KR20040079070A

KR20040079070A - 결핵균 특이적인 단백질

Info

Publication number: KR20040079070A
Application number: KR1020030013985A
Authority: KR
Inventors: 김유삼; 조상래; 조진원; 윤종복; 배길한; 박영일; 김승철; 어형진; 김정진; 김지수; 조민래; 이혜영; 장형진
Original assignee: (주)프로테옴텍
Priority date: 2003-03-06
Filing date: 2003-03-06
Publication date: 2004-09-14
Also published as: KR100566929B1

Abstract

본 발명은 결핵균에서 발견되는 신규한 단백질 Rv3369, 전기 단백질을 암호화하는 유전자, 전기 유전자를 포함하는 발현벡터, 전기 발현벡터로 형질전환된 미생물, 전기 미생물을 이용하여 전기 단백질 Rv3369를 제조하는 방법 및 전기 단백질 Rv3369을 포함하는 결핵진단키트에 관한 것이다. 본 발명의 Rv3369는 결핵환자에 대한 민감도와 특이도가 우수하므로, 결핵의 효과적인 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

결핵균 특이적인 단백질{Mycobacterium tuberculosis Specific Protein}

본 발명은 결핵균 특이적인 단백질에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 결핵균에서 발견되는 신규한 단백질 Rv3369, 전기 단백질을 암호화하는 유전자, 전기 유전자를 포함하는 발현벡터, 전기 발현벡터로 형질전환된 미생물, 전기 미생물을 이용하여 전기 단백질 Rv3369를 제조하는 방법 및 전기 단백질 Rv3369을 포함하는 결핵진단키트에 관한 것이다.

만성 감염성 질환인 결핵의 병인은 마이코박테리움 튜버큘로시스(Myco-bacterium tuberculosis)이다. 결핵은 개발도상국의 주요 질환으로서 전세계적으로 연간 8백만 명이 발병하고, 최근에는 AIDS 환자에게서 결핵의 발병률이 높은 것으로 나타나, AIDS가 결핵의 새로운 유포원으로 알려지고 있어 그 심각성이 더해지고 있다.

결핵균은 감염 후 일정 기간 동안 잠복기를 거친 후 발병되거나 또는 잠복기 없이 급성으로 발병하여 폐의 염증과 천식을 동반하는 합병증을 일으켜 감염자를 사망시킨다. 결핵균 단순 보균자의 경우, 자각증상이 없으므로 결핵을 타인에게 쉽게 전염시킬 수 있고, 발병을 감지한 후에도 장기간의 치료기간이 요구되므로, 치료기간 중에 결핵균의 변형체에 의한 2차 감염이 발생될 가능성이 높아, 결핵의 예방 및 치료에 큰 어려움이 있는 실정이다.

한편, 결핵의 감염을 예방하기 위해서, 백신으로 마이코박테리움 보비스(M. bovis)의 비독성 생균주인 바실러스 칼메트-구에린(BCG)이 통상적으로 사용되고 있지만, 전기 백신의 안정성과 유효성의 문제로 논란이 되고 있어, 미국과 같은 몇몇 국가에서는 백신으로서의 사용이 금지된 실정이다.

현재, 결핵균의 감염을 진단하는 방법 중, 가장 일반적으로 사용되는 방법은 튜베르쿨린 PPD(protein-purified derivative)라는 항원을 피검사자의 피부내에 노출시키는 방법이다. 전기 항원을 주입하고 48시간 내지 72시간 후에 항원 특이적인 T 세포의 반응으로 주입 부위에 감지할 만한 경변이 발생하면, 이는 마이코박테리움 항원에 이미 노출 되었음을 나타낸다. 그러나, 이 방법에서 사용되는 항원은 다른 병인성 또는 기타 죽은 물체에 기생하는 마이코박테리아와의 교차 반응성 때문에 특이성이 떨어진다는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 여러가지 방법이 연구되고 있으나, 아직까지는 별다른 실효를 거두지 못하고 있다.

