KR100951057B1 - 면역특이단백질 항원을 사용하는 우결핵 특이 효소면역진단키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법 - Google Patents

면역특이단백질 항원을 사용하는 우결핵 특이 효소면역진단키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 우결핵 특이 효소면역진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 우결핵균의 단백질항원 중 면역특이단백질 항원인 MPB70 등을 이용한 효소면역측정법을 통하여 신속하고 정확하게 우결핵을 진단하는 우결핵 특이 효소면역진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법에 관한 것이다.
우결핵, 정제단백질, 효소면역측정법, 피내검사

Description

면역특이단백질 항원을 사용하는 우결핵 특이 효소면역진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법{Bovine tuberculosis specific enzyme immuno assay kit comprising　immune specific protein antigen and other immunogens　and the method for diagnosing the bovine tuberculosis by using the same}
본 발명은 우결핵 특이 효소면역진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 우결핵균의 단백질항원 중 면역특이단백질 항원인 MPB70 등을 이용한 효소면역측정법을 통하여 신속하고 정확하게 우결핵을 진단하는 우결핵 특이 효소면역진단 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법에 관한 것이다.
1. 우결핵 혈청진단법의 특성
결핵은 사람과 동물에 공중보건적 및 경제적으로 심각한 피해를 일으키고 있다. 마이코박테리움 튜버클로시스 , 마이코박테리움 보비스 , 마이코박테리움 마이크 로티 및 마이코박테리움 카네티를 포함하는 마이코박테리움 튜버클로시스군은 결핵 을 일으키는 주요한 마이코박테리움 속균이며, 소에서는 특히, 마이코박테리움 보비스가 직접적인 결핵원인균이다. 사람 결핵에서와 같이 우결핵은 지연형 과민반응에 의한 진단, 즉, 결핵유래 단백질체의 피내접종 후 종창 및 경결을 관찰하여 진단하는 것이 일반적으로 사용되고 있다. 그러나, 이 진단법은 피내접종과 3일후 관찰이라는 큰 불편함이 있어 특이항체가 측정에 의한 진단법 개발에 대한 연구가 계속되어 왔다. 우결핵의 야외 공인진단법으로 쓰이고 있는 피내진단법은 우결핵항원에 대한 면역반응 중 탐식세포 및 T 세포 등이 관여하는 세포성 면역반응 정도를 측정하는 것이다. 이러한 세포성 면역반응은 우결핵 병변이 진행됨에 따라 증가하다가, 우결핵 말기에서는 감소하는 일반적인 경향을 보인다. 한편, 우결핵 항원에 대한 항체 반응은 우결핵 초기에는 반응을 나타내지 않다가, 우결핵 병변이 진행됨에 따라 서서히 증가하는 경향을 보이고 있다. 따라서, 세포성 면역반응이 감소하는 시기에 우결핵 항원에 특이적으로 반응하는 항체를 측정하는 것은 세포성면역반응을 이용한 피내진단법에서 나타날 수 있는 우결핵 감염후기개체의 음성진단결과를 우결핵 특이항체 검출에 의해 양성으로 진단할 수 있어서 체액성면역반응을 이용한 우결핵특이항체 진단법은 세포성면역반응을 이용한 피내진단법과 상호보완적인 진단법으로 유용하다. 우결핵은 세계적으로 피내진단, 도축장 육안 결절검사 및 병리조직학적 및 세균유전학적 확진을 공인 진단법으로 채택하고 있다. 우결핵 진단에 있어 피내진단과 상호보완적인 혈청진단법을 병용한다면, 양성개체 탐색율을 더욱 향상시킬 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 도축장 검사에서 육안결절 검사와 더불어 도축우 혈청검사를 통한 우결핵 검진법이 적용된다면, 도축장에서 우결핵 검색율이 향상되는 효과를 가져올 수 있다.
우결핵 혈청학적 진단법으로 적용된 것을 살펴보면, 보체결합반응, 효소면역측정법, 면역크로마토그래피 및 라텍스비드 응집반응 등을 들 수 있다[재검토를 위해 Koo 일행, 2004와 2005]. 효소면역측정법은 96웰 플레이트에 특이항원을 코팅하여 혈청을 반응시킴으로써 혈청내의 특이항체 양을 측정하는 방법으로서 대량의 시료를 동시에 처리가 용이한 방법이며, PPD, MPB70, ESAT-6 등의 특이항원 단백질을 이용한 검사법이 연구되어져 왔다[재검토를 위해 Harboe 일행, 1990; Cho, 1998]. 면역크로마토그래피는 특이항원을 나이트로셀룰로오스막에 코팅하고 혈청을 흘려보내줌으로써 항원, 항체 반응유무를 육안적으로 관찰하는 진단법으로서 신속하게 판독장비 없이 용이하게 진단할 수 있는 진단법이며, 주로 재조합 단백질 항원, MPB70, MPB83, ESAT-6, CFP10 등이 활용되어 왔다[재검토를 위해 Lyashchenko 일행, 1998]. 라텍스비드 응집반응은 특이항원을 라텍스 비드에 결합시키고 혈청을 반응시킴으로써 항원, 항체 응집 복합체를 육안적으로 관찰하는 방법으로서 면역크로마토그래피와 마찬가지로 신속하고 판독이 용이한 장점을 갖고 있다.
이러한 혈청학적 진단법은 여러 연구자 보고에 따르면, 특이성과 민감성에서 많은 차이를 보이는데, 일반적으로 특이성은 높은 반면, 민감성은 낮은 경향을 보이고 있다[재검토를 위해 Fifis 일행, 1992]. 이러한 결과는 결핵균의 증식속도가 느리고 이에 따라 일어나는 면역반응이 1차적으로 세포성 면역반응이 주를 이루고 2차적으로 체액성면역반응인 항체반응이 뒤따르는데 따른 특징으로 보인다. 따라서, 사람에서도 현재까지 사람결핵의 원인균인 마이코박테리움 튜버클로시스의 항 원 중 특이성이 뛰어난 항원은 아직 발견되지 않고 있다 [재검토를 위해 Garg 일행, 2003]. 따라서, 많은 연구자들이 결핵의 특이 항원을 찾아내고, 재조합 단백질과 천연 단백질을 이용하여 효소면역측정법, 면역크로마토그래피 및 라텍스비드 응집반응 등의 혈청학적 진단법 개발을 해오고 있으나, 아직까지 상용화되어 국가방역상 사용되는 예는 극히 제한적이며, 피내진단이나 결절검사를 대체할 공인진단법으로 활용되지는 못하고 있으며, 결핵진단을 보완 내지 보조하는 진단법으로 활용되고 있다.
2. 우결핵 효소면역측정법 특성 및 진단용 항원
효소면역측정법은 대량·신속·정확한 진단법으로 질병진단에 있어 널리 활용되고 있다. 이에 덧붙여서, 효소면역측정법의 결과는 흡광도라는 수치로 표현되기 때문에 진단결과의 객관성 확보라는 결정적인 장점도 가지고 있다. 효소면역측정법에 이용할 수 있는 시료들은 항체를 가지고 있는 체액들, 예를 들면, 혈청 및 우유 등을 이용할 수 있다. 또한, 효소면역측정법에 활용하는 2차 항체의 면역글로블린 서브클래스에 따라 각각의 서브클래스별 면역글로블린 양을 알 수 있고, 이를 통하여 T 세포 아군의 면역반응 관여 정도를 간접적으로 알 수 있다. 효소면역측정법은 개체의 사전과 사후에 모두 검사할 수 있으며, 효소면역측정법의 관건은 특이성과 민감성이 뛰어난 항원의 사용이라고 할 수 있겠다. 특히, 특이성은 뛰어나지만 민감성이 낮기 때문에 특이성을 유지하면서 민감성이 높은 항원을 구성하는 것이 앞으로의 과제라 할 수 있다.
효소면역측정법에 가장 널리 활용되고 있는 항원은 피내진단 항원으로 활용되고 있는 PPD와 분비항원 중 가장 많은 부분을 차지하고 면역원성이 우수한 MPB70 항원이다[재검토를 위해 Lightbody 일행, 2000]. 최근에는 MPB70과 비슷한 생화학적 성상을 가지고 있는 MPB83이 뛰어난 우결핵 항원으로 주목을 받고 있다[재검토를 위해 McNair 일행, 2001; Amadori 일행, 2002]. 우결핵균은 그 유전체가 완전 해독되었고, 4,000여개의 단백질이 표현되는 것으로 밝혀졌다[재검토를 위해 Garnier 일행, 2003]. 이중 면역학적으로 Antigen 85와 ESAT-6, CFP10 등이 새로운 항원으로 많이 연구되고 있다[재검토를 위해 Linenbaum 일행, 2001]. 특히, ESAT-6와 CFP10은 우결핵균이 초기에 분비하는 단백질항원이기 때문에 이를 이용한 혈청 내에서의 조기 항체 진단가능성 때문에 효소면역측정법에 적용하는 연구가 진행되고 있다[재검토를 위해 Liu 일행, 2007].
우결핵을 검진하는 모든 나라에서는 우결핵균 배양상층액 단백질인 피피디의 피내접종에 의한 지연형 과민반응정도를 측정함으로써 진단하고 있다. 피피디 피내검사에 의해 성공적으로 우결핵을 근절한 나라도 있으며, 우리나라도 우결핵 피내검진과 양성우 살처분 등의 일관된 방제대책으로 1960년대 0.56%이었던 양성율이 2006년 현재 0.16%로 감소시켰다. 피내진단법의 이러한 성공적인 결과에도 불구하고, 피내진단법이 가지고 있는 단점들 때문에 많은 과학자들이 피내진단을 보완할 수 있는 진단법을 개발하고자 연구하여 왔다. 피내진단법의 단점은 첫째, 혈청진단법과 달리, 접종 시와 접종반응 측정 시, 두 번 개체를 보정해야 한다는 점이다. 둘째, 결핵병변이 심하게 진행된 개체에서는 피내진단항원에 대한 지연형 과민반응 이 나타나지 않아 음성으로 진단될 수 있다는 점이다. 이점은 결핵후기 개체가 결핵초기 개체보다 우결핵균 배설량과 배설빈도가 더 많아 전파위험성이 높다는 점을 고려할 때, 이를 보완할 수 있는 진단법의 개발이 요구되어 왔다. 따라서, 혈청 내에 있는 우결핵 특이항체가를 측정함으로써 우결핵을 진단하고자 하는 연구들이 계속되고 있다.
이에 본 발명자들은 현재 우결핵 진단법인 피내검사의 단점을 보완하기 위해 혈청내의 우결핵 특이항체가를 측정하는 효소면역측정법을 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 우결핵균 배양상층액으로부터 순수정제한 면역특이단백질 항원을 이용한 효소면역측정법을 통하여 신속하고 정확하게 우결핵을 진단할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 우결핵 스크리닝 진단용 효소면역측정 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 서열번호 1 내지 10의 우결핵 면역특이단백질 항원을 이용한 우결핵 스크리닝 진단용 효소면역측정 키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법을 제공한다.
