KR20030028059A

KR20030028059A - 항-결핵균 항체를 포함하는 결핵균 항원 진단키트

Info

Publication number: KR20030028059A
Application number: KR1020010059973A
Authority: KR
Inventors: 권혁한
Original assignee: (주)시로텍코리아
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2001-09-27
Publication date: 2003-04-08

Abstract

본 발명은 항-결핵균 항체를 포함하는 결핵균 항원 검출용 진단키트에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 토끼, 염소, 산양 등의 동물로부터 항-결핵균 항체를 정제하여 피검전혈의 결핵 진단 여부를 판별하는 진단키트에 관한 것으로서, 전혈을 이용하여 결핵을 판별하므로 진단이 용이하고 편리하며, 93.3% 민감도와 94.3%의 특이도로 결핵균 항원을 5분 이내에 검출할 수 있는 효과적인 진단키트에 관한 것이다.

Description

항-결핵균 항체를 포함하는 결핵균 항원 진단키트{Diagnostic test kit of tuberculosis antigen including anti-tuberculous antibody}

본 발명은 항-결핵균 항체를 포함하는 결핵균 항원 검출용 진단키트에 관한 것이며, 보다 구체적으로는 토끼, 염소, 산양 등의 동물로부터 항-결핵균 항체를 정제하여 피검전혈의 결핵 진단 여부를 판별하는 진단키트에 관한 것이다.

결핵은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis)의 감염에 의해 생기는 감염성 질환이다. 대부분의 결핵은 먼저 결핵에 걸린 환자가 기침과 재채기, 큰소리로 말하기 등을 할 때 결핵균이 포함된 객담 비말이 공기 중에 노출되면서 다른 사람의 말초 기도의 폐까지 흡입됨으로서 발병하기 시작한다. 그러나 비말 핵인 결핵균을 흡입하더라도 대부분의 경우에는 숙주의 면역 방어기전으로 인해 자연 치유되지만 그 중의 일부는 결핵균이 폐문부의 임파절로 확장되어 일차복합체를 이루거나, 늑막삼출로 늑막염을 유발하던지 속립결핵, 결핵성 뇌막염, 골격핵, 장결핵 등 전신감염을 일으키는 경우도 있다. 초감염 결핵은 대부분 일차복합체가 치유되면 휴면상태에 들어가게 되며, 이 감염환자의 약 10%에서는 체내의 면역이 결핍하게 되면 결과적으로 병변이 재활성화되어 균이 다시 자라게 되는데 이는 내인성 원인에 의한 것으로 생각된다. 특히, 성인에서의 결핵은 주로 폐의 상부에 잘 생기고 폐 조직의 괴사성 파괴가 심하여 공동을 형성하여 결핵균이 자라기 좋은 조건이 되는 경우가 많다.

한편, 최근 AIDS의 확산과 다제 약제 내성 결핵균이 확산되어 후진국이나 개발도상국에서 문제시되던 것이 선진국까지 문제가 확산되고 있는 추세이다.

그리하여 세계보건기구는 결핵퇴치에 큰 관심을 가지게 되었다. 이미 다제 약제 내성 결핵균이 등장함으로써 기존의 결핵예방을 위한 백신이나 항생제는 결핵퇴치에 큰 효과를 나타내지 못하는 실정이므로, 초기에 결핵을 진단하여 치료하는 것이 급선무인 상황하에 놓여있다.

현재 시행되고 있는 결핵을 진단하기 위한 방법으로서는, 피부반응검사, 도말염색 표본 현미경 검사, 균 분리배양 검사, 흉부 X 선 검사 등이 있는데, 이들 진단 방법은 환자의 가검물이나 피부를 통해 진단하는 것이므로 비용이나 시간이 오래 걸리는 단점이 있다.

이러한 단점을 해결하기 위해 환자의 혈액에서 결핵균이나 그 구성성분(항원)을 검출하여 항원-항체반응을 이용한 검출이나 PCR를 이용한 결핵 진단 방법이 개발되고 있다. 그 중 항원-항체반응법은 단시간 내에 이루어지며 특수한 장비나시설이 필요하지 않고 특이도나 민감도 등이 우수하여 널리 사용될 수 있는 것이다.

이에 따라서 몇몇 진단키트가 개발되었으나, 민감도가 60에서 85%으로 낮은 수준이고, 특이도는 85에서 96%정도이므로 대부분이 실험실 수준에서 결핵균을 검출 할 수 있는 정도에 불과하다. 또한 이러한 극소의 진단키트들은 사람의 혈액 중 하나의 구성성분인 혈청만을 따로 원심분리시켜 사용하여야 하는 번거로움이 있으므로, 시간적, 장비적 제한을 받고 있다.