따라서, 결핵을 보다 효과적으로 진단할 수 있는 방법을 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 결핵을 보다 효과적으로 진단할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구노력한 결과, 병원성 결핵균에서는 특이적으로 나타나지만 비병원성 결핵균에서는 나타나지 않는 특이한 단백질인 Rv3369를 이용하면, 결핵 환자를 효과적으로 구별할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 첫 번째 목적은 결핵균 특이적인 단백질 Rv3369을 제공하는것이다.

본 발명의 두 번째 목적은 전기 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.

본 발명의 세 번째 목적은 전기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 네 번째 목적은 전기 발현벡터로 형질전환된 미생물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다섯 번째 목적은 전기 미생물을 이용하여, 단백질 Rv3369를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 여섯 번째 목적은 전기 단백질 Rv3369을 포함하는 결핵진단키트를 제공하는 것이다.

도 1a는 병원성 결핵균(K strain)을 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

도 1b는 병원성 결핵균(CDC1551 strain)을 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

도 1c는 비병원성 결핵균(H37Rv strain)을 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.

도 2a는 비병원성 결핵균(H37Rv strain)을 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 부분확대 사진이다.

도 2b는 병원성 결핵균(K strain)을 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 부분확대 사진이다.

도 3은 Rv3369의 질량분석결과를 나타내는 그래프이다.

도 4는 pRSETrv3369의 유전자 지도이다.

본 발명의 결핵균 특이적인 단백질 Rv3369은 145개의 아미노산으로 구성되고(서열번호 1), 전기 단백질을 암호화하는 유전자 rv3369는 435bp의 염기서열을 갖는다(서열번호 2). 전기 유전자 rv3369를 발현시키기 위한 발현벡터가 특별히 제한되지는 않으나, pRSETrv3369를 사용함이 바람직하고, 전기 발현벡터가 도입되는 미생물이 특별히 제한되지는 않으나, 대장균을 이용함이 바람직하다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하고자 한다.

우선, 본 발명자들은 분비성 단백질로서 특이성과 민감성이 우수한 항원을 얻기 위하여, 병원성 결핵균과 비병원성 결핵균을 대상으로 하여 2차원 젤 전기 영동법을 실시하였다. 그 결과, 비병원성 결핵균에서는 검출되지 않지만, 병원성 결핵균에서는 pH 4.5 내지 5.5, MW 10 내지 20kDa 위치에 존재하는 단백질을 검출할 수 있었다. 전기 검출된 단백질을 분리하여 MALDI-TOF Mass spectrometer 와 ESI-Mass spectrometer로 분석한 결과, 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)에서 기인한 단백질임을 확인할 수 있었다. 이에, 본 발명자들은 전기 단백질을 "Rv3369"라 명명하였다.

Rv3369를 대량으로 제조하기 위하여, 전기 단백질을 암호화하는 유전자rv3369를 수득하고, 전기 유전자를 pRSET에 삽입시켜서, 발현벡터인 pRSETrv3369를 작제하였으며, 이를 이용하여 대장균 BL21(DE3)을 형질전환시켜 재조합 대장균을 제조하였다. 전기 재조합 대장균을 배양할 경우, 전술한 결핵균 특이적인 Rv3369 를 대량으로 생산할 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명자들은 전기 형질전환된 대장균을 '대장균 3369(pRSET/BL21)(Escherichia coli3369(pRSET/BL21))'이라 명명하고, 이를 2003년 1 월 29 일자로 국제기탁기관인 한국종균협회(KFCC) 부설, 한국미생물 보존센터(KCCM, 대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩 소재)에 기탁번호 'KCCM 10462 '로 기탁하였다.