본 발명에서는 면역특이단백질 항원을 포함하는 효소면역측정 진단키트를 이용하여 혈청으로 우결핵을 대량으로 신속하게 스크리닝하여 진단을 할 수 있었고, 결핵 피내진단과 도축장 결절검사 등의 우결핵 진단법을 보완하여 우결핵의 검색율을 높일 수 있었다.
우결핵은 마이코박테리움속균 중 우결핵균인 마이코박테리움 보비스가 호흡기와 소화기 계통에 감염되어 경우에 따라 기침, 콧물, 설사, 변비 및 쇠약 등의 임상증상을 보일 수 있는 만성소모성 질병이다. 우결핵균은 다른 고병원성 마이코박테리움속균들과 마찬가지로 세대시간이 24시간 정도로 일반세균에 비해 상당히 긴 것을 특징으로 한다. 따라서, 우결핵균은 체내에 감염되어도 서서히 증식하는 특성을 갖고 있다. 면역반응에 있어 우결핵균의 특징은 일반세균이 감염된 후 탐식되어 제거되는 과정을 거치는 것과는 달리, 탐식된 후에도 그 탐식세포 내에서 생존할 수 있는 능력을 가지고 있다는 점이다. 이에 근거하여 기존 우결핵의 진단은 우결핵 단백질항원을 미근부 또는 경부 피내에 접종하여 72시간 후 접종부위의 지연형 과민반응정도를 검사해 왔다.
우결핵에 감염된 소는 소뿐 아니라 사람에게도 전염시킬 수 있기 때문에, 축산업뿐만 아니라 인류 보건을 위해서도 방제되어야 할 중요한 인수공통전염병이다. 따라서, 우결핵으로 진단된 소는 소각 또는 매몰 등의 방법으로 우결핵균 전파를 미연에 방지하고 있다.
본 발명은 우결핵균의 배양상층액 중 정제된 면역특이단백질 항원을 이용하는 효소면역측정법을 통하여 우결핵을 보다 신속하고 정확하게 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 사용하는 면역특이단백질 항원으로는 각각 서열번호 1 내지 10으로 표현되는 MPB70, MPB83, MPT64, Fas, Smc, Nrp, RpoC, 유전자전위효 소(Transposase), LeuA 및 MbtE 등의 단백질들을 들 수 있다.
본 발명은 상기 서열번호 1 내지 10으로 표현되는 MPB70, MPB83, MPT64, Fas, Smc, Nrp, RpoC, 유전자전위효소(Transposase), LeuA 및 MbtE를 포함하는 우결핵 효소면역진단용 키트에 관한 것이다.
또한 본 발명에서는 소 혈청을 이용하여 우결핵 특이항체를 진단할 수 있는 효소면역측정진단키트를 이용하여 우결핵을 신속하고 정확하게 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명에 의한 우결핵 진단방법은 하기 단계들을 포함한다:
1) 서열번호 1 내지 10으로 표현되는 면역특이단백질 항원을 플레이트에 코팅한 후 젤라틴을 처리하여 항원 표면을 봉쇄하는 단계;
2) 우결핵 특이 항체를 처리하여 플레이트에 코팅된 면역특이단백질 항원과 특이 결합시키는 단계; 및
3) 상기 특이결합된 항체의 양을 측정하기 위하여 퍼옥시다아제가 부착된 2차 항체를 첨가한 후 발색반응을 관찰하는 단계.
상기 과정을 보다 상세히 살펴보면, 먼저, 96웰 엘라이자 플레이트에 우결핵균 배양액으로부터 정제한 특이항원을 코팅한 다음, 각 웰에 젤라틴을 처리하여 표면을 봉쇄하여 이후 항체가 웰에 결합할 수 없도록 하였다. 혈청을 각 웰에 접종하여 혈청내의 항체 중 웰 표면에 코팅된 항원과의 특이결합을 하도록 하였다. 특이항원과 결합한 특이항체의 양을 측정하기 위해 소 항체에 대한 항체에 퍼옥시다아제를 부착시킨 2차 항체[친화성 정제 항체 퍼옥시다아제 라벨된 염소 항- 소(Affinity purified antibody peroxidase labelled goat anti-bovine) IgG(H+L); Kirkegaard & Perry Laboratories, Gaithersburg, Maryland, USA]를 첨가하여 결합시킨 다음, 기질(ABTS, 2,2'-아지노(azino)-비스(3-에틸벤조티아졸린(ethylbenzothiazoline)-6-설폰산)디암모늄염; Sigma Co., St. Louis, MO, USA)을 첨가하여 발색반응을 관찰하였다. 발색정도는 흡광도로 측정하였으며, 음성 흡광도의 2배되는 흡광도를 보이는 개체를 양성으로 판정하였다. 매 실험마다 음성 흡광도는 0.2에서 0.4의 범위에 있어야 유효한 실험으로 인정한다.
기존 우결핵 효소면역측정법은 피내진단액으로 사용하는 피피디, 면역원성단백질로 동정되어 이를 유전자재조합기법으로 생산한 단백질인 MPB70(재조합 MPB70) 등을 이용한 효소면역측정법이 주로 사용되었는 바, 본 발명에서는 기존의 피피디와 재조합 MPB70를 이용한 효소면역측정법과 우결핵균 배양 상층액으로부터 분리 정제한 면역원성 단백질을 이용한 효소면역측정법을 비교하였다.
우결핵 진단 시 종래의 피내진단법 대신에 본 발명에 의한 효소면역측정법을 적용한다면, 채혈시 1회 보정, 진단시간 3일에서 2일로 단축 및 진단결과의 객관성 제고 등의 효과를 얻을 수 있다. 더욱이, 우결핵균 감염에 따른 세포성면역반응은 초기에는 항체반응에 앞서 나타나며, 후기로 갈수록 차차 감소하는 반면, 항체반응은 후기로 갈수록 증가하는 경향을 보이기 때문에 만약 결핵 감염후기에 피내진단을 적용했을 때는 감염되었음에도 불구하고 음성으로 나타날 수 있으며, 이 시기에 높게 형성된 항체를 측정함으로써 결핵을 진단할 수 있다. 현재 혈청을 이용한 소 질병진단은 브루셀라 등 주요 가축전염병에 대해서 실시하도록 되어있는바, 주요 가축전염병 진단용 혈청을 공동 활용할 수 있기 때문에 진단 노동력과 시간을 그만큼 절감하는 효과를 가져 올 수 있다. 본 발명에서 개발된 효소면역측정키트로 우결핵 진단이 보완된다면, 우결핵 양성우의 색출이 강화되어 우결핵 방제를 통한 농장위생제고와 인류보건 향상에 이바지할 것이다.
이하, 실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 사용균주 및 배양조건
우결핵균으로서는 마이코박테리움 보비스 AN5(ATCC 35726)를 사용하였다. 동결건조되어 냉동보관(-70℃)되어 있던 균주를 LJ 사면배지[LJ(Lowenstein-Jensen) 기본 배지(Difco Co.) 37.2 g, D.W. 600㎖, 전체 계란(whole eggs) 1,000㎖]에 접종하여 37℃에서 8주간 배양한 균태를 스파툴라 루프(spat㎕a loop)로 소톤(Sauton) 배지[아스파라긴 4.8g, 시트르산 2.4g, MgSO4 0.6g, K2HPO4 0.6 g, 구연산철암모늄(ferric ammonium citrate) 0.06g, 글리세린 72㎖, ZnSO4 0.0096g, CuSO4 0.0012g, 암모니아수 2.70 ㎖, D.W. 1,200㎖, pH 7.2]를 10㎖씩 소분한 배양액의 액면에 균체를 부유시켜 37℃에서 8주간 배양하여 종균주로 하였다.
종균주는 니아신 테스트(niacin test), 질산 환원 테스트(nitrate reduction test), 카탈라아제 테스트(catalase test) 및 Tween 80 가수분해 테스트(hydrolysis test)의 생화학시험과 PCR(polymerase chain reaction; 중합효소연쇄반응)에 의한 IS6110과 IS1081의 특이유전자를 검사하여 동정하였다.
IS6110 특이유전자 검사를 위한 프라이머 서열과 반응조건은 다음과 같다: 서열번호 15의 IS6110 유전자를 주형으로 하고 서열번호 11 및 12의 프라이머를 사용하여 95℃에서 5분간 예비변성한 후 95℃에서 45초간 변성, 60℃에서 45초간 어닐링 및 72℃에서 45초간 확장하는 사이클을 35회 거친 다음 72℃에서 10분간 확장하였다.
IS1081 특이유전자 검사를 위한 프라이머 서열과 반응조건은 다음과 같다: 서열번호 16의 IS1081 유전자를 주형으로 하고 서열번호 13 및 14의 프라이머를 사용하여 95℃에서 5분간 예비변성한 후 95℃에서 1분간 변성, 60℃에서 1분간 어닐링, 및 72℃에서 1분간 확장하는 사이클을 35회 실시하였다. 10㎖의 소톤(Sauton) 배지에 배양된 종균주를 100㎖씩 소분한 소톤(Sauton) 배지 액면에 다시 계대하여 37℃에서 8주간 배양하였다.
1. 니아신 테스트(niacin test), 질산 환원 테스트(nitrate reduction test), 카탈라아제 테스트(catalase test) 및 Tween 80 가수분해 테스트(hydrolysis test)의 생화학시험
1) 니아신 테스트 (niacin test)
LJ 사면배지에 3주 이상 배양하고 뚜렷이 배양된 균을 사용하였다. 2ml 멸균 증류수나 식염수를 사면배지의 표면에 첨가하였다. 주사침으로 사면배지를 자르거나 찔렀다. 사면배지를 37℃, 2시간 정치배양하거나, 실온에서 20분간 사면배지를 수평으로 놓거나 121℃, 30분간 사면배지를 수평으로 놓았다. 5분간 사면배지를 정치하였다. 이 용액을 1ml를 취하여 시험샘플로 사용하였다. 니아신 테스트 키트(HiMedia, India)의 Part A 1ml를 Part B 1ml에 첨가하였다. 시험샘플 1ml를 주사기로 시약(Part A + Part B)에 첨가하였다. 5분 내에 노란색으로 변하면 양성이며, 우결핵균은 5분 내에 노란색으로 변화하지 않는 니아신 음성이다.
2) 질산 환원 테스트(nitrate reduction test)
3-5주 배양된 균으로 실험하였다. 한 루프의 배양균을 질산 환원 테스트 키트 (HiMedia, India)의 R056에 무균적으로 풀고 잘 섞어주었다. 37℃ 항온수조에서 2시간 배양한다. 0.1N HCl 2방울을 첨가하였다. 질산 환원 테스트 키트(HiMedia, India)의 R060 2-3방울을 배양된 R056에 무균적으로 첨가하였다. 30-60초 내에 빨간 색으로 변하면 양성이며, 우결핵균은 색깔변화가 없는 음성이다.
