serum
RU2341288C1 (ru) СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ СВОЙСТВОМ ФОРМИРОВАТЬ КЛЕТОЧНЫЙ ИММУНИТЕТ ПРОТИВ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS H37 Rv, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЕГО (ВАРИАНТЫ), РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ И СРЕДСТВО ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА
TW403655B (en) Novel attenuated pseudomonas aeruginosa strains
CN101248084B (zh) 包含潜伏感染阶段期间所表达的抗原的结核疫苗
KR100968069B1 (ko) 우결핵균 특이단백질 및 그 정제방법
Saunders et al. Immunoblot analysis of antigens associated with Haemophilus ducreyi using serum from immunised rabbits.
HUT77574A (hu) Eljárás fokozott antigénaktivitású Helicobacter sp. és azt tartalmazó vakcina előállítására
US8663940B2 (en) Ex-vivo passive protection bacteremia assay
RU2627897C1 (ru) Способ получения антигена для определения противобруцеллезного иммунитета
HUT77876A (hu) Eljárás fokozott antigénaktivitású bélbaktériumok és azokat tartalmazó vakcinák előállítására
AU2003213233A1 (en) Method of making cs6 antigen vaccine for treating, preventing, or inhibiting enterotoxigenic escherichia coli infections
Vasconcellos et al. Vaccine Against Entheropathogenic E. coli: A Systematic Review
Cooper et al. Immunogenicity of ribosomal preparations from Neisseria gonorrhoeae
Nyirenda Natural immunity to Salmonella in humans
Widen et al. Agar microdroplet assay for delayed hypersensitivity to Legionella pneumophila serogroup 1
Baron et al. Genetic transformation of pilation and virulence into Neisseria gonorrhoeae T4
Saunders et al. Humoral response of the mouse to Treponema pallidum.

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200880024159.X

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 08767027

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 6574/CHENP/2009

Country of ref document: IN

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 200901503

Country of ref document: EA

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2008767027

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: a200912563

Country of ref document: UA