KR101140405B1 - Ｍ. ａｂｓｃｅｓｓｕｓ 감염 진단용 마커의 스크리닝 방법 및 발굴된 단백질 항원 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 비결핵 항산균 중 하나인 M. abscessus 감염 진단용 항원 스크리닝 방법, 발굴된 진단용 항원 및 이 항원을 포함하는 M. abscessus 감염 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 진단용 항원은 항산균 감염증 중에서 특히 고병원성인 M. abscessus만을 특이적으로 진단할 수 있다.
비결핵 항산균, M. abscessus, superoxide dismutase, catalase

Description

Ｍ. ａｂｓｃｅｓｓｕｓ 감염 진단용 마커의 스크리닝 방법 및 발굴된 단백질 항원{Screening Methods for Diagnostic Markers for Mycobacterium abscessus Infection and Protein Antigens}
본 발명은 비결핵 항산균 중 하나인 M. abscessus 감염 진단용 항원 스크리닝 방법, 발굴된 진단용 항원 및 이 항원을 포함하는 M. abscessus 감염 진단용 조성물에 관한 것이다.
가. 비결핵 항산균 (Nontuberculous Mycobacteria, NTM)의 중요성
항산균(마이코박테리아) 감염증은 세균성 질병으로는 인류에 가장 큰 피해를 주고 있으며 가장 대표적인 것은 결핵균(Mycobacterium tuberculosis) 감염에 의해 발병하는 결핵으로 전세계적으로 유병율은 20억명에 이르고, 매년 800만 명의 신환자가 발생하며 300만 명이 사망하는 것으로 추산되고 있다.
비결핵 항산균(nontuberculous mycobacteria, NTM) 감염증은 최근 국내외에서 빠른 속도로 증가하고 있으며 객담 acid-fast bacilli (AFB) 도말양성인 경우 과거에는 폐결핵의 확실한 진단기준이라고 여겨졌으나, 최근에는 이 환자들 중 10-20%가 NTM 폐질환으로 밝혀지고 있다. NTM 폐질환은 결핵에 비해 항생제 내성률이 높고 치료효율이 낮아 2년 정도의 장기간의 병합항생제 치료에도 불구하고 완치율은 50-60% 이하에 머무르고 있다.
NTM 폐질환은 결핵과 유사한 병리학적, 생리학적 특성을 갖고 있다고 생각되고 있으나 병인론 및 면역현상, 숙주의 유전적 환경, 숙주와 병원체의 관계가 명확하게 밝혀지지 않았다. 점차 의료기술 발달에 의한 항암제 치료, 세포치료, 장기이식과 여러 가지 신종 바이러스의 출현 및 항생제 남용에 따른 고도내성균의 확산으로 NTM 감염증의 병인론 기전을 결핵과 구분하여 다양한 시각에서 치료의 효율을 최적화할 수 있는 기술의 개발이 절실하다.
최근까지 NTM 감염 질환에 대한 국내외 연구 수준은 증례보고를 중심으로 역학적인 부분에만 치중되어 있으므로 본질적인 예방 및 치료의 효율을 극대화하기 위해서는 다양한 NTM의 병인론, 병원체간의 유사점과 차이점 분석, 각 NTM의 특이적인 항원을 이용한 세포 사멸기전 분석과 NTM의 특이적 면역반응에 대한 연구가 절실히 필요하다. 최근에는 숙주의 면역상태, 유전환경 등에 따른 맞춤형 치료가 요구되는 시점에서 NTM의 특성을 규명하고 다양한 NTM에 대한 숙주의 특이적인 면역현상을 규명하는 것은 emerging pathogen에 대한 국가 경쟁력 및 국가 보건향상에 절실히 필요하다.
나. 국내에서 유행하는 비결핵 항산균의 종류 및 국외와의 차이점
NTM으로 인한 질환은 폐질환, 림프절염, 피부질환, 파종성 질환 등 4가지 특징적인 임상 증후군으로 분류되고 있다. 이중 폐질환은 NTM으로 인한 질환의 90% 이상을 차지하는 가장 흔한 형태이다.