3) 카탈라아제 테스트(catalase test)
카탈라아제 테스트 키트(HiMedia, India)의 카탈라아제 버퍼 R057 0.5ml에 시험균주를 풀었다. 항온수조에 68℃, 20분간 튜브를 놓았다. 튜브를 제거하고 실온에 식혔다. 신선한 카탈라아제 시약 R058 0.5ml을 첨가하였다. 20분 동안 용액의 표면에 기포생성유무를 관찰하였다. 기포가 생성되면 양성이며, 우결핵균은 기포가 생성되지 않는 음성이다.
4) Tween 80 가수분해 테스트(hydrolysis test)
0.067M 인산 완충액(pH 7) 100ml과 Tween 80 0.5 ml, 0.1% 수용성 뉴트럴 레드(neutral red)를 순서대로 섞고 121℃, 10분간 멸균시키고 갈색병에 담아 4℃에 보관하면서 기질로 사용하였다. 기질이 담겨진 튜브에 3 mm의 균괴를 풀고 37℃에서 배양하였다. 1, 5, 10일째에 기질 튜브가 분홍색 또는 빨간색으로 변하는 지를 관찰하였다. 10일후에도 색깔변화가 없으면 음성이며, 우결핵균이 이에 해당된다.
2. IS6110과 IS1081의 특이유전자(도 1a 및 도 1b 참조)
1) 서열번호 15의 IS6110과 서열번호 16의 IS1081은 마이코박테리움 보비스를 유전자적으로 특이검색하기 위한 부위이다. 이 유전자 유무를 확인함으로써 마이코박테리움 보비스로 동정할 수 있다(http://genolist.pasteur.fr/BoviList/).
3. PCR에 사용한 프라이머의 염기서열
IS6110과 IS1081 PCR에 사용한 프라이머 염기서열은 하기 표 1에 나타내었다:
프라이머 서열
IS6110 PCR 프라이머 F 5' - GGACAACGCCGAATTGCG - 3' (서열번호 11)
프라이머 R 5' - TAGGCGTCGGTGACAAAGGCCAC - 3' (서열번호 12)
IS1081 PCR 프라이머 F 5' - AAGCGAGCTGAACGCGCACTG - 3' (서열번호 13)
프라이머 R 5' - TGGATGCCCAGGATCTCTCGG - 3' (서열번호 14)
[실시예 2] 단백질추출 및 침전
상기 실시예 1에서 8주간 배양한 균액의 잡균오염 유무를 육안 및 항산성 염색으로 확인하여 오염여부를 확인한 후, 배양된 균액을 잘 흔들어 균막을 배지 중에 완전히 가라앉혀 진탕부유시키고 100℃ 증기압에서 3시간동안 살균하였다. 살균된 것을 실온에서 냉각한 다음 60 메쉬의 동망으로 여과하고 이어서 여과지로 여과하여 투명한 황갈색의 액체를 12,000 rpm, 30분간 원심침전시켰다. 그 상층액에 암모늄 설페이트(ammonium sulfate)가 85% 되게 용해시켜 단백질을 침전시킨 후, 10,000×g에서 10분간 원심침전하여 2부피의 멸균 PBS에 재부유하여 멸균 PBS로 투석막(MWCO 3,500)을 이용하여 암모늄 설페이트를 제거하였다. 투석 후 BCA 단백질 분석 키트(BCA protein assay kit, Pierce Co.)로 단백질 농도를 측정한 다음, 진공원심농축기를 이용하여 건조시켜 정제에 공시하였다.
[실시예 3] 특이단백질 정제
상기 실시예 2에서 건조시킨 단백질을 음이온 교환수지 크로마토그래피인 MonoQ HR5/5과 FPLC 시스템을 이용하여 분획하였다(도 2). 이를 위하여 건조된 단백질을 버퍼 A(30mM 트리스-HCl w/ 2% 부탄올, pH 8.8)에 9.5㎎/㎖ 농도로 재부유하였다. 유속을 분당 1㎖로 하였으며, 바이알(vial)당 1㎖을 분획하였다. 6번 분획부터 26번 분획까지 20개 분획은 NaCl 농도를 0 에서 1M까지 직선성으로 경사를 주었고, 26번 분획부터 31번 분획까지 5개 분획은 1M에서 2M까지 직선성으로 경사를 주었다.
도 2에서 X축은 흘려보낸 버퍼의 양을 나타내며, Y축은 단백질 측정파장인 280 nm에서의 흡광도를 나타낸다. X축상의 빨간색 번호는 수집한 분획의 수이며, 초록색은 버퍼의 염농도 경사를 보여준다. 원 단백질 9.5 mg/ml을 MonoQ HR5/5에 로딩하고, 버퍼를 흘려보내준 후 1번부터 5번까지는 염농도 경사를 가해주지 않은 상태에서 분획을 수집하였으며, 6번 분획부터는 염농도 경사를 초록색 그래프에서 보여주는 것과 같이 가해주었다. 각각의 수집된 분획에 대한 흡광도 결과는 파란색그래프와 같이 나타났으며, 높은 흡광도를 나타낸 분획인 1번, 2번, 3번, 18번, 19번, 20번 및 21번 분획에 대해 단백질 분석 및 면역원성을 확인하였다.
도 3에서 나타난 바와 같이 염농도 경사없이 수집한 분획 중 2번 분획은 25 kDa, 20 kDa 및 10 kDa 등을, 3번 분획은 20 kDa과 10 kDa 단백질이 함유되어 있음을 확인할 수 있었고, 18번, 19번, 20번 분획도 20 kDa과 10 kDa의 단백질이 함유되어 있음을 확인할 수 있었다(도 3의 왼쪽 그림). 도 3의 오른쪽그림은 단백질이 함유된 각각의 분획이 전개된 SDS-PAGE 젤의 단백질을 나이트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮긴 후, 우결핵균 AN5(우결핵 표준균주)를 인공감염시킨 소 양성혈청과 반응시킨 결과이다. 그림에서 관찰된 바와 같이, 염농도경사전 분획중에는 2번과 3번 분획이, 염농도경사후 분획중에는 18번과 19번 분획이 20 kDa에서 양성혈청과 뚜렷한 반응을 보여 이 단백질이 면역원성 단백질임을 확인하였다. 분획된 단백질중 우결핵 효소면역측정법에 활용할 적합한 항원은 염농도경사를 가해준 후에 수집된 분획중 면역원성이 뚜렷이 확인된 18번과 19번 분획임을 알 수 있었다. 18번과 19번 분획의 면역원성 단백질을 동정하고자 각각의 분획을 1차원 전기영동으로 전개하였으며, 면역원성이 확인된 20 kDa 부위를 각각 절단하여 트립신으로 단백질을 분해한 다음, 분해된 펩타이드를 질량분석기와 우결핵균 단백질에 대한 아미노산서열의 데이터베이스를 이용하여 동정하였다. 18번 분획은 MPB70, MPB83, MPT64, Fas, Smc, Nrp, RpoC, 유전자전위효소(Transposase), LeuA 및 MbtE 등 10종의 단백질이, 19번 분획은 MPB70, MPB83, MPT64, CFP21, 분지산변위효소(chorismate mutase), GroEL, PepA, FixB, PpiA, LppX, GreA, CFP10, MPT32, EsxN, Fas, Mb3713c 및 RpoC 등 17종의 단백질이 함유되어 있음을 확인하였다. 이들 단백질들의 아미노산 서열 번호는 표 2와 같다. 이들 두개의 분획과 이전의 우결핵 효소면역측정법용 항원인 피피디, 재조합 MPB70을 비교하였다.
1. MonoQ 분획의 면역원성 단백질
일련번호 면역원성 단백질 해당 분획 아미노산 서열번호
1 Smc 18 5
2 Nrp 18 6
3 유전자전위효소 (Transposase) 18 8
4 LeuA 18 9
5 MbtE 18 10
6 MPB70 18, 19 1
7 MPB83 18, 19 2
8 MPT64 18, 19 3
9 Fas 18, 19 4
10 RpoC 18, 19 7
11 CFP21 19 17
12 분지산 변위효소 (Chorismate mutase) 19 18
13 GroEL 19 19
14 PepA 19 20
15 FixB 19 21
16 PpiA 19 22
17 LppX 19 23
18 GreA 19 24
19 CFP10 19 25
20 MPT32 19 26
21 EsxN 19 27
22 Mb3713c 19 28
[시험예 4] 효소면역측정법
먼저, 하기 표 3에 기재된 표준혈청 96웰 플레이트에 PPD, rMPB70, MonoQ18 및 MonoQ19 항원을 각각 코팅 완충액[Na2CO3 1.59g, NaHCO3 2.93g, NaN3 0.2g, D.W. 1,000 ml, pH 9.6]에 1㎍/ml로 희석시켰다. ELISA 플레이트에 1㎍/ml로 희석된 상기 항원들을 100 ㎕씩 접종하여 4℃에서 하룻밤동안 정치하여 흡착시켰다. 모든 플레이트는 항온배양 전에 1분 동안 진탕(shaking)하였다. 블로킹(Blocking) 완충액은 1% 젤라틴을 PBS에 녹여서 필요한 만큼(예를 들면, 블로킹용 15 ml/플레이트, 컨쥬게이트(conjugate)용 10ml/플레이트) 미리 만들어 놓는다. 코팅 플레이트를 Tween-PBS(NaCl 8g, KH2PO4 0.2g, Na2HPO4·7H2O 1.15g, KCl 0.2g, Tween 20 0.5ml, D.W. 1,000 ml, pH 7.4)로 250 ㎕씩 4회 세척하였다. 세척 후 와이프올을 바닥에 놓고 ELISA 플레이트를 그 표면 위에 털었다. 미리 만들어 놓은 블로킹 완충액을 150 ㎕씩 각 웰(well)에 접종하여 1시간동안 37℃에서 반응시켰다. 모든 플레이트는 항온배양 전에 1분 동안 진탕하였다. 혈청을 꺼내어 준비해 놓았다. 처리한 샘플 수가 많으면, 미리 희석시켜 놓았다(혈청 5㎕ : PBS 1,000 ㎕). 블로킹(Blocking) 완충액으로 1시간 동안 반응 후 Tween-PBS 250 ㎕씩 4회 세척하였다. 희석시켜 놓은 혈청을 각 웰에 100 ㎕씩 접종하였다. 모든 플레이트는 항온배양 전에 1분 동안 진탕하였다. 같은 혈청을 두 웰에 반복 접종하였다.
