KR101359801B1

KR101359801B1 - 결핵 진단을 위한 항원 조성물, 이를 포함하는 결핵 진단 키트 및 이를 이용한 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법

Info

Publication number: KR101359801B1
Application number: KR1020120099131A
Authority: KR
Inventors: 박영길; 김정란
Original assignee: 사단법인대한결핵협회
Priority date: 2012-09-07
Filing date: 2012-09-07
Publication date: 2014-02-07

Abstract

본 발명은 결핵 진단을 위한 항원 조성물, 이를 포함하는 결핵 진단 키트 및 이를 이용한 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로서, 결핵 진단을 위해 필요한 혈액량이 종래의 결핵 진단용 키트에 비하여 현저하게 감소되면서도 잠복 결핵 환자까지 진단할 수 있는 결핵 진단을 위한 항원 조성물, 이를 포함하는 결핵 진단 키트 및 이를 이용한 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

Description

결핵 진단을 위한 항원 조성물, 이를 포함하는 결핵 진단 키트 및 이를 이용한 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법{COMPOSITION CONTAINING M.TUBERCULOSIS ANTIGENS, DIAGNOSTIC KIT FOR DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS COMPRISING THEREOF, AND METHOD OF PROVIDING INFORMATION FOR DIAGNOSIS OF TUBERCULOSIS USING THEREOF}

본 발명은 결핵 진단을 위한 항원 조성물, 이를 포함하는 결핵 진단 키트 및 이를 이용한 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것으로서, 결핵 진단을 위해 필요한 혈액량이 종래의 결핵 진단용 키트에 비하여 현저하게 감소 되면서도 잠복 결핵 환자까지 진단할 수 있는 결핵 진단을 위한 항원 조성물, 이를 포함하는 결핵 진단 키트 및 이를 이용한 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

전염성이 높은 결핵은 세계 인구의 약 3분의 1이 감염되어 있으며, 결핵에 일단 감염되면 감염자의 90% 이상은 잠복 감염의 형태로 질병이 진행되며, 감염자의 약 5-10%에서 결핵이 발병한다.

현재 우리나라는 OECD 국가 중에 결핵발생률, 유병률, 사망률 등이 가장 높다. 질병관리본부에서 발표한 결핵환자 신고 현황 연보에 따르면 2010년도 신고된 신환자율은 인구 십만 명당 74.3명이며, 이 중에 주변 사람에게 전염시킬 수 있는 도말 양성 환자의 신고 신환자율은 십만 명당 22명으로 보고되었다.

결핵은 결핵균에 감염에 의한 것으로 주로 폐에 영향을 미치며 다른 신체 부위에도 감염된다. 결핵에 일단 감염되면 정상인의 90% 이상은 잠복감염의 형태로 질병이 진행되며, 감염자의 약 5-10%에서 결핵이 발병한다. 즉 몸의 면역체계가 결핵균의 성장을 막지 못하여 세균 감염될 경우, 병균을 타인에게 전염시킬 수 있다.

결핵균의 감염은 3단계 구성이다. 급성시기에 박테리아는 장기에서 면역 반응이 증가될 때까지 증가한다. 민감해진 CD4 T 림포사이트(CD4 T Lymphocyte)가 감염 조절을 매개하며 가장 중요한 매개 분자는 인터페론 감마(IFN-γ)로 보인다. 박테리아의 양이 감소하기 시작하고 박테리아의 양이 낮은 단계에서 일정하게 유지되면, 잠복 시기가 형성된다. 이 기간에 결핵균은 활발한 증식을 하지 않고 육아종 내에 남아있는 비활동 상태로 전환한다. 일부의 경우, 감염이 재활동 시기로 전환되며 잠복중인 박테리아가 다시 복제를 시작한다. 결핵균이 초기 감염에서 잠복기로 전환할 때 유전자 발현 변화가 동반하는 것으로 제시되었다 (Honer zu Bentrup, 2001). 또한, 박테리아가 활성 복제기에서 잠복기로 전환하는 동안 박테리아가 유전자 발현을 조절하여 면역반응에 관한 항원 특이성에 변화가 나타날 가능성이 있다.

잠복기 감염 조절에 관한 면역 반응 전체 및 재활성 요인에 관하여 상당 부분이 알려지지 않았다. 그러나 우성 세포 종류의 변경에 의한 것이라고 일부 증명되었다. CD4 T 세포는 급성시기에 감염 조절에 필수적이고 충분하며 CD8 T 세포는 잠복기에 더 중요하게 반응한다고 알려졌다. 1998 Cole 등은 결핵균의 게놈 배열 전체를 발표하였으며 뉴클리오티드 배열 및 추정의 단백질 배열을 밝히는 약 4,000의 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)(Cole et al 1998)의 존재를 예측하였다.

활동성 결핵은 매우 전염성이 강하여, 빠른 진단과 조기 치료는 활동성 결핵의 조절과 박멸에 중요한 요소이다. 활동성 결핵은 오랜 기간 1개 이상의 항생제 치료를 통해 치료될 수 있다. 그러나, 일부 환자는 치료 과정이 적합하지 않아 재발하는 경우도 있다. 또한 감염된 개체가 무증상이지만 전염성을 가지는 경우도 있다.