NTM 폐질환은 주위 환경에 존재하는 균이 공기를 통해 호흡기에 감염되어 발생하는 것으로 생각하고 있으나 아직까지 사람간의 전파양상에 대해서는 알려진 바 없다. NTM 폐질환을 일으키는 원인균의 분포는 국가에 따라 그리고 국가 내에서도 지역에 따라 다양하다.
미국과 일본에서 NTM 폐질환의 가장 흔한 원인균은 Mycobacterium avium-intracellulare complex (MAC)로 60-80%를 차지하며, Mycobacterium kansasii가 두 번째로 흔한 원인균으로 15-20%를 차지하고 있다. Mycobacterium abscessus, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium chelonae 등 rapidly growing mycobacteria는 폐질환 원인균의 5% 미만을 차지하는 상대적으로 드문 원인균이다.
국내에서는 1981년 MAC 폐질환 증례가 처음으로 보고된 이후 최근까지도 NTM 폐질환은 증례보고 수준에 머무르고 있다. 우리나라에서는 NTM 폐질환의 원인균 중 MAC가 가장 흔하고, 외국과 달리 M. abscessus가 두 번째로 흔한 원인균이며, 미국과 일본에서 두 번째로 흔한 M. kansasii 폐질환은 국내에서는 매우 드물게 발생하고 있다.
NTM 폐질환의 치료는 clarithromycin, rifampin, ethambutol 등 여러 항생제를 2년간 병합투여함에도 치료성공률은 50-60%에 불과한 실정이다. 고령의 환자에서 여러 항생제를 병합투여하면서 부작용도 흔하다.
NTM 감염질환 중 M. abscessus 폐질환은 모든 NTM 중 가장 항생제 내성이 강하고 치료가 힘들어, 내과적 치료만으로는 완치가 불가능하다고도 여겨지고 있다.
다. Mycobacterium abscessus 감염질환의 중요성
빠르게 자라는 NTM (rapid growing mycobacteria)에 의한 폐질환은 대부분 M. abscessus, M. chelonae, M. fortuitum 세 균종에 의해 이루어진다. 이중 M. abscessus가 폐질환을 일으키는 원인균의 80% 이상 그리고 M. fortuitum이 15%를 차지한다고 알려져 있다. M. abscessus는 M. fortuitum에 비해 병원성이 높으며 기저질환을 동반하지 않은 M. abscessus 폐질환은 병의 진행이 매우 느리나 기저질환 특히 위식도질환이 동반된 경우는 상대적으로 병의 진행이 빠르다. 그러므로 효과적인 치료를 위해서는 정확하고 신속한 진단기법의 개발이 절실히 필요하다.
본 발명자는 M. abscessus 진단마커를 발굴하기 위해 노력하던 중 특정한 조건에서 특이적으로 발현되는 M. abscessus의 단백질 항원이 비결핵 항산균 중에서도 특히 병원성이 높은 M. abscessus의 폐질환을 혈청학적으로 감별진단하는데 유용함을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 한 목적은 (1) M. abscessus를 상피세포 또는 큰포식세포로 감염시키거나, 상피세포에 감염시킨 후 큰포식세포로 감염시키는 단계; (2) 상기 감염 조건에서 특이적으로 발현되는 M. abscessus의 단백질을 확인하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)에서 확인된 단백질과 M. abscessus 감염에 의한 폐질환 환자의 혈청을 반응하여 M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질을 선별 및 동정하는 단계를 포함한 M. abscessus 감염 진단용 항원 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질은 superoxide dismutase인 것을 특징으로 하는 M. abscessus 감염 진단용 항원 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 superoxide dismutase를 포함하는 M. abscessus 감염 진단용 조성물을 제공하는데 있다.
삭제
삭제
본 발명의 또 다른 목적은 (1) M. abscessus를 지정된 산소 및 pH 조건에서 배양시키는 단계; (2) 상기 조건에서 특이적으로 발현되는 M. abscessus의 분비 단백질을 발굴하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)에서 발굴된 단백질과 M. abscessus 감염에 의한 폐질환 환자 혈청을 반응하여 M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질을 선별 및 동정하는 단계를 포함한 M. abscessus 감염 진단용 항원 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질은 catalase인 것을 특징으로 하는 M. abscessus 감염 진단용 항원 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 catalase 를 포함하는 M. abscessus 감염 진단용 조성물을 제공하는데 있다.