그러므로, 이러한 단점을 해결하여 직접 전혈을 이용하여 보다 사용이 용이하고 편리하며, 특이도와 민감도가 우수하고, 환자로부터 단시간 내에 정확한 결핵균을 검출할 수 있는 진단키트의 개발이 당업계에서 요구되고 있는 실정이다.

상기와 같은 단점을 해결하기 위해 본 발명자는 결핵균 진단에 있어서 보다 우수한 민감도와 특이도로 단시간내에 결핵균을 검출할 수 있는 진단키트를 개발하고자 예의 연구검토한 결과, EIA(Enzyme Immunoassay) 중 ELISA(Enzyme Linked Immunosorbentassay)을 이용하여 본 발명의 진단키트를 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 토끼, 염소, 산양 등의 동물에 결핵균을 면역시켜 동물의 혈청에서 항-결핵균 항체를 정제하여 결핵균 항원을 검출하는 진단키트로서, 기존의 진단키트와는 달리 직접 전혈을 이용하므로 보다 사용이 용이하고 편리하며, 93.3%의 민감도와 94.3%의 특이도로 환자로부터 단시간 내에 정확한 결핵균을 검출할 수 있는 진단키트를 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 진단키트를 이용한 결핵균 항원의 검출방법을 제공하는 데에 있다.

도 1은, 본 발명의 진단키트의 검출 방법을 모식화시킨 것이다.

도 2는, 항-결핵균 항체의 농도에 따른 항원의 최소검출농도를 나타낸 그래프이다.

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.

면역진단법 중 민감도나 특이도가 유리한 조건에 있고 검사시약의 취급이 안전하며 비교적 간편하고 단시간 내에 수행하는 것이 EIA인데, 본 발명자는 이 중 ELISA을 이용하여 결핵균의 검출을 위한 진단키트를 개발하였다.

본 발명의 진단키트는 ⅰ)동물의 항혈청으로부터 정제한 항체가 피복된 항체고상화플레이트 ⅱ)검체를 희석하기 위한 완충용액 ⅲ)기질과의 반응을 위한 효소표지항체액 ⅳ)전혈 중 혈청 성분만을 분리시키는 완충성분액 ⅴ)반응을 나타내는 발색액 ⅵ)반응을 정지하는 반응정지액을 포함한다.

상기에서, 항-결핵균 항체는 결핵균 항원을 토끼, 염소, 산양 등의 동물에 면역시켜 동물의 혈청에서 정제하며, 항-결핵균 항체는 마이크로티터플레이트 웰당 10 내지 15㎍/㎖로 피복시키는 것이 바람직하다.

또한, 결핵균 표준 항원은 결핵균을 증류수에 100mg/ml 정도로 희석한 후 파쇄기로 파쇄하고 파쇄되지 않은 균체는 27,000 ×g에서 30분간 원심분리하고, 상층액을 모아 초원심분리기에서 100,000 ×g에서 4시간 원심분리하여 수득한 상층액을 0.2㎛ 여과기를 이용하여 여과한 후 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 진단키트에 있어서, 효소표지항체액은 퍼록시다아제 표지항사람 이뮤노글로블린 항체로 플레이트 웰당 25㎍이 포함되어 있고, 발색액은 3,3',5,5'테트라메틸벤지딘(Tetramethylbenzidine)(TMB)으로 15ml/100ml로 제조하였으며, 반응정지액은 15% 황산으로 구성하였다.

이와 같은 진단키트를 이용한 결핵균 항원의 검출방법은 마이크로티터플레이트에 항-결핵균 항체를 피복한 EIA로 41배로 희석된 피검전혈을 웰에 고상화시킨 항체에 첨가한 다음, 전혈 중 혈청성분만을 분리시키는 완충성분액을 웰에 떨어뜨려 항원-항체 복합체를 형성한 다음, 효소표지 항사람이뮤노글로블린을 첨가하여, 항원-항체-효소표지항체의 면역복합체를 형성시키고, 형성된 면역복합체에 기질 TMB)을 가하여 발색시켜 최적의 흡광범위인 450nm의 흡광도를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명은 이하의 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술되지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