전기 Rv3369를 이용하여, 결핵감염 진단키트를 제조할 수도 있다. 본 발명의 결핵진단 키트는 Rv3369를 흡착시킨 플레이트, 반응검출용 디텍터, 디텍터용 기질액, 양성 대조혈청, 음성 대조혈청, 검체 희석액 및 세척액을 포함한다: 이때, 플레이트가 특별히 제한되지는 않으나, 엘리사(ELISA)용 마이크로 플레이트를 사용함이 바람직하고, Rv3369의 흡착농도가 특별히 제한되지는 않으나, 4 내지 5ug/ml의 농도로 균일하게 흡착시킴이 바람직한데, Rv3369의 흡착농도가 4ug/ml 이하일 경우에는, 민감도 및 특이도가 낮고, 엘리사용 마이크로 플레이트에는 5ug/ml의 농도이상으로 흡착시킬 수 없기 때문에, 4 내지 5ug/ml 이외의 농도는 바람직하지 않다. 반응 검출용 디텍터 및 디텍터용 기질액이 특별히 제한되지는 않으나, 산양 항-인간 IgG-퍼옥시다제를 사용함이 바람직하고, 이에 대한 기질액으로는 테트라메틸 벤지딘과 과산화수소수를 포함하는 용액을 사용함이 바람직하다. 양성 대조혈청과 음성 대조혈청은 각각 결핵환자의 혈청과 정상인의 혈청을 사용함이 바람직하다. 검체 희석액이 특별히 제한되는 것은 아니나, 소혈청, 산양혈청, 극 미량의 계면활성제, EDTA, 방부제 등을 함유하는 중성의 완충용액을 사용함이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20%(v/v)의 소혈청, 5%(v/v)의 산양혈청, 0.01%(v/v) 트리톤 X-100, 2mM EDTA 및 0.1%(w/v)의 질화 나트륨을 포함하는 중성 인산염 완충액을 사용한다. 세척액이 특별히 제한되지는 않으나, 계면활성제와 방부제를 포함하는 중성의 완충용액을 사용함이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.05%(v/v) 트윈20과 0.0005%(w/v) 티메로살(thimerosal)을 포함하는 중성의 인산염 완충액을 사용한다.

전기 결핵감염 진단키트에 검체를 가한 후, 얻어진 결과는 ELISA 판독기를이용하여 490nm에서 흡광도를 측정하여 결정함이 바람직한데, 판정기준은 양성 대조혈청과 음성 대조혈청을 검체로 사용하여 측정된 흡광도를 사용함이 바람직하다.

본 발명의 Rv3369를 이용할 경우, 결핵균의 감염을 보다 정확하게 구별할 수 있으므로, 결핵의 효과적인 진단에 사용할 수 있을 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 2차원 젤 전기 영동법에 의한 병원성 임상 결핵균들과 비병원성 실험 연구용 결핵균간의 분비성 단백질 분석