삭제
본 발명의 한 양태는 (1) M. abscessus를 상피세포 또는 큰포식세포로 감염시키거나, 상피세포에 감염시킨 후 큰포식세포로 감염시키는 단계; (2) 상기 감염 조건에서 특이적으로 발현되는 M. abscessus의 단백질을 확인하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)에서 확인된 단백질과 M. abscessus 감염에 의한 폐질환 환자 혈청을 반응하여 M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질을 선별 및 동정하는 단계를 포함한 M. abscessus 감염 진단용 항원 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 단계 (1)에서는 M. abscessus를 상피세포(epithelial cell) 또는 큰포식세포(macrophage)에 직접(바로) 감염시키거나, 상피세포에 감염 후 나온 M. abscessus를 큰포식세포에 감염시킬 수 있다.
상기 단계 (2)에서는 단백질 동정(identification)에 통상적으로 이용되는 방법이라면 모두 이용될 수 있다. 본 발명에서는, 2차원 전기영동(2-dimensional electrophoresis)을 통하여 상기 감염 조건에서 특이적으로 발현되는 단백질이 실제적으로 증가되었다는 것을 확인하고, LC-ESI-MS(liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry) 기법을 이용하여 확인하는 것이 바람직하다.
상기 단계 (3)에서는 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 방법이라면 모두 이용될 수 있다. 본 발명에서는, 단계 (2)에서 확인된 단백질을 이용하여 M. abscessus 감염에 의한 폐질환 환자의 혈청으로 1차원 전기영동과 면역블롯(1-dimensional electrophoresis-immunoblot) 및/또는 2차원 전기영동과 면역블롯(2-dimensional electrophoresis-immunoblot)을 실시한 후 M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질 항원을 LC-ESI-MS 기법으로 동정하고 매칭 스코어(matching score)와 생물정보학 분석(bioinformatic analysis)을 통해 진단용 항원을 분석하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 단계 (3)에서 상기 M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질은 superoxide dismutase인 것을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 스크리닝 방법으로 발굴된 M. abscessus 감염 진단용 항원을 제공한다. 상기 항원은 바람직하게는 probable superoxide dismutase (MAB0118c)이다.
또한, superoxide dismutase를 포함하는 M. abscessus 감염 진단용 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 (1) M. abscessus를 지정된 산소 및 pH 조건에서 배양시키는 단계; (2) 상기 조건에서 특이적으로 발현되는 M. abscessus의 분비 단백질을 발굴하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)에서 발굴된 단백질과 M. abscessus 감염에 의한 폐질환 환자의 혈청을 반응하여 M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질을 선별 및 동정하는 단계를 포함한 M. abscessus 감염 진단용 항원 스크리닝 방법에 관한 것이다.
상기 단계 (1)에서 산소 조건은 10 내지 25%으로, pH 조건은 pH 5.0 내지 7.5로 지정할 수 있다. 보다 바람직하게는 pH7.0 및 21% O2, pH7.5 및 21% O2, pH6.0 및 21% O2, pH5.0 및 21% O2, 또는 pH5.0 및 13% O2 조건하에서 배양을 실시할 수 있다.
상기 단계 (3)에서는 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 이용될 수 있다. 본 발명에서는, 단계 (2)에서 발굴된 단백질을 이용하여 M. abscessus 감염 환자 혈청으로 1차원 전기영동과 면역블롯(1-dimensional electrophoresis-immunoblot) 및 2차원 전기영동과 면역블롯(2-dimensional electrophoresis-immunoblot)을 실시한 후 M. abscessus 감염 환자 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질 항원은 LC-ESI-MS 기법으로 동정하고 매칭 스코어(matching score)와 생물정보학 분석(bioinformatic analysis)을 통해 진단용 항원을 분석하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 단계 (3)에서 M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질은 catalase인 것을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 스크리닝 방법으로 발굴된 M. abscessus 감염 진단용 항원을 제공한다. 상기 항원은 바람직하게는 catalase (MAB0351)이다.