〔실시예 1〕토끼의 혈청에서 항-결핵균 항체의 정제

항체고상화플레이트는 토끼에 결핵균을 면역시켜 토끼의 혈청으로부터 항-결핵균 항체를 정제하여 마이크로티터플레이트에 고상화시킨 것으로, 항-결핵균 항체는 결핵균을 배양기에서 32℃, 3내지 5일간 배양한 다음 121℃, 15분 동안 고압멸균후 -65℃에서 동결건조시켜 인산완충용액에 15mg/ml 농도로 부유하여 파쇄하여 항체제조용 항혈청으로 사용하였다. 이 항혈청을 토끼에 2ml 씩 4주 간격으로 주사하여 면역시킨 다음, 결핵균 항원에 대한 항체가 높아진 것을 확인한 후에 혈액을 채혈하여 100,000 ×g에서 3시간 원심분리하여 혈청을 얻어 결핵균 항원과 반응시켜 소디움 티오설페이트 완충액 1ml에 2ml를 넣어 항원을 탈리시키고 그 용출액을트리스염산완충용액으로 중성으로 하여 항-결핵균 항체를 정제하였으며 정제한 항-결핵균 항체를 마이크로티터플레이트 웰당 10내지 15㎍/ml를 피복하였다.

〔실시예 2〕결핵균 표준 항원의 정제

결핵균 표준 항원은 결핵균을 증류수에 100mg/ml 정도로 희석한 후 파쇄기로 파쇄하고 파쇄되지 않은 균체는 27,000 ×g에서 30분간 원심분리하고 상층액을 모아 초원심분리기로 100,000 ×g에서 4시간 원심분리하여 수득한 상층액을 0.2㎛ 여과기를 이용하여 여과한 후 사용하였다.

〔실시예 3〕검체희석용 완충용액의 제조

검체 희석을 위한 완충용액은 0.5M 트리즈마베이스에 헤파린 1.5g을 혼합하여 0.5M 염산으로 pH 8로 하여 증류수 1000ml에 녹여 사용하였다.

〔실시예 4〕전혈 중 혈청성분 분리용 완충성분액 제조

완충성분액은 트리스 염산 0.24 mM과 2SSC를 6:4의 비율로 혼합하고, 이를 12,000×g에서 1분 30초 동안 원심분리한 후 상층액을 -65℃에서 동결건조하여 사용하였다.

〔실시예 5〕진단키트를 이용한 결핵균 항원의 검출방법

도 1에 나타낸 바와 같이, 마이크로티터플레이트에 항-결핵균 항체를 피복한 EIA로 41배로 희석된 피검전혈을 웰에 고상화시킨 항체에 첨가한 후, 전혈 중 혈청성분만을 분리시키는 완충성분액을 웰에 떨어뜨리면 항원-항체 복합체가 형성(도 1 중 (a)에 해당)되며, 효소표지 항사람이뮤노글로블린을 첨가하면, 항원-항체-효소표지항체의 면역복합체를 형성한다(도 1 중 (b)에 해당). 다음에 형성된 면역복합체에 기질(TMB) 한두 방울을 첨가하여 발색(도 1 중 (c)에 해당)시키고, 15% 황산 한두 방울을 떨어뜨려 반응을 정지시켰다. 발색반응 정도는 최적의 흡광범위인 450nm의 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.

〔실시예 6〕진단키트의 최소검출 항원 농도

본 발명의 진단키트에 있어서, 항-결핵균 항체의 농도에 따른 항원의 최소검출농도를 확인하기 위하여, 감도시험을 하였다. 그 결과는 도 2에 나타내었다. 도 2에서 알 수 있듯이, 표준항원액 0 mIU/ml로 측정한 흡광도는 0.05이하였고 2 IU/ml로 측정한 흡광도는 1.00 이상으로 나타나 진단키트의 최소 검출농도는 250 mIU/ml임을 알 수 있었다.

〔실시예 7〕본 발명의 진단키트의 효율성을 확인하기 위한 임상시험

본 발명의 진단키트의 효율성을 확인하기 위하여 임상시험을 하였다.

진단키트의 임상시험을 위해 임상적으로 폐결핵으로 진단되고 초진시 치료하지 않았으며 균검사결과 흉부 X 선 소견이 있는 환자임이 확인된 집단, 45명을 대상으로 실시예 5와 같이 실험하였다.