병원성 결핵균(M. tuberculosisK strain과 CDC1551 strain)과 비병원성 결핵균(M. tuberculosisH37Rv strain)을 동결건조하여 각 결핵균의 분말을 수득하였다. 전기 각 분말을 3ml의 3차 증류수에 용해시키고, 각 시료의 전체 단백질 농도가 150ug이 되도록 하여, SDS/DTT 용균 용액(0.3% SDS, 3% DTT, 50mM Tris/HCl, pH 8.0) 50ul와 혼합하고, 95℃에서 5분간 방치하였다. 이어, 액상화 용액(7M urea, 2M thiourea, 4% CHAPS, 40mM Tris-HCl, 0.002% bromophenolblue, 2mMtributylphosphine) 500ul를 첨가하고, 14000 rpm, 4℃에서 15분간 원심분리한 다음, 상층액 500ul를 취하여, 길이가 18cm, pH 4.5 내지 5.5인 고정화 pH 구배 스트립(pH gradient dry strip)에 적용하고, 100,000Vhr의 전기조건으로 아이소일렉트릭포커싱(isoelectricfocusing, IEF)을 수행하였다. 이어, TBP평형화 완충용액(0.2mM tributylphosphine, 6M urea, 2% SDS, 20% glycerol, 2.5% acrylamide, 375mM Tris, pH 8.8)에 침지하여 평형화시킨 다음, 14% 내지 16%의 농도 구배 SDS 전기영동용 젤(5X Tris(pH 8.8), 40% acrylamide, 50% glycerol, 10% SDS, 100mM sodium thiosulfate, 16% ammonium persulfate, TEMED)을 이용하여, 200mA의 전류로 12시간동안 전기영동하고, 질산은 염색방법으로 염색하였다(참조: 도 1a, 도 1b, 도 1c, 도 2a, 도 2b). 도 1a는 병원성 결핵균(K strain)을 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이고, 도 1b는 병원성 결핵균(CDC1551 strain)을 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이며, 도 1c는 비병원성 결핵균(H37Rv strain)을 2차원 전기영동한 결과를 나타내는 사진이고, 도 2a는 비병원성 결핵균(H37Rv strain)을 2차원 전기영동한 결과 중, pH 4.5 내지 5.5와 MW 13 내지 17kDa 부분을 나타내는 부분확대 사진이며, 도 2b는 병원성 결핵균(K strain)을 2차원 전기영동한 결과 중, pH 4.5 내지 5.5와 MW 13 내지 17kDa 부분을 나타내는 부분확대 사진이다.

상기 도 2a 내지 도 2b에서 보듯이, 16kDa의 단백질은 병원성 결핵균에는 존재하지만 비병원성 결핵균에서는 발견되지 않았으며, 이에 전기 단백질을 "Rv3369"라 명명하였다.

실시예 2: MALDI-TOF 분석법을 이용한 Rv3369 단백질의 분석

전기 실시예 1의 Rv3369의 질량패턴을 MALDI-TOF법으로 분석을 하였다. 전기 2차원 전기영동 젤에서 Rv3369를 적출하고, 탈색시키고, 증류수로 세척한 다음, 단백질 분해 용액(0.02ug trypsin/ml, 25mM ammonium carbonate) 8ul와 혼합하고, 37℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 추출용액(50% Acetonitrile, 0.1% Trifluoro acetic acid, 3차 증류수) 8ul과 혼합하였으며, 10분간 초음파를 처리하였다. 이어, 시료 1ul를 취하여 MALDI-TOF(Micromass사, UK)에 적용하였다. 분석 결과, Rv3369는 결핵균에 존재하는 단백질이 갖는 질량 패턴을 보여주었다.

실시예 3: 질량 분석법을 이용한 Rv3369 단백질의 분석

Rv3369의 아미노산 서열을 알아보기 위해, HPLC 질량분석기(HPLC ESI-Mass spectrometer)를 이용하여 분석하였다. 시료는 실시예 2의 MALDI-TOF 분석법에 적용된 것과 동일한 시료에 HPLC 전개용매(2% acetonitrile, 0.1% formic acid (v/v), 3차 증류수)를 4ul 혼합한 것을 사용하였다. 전기 시료를 HPLC 자동 시료 주입장치(auto sampler)를 이용하여 HPLC에 주입하고 질량분석을 수행하였다(HPLC, Agilent 1100 series; mass spectrometry, Finnigan LCQ DECA ion trap mass spectrometer, Thermo Quest, USA; peptide separation column, microbore reversephase column(C18)). 이때, 사용된 NSI 변수는 다음과 같다(spray voltage, 1.8Kv; capillary temperature, 200℃; capillary voltage, 34V; tube lens offset, 40V; electron multiplier, -60V). 이로부터 얻어진 질량분석 데이터 중에서 CID(collision-induced dissociation, ms/ms) 데이터는 Xcorr(cross correlation)의 수치가 2.0 이상이 되는 것과 δCn(delta normalized correlation)의 수치가 0.1 이상이 되는 것만을 선별하였다: 이때, Xcorr는 데이터 베이스화 되어있는 펩티드 서열과 분석 결과 얻어진 펩티드 서열간의 유사성을 나타내는 수치이고, δCn은 분석결과로부터 예상될 수 있는 데이터 베이스 상의 펩티드 서열 중에 가장 유사한 것과 그 다음으로 유사한 것의 펩티드 서열상의 차이의 정도를 나타내는 수치이다(참조: 도 3). 도 3은 Rv3369의 질량 분석결과를 나타내는 그래프로서, 도 3의 분석결과로부터 Rv3369가 결핵균에서 발견되는 145개의 아미노산 서열을 갖는 단백질임을 알 수 있었다(서열번호 1).