또한, catalase 를 포함하는 M. abscessus 감염 진단용 조성물을 포함할 수 있다.
본 발명에 의하여, 비결핵 항산균 M. abscessus의 진단은 본 발명의 진단용 항원을 혈청학적 시료에 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정함으로써 생물학적 샘플 중에서 본 발명의 진단용 항원에 특이적으로 결합하는 항체의 존재여부를 확인하는 방법에 의할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 '항원-항체 복합체'란 본 발명의 항원 단백질과 생물학적 샘플(혈청) 중 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.
본 발명의 항원 단백질은 비결핵 항산균 M. abscessus로부터 유래한 것으로서, DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.
상기 본 발명의 진단용 조성물은 진단용 항원 이외에 면역학적 분석에 사용되는 당업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다.
상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.
면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.
상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시 다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물질로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 3H, 14C, 32P, 35S, 36Cl, 51Cr, 57Co, 58Co, 59Fe, 90Y, 125I, 131I, 186Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.
한편, 본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함된다. 그 외 의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
따라서 바람직하게는, 본 발명의 M. abscessus 감염 진단용 조성물은 진단용 키트의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명에 따르면, 비결핵 항산균 중에서 특히 고병원성이며 국내에서 가장 문제가 되고 있는 M. abscessus만을 특이적으로 진단할 수 있는 마커를 스크리닝할 수 있으며, 또한, 스크리닝된 마커는 M. abscessus 감염을 진단하는데 이용될 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1: superoxide dismutase의 발굴>
1-1. 균과 세포의 배양 및 세포로의 균 감염
M. abscessus ATCC19977TM균을 7H9-OADC 배지에 접종하여 37℃에서 삼일 배양하였다. 배양된 균을 PBS로 세 번 세척한 후, 이를 7H10 OADC agar 플레이트에 분주하여 오염 여부 확인과 함께 CFU (colony forming unit)을 계산하여 -80℃에서 사용 전까지 보관하였다. 상피세포 (A549 human epithelial cell line)와 큰포식세포 (THP-1 human monocytic cell line)는 10% FBS와 1%의 항생제(100,000IU/ml 페니실린, 10,000ug/ml 스트렙토마이신)를 포함하는 RPMI-1640을 이용하여 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. 1x105 cell/ml 상피세포를 12 well plate에 3일 키운 후, MOI (multiplicity of infection) 1:50으로 감염시켰다. 감염 20시간 후, PBS의 세척을 통해 남아있는 균들을 제거하였고, 이 시간을 0 day로 간주하였다. 깨끗한 배지에 추가적으로 1-3 day 배양하였고, 각각의 0,1,2,3 day의 배양액을 제거한 후, 0.5ml의 0.1% Triton X-100 (Sigma)으로 lysis하였다. 이를 7H10 agar plate에 순차적으로 희석하여 깔아 37℃에서 3일 배양시킨 후, CFU를 측정하였다. 큰포식세포는 20 mM PMA (phobol myristate acetate)를 처리하여 분화시킨 후, PBS로 세척하여 감염 전까지 하루를 incubation하였다. 분화된 큰포식세포에 20시간, MOI 1:50으로 감염시킨 상피세포에서 나온 균을 감염시켜 상피세포와 마찬가지로 1-3 day 배양하였다. 큰포식세포 역시 위에서 언급한 것과 같이 lysis시켜 CFU를 측정하였다.
그 결과 상피세포 (A549 cell line)를 통과하여 큰포식세포 (THP-1 cell line)에 감염된 M. abscessus는 결핵균과 유사한 패턴으로 큰포식세포에서 증식, 생존한 반면 큰포식세포에 직접 감염시킨 M. abscessus는 3일째에 초기 감염양과 동일한 수준으로 증식, 생존하지 못하였다. 본 실험의 결과는 병원성이 낮은 비결핵 mycobacteria가 상피세포를 통과하면서 병원성이 획득되며 큰포식세포내에서 생존, 증식할 때 필요한 유전자의 발현이 증가하는 것임을 나타낸다(도 1).