혈청시료와 표준혈청 96웰 플레이트 접종 표
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A S1 S2 S3 S4 S5 S6
B S7 S8 S9 S10 S11 S12
C S13 S14 S15 S16 S17 S18
D S19 S20 S21 S22 S23 S24
E S25 S26 S27 S28 S29 S30
F S31 S32 S33 S34 S35 S36
G S37 S38 S39 S40 S41 S42
H S43 S44 S45 S46 NC PC
NC(Negative Control): 우결핵 음성혈청
PC(Positive Control): 표준균주를 감염시킨 소에서 채취한 양성혈청
접종 후 1시간동안 37℃에서 반응시켰다. 컨쥬게이트를 블로킹 완충액으로 실험 전 즉시 희석해 놓았다(소 IgG의 경우, 2,000 배). 반응 후 위 세척과정과 같이 세척하였다. 희석해 놓은 컨쥬게이트를 100 ㎕씩 각 웰에 접종한 다음 실온(20± 3℃)에서 30분 동안 반응시켰다. 모든 플레이트는 항온배양 전에 1분 동안 진탕하였다. 기질용액[H2O2 10㎕, ABTS 1 타블릿(10mg), 시트르산 완충액(시트르산{1.92 g/100ml} 12.15 ml, Na2HPO4 {2.82g/100ml} 12.85 ml, D.W. 25 ml, pH5.0) 50 ml]을 접종 바로 전에 미리 제조해 놓았다. 30분 반응 후 위와 동일하게 세척하고 상기 기질 용액을 각 웰에 100 ㎕씩 접종시켰다. 15분 후 반응이 완성되었다. 반응이 완성되면, 반응중지용액(원액 HCl 4.4 ml, D.W. 1,000 ml)을 50 ㎕씩 각 웰에 접종하고 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
각 혈청의 평균값을 구하였다. 양성혈청의 흡광도는 0.8 이상, 음성혈청의 흡광도는 0.4이하를 보여야 유효한 시험으로 인정하였다. 샘플혈청의 흡광도를 음성혈청의 흡광도로 나누어 2.0 이상이면 양성으로 하고, 2.0미만 음성으로 하였다.
또한 민감성은 양성인 개체가 새로운 진단법에서 양성으로 판정되는 퍼센트이며, 특이성은 음성인 개체가 새로운 진단법에서 음성으로 판정될 퍼센트이며, 하기 수학식 1로 표현될 수 있다:
민감성 = (새로운 진단법 양성개체수)/(표준진단법 양성개체수), 특이성 = (새로운 진단법 음성개체수)/(표준진단법 음성개체수).
양성예측치는 새로운 진단법에서 양성결과가 양성일 퍼센트이며, 음성예측치는 새로운 진단법에서 음성결과가 음성일 퍼센트이며, 하기 수학식 2로 표현될 수 있다:
양성예측치 = (새로운 진단법 양성개체수중 표준진단법 양성개체수)/(새로운 진단법 양성개체수), 음성예측치 = (새로운 진단법 음성개체수중 표준진단법 음성개체수)/(새로운 진단법 음성개체수).
1. PPD ELISA
bTB IST PPV & NPV
+ -
PPD ELISA + 7 0 PPV = 100
- 8 7 NPV = 47
Se & Sp Se = 47 Sp = 100
rMPB70 ELISA
bTB IST PPV & NPV
+ -
rMPB70 ELISA + 1 0 PPV = 100
- 14 7 NPV = 33
Se & Sp Se = 7 Sp = 100
MonoQ18 ELISA
bTB IST PPV & NPV
+ -
MonoQ18 ELISA + 8 0 PPV = 100
- 7 7 NPV = 50
Se & Sp Se = 53 Sp = 100
MonoQ19 ELISA
bTB IST PPV & NPV
+ -
MonoQ19 ELISA + 6 0 PPV = 100
- 9 7 NPV = 44
Se & Sp Se = 40 Sp = 100
[ELISA : 효소면역측정법 (enzyme-linked immunosorbent assay),
bTB : 우결핵 (bovine tuberculosis),
IST : 피내진단법 (intradermal skin test),
Se : 민감성 (sensitivity),
Sp : 특이성 (specificity),
PPV : 양성예측치 (positive predicitive value),
NPV : 음성예측치 (negative predictive value).]
도 4는 MPB70 등 정제단백질을 이용한 효소면역측정법 결과이며, 도 5는 피피디, 재조합 MPB70, 18번 분획(MonoQ18) 및 19번 분획(MonoQ19)에 대한 효소면역측정법 결과를 비교한 그래프로서 피내검진에 의한 우결핵 양성우, 의양성우 및 음성우의 흡광도를 음성혈청 흡광도로 나눈 값을 보여준다. 우결핵 양성우, 의양성 및 음성우 각각에 대해 18번 분획이 기존의 피피디, 재조합 MPB70 항원보다 민감성(Se), 특이성(Sp), 양성예측치(PPV), 음성예측치(NPV) 등에서 우수한 결과를 나타내었다(표 4 내지 표 7 참조).
우결핵 효소면역측정법은 우결핵이 감염되어 후기로 진행된 개체를 피내진단법으로 검진 시 음성결과가 나올 수 있기 때문에 이를 보완하여 우결핵 양성개체를 보다 완전하게 색출할 수 있는 진단법으로서 우결핵 항체반응이 높아지는 후기에 피내진단법과 병행하여 적용한다면, 보다 정확하게 우결핵을 진단할 수 있는 방법이다. 또한, 우군전체에 대한 우결핵균에 대한 감염여부를 파악하기 위한 우결핵 스크리닝 검사로도 적합하다. 본 발명에 의한 우결핵 효소면역측정법으로 양성 개체가 나타난다면, 그 우군은 우결핵균에 노출되었을 가능성이 있음을 알 수 있다. 우결핵 스크리닝 검사를 기존의 피내진단법으로 시행한다면, 3일의 시간이 소요되며, 접종시와 결과 판정시 두 번 소를 보정해야 하지만, 효소면역측정법으로 스크리닝한다면, 채혈시 1번만 보정하면 되며, 결과 또한, 보다 객관적인 수치로 표현될 수 있다는 장점과 대량의 혈청가검물을 동시에 신속히 검사할 수 있으며, 동일한 개체의 혈청으로 다른 전염병, 예를 들면, 브루셀라 등의 혈청검진을 할 수 있어 노동력의 절감효과를 가져올 수 있을 것이다.
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도 1a 및 1b는 마이코박테리움 보비스를 유전자적으로 특이검색하기 위한 부위에 해당하는 IS6110과 IS1081 유전자 및 이들의 주변 서열을 각각 보여준다. 상기 도면에서 넘버링된 부분이 각각 IS6110과 IS1081에 해당하는 유전자이며, 굵은 색으로 밑줄 친 부분은 상기 유전자들을 PCR 증폭 시 사용할 수 있는 프라이머 서열이다.
도 2는 우결핵균 단백질 중 음이온 크로마토그래피 MonoQ HR 5/5에 의한 분획을 나타낸 것이다.
도 3은 면역특이단백질을 조사하기 위하여 단백질 분획의 1차원 전기영동 사진(왼쪽), 우결핵균 감염 혈청에 의한 웨스턴블럿(오른쪽) 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 MPB70등 정제단백질을 이용한 효소면역측정법을 실시하기 위한 평판배양기 사진이다.
도 5는 기존과 신규 MonoQ 항원과 효소면역측정법를 실시한 결과이다:
[PPD : 기존 효소면역측정용 항원 1 (우결핵 피내진단액),
rMPB70 : 기존 효소면역측정용 항원 1 (재조합 MPB70)
MonoQ18 : MonoQ 컬럼으로 정제된 18번 분획,
MonoQ19 : MonoQ 컬럼으로 정제된 19번 분획,
TB, 피내진단 결핵(tuberculosis diagnosed by intradermal test),
S/N: 샘플OD/음성OD의 비율].
<110> REPUBLIC OF KOREA(Management : Ministry of Agriculture and forestry, National Veterinary Research) <120> Bovine tuberculosis specific enzyme immuno assay kit comprising immune specific protein antigen and other immunogens and the method for diagnosing the bovine tuberculosis by using the same <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 193 <212> PRT <213> MPB70 protein of Mycobacterium bovis <400> 1 Met Lys Val Lys Asn Thr Ile Ala Ala Thr Ser Phe Ala Ala Ala Gly 1 5 10 15 Leu Ala Ala Leu Ala Val Ala Val Ser Pro Pro Ala Ala Ala Gly Asp 20 25 30 Leu Val Gly Pro Gly Cys Ala Glu Tyr Ala Ala Ala Asn Pro Thr Gly 35 40 45 Pro Ala Ser Val Gln Gly Met Ser Gln Asp Pro Val Ala Val Ala Ala 50 55 60 Ser Asn Asn Pro Glu Leu Thr Thr Leu Thr Ala Ala Leu Ser Gly Gln 65 70 75 80 Leu Asn Pro Gln Val Asn Leu Val Asp Thr Leu Asn Ser Gly Gln Tyr 85 90 95 Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Ala Ala Phe Ser Lys Leu Pro Ala Ser 100 105 110 Thr Ile Asp Glu Leu Lys Thr Asn Ser Ser Leu Leu Thr Ser Ile Leu 115 120 125 Thr Tyr His Val Val Ala Gly Gln Thr Ser Pro Ala Asn Val Val Gly 130 135 140 Thr Arg Gln Thr Leu Gln Gly Ala Ser Val Thr Val Thr Gly Gln Gly 145 150 155 160 Asn Ser Leu Lys Val Gly Asn Ala Asp Val Val Cys Gly Gly Val Ser 165 170 175 Thr Ala Asn Ala Thr Val Tyr Met Ile Asp Ser Val Leu Met Pro Pro 180 185 190 Ala <210> 2 <211> 220 <212> PRT <213> MPB83 protein of Mycobacterium bovis <400> 2 Met Ile Asn Val Gln Ala Lys Pro Ala Ala Ala Ala Ser Leu Ala Ala 1 5 10 15 Ile Ala Ile Ala Phe Leu Ala Gly Cys Ser Ser Thr Lys Pro Val Ser 20 25 30 Gln Asp Thr Ser Pro Lys Pro Ala Thr Ser Pro Ala Ala Pro Val Thr 35 40 45 Thr Ala Ala Met Ala Asp Pro Ala Ala Asp Leu Ile Gly Arg Gly Cys 50 55 60 Ala Gln Tyr Ala Ala Gln Asn Pro Thr Gly Pro Gly Ser Val Ala Gly 65 70 75 80 Met Ala Gln Asp Pro Val Ala Thr Ala Ala Ser Asn Asn Pro Met Leu 85 90 95 Ser Thr Leu Thr Ser Ala Leu Ser Gly Lys Leu Asn Pro Asp Val Asn 100 105 110 Leu Val Asp Thr Leu Asn Gly Gly Glu Tyr Thr Val Phe Ala Pro Thr 115 120 125 Asn Ala Ala Phe Asp Lys Leu Pro Ala Ala Thr Ile Asp Gln Leu Lys 130 135 140 Thr Asp Ala Lys Leu Leu Ser Ser Ile Leu Thr Tyr His Val Ile Ala 145 150 155 160 Gly Gln Ala Ser Pro Ser Arg Ile Asp Gly Thr His Gln Thr Leu Gln 165 170 175 Gly Ala Asp Leu Thr Val Ile Gly Ala Arg Asp Asp Leu Met Val Asn 180 185 190 Asn Ala Gly Leu Val Cys Gly Gly Val His Thr Ala Asn Ala Thr Val 195 200 205 Tyr Met Ile Asp Thr Val Leu Met Pro Pro Ala Gln 210 215 220 <210> 3 <211> 228 <212> PRT <213> MPT64 protein of Mycobacterium bovis <400> 3 Met Arg Ile Lys Ile Phe Met Leu Val Thr Ala Val Val Leu Leu Cys 1 5 10 15 Cys Ser Gly Val Ala Thr Ala Ala Pro Lys Thr Tyr Cys Glu Glu Leu 20 25 30 Lys Gly Thr Asp Thr Gly Gln Ala Cys Gln Ile Gln Met Ser Asp Pro 35 40 45 Ala Tyr Asn Ile Asn Ile Ser Leu Pro Ser Tyr Tyr Pro Asp Gln Lys 50 55 60 Ser Leu Glu Asn Tyr Ile Ala Gln Thr Arg Asp Lys Phe Leu Ser Ala 65 70 75 80 Ala Thr Ser Ser Thr Pro Arg Glu Ala Pro Tyr Glu Leu Asn Ile Thr 85 90 95 Ser Ala Thr Tyr Gln Ser Ala Ile Pro Pro Arg Gly Thr Gln Ala Val 100 105 