대상 집단의 전혈은 본 발명의 진단키트와 접촉한지 5분 이내에 푸른색의 발색이 나타났으며, 표 1에 나타나듯이, 45명 중 42명이 양성결과로 나타나 민감도가 93.3%임을 알 수 있었다. 정상인 51명을 대상으로 실시한 결과 51명 모두 음성결과로 나타났고 결핵증상을 가진 음성 환자 35명을 대상으로 실시한 결과, 31명이 음성결과가 나타나 특이도는 94.3%임을 알 수 있었다.

[표 1]

[정상인과 결핵 환자의 결핵균 항원 검출]

시 료	사람의 수	본 발명의 진단키트에 의한항원이 검출된 사람의 수	양성(%)	음성(%)
정상인	51	0	0	100
결핵증상을 가진 음성환자	35	4	11.4	88.6
결핵균 감염 환자	45	42	93.3	6.7

이상과 같이, 본 발명의 진단키트에 의하면, 항-결핵균 항체를 포함한 결핵균 항원 검출용으로서, 직접 전혈을 이용하므로 보다 사용이 용이하고 편리하며, 93.3%의 민감도와 94.3%의 특이도로 환자로부터 5분 이내에 정확한 결핵균을 검출할 수 있다.

Claims

결핵균 항원을 동물에 면역시켜 동물의 혈청에서 항결핵균 항체를 정제하여 결핵균의 감염 여부를 확인할 수 있는 진단키트로서, ⅰ)동물의 항혈청으로부터 정제한 항체가 피복된 항체고상화플레이트 ⅱ)검체를 희석하기 위한 완충용액 ⅲ)기질과의 반응을 위한 효소표지항체액 ⅳ)전혈 중 혈청성분만을 분리시키는 완충성분액 ⅴ)반응을 나타내는 발색액 ⅵ)반응을 정지하는 반응정지액을 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
제 1 항에 있어서, 상기 동물의 항혈청은 토끼에 면역시켜 얻은 항혈청인 것을 특징으로 하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
제 1 항에 있어서, 항-결핵균 항체는 결핵균을 배양기에서 배양한 다음 고압멸균후 동결건조시켜 인산완충용액에 15mg/ml 농도로 부유하여 파쇄하여 항체제조용 항혈청으로 사용하고, 이 항혈청을 토끼에 2ml 씩 4주 간격으로 주사하여 면역시킨 다음, 결핵균 항원에 대한 항체가 높아진 것을 확인한 후에 혈액을 채혈하여 원심분리하여 혈청을 얻어 결핵균 항원과 반응시켜 소디움 티오설페이트 완충액으로 항원을 탈리시키고 그 용출액을 트리스염산완충용액으로 중성으로 하여 항-결핵균 항체를 정제하는 것을 특징으로 하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
제 1 항에 있어서, 정제한 항-결핵균 항체는 마이크로티터플레이트 웰당 10내지 15㎍/ml를 피복시키는 것을 특징으로 하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
제 1 항에 있어서, 검체를 희석하기 위한 완충용액은 트리스염산완충액인 것을 특징으로 하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
제 1 항에 있어서, 발색제는 3,3',5,5' 테트라메틸벤지딘인 것을 특징으로 하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
제 1 항에 있어서, 전혈 중 혈청성분을 분리시키는 완충성분액은 트리스 염산 0.24 mM과 2SSC를 6:4의 비율로 혼합하고, 이를 12,000×g에서 원심분리한 후 상층액을 동결건조하여 사용하는 것을 특징으로 하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
제 1 항에 있어서, 결핵균 항원은 결핵균을 증류수에 100mg/ml 정도로 희석한 후 파쇄기로 파쇄하고 파쇄되지 않은 균체는 27,000 ×g에서 원심분리하고, 상층액을 모아 초원심분리기로 100,000 ×g에서 원심분리하여 수득한 상층액을 0.2㎛ 여과기를 이용하여 여과한 후 사용하는 것을 특징으로 하는 결핵균 항원 검출용 진단키트.
제 1 항에 기재된 진단키트를 사용하여, 마이크로티터플레이트에 항-결핵균 항체를 피복한 EIA로 41배로 희석된 피검전혈을 웰에 고상화시킨 항체에 첨가한 후, 전혈 중 혈청성분만을 분리시키는 완충성분액을 웰에 떨어뜨려 항원-항체 복합체를 형성하고, 효소표지 항사람이뮤노글로블린을 첨가하여, 항원-항체-효소표지항체의 면역복합체를 형성시키고, 형성된 면역복합체에 기질(TMB)을 가하여 발색시켜 450nm의 흡광도를 측정하는 단계를 포함하는 결핵균 항원의 검출방법.