1-2. M. abscessus ATCC19977TM type 균주의 12개 단백질의 발굴
실시예 1-1에서 언급된 것과 같이 3가지 조건 즉, 상피세포 통과 후 큰포식세포내 감염, 상피세포내 감염, 큰포식세포내 감염 조건에서 특이적으로 발현되는 단백질을 2차원 전기영동을 실시하였다. 각 조건에서 특이적으로 발현되는 단백질 항원을 발굴하여 LC-ESI-MS 기법으로 동정하였고 (도 2), 매칭 스코어(matching score)와 생물정보학 분석 (bioinformatic analysis)을 통해 분석하였다(표 1, 표 2).
본 실시예에서 이용된 실험 방법은 다음과 같다. 최종적으로 각 조건에 따라 모아진 단백질 샘플 200㎍을 재수화 완충용액[8 M Urea, 2% CHAPS, 80 mM DTT, 0.001% bromophenol blue, 0.2% ampholyte (Biolyte, Bio-Rad)]에 첨가한 후, 길이가 7 cm, pH 4-7의 범위를 갖는 IPG strip (Bio-Rad)에 재수화하였다. 이때 디폴트 (Default) 온도는 20℃이며, strip당 최대전류가 50 μA의 시스템을 갖는 PROTEIN IEF CELL (Bio-Rad)을 사용하였다. 12-16시간의 재수화과정 후, 3차 증류 수를 미리 적신 전극 심지 (wick)을 전극 위에 올려놓고 그 위에 strip을 얹고 광질유 (mineral oil)을 충분히 덮어준 후, 250 V에서 30분간 시료의 염(salt) 또는 불순물을 제거하였다. 염 제거 과정 후, 2시간 동안 250 V에서 4000 V로 전압을 올려주고 4000 V에서 20,000 Vhr 동안의 focusing 과정을 거쳤고, focusing이 끝난 후에는 시료의 over-focusing 또는 drifting을 방지하기 위해서 500 V에서 hold step을 두었다. Focusing이 끝난 후에는 시료의 over-focusing 또는 drifting을 방지하기 위해 500 V에서 hold step을 두었고, IEF가 종료된 후에 스트립은 2차 분리 전까지 -20℃에서 보관하였다. -20℃에서 보관 중이던 strip을 실온에서 녹이고, 스트립 안의 단백질이 SDS와 결합할 수 있도록 스트립을 평형 완충용액 Ⅰ[6 M Urea, 0.375 M Tris-Cl (pH 8.8), 2% DTT (w/v), 2% SDS, 20% glycerol]에 넣고 20분간 반응시켰다. 1차 반응 후, 평형 완충용액 Ⅱ [6 M Urea, 0.375 M Tris-Cl (pH 8.8), 2.5% iodoacetamide (w/v), 2% SDS, 20% glycerol]에 넣고 20분간 2차 반응을 시킨 후, 충분히 평형된 스트립의 양극(anode)쪽을 SDS-PAGE 젤의 왼쪽으로 (marker 방향) 가도록 삽입하였다. 12% 농도의 폴리아크릴아미드 젤 을 사용하여 전기영동하고, 젤은 Coomassie brilliant blue R250 (Bio-Rad)으로 염색한 후, 30% 메탄올과 10% 빙초산의 용액으로 탈색하였다. 2-DE로 분리한 유의하게 증가되는 단백질 스팟들은 LC-ESI-MS 분석을 통해 동정하였다. 동정된 스팟은 2-DE 분석 소프트웨어 (Prodigy Samespots, Nonlinear Dynamics Ltd Nonliner USA Inc)를 이용하여 보다 구체적으로 스팟들의 강도 (intensity)를 비교분석하였다.