110 Val Leu Lys Val Tyr Gln Asn Ala Gly Gly Thr His Pro Thr Thr Thr 115 120 125 Tyr Lys Ala Phe Asp Trp Asp Gln Ala Tyr Arg Lys Pro Ile Thr Tyr 130 135 140 Asp Thr Leu Trp Gln Ala Asp Thr Asp Pro Leu Pro Val Val Phe Pro 145 150 155 160 Ile Val Gln Gly Glu Leu Ser Lys Gln Thr Gly Gln Gln Val Ser Ile 165 170 175 Ala Pro Asn Ala Gly Leu Asp Pro Val Asn Tyr Gln Asn Phe Ala Val 180 185 190 Thr Asn Asp Gly Val Ile Phe Phe Phe Asn Pro Gly Glu Leu Leu Pro 195 200 205 Glu Ala Ala Gly Pro Thr Gln Val Leu Val Pro Arg Ser Ala Ile Asp 210 215 220 Ser Met Leu Ala 225 <210> 4 <211> 3069 <212> PRT <213> Fas protein of Mycobacterium bovis <400> 4 Met Thr Ile His Glu His Asp Arg Val Ser Ala Asp Arg Gly Gly Asp 1 5 10 15 Ser Pro His Thr Thr His Ala Leu Val Asp Arg Leu Met Ala Gly Glu 20 25 30 Pro Tyr Ala Val Ala Phe Gly Gly Gln Gly Ser Ala Trp Leu Glu Thr 35 40 45 Leu Glu Glu Leu Val Ser Ala Thr Gly Ile Glu Thr Glu Leu Ala Thr 50 55 60 Leu Val Gly Glu Ala Glu Leu Leu Leu Asp Pro Val Thr Asp Glu Leu 65 70 75 80 Ile Val Val Arg Pro Ile Gly Phe Glu Pro Leu Gln Trp Val Arg Ala 85 90 95 Leu Ala Ala Glu Asp Pro Val Pro Ser Asp Lys His Leu Thr Ser Ala 100 105 110 Ala Val Ser Val Pro Gly Val Leu Leu Thr Gln Ile Ala Ala Thr Arg 115 120 125 Ala Leu Ala Arg Gln Gly Met Asp Leu Val Ala Thr Pro Pro Val Ala 130 135 140 Met Ala Gly His Ser Gln Gly Val Leu Ala Val Glu Ala Leu Lys Ala 145 150 155 160 Gly Gly Ala Arg Asp Val Glu Leu Phe Ala Leu Ala Gln Leu Ile Gly 165 170 175 Ala Ala Gly Thr Leu Val Ala Arg Arg Arg Gly Ile Ser Val Leu Gly 180 185 190 Asp Arg Pro Pro Met Val Ser Val Thr Asn Ala Asp Pro Glu Arg Ile 195 200 205 Gly Arg Leu Leu Asp Glu Phe Ala Gln Asp Val Arg Thr Val Leu Pro 210 215 220 Pro Val Leu Ser Ile Arg Asn Gly Arg Arg Ala Val Val Ile Thr Gly 225 230 235 240 Thr Pro Glu Gln Leu Ser Arg Phe Glu Leu Tyr Cys Arg Gln Ile Ser 245 250 255 Glu Lys Glu Glu Ala Asp Arg Lys Asn Lys Val Arg Gly Gly Asp Val 260 265 270 Phe Ser Pro Val Phe Glu Pro Val Gln Val Glu Val Gly Phe His Thr 275 280 285 Pro Arg Leu Ser Asp Gly Ile Asp Ile Val Ala Gly Trp Ala Glu Lys 290 295 300 Ala Gly Leu Asp Val Ala Leu Ala Arg Glu Leu Ala Asp Ala Ile Leu 305 310 315 320 Ile Arg Lys Val Asp Trp Val Asp Glu Ile Thr Arg Val His Ala Ala 325 330 335 Gly Ala Arg Trp Ile Leu Asp Leu Gly Pro Gly Asp Ile Leu Thr Arg 340 345 350 Leu Thr Ala Pro Val Ile Arg Gly Leu Gly Ile Gly Ile Val Pro Ala 355 360 365 Ala Thr Arg Gly Gly Gln Arg Asn Leu Phe Thr Val Gly Ala Thr Pro 370 375 380 Glu Val Ala Arg Ala Trp Ser Ser Tyr Ala Pro Thr Val Val Arg Leu 385 390 395 400 Pro Asp Gly Arg Val Lys Leu Ser Thr Lys Phe Thr Arg Leu Thr Gly 405 410 415 Arg Ser Pro Ile Leu Leu Ala Gly Met Thr Pro Thr Thr Val Asp Ala 420 425 430 Lys Ile Val Ala Ala Ala Ala Asn Ala Gly His Trp Ala Glu Leu Ala 435 440 445 Gly Gly Gly Gln Val Thr Glu Glu Ile Phe Gly Asn Arg Ile Glu Gln 450 455 460 Met Ala Gly Leu Leu Glu Pro Gly Arg Thr Tyr Gln Phe Asn Ala Leu 465 470 475 480 Phe Leu Asp Pro Tyr Leu Trp Lys Leu Gln Val Gly Gly Lys Arg Leu 485 490 495 Val Gln Lys Ala Arg Gln Ser Gly Ala Ala Ile Asp Gly Val Val Ile 500 505 510 Ser Ala Gly Ile Pro Asp Leu Asp Glu Ala Val Glu Leu Ile Asp Glu 515 520 525 Leu Gly Asp Ile Gly Ile Ser His Val Val Phe Lys Pro Gly Thr Ile 530 535 540 Glu Gln Ile Arg Ser Val Ile Arg Ile Ala Thr Glu Val Pro Thr Lys 545 550 555 560 Pro Val Ile Met His Val Glu Gly Gly Arg Ala Gly Gly His His Ser 565 570 575 Trp Glu Asp Leu Asp Asp Leu Leu Leu Ala Thr Tyr Ser Glu Leu Arg 580 585 590 Ser Arg Ala Asn Ile Thr Val Cys Val Gly Gly Gly Ile Gly Thr Pro 595 600 605 Arg Arg Ala Ala Glu Tyr Leu Ser Gly Arg Trp Ala Gln Ala Tyr Gly 610 615 620 Phe Pro Leu Met Pro Ile Asp Gly Ile Leu Val Gly Thr Ala Ala Met 625 630 635 640 Ala Thr Lys Glu Ser Thr Thr Ser Pro Ser Val Lys Arg Met Leu Val 645 650 655 Asp Thr Gln Gly Thr Asp Gln Trp Ile Ser Ala Gly Lys Ala Gln Gly 660 665 670 Gly Met Ala Ser Ser Arg Ser Gln Leu Gly Ala Asp Ile His Glu Ile 675 680 685 Asp Asn Ser Ala Ser Arg Cys Gly Arg Leu Leu Asp Glu Val Ala Gly 690 695 700 Asp Ala Glu Ala Val Ala Glu Arg Arg Asp Glu Ile Ile Ala Ala Met 705 710 715 720 Ala Lys Thr Ala Lys Pro Tyr Phe Gly Asp Val Ala Asp Met Thr Tyr 725 730 735 Leu Gln Trp Leu Arg Arg Tyr Val Glu Leu Ala Ile Gly Glu Gly Asn 740 745 750 Ser Thr Ala Asp Thr Ala Ser Val Gly Ser Pro Trp Leu Ala Asp Thr 755 760 765 Trp Arg Asp Arg Phe Glu Gln Met Leu Gln Arg Ala Glu Ala Arg Leu 770 775 780 His Pro Gln Asp Phe Gly Pro Ile Gln Thr Leu Phe Thr Asp Ala Gly 785 790 795 800 Leu Leu Asp Asn Pro Gln Gln Ala Ile Ala Ala Leu Leu Ala Arg Tyr 805 810 815 Pro Asp Ala Glu Thr Val Gln Leu His Pro Ala Asp Val Pro Phe Phe 820 825 830 Val Thr Leu Cys Lys Thr Leu Gly Lys Pro Val Asn Phe Val Pro Val 835 840 845 Ile Asp Gln Asp Val Arg Arg Trp Trp Arg Ser Asp Ser Leu Trp Gln 850 855 860 Ala His Asp Ala Arg Tyr Asp Ala Asp Ala Val Cys Ile Ile Pro Gly 865 870 875 880 Thr Ala Ser Val Ala Gly Ile Thr Arg Met Asp Glu Pro Val Gly Glu 885 890 895 Leu Leu Asp Arg Phe Glu Gln Ala Ala Ile Asp Glu Val Leu Gly Ala 900 905 910 Gly Val Glu Pro Lys Asp Val Ala Ser Arg Arg Leu Gly Arg Ala Asp 915 920 925 Val Ala Gly Pro Leu Ala Val Val Leu Asp Ala Pro Asp Val Arg Trp 930 935 940 Ala Gly Arg Thr Val Thr Asn Pro Val His Arg Ile Ala Asp Pro Ala 945 950 955 960 Glu Trp Gln Val His Asp Gly Pro Glu Asn Pro Arg Ala Thr His Ser 965 970 975 Ser Thr Gly Ala Arg Leu Gln Thr His Gly Asp Asp Val Ala Leu Ser 980 985 990 Val Pro Val Ser Gly Thr Trp Val Asp Ile Arg Phe Thr Leu Pro Ala 995 1000 1005 Asn Thr Val Asp Gly Gly Thr Pro Val Ile Ala Thr Glu Asp Ala Thr 1010 1015 1020 Ser Ala Met Arg Thr Val Leu Ala Ile Ala Ala Gly Val Asp Ser Pro 1025 1030 1035 1040 Glu Phe Leu Pro Ala Val Ala Asn Gly Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp 1045 1050 1055 Trp His Pro Glu Arg Val Ala Asp His Thr Gly Val Thr Ala Thr Phe 1060 1065 1070 Gly Glu Pro Leu Ala Pro Ser Leu Thr Asn Val Pro Asp Ala Leu Val 1075 1080 1085 Gly Pro Cys Trp Pro Ala Val Phe Ala Ala Ile Gly Ser Ala Val Thr 1090 1095 1100 Asp Thr Gly Glu Pro Val Val Glu Gly Leu Leu Ser Leu Val His Leu 1105 1110 1115 1120 Asp His Ala Ala Arg Val Val Gly Gln Leu Pro Thr Val Pro Ala Gln 1125 1130 1135 Leu Thr Val Thr Ala Thr Ala Ala Asn Ala Thr Asp Thr Asp Met Gly 1140 1145 1150 Arg Val Val Pro Val Ser Val Val Val Thr Gly Ala Asp Gly Ala Val 1155 1160 1165 Ile Ala Thr Leu Glu Glu Arg Phe Ala Ile Leu Gly Arg Thr Gly Ser 1170 1175 1180 Ala Glu Leu Ala Asp Pro Ala Arg Ala Gly Gly Ala Val Ser Ala Asn 1185 1190 1195 1200 Ala Thr Asp Thr Pro Arg Arg Arg Arg Arg Asp Val Thr Ile Thr Ala 1205 1210 1215 Pro Val Asp Met Arg Pro Phe Ala Val Val Ser Gly Asp His Asn Pro 1220 1225 1230 Ile His Thr Asp Arg Ala Ala Ala Leu Leu Ala Gly Leu Glu Ser Pro 1235 1240 1245 Ile Val His Gly Met Trp Leu Ser