실시예 4: 유전자 재조합 기술을 이용한 Rv3369의 제조

전술한 바와 같이, 결핵균 특이적인 것으로 확인된 Rv3369를 대량으로 생산하기 위하여, 전기 Rv3369의 유전자를 클로닝하고, 발현벡터를 작제한 후, 전기 발현벡터로 형질전환된 대장균을 제조하였으며, 전기 대장균을 배양하고, 이로부터 Rv3369를 수득하였다.

실시예 4-1: Rv3369를 발현하는 발현벡터의 작제

결핵균(M. tuberculosis)의 염색체를 주형으로 하고, 프라이머 1: 5'-atgtgggcaggctaccgttgg-3'(서열번호 3)과 프라이머 2: 5'-gacgacgcccacgg gctga-3'(서열번호 4)를 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하여, Rv3369를 암호화하는 435bp의 유전자인rv3369를 수득하였다(서열번호 2). 이어, 전기 수득한rv3369를 대장균 발현 벡터인 pRSET에 도입하여, Rv3369를 발현하는 발현벡터를 작제하고, 이를 "pRSETrv3369"라 명명하였다(참조: 도 4).

실시예 4-2: 숙주의 형질전환 및 배양

전기 작제한 pRSETrv3369를 대장균 BL21(DE3)에 도입하여, 형질전환된 재조합 대장균을 제조하였다. 이어, 전기 형질전환된 재조합 대장균을 LB배지에 접종하여 37℃에서 18시간 동안 진탕 배양한 다음, 동일한 배지를 사용하여 100(v/v)배 희석하고, 2시간 동안 진탕 배양하여 600nm에서 흡광도가 약 0.6이 되게 하였다. 그런다음, IPTG를 1mM가 되게 첨가하고, 4시간 동안 추가적으로 배양하였다. 배양이 종료된 후, 배양액을 6,000rpm에서 10분간 원심 분리하여 대장균 침전물을 회수하였다.

실시예 4-3: Rv3369의 제조

전기 실시예 4-2에서 회수한 대장균 침전물을 초음파처리기로 파쇄하고, 원심분리하여 상등액을 수득한 후, Ni-겔 친화 크로마토그래피(affinity chromatography)에 적용하여, Rv3369를 제조하였다.

이에, 본 발명자들은 Rv3369를 제조할 수 있도록 형질전환된 대장균을 '대장균 3369(pRSET/BL21)(Escherichia coli3369(pRSET/BL21))'이라 명명하고, 이를 2003년 1 월 29 일자로 국제기탁기관인 한국종균협회(KFCC) 부설, 한국미생물 보존센터(KCCM, 대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 361-221 유림빌딩 소재)에 기탁번호 'KCCM 10462 '로 기탁하였다.

실시예 5: Rv3369 단백질의 IgG 항체에 대한 민감도 및 특이도 검사

Rv3369을 1ug/ml되게 50mM 탄산염 용액으로 희석하고, ELISA용 96웰 플레이트에 0.2ml씩 분주하여. 37℃에서 3시간동안 방치시켰다. 이어, 각 웰로부터 잔여 용액을 제거하고, 1%(w/v) 소혈청알부민(bovine serum albumin) 용액을 각 웰에 0.25ml씩 분주한 다음, 실온에서 2시간동안 방치시켰다.