Spot no. Protein M.W. pI specific
1 Probable fumarate hydratase Fum 49221 5.12 A549
2 Isocitrate lyase (AceA) 46934 5.02 A549
3 Conserved hypothetical protein 24681 4.38 A549
4 Adenosylhomocysteinase 53217 4.73 THP1
5 Chaperone protein DnaK (Hsp 70) 66470 4.74 THP-1
6 Antigen 85-A/B/C precursor 34909 5.72 THP-1
7 60 kDa chaperonin GroEL 56388 4.76 A549-THP1
8 Probable transketolase 75557 4.98 THP-1
9 Succinyl-CoA synthetase, alpha chain 30837 5.24 THP-1
10 Succinyl-CoA synthetase, alpha chain 30837 5.24 A549
11 Conserved hypothetical protein 22333 5.07 A549-THP1
12 Probable superoxide dismutase (Mn) 23025 5.46 A549
Figure 112009024041857-pat00001
1-3. 면역블롯 및 SOD의 발굴
위의 세포를 통과한 M. abscessus ATCC19977TM 균을 초음파로 분쇄한 후 원심분리로 cytosolic fraction 항원을 수거하고 이를 이용하여 M. abscessus 감염환자 5명의 혈청, M. tb 감염환자 4명의 혈청, 건강인의 5명의 혈청으로 1차원 전기영동과 면역블롯(1-dimensional electrophoresis-immunoblot)(도 3) 및 이들의 pooling 혈청으로 2차원 전기영동과 면역블롯(2-dimensional electrophoresis-immunoblot)(도 4)을 실시하였다. M. abscessus 감염 환자 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질 항원은 LC-ESI-MS 기법으로 동정하였고 매칭 스코어(matching score)와 생물정보학 분석(bioinformatic analysis)을 통해 항원을 분석하였다.
그 결과 도 2, 표 1, 2의 12번에 해당하는 단백질이라는 것을 확인하였다. 이 단백질은 상피세포에서 발현이 증가되고 큰포식세포에 직접 감염시켰을 때보다 약 2.0배의 높은 발현양을 보였다(도 5). 본 단백질은 the iron/manganese superoxide dismutase family에 속하는 superoxide dismutase (SOD)로 상피세포내 감염시에 특이적으로 증가하고 molecular weight은 23.025 kDa이며 pI 값은 5.46이다.
<실시예 2: catalase의 발굴>
2-1. M. abscessus의 배양과 배양액 수거
항원은 지정된 조건하에서 배양하여 수거한 M. abscesus의 분비 항원을 이용하였다. 기존의 보고에서 죽은 결핵균보다 살아있는 결핵균에서 분비되는 항원이 더욱 효과적인 방어면역 유도 및 진단항원을 포함하고 있다는 사실에 기초하여 M. abscesus가 분비하는 항원에 초점을 맞추어 실험하였다. 시험관 내에서 M. abscesus을 배양하면 배양액내 세포외로 단백질을 분비하는데 이를 CFP (Culture filtrate protein)라 하고 이러한 단백질은 세포질 단백질과 구별되는 특징을 나타내며 살아있는 세균의 빠른 인지가 가능한 항원으로 작용한다.
우선 M. abscesus ATCC19977TM 균주를 7H9-OADC 배지에 접종하여 37℃에서 7일간 배양하였다. 배양된 균주는 글래스 비드 비터(glass bead beater)로 교반한 후 단일 M. abscesus가 존재하는 상층액을 수거하였고, 이를 7H10-OADC 아가 플레이트에 분주하여 오염 여부 확인과 함께 CFU(colony forming unit)를 계산하였다. 이렇게 만든 M. abscesus의 초기 배양액(seedlot)은 1ml씩 분주하여 -80℃에서 사용 전까지 보관하였다.
분비 항원 (CFP 항원)은 1 x 109 CFU/ml의 각 균주의 초기 배양액 중 100㎕를 35ml의 변형된 Watson-Reid 브로스 (mWR 배지) 합성 배지 (non-protein based medium)에 접종 후 37℃에서 2주간 배양함으로써 얻었다. 이 때의 각 배양 조건은 다음과 같다. pH7.0, 21% O2를 정상배양 조건으로 하여 pH7.5, 21% O2, pH6.0, 21% O2, pH5.0, 21% O2, pH5.0, 13% O2 하에서 배양을 실시하였다. 37℃에서 2주 동안 standing 배양 후, 10,000 xg에서 원심하여 일차적으로 pellet 균을 제거하고 0.2㎛ 여과를 통해 2차적으로 균을 제거하여 배양액을 얻었고, 이를 3-kDa 분자량 컷오프(cutoff)를 통해 농축하였다. 농축한 각 균주의 분비 항원은 BCA 단백질 농도 측정방법에 따라 농도를 측정하였다.