Ala Ala Ala Gln His Ala Val Thr 1250 1255 1260 Ala Thr Asp Gly Gln Ala Arg Pro Pro Ala Arg Leu Val Gly Trp Thr 1265 1270 1275 1280 Ala Arg Phe Leu Gly Met Val Arg Pro Gly Asp Glu Val Asp Phe Arg 1285 1290 1295 Val Glu Arg Val Gly Ile Asp Gln Gly Ala Glu Ile Val Asp Val Ala 1300 1305 1310 Ala Arg Val Gly Ser Asp Leu Val Met Ser Ala Ser Ala Arg Leu Ala 1315 1320 1325 Ala Pro Lys Thr Val Tyr Ala Phe Pro Gly Gln Gly Ile Gln His Lys 1330 1335 1340 Gly Met Gly Met Glu Val Arg Ala Arg Ser Lys Ala Ala Arg Lys Val 1345 1350 1355 1360 Trp Asp Thr Ala Asp Lys Phe Thr Arg Asp Thr Leu Gly Phe Ser Val 1365 1370 1375 Leu His Val Val Arg Asp Asn Pro Thr Ser Ile Ile Ala Ser Gly Val 1380 1385 1390 His Tyr His His Pro Asp Gly Val Leu Tyr Leu Thr Gln Phe Thr Gln 1395 1400 1405 Val Ala Met Ala Thr Val Ala Ala Ala Gln Val Ala Glu Met Arg Glu 1410 1415 1420 Gln Gly Ala Phe Val Glu Gly Ala Ile Ala Cys Gly His Ser Val Gly 1425 1430 1435 1440 Glu Tyr Thr Ala Leu Ala Cys Val Thr Gly Ile Tyr Gln Leu Glu Ala 1445 1450 1455 Leu Leu Glu Met Val Phe His Arg Gly Ser Lys Met His Asp Ile Val 1460 1465 1470 Pro Arg Asp Glu Leu Gly Arg Ser Asn Tyr Arg Leu Ala Ala Ile Arg 1475 1480 1485 Pro Ser Gln Ile Asp Leu Asp Asp Ala Asp Val Pro Ala Phe Val Ala 1490 1495 1500 Gly Ile Ala Glu Ser Thr Gly Glu Phe Leu Glu Ile Val Asn Phe Asn 1505 1510 1515 1520 Leu Arg Gly Ser Gln Tyr Ala Ile Ala Gly Thr Val Arg Gly Leu Glu 1525 1530 1535 Ala Leu Glu Ala Glu Val Glu Arg Arg Arg Glu Leu Thr Gly Gly Arg 1540 1545 1550 Arg Ser Phe Ile Leu Val Pro Gly Ile Asp Val Pro Phe His Ser Arg 1555 1560 1565 Val Leu Arg Val Gly Val Ala Glu Phe Arg Arg Ser Leu Asp Arg Val 1570 1575 1580 Met Pro Arg Asp Ala Asp Pro Asp Leu Ile Ile Gly Arg Tyr Ile Pro 1585 1590 1595 1600 Asn Leu Val Pro Arg Leu Phe Thr Leu Asp Arg Asp Phe Ile Gln Glu 1605 1610 1615 Ile Arg Asp Leu Val Pro Ala Glu Pro Leu Asp Glu Ile Leu Ala Asp 1620 1625 1630 Tyr Asp Thr Trp Leu Arg Glu Arg Pro Arg Glu Met Ala Arg Thr Val 1635 1640 1645 Phe Ile Glu Leu Leu Ala Trp Gln Phe Ala Ser Pro Val Arg Trp Ile 1650 1655 1660 Glu Thr Gln Asp Leu Leu Phe Ile Glu Glu Ala Ala Gly Gly Leu Gly 1665 1670 1675 1680 Val Glu Arg Phe Val Glu Ile Gly Val Lys Ser Ser Pro Thr Val Ala 1685 1690 1695 Gly Leu Ala Thr Asn Thr Leu Lys Leu Pro Glu Tyr Ala His Ser Thr 1700 1705 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Mycobacterium bovis <400> 15 gtgccgatcg ccccatcgac ctactacgac cacatcaacc gggagcccag ccgccgcgag 60 ctgcgcgatg gcgaactcaa ggagcacatc agccgcgtcc acgccgccaa ctacggtgtt 120 tacggtgccc gcaaagtgtg gctaaccctg aaccgtgagg gcatcgaggt ggccagatgc 180 accgtcgaac ggctgatgac caaactcggc ctgtccggga ccacccgcgg caaagcccgc 240 aggaccacga tcgctgatcc ggccacagcc cgtcccgccg atctcgtcca gcgccgcttc 300 ggaccaccag cacctaaccg gctgtgggta gcagacctca cctatgtgtc gacctgggca 360 gggttcgcct acgtggcctt tgtcaccgac gcctacgctc gcaggatcct gggctggcgg 420 gtcgcttcca cgatggccac ctccatggtc ctcgacgcga tcgagcaagc catctggacc 480 cgccaacaag aaggcgtact cgacctgaaa gacgttatcc accatacgga taggggatct 540 cagtacacat cgatccggtt cagcgagcgg ctcgccgagg caggcatcca accgtcggtc 600 ggagcggtcg gaagctccta tgacaatgca ctagccgaga cgatcaacgg cctatacaag 660 accgagctga tcaaacccgg caagccctgg cggtccatcg aggatgtcga gttggccacc 720 gcgcgctggg tcgactggtt caaccatcgc cgcctctacc agtactgcgg cgacgtcccg 780 ccggtcgaac tcgaggctgc ctactacgct caacgccaga gaccagccgc cggctga 837 <210> 16 <211> 1248 <212> DNA <213> IS1081 (Mb2540c) of Mycobacterium bovis <400> 16 atgacctctt ctcatcttat cgacaccgag cagcttctgg ctgaccaact cgcacaggcg 60 agcccggatc tgctgcgcgg gctgctctcg acgttcatcg ccgccttgat gggggctgaa 120 gccgacgccc tgtgcggggc gggctaccgc gaacgcagcg atgagcggtc caatcagcgc 180 aacggctacc gccaccgtga tttcgacacc cgtgccgcaa ccatcgacgt cgcgatcccc 240 aagctgcgcc agggcagcta tttcccggac tggctgctgc agcgccgcaa gcgagctgaa 300 cgcgcactga ccagcgtggt ggcgacctgc tacctgctgg gagtatccac tcgccggatg 360 gagcgcctgg tcgaaacact tggtgtgaca aagctttcca agtcgcaagt gtcgatcatg 420 gccaaagagc tcgacgaagc cgtagaggcg tttcggaccc gcccgctcga tgccggcccg 480 tataccttcc tcgccgccga cgccctggtg ctcaaggtgc gcgaggcagg ccgcgtcgtc 540 ggagtgcaca ccttgatcgc caccggcgtc aacgccgagg gctaccgaga gatcctgggc 600 atccaggtca cctccgccga ggacggggcc ggctggctgg cgttcttccg cgacctggtc 660 gcccgcggcc tgtccggggt cgcgctggtc accagcgacg cccacgccgg cctggtggcc 720 gcgatcggcg ccaccctgcc cgcagcggcc tggcagcgct gcagaaccca ctacgcagcc 780 aatctgatgg cagccacccc gaagccctcc tggccgtggg tgcgcaccct gctgcactcc 840 atctacgacc agcccgacgc cgaatcagtt gttgcccaat atgatcgggt actcgacgct 900 ctgaccgaca aactccccgc ggtggccgag cacctcgaca ccgcccgcac cgacctgctg 960 gcgttcaccg ccttccccaa gcagatctgg cgccaaatct ggtccaacaa cccccaggaa 1020 cgcctcaacc gagaggtacg acgccgaacc gacgtcgtgg gcatcttccc cgaccgcgcc 1080 tcgatcatcc gcctcgtcgg agccgtcctc gccgaacaac acgacgaatg gatcgaagga 1140 cggcgctacc tgggcctcga ggtcctcacc cgagcccgag cagcactgac cagcaccgaa 1200 gaacccgcca agcagcaaac caccaacacc ccagcactga ccacctag 1248 <210> 17 <211> 217 <212> PRT <213> CFP21 protein of Mycobacterium bovis <400> 17 Met Thr Pro Arg Ser Leu Val Arg Ile Val Gly Val Val Val Ala Thr 1 5 10 15 Thr Leu Ala Leu Val Ser Ala Pro Ala Gly Gly Arg Ala Ala His Ala 20 25 30 Asp Pro Cys Ser Asp Ile Ala Val Val Phe Ala Arg Gly Thr His Gln 35 40 45 Ala Ser Gly Leu Gly Asp Val Gly Glu Ala Phe Val Asp Ser Leu Thr 50 55 60 Ser Gln Val Gly Gly Arg Ser Ile Gly Val Tyr Ala Val Asn Tyr Pro 65 70 75 80 Ala Ser Asp Asp Tyr Arg Ala Ser Ala Ser Asn Gly Ser Asp Asp Ala 85 90 95 Ser Ala His Ile Gln Arg Thr Val Ala Ser Cys Pro Asn Thr Arg Ile 100 105 110 Val Leu Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Thr Val Ile Asp Leu Ser Thr 115 120 125 Ser Ala Met Pro Pro Ala Val Ala Asp His Val Ala Ala Val Ala Leu 130 135 140 Phe Gly Glu Pro Ser Ser Gly Phe Ser Ser Met Leu Trp Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ser Leu Pro Thr Ile Gly Pro Leu Tyr Ser Ser Lys Thr Ile Asn Leu 165 170 175 Cys Ala Pro Asp Asp Pro Ile Cys Thr Gly Gly Gly Asn Ile Met Ala 180 185 190 His Val Ser Tyr Val Gln Ser Gly Met Thr Ser Gln Ala Ala Thr Phe 195 200 205 Ala Ala Asn Arg Leu Asp His Ala Gly 210 215 <210> 18 <211> 105 <212> PRT <213> Chorismate mutase of Mycobacterium bovis <400> 18 Met Arg Pro Glu Pro Pro His His Glu Asn Ala Glu Leu Ala Ala Met 1 5 10 15 Asn Leu Glu Met Leu Glu Ser Gln Pro Val Pro Glu Ile Asp Thr Leu 20 25 30 Arg Glu Glu Ile Asp Arg Leu Asp Ala Glu Ile Leu Ala Leu Val Lys 35 40 45 Arg Arg Ala Glu Val Ser Lys Ala Ile Gly Lys Ala Arg Met Ala Ser 50 55 60 Gly Gly Thr Arg Leu Val His Ser Arg Glu Met Lys Val Ile Glu Arg 65 70 75 80 Tyr Ser Glu Leu Gly Pro Asp Gly Lys Asp Leu Ala Ile Leu Leu Leu 85 90 95 Arg Leu Gly Arg Gly Arg Leu Gly His 100 105 <210> 19 <211> 539 <212> PRT <213> GroEL protein of Mycobacterium bovis <400> 19 Met Ser Lys Leu Ile Glu