양성 검체로는 진성 결핵으로 확인된 환자의 혈청을 사용하고, 음성 대조 검체로는 정상인의 혈청을 사용하였다. 전기 양성 및 음성 검체를 각각 20%(w/v)의 소혈청알부민과 0.05%(v/v) 트리톤 X-100를 포함하는 인산염 완충액(pH 7.0)으로100배 희석하고, 이를 각 웰에 200ul씩 분주한 후, 37℃에서 60분간 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 세척액(0.01%(v/v) 트윈20이 함유된 인산염 완충액, pH 7.0)으로 5회 세척하였다. 그런 다음, 고트 항-인간 IgG-페옥시다제(goat anti-human IgG-peroxidase)를 20%(v/v) 고트 혈청이 포함된 인산염 완충액에 10,000배 희석하여 각 웰에 200ul씩 넣고 37℃에서 60분간 반응시켰다.

반응이 완료된 후, 전기 세척액으로 각 웰을 5회 5회 세척하고 테트라메틸 벤지딘(tetramethyl benzidine)과 과산화수소가 함유된 기질액 0.2㎖/well을 넣고 실온에서 30분간 반응시켰다. 이때, Rv3369에 대한 항체가 존재하는 혈청을 반응시킨 웰은 푸른색을 나타내고, 4N H₂SO₄용액을 각 웰에 50ul씩 넣어 혼합하면 전기 반응이 정지되고 푸른색 반응물은 노란색으로 변한다. 그 발색정도를 ELISA 판독기로 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정한 결과, Rv3369는 음성 검체에 대하여는 낮은 흡광도(음성판정 검체)를 나타내고, 양성 대조군에 대해서는 높은 흡광도(양성판정 검체)를 나타냄을 알 수 있었다. 이때, 전체 음성 검체의 수에 대한 음성판정 검체의 수의 비율을 "특이도"라 정의하고, 전체 양성 검체의 수에 대한 양성 판정 검체의 수의 비율을 "민감도"라 정의하였으며, 상기 결과는, 본 발명의 Rv3369의 특이도와 민감도가 매우 높음을 나타낸다.

실시예 6: 항원으로 사용하기 위한 Rv3369의 최적 농도 결정

Rv3369가 항원으로서 엘리사법에서 최고 민감도 및 특이도를 보이는 최적 농도를 결정하기 위하여, 여러 가지 농도의 Rv3369 흡착 플레이트에 흡착시키고, 전기 실시예 5와 동일한 방법을 이용하여, 각 농도에 있어서의 특이도와 민감도를 측정한 후, 상호 비교하였다. 이때, Rv3369의 농도는 0.5, 1, 2, 3, 4 및 5㎍/ml를 사용하였다. 그 결과, 5㎍/ml의 농도로 흡착시켰을 때, 가장 높은 특이도와 민감도를 나타내었다.

한편, 결핵 진단용 항원으로서, 전기 Rv3369의 특이도 및 민감도를 종래에 사용되던 다른 항원과 비교하였다. 즉, 종래에 사용되던, UmaA1, FolK 및 Efp와 본 발명의 Rv3369를 사용하여 양성 검체와 음성 검체를 대상으로 민감도와 특이도를 측정하고, 비교하였다(참조: 표 1).

각 항원의 민감도 및 특이도의 비교

항원	민감도(%)	특이도(%)
Rv3369	86	98
UmaA1	71	99
FolK	21.3	91
Efp	74	95

상기 표 1에서 보듯이, 본 발명의 Rv3369는 우수한 특이도(98%)와 높은 민감도(86%)를 보였다. 또한, 공지된 결핵 진단용 항원보다 우수함을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 결핵균에서 발견되는 신규한 단백질 Rv3369, 전기 단백질을 암호화하는 유전자, 전기 유전자를 포함하는 발현벡터, 전기 발현벡터로 형질전환된 미생물, 전기 미생물을 이용하여 전기 단백질 Rv3369를 제조하는 방법 및 전기 단백질 Rv3369을 포함하는 결핵진단키트를 제공한다. 본 발명의 Rv3369는 결핵환자에 대한 민감도와 특이도가 우수하므로, 결핵의 효과적인 진단에 널리 활용될 수 있을 것이다.