2-2. 2DE-immunoblot와 LC-ESI-MS 기법을 이용하여 M. abscessus 감염환자 혈청에 특이적으로 반응하는 항원의 발굴
실시예 2-1에서 얻은 CFP항원을 이용하여 M. tb 환자 pooling 혈청과 M. abscessus 환자 pooling 혈청으로 1차원 전기영동과 면역블롯(1-dimensional electrophoresis-immunoblot) 기법을 이용하여 M. abscessus 감염 환자의 혈청에 특이적으로 반응하는 약 50 kDa 크기의 단백질 항원을 발굴하였다(도 6). 이 단백질은 pH 5.0 배양조건에서만 발현됨을 확인하였다(도 6). 또한, 이를 다른 5명의 M. abscessus 폐질환 환자의 pooling 혈청을 이용하여 1차원 전기영동과 면역블롯(1-dimensional electrophoresis-immunoblot) 기법으로 재확인한 결과 pH5.0 배양조건에서만 발현된 50 kDa 크기의 항원에 특이적으로 반응한다는 것을 알았다(도 7). 이를 2차원 전기영동과 면역블롯(2-dimensional electrophoresis-immunoblot)을 실시하여 M. abscessus 폐질환 환자의 pooling 혈청에 특이적으로 반응하는 항원을 검출하였고 검출된 항원은 LC-ESI-MS 기법으로 동정하였고 매칭 스코어(matching score)와 생물정보학 분석(bioinformatic analysis)을 통해 항원을 분석하였다 (도 8). 본 실험 기법으로 발굴된 항원은 catalase로 molecular weight은 54.717 kDa이며 pI 값은 5.49였다.
본 실시예에서 이용된 실험 방법은 다음과 같다. 최종적으로 모아진 단백질 샘플은 2D 전기영동과 LC-ESI-MS 기법으로 분석하였다.
각각의 시료 200㎍ (IPG 스트립이 7cm일 경우), 재수화 완충용액[8 M Urea, 2% CHAPS, 80 mM DTT, 0.001% bromophenol blue, 0.2% ampholyte (Biolyte, Bio-Rad)]에 첨가하였다. IPG 스트립 (Bio-Rad)은 pH 4-7 범위를 갖고 있으며, 그 길이가 7cm 인 것을 사용하였다. 디폴트(Default) 온도가 20℃이며, 스트립당 최대전류가 50 μA의 시스템을 갖는 PROTEAN IEF cell (Bio-Rad)을 사용하였다. 먼저 준비한 시료를 재수화 트레이에 로딩하여 12-16시간 재수화시킨 후, 시료의 염(salt) 또는 불순물을 제거하기 위하여 3차 증류수로 미리 적신 전극 심지(wick)를 전극 위에 올려놓았다. 그 위에 스트립을 얹고 광질유를 충분히 덮어준 후 250 V에서 30분간 과잉의 염을 제거하였다. 염 제거 과정 후, 스트립이 7 cm일 경우에는 2시간 동안 250 V에서 4000 V로 전압을 올려주고 4000 V에서 20,000 VHr 동안의 focusing 과정을 실시하였다. Focusing이 끝난 후에는 시료의 over-focusing 또는 drifting을 방지하기 위해 500 V에서 hold step을 두었고, IEF가 종료된 후에 스트립은 2차 분리 전까지 -20℃에서 보관하였다. -20℃에서 보관 중이던 IPG 스트립을 실온에서 녹이고, 스트립 안의 단백질이 SDS와 결합할 수 있도록 스트립을 평형 완충용액 Ⅰ[6 M Urea, 0.375 M Tris-Cl (pH 8.8), 2% DTT (w/v), 2% SDS, 20% glycerol]에 넣고 20분간 반응시켰다. 1차 반응 후, 평형 완충용액 Ⅱ [6 M Urea, 0.375 M Tris-Cl (pH 8.8), 2.5% iodoacetamide (w/v), 2% SDS, 20% glycerol]에 넣고 20분간 2차 반응을 시킨 후, 충분히 평형된 스트립의 양극(anode)쪽을 SDS-PAGE 젤의 왼쪽으로 (marker 방향) 가도록 삽입하였다. 10%, 13.5% 농도의 폴리아크릴아미드 젤을 사용하여 전기영동하고, 젤은 Coomassie brilliant blue R250 (Bio-Rad)으로 염색한 후, 30% 메탄올과 10% 빙초산의 용액으로 탈색하였다. 2-DE로 분리하여 M.tb 환자와 유의하게 차이를 나타내는 M. abscessus 환자의 혈청 단백질 스팟은 LC-ESI-MS 분석을 통해 동정하였다.