Tyr Asp Glu Thr Ala Arg Arg Ala Met Glu 1 5 10 15 Val Gly Met Asp Lys Leu Ala Asp Thr Val Arg Val Thr Leu Gly Pro 20 25 30 Arg Gly Arg His Val Val Leu Ala Lys Ala Phe Gly Gly Pro Thr Val 35 40 45 Thr Asn Asp Gly Val Thr Val Ala Arg Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro 50 55 60 Phe Glu Asp Leu Gly Ala Gln Leu Val Lys Ser Val Ala Thr Lys Thr 65 70 75 80 Asn Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Ile Leu Ala Gln 85 90 95 Ala Leu Ile Lys Gly Gly Leu Arg Leu Val Ala Ala Gly Val Asn Pro 100 105 110 Ile Ala Leu Gly Val Gly Ile Gly Lys Ala Ala Asp Ala Val Ser Glu 115 120 125 Ala Leu Leu Ala Ser Ala Thr Pro Val Ser Gly Lys Thr Gly Ile Ala 130 135 140 Gln Val Ala Thr Val Ser Ser Arg Asp Glu Gln Ile Gly Asp Leu Val 145 150 155 160 Gly Glu Ala Met Ser Lys Val Gly His Asp Gly Val Val Ser Val Glu 165 170 175 Glu Ser Ser Thr Leu Gly Thr Glu Leu Glu Phe Thr Glu Gly Ile Gly 180 185 190 Phe Asp Lys Gly Phe Leu Ser Ala Tyr Phe Val Thr Asp Phe Asp Asn 195 200 205 Gln Gln Ala Val Leu Glu Asp Ala Leu Ile Leu Leu His Gln Asp Lys 210 215 220 Ile Ser Ser Leu Pro Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ala Gly 225 230 235 240 Thr Gly Lys Pro Leu Leu Ile Val Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala 245 250 255 Leu Ala Thr Leu Val Val Asn Ala Ile Arg Lys Thr Leu Lys Ala Val 260 265 270 Ala Val Lys Gly Pro Tyr Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Phe Leu Glu 275 280 285 Asp Leu Ala Val Val Thr Gly Gly Gln Val Val Asn Pro Asp Ala Gly 290 295 300 Met Val Leu Arg Glu Val Gly Leu Glu Val Leu Gly Ser Ala Arg Arg 305 310 315 320 Val Val Val Ser Lys Asp Asp Thr Val Ile Val Asp Gly Gly Gly Thr 325 330 335 Ala Glu Ala Val Ala Asn Arg Ala Lys His Leu Arg Ala Glu Ile Asp 340 345 350 Lys Ser Asp Ser Asp Trp Asp Arg Glu Lys Leu Gly Glu Arg Leu Ala 355 360 365 Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Val Gly Ala Ala Thr Glu 370 375 380 Thr Ala Leu Lys Glu Arg Lys Glu Ser Val Glu Asp Ala Val Ala Ala 385 390 395 400 Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Pro Gly Gly Gly Ala Ser 405 410 415 Leu Ile His Gln Ala Arg Lys Ala Leu Thr Glu Leu Arg Ala Ser Leu 420 425 430 Thr Gly Asp Glu Val Leu Gly Val Asp Val Phe Ser Glu Ala Leu Ala 435 440 445 Ala Pro Leu Phe Trp Ile Ala Ala Asn Ala Gly Leu Asp Gly Ser Val 450 455 460 Val Val Asn Lys Val Ser Glu Leu Pro Ala Gly His Gly Leu Asn Val 465 470 475 480 Asn Thr Leu Ser Tyr Gly Asp Leu Ala Ala Asp Gly Val Ile Asp Pro 485 490 495 Val Lys Val Thr Arg Ser Ala Val Leu Asn Ala Ser Ser Val Ala Arg 500 505 510 Met Val Leu Thr Thr Glu Thr Val Val Val Asp Lys Pro Ala Lys Ala 515 520 525 Glu Asp His Asp His His His Gly His Ala His 530 535 <210> 20 <211> 355 <212> PRT <213> PepA protein of Mycobacterium bovis <400> 20 Met Ser Asn Ser Arg Arg Arg Ser Leu Arg Trp Ser Trp Leu Leu Ser 1 5 10 15 Val Leu Ala Ala Val Gly Leu Gly Leu Ala Thr Ala Pro Ala Gln Ala 20 25 30 Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gln Asp Arg Phe Ala Asp Phe Pro Ala Leu 35 40 45 Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Val Ala Gln Val Gly Pro Gln Val Val 50 55 60 Asn Ile Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Val Gly Ala Gly Thr 65 70 75 80 Gly Ile Val Ile Asp Pro Asn Gly Val Val Leu Thr Asn Asn His Val 85 90 95 Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala Phe Ser Val Gly Ser Gly Gln 100 105 110 Thr Tyr Gly Val Asp Val Val Gly Tyr Asp Arg Thr Gln Asp Val Ala 115 120 125 Val Leu Gln Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu Pro Ser Ala Ala Ile Gly 130 135 140 Gly Gly Val Ala Val Gly Glu Pro Val Val Ala Met Gly Asn Ser Gly 145 150 155 160 Gly Gln Gly Gly Thr Pro Arg Ala Val Pro Gly Arg Val Val Ala Leu 165 170 175 Gly Gln Thr Val Gln Ala Ser Asp Ser Leu Thr Gly Ala Glu Glu Thr 180 185 190 Leu Asn Gly Leu Ile Gln Phe Asp Ala Ala Ile Gln Pro Gly Asp Ser 195 200 205 Gly Gly Pro Val Val Asn Gly Leu Gly Gln Val Val Gly Met Asn Thr 210 215 220 Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly Phe Ala 225 230 235 240 Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile Arg Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Ser Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu Gly Leu 260 265 270 Gly Val Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg Val Val 275 280 285 Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile 290 295 300 Thr Ala Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met Ala Asp 305 310 315 320 Ala Leu Asn Gly His His Pro Gly Asp Val Ile Ser Val Thr Trp Gln 325 330 335 Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala Glu Gly 340 345 350 Pro Pro Ala 355 <210> 21 <211> 318 <212> PRT <213> FixB protein of Mycobacterium bovis <400> 21 Met Ala Glu Val Leu Val Leu Val Glu His Ala Glu Gly Ala Leu Lys 1 5 10 15 Lys Val Ser Ala Glu Leu Ile Thr Ala Ala Arg Ala Leu Gly Glu Pro 20 25 30 Ala Ala Val Val Val Gly Val Pro Gly Thr Ala Ala Pro Leu Val Asp 35 40 45 Gly Leu Lys Ala Ala Gly Ala Ala Lys Ile Tyr Val Ala Glu Ser Asp 50 55 60 Leu Val Asp Lys Tyr Leu Ile Thr Pro Ala Val Asp Val Leu Ala Gly 65 70 75 80 Leu Ala Glu Ser Ser Ala Pro Ala Gly Val Leu Ile Ala Ala Thr Ala 85 90 95 Asp Gly Lys Glu Ile Ala Gly Arg Leu Ala Ala Arg Ile Gly Ser Gly 100 105 110 Leu Leu Val Asp Val Val Asp Val Arg Glu Gly Gly Val Gly Val His 115 120 125 Ser Ile Phe Gly Gly Ala Phe Thr Val Glu Ala Gln Ala Asn Gly Asp 130 135 140 Thr Pro Val Ile Thr Val Arg Ala Gly Ala Val Glu Ala Glu Pro Ala 145 150 155 160 Ala Gly Ala Gly Glu Gln Val Ser Val Glu Val Pro Ala Ala Ala Glu 165 170 175 Asn Ala Ala Arg Ile Thr Ala Arg Glu Pro Ala Val Ala Gly Asp Arg 180 185 190 Pro Glu Leu Thr Glu Ala Thr Ile Val Val Ala Gly Gly Arg Gly Val 195 200 205 Gly Ser Ala Glu Asn Phe Ser Val Val Glu Ala Leu Ala Asp Ser Leu 210 215 220 Gly Ala Ala Val Gly Ala Ser Arg Ala Ala Val Asp Ser Gly Tyr Tyr 225 230 235 240 Pro Gly Gln Phe Gln Val Gly Gln Thr Gly Lys Thr Val Ser Pro Gln 245 250 255 Leu Tyr Ile Ala Leu Gly Ile Ser Gly Ala Ile Gln His Arg Ala Gly 260 265 270 Met Gln Thr Ser Lys Thr Ile Val Ala Val Asn Lys Asp Glu Glu Ala 275 280 285 Pro Ile Phe Glu Ile Ala Asp Tyr Gly Val Val Gly Asp Leu Phe Lys 290 295 300 Val Ala Pro Gln Leu Thr Glu Val Ile Lys Ala Arg Lys Gly 305 310 315 <210> 22 <211> 182 <212> PRT <213> PpiA protein of Mycobacterium bovis <400> 22 Met Ala Asp Cys Asp Ser Val Thr Asn Ser Pro Leu Ala Thr Ala Thr 1 5 10 15 Ala Thr Leu His Thr Asn Arg Gly Asp Ile Lys Ile Ala Leu Phe Gly 20 25 30 Asn His Ala Pro Lys Thr Val Ala Asn Phe Val Gly Leu Ala Gln Gly 35 40 45 Thr Lys Asp Tyr Ser Thr Gln Asn Ala Ser Gly Gly Pro Ser Gly Pro 50 55 60 Phe Tyr Asp Gly Ala Val Phe His Arg Val Ile Gln Gly Phe Met Ile 65 70 75 80 Gln Gly Gly Asp Pro Thr Gly Thr Gly Arg Gly Gly Pro Gly Tyr Lys 85 90 95 Phe Ala Asp