<110> Proteomtech., Inc. <120> Mycobacterium tuberculosis Specific Protein <160> 4 <170> KopatentIn 1.6 <210> 1 <211> 144 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 1 Met Trp Ala Gly Tyr Arg Trp Ala Met Ser Val Glu Leu Thr Gln Glu 1 5 10 15 Val Ser Ala Arg Leu Thr Ser Asp Leu Tyr Gly Trp Leu Thr Thr Val 20 25 30 Ala Arg Ser Gly Gln Pro Val Pro Arg Leu Val Trp Phe Tyr Phe Asp 35 40 45 Gly Thr Asp Leu Thr Val Tyr Ser Met Pro Gln Ala Ala Lys Val Ala 50 55 60 His Ile Thr Ala His Pro Gln Val Ser Leu Asn Leu Asp Ser Asp Gly 65 70 75 80 Asn Gly Ala Gly Ile Ile Val Val Gly Gly Thr Ala Ala Val Val Ala 85 90 95 Thr Asp Val Asp Cys Arg Asp Asp Ala Pro Tyr Trp Ala Lys Tyr Arg 100 105 110 Glu Asp Ala Ala Lys Phe Gly Leu Thr Glu Ala Ile Ala Ala Tyr Ser 115 120 125 Thr Arg Leu Lys Ile Thr Pro Thr Arg Val Trp Thr Thr Pro Thr Gly 130 135 140 <210> 2 <211> 435 <212> DNA <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 2 atgtgggcag gctaccgttg ggccatgagc gtcgaactga cacaagaggt ttctgccagg 60 ctcacgtccg acctttacgg gtggttgacc accgtcgccc gatcggggca gccggttccg 120 cggctggtgt ggttctactt cgacgggacc gacctgacgg tgtactccat gcctcaggcg 180 gccaaggtcg cccacatcac cgcccatccg caggtcagcc tgaacctgga ctccgacggc 240 aacggcgccg ggatcatcgt ggtgggcggg acggcggcgg tggtggccac cgatgtcgac 300 tgccgcgacg acgcgccgta ttgggccaag taccgcgagg atgccgcgaa gttcgggctg 360 accgaggcga tcgccgccta cagcacccgg ctgaagatca ccccgacccg ggtgtggacg 420 acgcccacgg gctga 435 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 3 atgtgggcag gctaccgttg g 21 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 4 gacgacgccc acgggctga 19

Claims

병원성 결핵균에서 특이적으로 존재하고, 145개의 아미노산을 포함하는 단백질 Rv3369(서열번호 1).
제 1항의 단백질을 암호화하는 유전자.
제 1항의 단백질을 암호화하고, 435bp의 염기서열을 포함하는 유전자rv3369(서열번호 2).
제 3항의 유전자rv3369를 포함하는 대장균 발현벡터 pRSETrv3369.
제 4항의 발현벡터로 형질전환된 대장균 3369(pRSET/BL21)(Escherichia coli3369(pRSET/BL21))(KCCM 10462).
제 5항의 형질전환된 대장균을 배양하고, 이로부터 Rv3369를 수득하는 단계를 포함하는, Rv3369의 제조방법.
제 1항의 Rv3369를 흡착시킨 플레이트, 반응검출용 디텍터, 디텍터용 기질액, 양성 대조혈청, 음성 대조혈청, 검체 희석액 및 세척액을 포함하는 결핵감염 진단키트.
제 7항에 있어서,

검체 희석액은 소혈청, 산양혈청, 트리톤 X-100, EDTA 및 질화 나트륨을 포함하는 중성 인산염 완충액인 것을 특징으로 하는

결핵감염 진단키트.