도 1은 THP-1 큰포식세포에 직접 감염시킨 M. abscessus 및 A549 상피세포를 통과하여 THP-1 큰포식세포에 감염시킨 M. abscessus의 세포내 증식율을 나타낸 것이다.
도 2는 A549 상피세포 통과 후 THP-1 큰포식세포내 감염, A549 상피세포내 감염, THP-1 큰포식세포내 감염의 3가지 조건에서 특이적으로 발현되는 M. abscessus의 단백질을 나타낸 것이다.
도 3은 M. abscessus에서 특이적으로 발현되는 단백질을 이용하여 M. abscessus 감염환자, 결핵균 감염환자, 건강인의 혈청을 활용하여 웨스턴 블롯을 실시한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 M. abscessus 감염환자의 혈청 pool에만 반응하는 단백질을 2D-immunoblot으로 확인한 결과 LC-ESI-MS 기법을 통하여 발굴한 것이다.
도 5는 M. abscessus 감염환자의 혈청 pool에만 반응하는 단백질을 2D-immunoblot으로 확인한 단백질을 LC-ESI-MS 기법을 통하여 발굴하고 상피세포 특이적으로 발현됨을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 M. abscessus 감염환자의 혈청 pool에만 반응하는 단백질을 1D-immunoblot으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 M. abscessus 감염환자의 혈청 pool에만 반응하는 단백질을 1D-immunoblot으로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 M. abscessus 감염환자의 혈청 pool에만 반응하는 단백질을 2D- immunoblot으로 확인한 단백질을 LC-ESI-MS 기법을 통하여 발굴하고 상피세포 특이적으로 발현됨을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

Claims (10)

  1. (1) M. abscessus를 상피세포 또는 큰포식세포로 감염시키거나, 상피세포에 감염시킨 후 큰포식세포로 감염시키는 단계; (2) 상기 감염 조건에서 특이적으로 발현되는 M. abscessus의 단백질을 확인하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)에서 확인된 단백질과 M. abscessus 감염에 의한 폐질환 환자의 혈청을 반응하여 M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질을 선별 및 동정하는 단계를 포함한 M. abscessus 감염 진단용 항원 스크리닝 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질은 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase)인 것을 특징으로 하는 M. abscessus 감염 진단용 항원 스크리닝 방법.
  4. 삭제
  5. (1) M. abscessus를 지정된 산소 및 pH 조건에서 배양시키는 단계; (2) 상기 조건에서 특이적으로 발현되는 M. abscessus의 분비 단백질을 발굴하는 단계; 및 (3) 상기 단계 (2)에서 발굴된 단백질과 M. abscessus 감염에 의한 폐질환 환자 혈 청을 반응하여 M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질을 선별 및 동정하는 단계를 포함한 M. abscessus 감염 진단용 항원 스크리닝 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 단계 (1)에서 산소 조건은 10 내지 25%이고, pH 조건은 pH 5.0 내지 7.5인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 단계 (1)에서 pH7.0 및 21% O2, pH7.5 및 21% O2, pH6.0 및 21% O2, pH5.0 및 21% O2, 또는 pH5.0 및 13% O2 조건하에서 배양을 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 삭제
  9. 제 5항에 있어서, 상기 M. abscessus 감염 혈청에 특이적으로 반응하는 단백질은 카탈라아제(catalase)인 것을 특징으로 하는 M. abscessus 감염 진단용 항원 스크리닝 방법.
  10. 삭제
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