Glu Phe His Pro Glu Leu Gln Phe Asp Lys Pro Tyr Leu 100 105 110 Leu Ala Met Ala Asn Ala Gly Pro Gly Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe 115 120 125 Ile Thr Val Gly Lys Thr Pro His Leu Asn Arg Arg His Thr Ile Phe 130 135 140 Gly Glu Val Ile Asp Ala Glu Ser Gln Arg Val Val Glu Ala Ile Ser 145 150 155 160 Lys Thr Ala Thr Asp Gly Asn Asp Arg Pro Thr Asp Pro Val Val Ile 165 170 175 Glu Ser Ile Thr Ile Ser 180 <210> 23 <211> 233 <212> PRT <213> Lppx protein of Mycobacterium bovis <400> 23 Met Asn Asp Gly Lys Arg Ala Val Thr Ser Ala Val Leu Val Val Leu 1 5 10 15 Gly Ala Cys Leu Ala Leu Trp Leu Ser Gly Cys Ser Ser Pro Lys Pro 20 25 30 Asp Ala Glu Glu Gln Gly Val Pro Val Ser Pro Thr Ala Ser Asp Pro 35 40 45 Ala Leu Leu Ala Glu Ile Arg Gln Ser Leu Asp Ala Thr Lys Gly Leu 50 55 60 Thr Ser Val His Val Ala Val Arg Thr Thr Gly Lys Val Asp Ser Leu 65 70 75 80 Leu Gly Ile Thr Ser Ala Asp Val Asp Val Arg Ala Asn Pro Leu Ala 85 90 95 Ala Lys Gly Val Cys Thr Tyr Asn Asp Glu Gln Gly Val Pro Phe Arg 100 105 110 Val Gln Gly Asp Asn Ile Ser Val Lys Leu Phe Asp Asp Trp Ser Asn 115 120 125 Leu Gly Ser Ile Ser Glu Leu Ser Thr Ser Arg Val Leu Asp Pro Ala 130 135 140 Ala Gly Val Thr Gln Leu Leu Ser Gly Val Thr Asn Leu Gln Ala Gln 145 150 155 160 Gly Thr Glu Val Ile Asp Gly Ile Ser Thr Thr Lys Ile Thr Gly Thr 165 170 175 Ile Pro Ala Ser Ser Val Lys Met Leu Asp Pro Gly Ala Lys Ser Ala 180 185 190 Arg Pro Ala Thr Val Trp Ile Ala Gln Asp Gly Ser His His Leu Val 195 200 205 Arg Ala Ser Ile Asp Leu Gly Ser Gly Ser Ile Gln Leu Thr Gln Ser 210 215 220 Lys Trp Asn Glu Pro Val Asn Val Asp 225 230 <210> 24 <211> 164 <212> PRT <213> GreA protein of Mycobacterium bovis <400> 24 Met Thr Asp Thr Gln Val Thr Trp Leu Thr Gln Glu Ser His Asp Arg 1 5 10 15 Leu Lys Ala Glu Leu Asp Gln Leu Ile Ala Asn Arg Pro Val Ile Ala 20 25 30 Ala Glu Ile Asn Asp Arg Arg Glu Glu Gly Asp Leu Arg Glu Asn Gly 35 40 45 Gly Tyr His Ala Ala Arg Glu Glu Gln Gly Gln Gln Glu Ala Arg Ile 50 55 60 Arg Gln Leu Gln Asp Leu Leu Ser Asn Ala Lys Val Gly Glu Ala Pro 65 70 75 80 Lys Gln Ser Gly Val Ala Leu Pro Gly Ser Val Val Lys Val Tyr Tyr 85 90 95 Asn Gly Asp Lys Ser Asp Ser Glu Thr Phe Leu Ile Ala Thr Arg Gln 100 105 110 Glu Gly Val Ser Asp Gly Lys Leu Glu Val Tyr Ser Pro Asn Ser Pro 115 120 125 Leu Gly Gly Ala Leu Ile Asp Ala Lys Val Gly Glu Thr Arg Ser Tyr 130 135 140 Thr Val Pro Asn Gly Ser Thr Val Ser Val Thr Leu Val Ser Ala Glu 145 150 155 160 Pro Tyr His Ser <210> 25 <211> 100 <212> PRT <213> CFP10 protein of Mycobacterium bovis <400> 25 Met Ala Glu Met Lys Thr Asp Ala Ala Thr Leu Ala Gln Glu Ala Gly 1 5 10 15 Asn Phe Glu Arg Ile Ser Gly Asp Leu Lys Thr Gln Ile Asp Gln Val 20 25 30 Glu Ser Thr Ala Gly Ser Leu Gln Gly Gln Trp Arg Gly Ala Ala Gly 35 40 45 Thr Ala Ala Gln Ala Ala Val Val Arg Phe Gln Glu Ala Ala Asn Lys 50 55 60 Gln Lys Gln Glu Leu Asp Glu Ile Ser Thr Asn Ile Arg Gln Ala Gly 65 70 75 80 Val Gln Tyr Ser Arg Ala Asp Glu Glu Gln Gln Gln Ala Leu Ser Ser 85 90 95 Gln Met Gly Phe 100 <210> 26 <211> 325 <212> PRT <213> MPT32 protein of Mycobacterium bovis <400> 26 Met His Gln Val Asp Pro Asn Leu Thr Arg Arg Lys Gly Arg Leu Ala 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ile Ala Ala Met Ala Ser Ala Ser Leu Val Thr Val Ala 20 25 30 Val Pro Ala Thr Ala Asn Ala Asp Pro Glu Pro Ala Pro Pro Val Pro 35 40 45 Thr Thr Ala Ala Ser Pro Pro Ser Thr Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro 50 55 60 Ala Thr Pro Val Ala Pro Pro Pro Pro Ala Ala Ala Asn Thr Pro Asn 65 70 75 80 Ala Gln Pro Gly Asp Pro Asn Ala Ala Pro Pro Pro Ala Asp Pro Asn 85 90 95 Ala Pro Pro Pro Pro Val Ile Ala Pro Asn Ala Pro Gln Pro Val Arg 100 105 110 Ile Asp Asn Pro Val Gly Gly Phe Ser Phe Ala Leu Pro Ala Gly Trp 115 120 125 Val Glu Ser Asp Ala Ala His Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Leu Leu Ser 130 135 140 Lys Thr Thr Gly Asp Pro Pro Phe Pro Gly Gln Pro Pro Pro Val Ala 145 150 155 160 Asn Asp Thr Arg Ile Val Leu Gly Arg Leu Asp Gln Lys Leu Tyr Ala 165 170 175 Ser Ala Glu Ala Thr Asp Ser Lys Ala Ala Ala Arg Leu Gly Ser Asp 180 185 190 Met Gly Glu Phe Tyr Met Pro Tyr Pro Gly Thr Arg Ile Asn Gln Glu 195 200 205 Thr Val Ser Leu Asp Ala Asn Gly Val Ser Gly Ser Ala Ser Tyr Tyr 210 215 220 Glu Val Lys Phe Ser Asp Pro Ser Lys Pro Asn Gly Gln Ile Trp Thr 225 230 235 240 Gly Val Ile Gly Ser Pro Ala Ala Asn Ala Pro Asp Ala Gly Pro Pro 245 250 255 Gln Arg Trp Phe Val Val Trp Leu Gly Thr Ala Asn Asn Pro Val Asp 260 265 270 Lys Gly Ala Ala Lys Ala Leu Ala Glu Ser Ile Arg Pro Leu Val Ala 275 280 285 Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Ala Pro Ala Glu Pro Ala Pro Ala Pro 290 295 300 Ala Pro Ala Gly Glu Val Ala Pro Thr Pro Thr Thr Pro Thr Pro Gln 305 310 315 320 Arg Thr Leu Pro Ala 325 <210> 27 <211> 94 <212> PRT <213> EsxN protein of Mycobacterium bovis <400> 27 Met Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp Val Asp Ala His Gly Ala Met 1 5 10 15 Ile Arg Ala Gln Ala Ala Ser Leu Glu Ala Glu His Gln Ala Ile Val 20 25 30 Arg Asp Val Leu Ala Ala Gly Asp Phe Trp Gly Gly Ala Gly Ser Val 35 40 45 Ala Cys Gln Glu Phe Ile Thr Gln Leu Gly Arg Asn Phe Gln Val Ile 50 55 60 Tyr Glu Gln Ala Asn Ala His Gly Gln Lys Val Gln Ala Ala Gly Asn 65 70 75 80 Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser Ser Trp Ala 85 90 <210> 28 <211> 154 <212> PRT <213> Mb3713c protein of Mycobacterium bovis <400> 28 Met Ala Glu Leu Lys Ser Gln Leu Arg Ser Asp Leu Thr Gln Ala Met 1 5 10 15 Lys Thr Gln Asp Lys Leu Arg Thr Ala Thr Ile Arg Met Leu Leu Ala 20 25 30 Ala Ile Gln Thr Glu Glu Val Ser Gly Lys Gln Ala Arg Glu Leu Ser 35 40 45 Asp Asp Glu Val Ile Lys Val Leu Ala Arg Glu Ser Arg Lys Arg Gly 50 55 60 Glu Ala Ala Glu Ile Tyr Thr Gln Asn Gly Arg Gly Glu Leu Ala Ala 65 70 75 80 Thr Glu His Ala Glu Ala Arg Ile Ile Asp Glu Tyr Leu Pro Thr Pro 85 90 95 Leu Thr Glu Gly Glu Leu Ala Asp Val Ala Asp Thr Ala Ile Ala Glu 100 105 110 Val Ala Glu Glu Leu Gly His Arg Pro Ser Met Lys Gln Met Gly Leu 115 120 125 Val Met Lys Ala Ala Thr Val Ile Ala Ala Gly Lys Ala Asp Gly Ala 130 135 140 Arg Leu Ser Ala Ala Val Lys Glu Arg Leu 145 150

Claims (3)

  1. 서열번호 1 내지 10으로 표현되는 MPB70, MPB83, MPT64, Fas, Smc, Nrp, RpoC, 유전자전위효소(Transposase), LeuA 및 MbtE로 구성된 면역특이단백질 항원을 포함하는 우결핵 특이 효소면역측정 혈청진단용 키트.
  2. 삭제
  3. 1) 서열번호 1 내지 10으로 표현되는 MPB70, MPB83, MPT64, Fas, Smc, Nrp, RpoC, 유전자전위효소(Transposase), LeuA 및 MbtE로 구성된 면역특이단백질 항원을 플레이트에 코팅한 후 젤라틴을 처리하여 항원 표면을 봉쇄하는 단계;
    2) 우결핵 특이 항체를 처리하여 플레이트에 코팅된 면역특이단백질 항원과 특이 결합시키는 단계; 및
    3) 상기 특이결합된 항체의 양을 측정하기 위하여 퍼옥시다아제가 부착된 2차 항체를 첨가한 후 발색반응을 관찰하는 단계;
    를 거치는 우결핵의 진단방법.
KR1020070118743A 2007-11-20 2007-11-20 면역특이단백질 항원을 사용하는 우결핵 특이 효소면역진단키트 및 이를 이용한 우결핵 진단방법 KR100951057B1 (ko)

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