비활동성 결핵은 결핵균에 감염은 되었으나 잠복 감염의 형태로 몸의 면역체계가 세균감염을 통제하므로 임상적으로 결핵 증상이 없고, 세균학적으로나 방사선상의 결핵 검사 등에서는 음성이 나타나며 타인에게 전파를 할 수 없는 상태이다. 하지만 비활동성 결핵이라고 하더라도 면역력이 악화되었을 경우 재활성화되어 활동성 결핵으로 나타날 수도 있다. 국내의 경우 3명중 1명은 잠복결핵감염자로 추정하고 있다.

이러한 결핵 발병 환자를 정확하게 치료하기 위해서는 활동성 결핵과 잠복 결핵을 정확하게 진단하여 결핵 발병한 사람에게만 약물복용을 실시하는 것이 필요하다. 잠복 결핵이지만 발병되지 않은 사람에게까지 예방화학치료는 약물남용으로 인한 부작용 및 경제적 손실을 가져올 수 있다. 특히 한국과 같이 잠복 결핵 감염자가 많은 경우, 활동성 결핵환자로부터 잠복 결핵감염자를 효과적으로 분리할 수 있는 신속하고 정확한 진단 방법의 개발이 필요하다.

현재에 사용되는 결핵 진단 검사들은 객담과 같은 환자 샘플에서 항산균 염색에 의한 도말 검사, 결핵균 배양 검사, 결핵균 핵산 증폭 검사와 같은 분자 생물학적 검사이다. 이외에도 흉부 X선 검사, 흉부 전산화 단층 촬영이 있으며, 면역학적 진단법으로 투베르쿨린 검사와 인터페론 감마분비 검사 등이 있다.

활동성 결핵을 빠르게 검사하는 방법으로 도말 검사는 객담을 항산균 염색에 의해 직접 현미경으로 관찰하는 방법이다. 이 방법은 역학적으로 중요한 전염력이 높은 환자를 신속하게 검출하고 검사방법이 용이한 장점이 있으나 민감도가 25-75%로 다양하다. 도말 양성 객담에서는 결핵균을 검출하는 민감도와 특이도가 높은 편이나, 도말 음성 객담에서는 낮은 편이다.

배양 검사는 표준화된 방법으로 형태학적으로 비결핵성 마이코박테리움(nontuberculous mycobacterium, NTM)으로부터 M. tuberculosis를 구분할 수 있으며 도말 검사에 비해 민감도가 높고, 결핵균을 분리할 수 있어 정확한 진단이 가능하다. 그러나, 약제 처방 결정을 위한 약제 감수성 검사에 유용하지만, 3-8주의 긴 배양시간이 필요로 하며 감염의 위험성이 매우 높으며 일부 항산균이 증식할 수 없다는 단점이 있다. 최근 액체배양법은 2주 정도에 결핵균의 배양여부를 알 수 있으므로 고체배지에 비해 결과를 빨리 알 수 있으나 균 동정이 필요로 하며 고체배양에 비해 위험성이 훨씬 높다.

분자생물학적 검사인 결핵균 핵산증폭검사는 객담이나 결핵균에 특이적인 유전자를 중합효소 연쇄반응을 이용하여 증폭하여 확인하는 검사법으로 신속하게 결과를 볼 수 있으며 도말 검사보다 높은 민감도를 나타내는 장점을 가지고 있어 보조검사로 유용하지만, 도말 검사보다 비용이 많이 들고 민감도와 특이도가 다양하다.

면역학적 진단법인 투베르쿨린 검사와 인터페론 감마분비 검사는 잠복 결핵과 활동성 결핵을 진단할 수 있다고 알려져 있다.

투베르쿨린 검사는 결핵균 배양액으로부터 유래된 정제 PPD를 피내 주사하여 이전에 결핵균에 감작된 T 림프구에 의한 지연과민반응을 접종부위의 결절 크기로 확인하는 방법으로 체내검사이므로 검사자와 검사환경에 의한 오류가 적으며, 축적된 임상자료가 많고, 적은 비용의 장점을 가지고 있으나, 체내검사의 이상반응에 의한 부작용을 유발할 수 있으며, BCG 예방접종이나 비결핵성 마이코박테리움에 의한 위양성 문제와 10-20%는 면역저하와 같은 이상없이 위음성을 보이는 문제점이 있다.

인터페론 감마 분비 검사는 투베르쿨린 검사와 같이 결핵균에 감작된 T 세포에 의한 지연 과민반응에 의한 검사로 BCG 예방 접종이나 대부분의 병원성 NTM에서는 존재하지 않는 결핵균 특이항원인 ESAT-6와 CFP-10을 사용하므로 투베르쿨린 검사보다 결핵감염에 대한 특이도가 높으며, 체외반응으로 이상반응이 없으며, 재검사시 증폭효과가 없다는 장점을 가지고 있지만, 비용이 많이 들고 소아에게는 축적된 임상자료가 부족하며, 혈액 검체의 취급하여 주의를 요하는 단점을 가지고 있다. 또한 항원을 2-3개(ESAT-6, CFP-10, TB7.7) 사용할 경우 잠복 감염에 대한 민감도가 낮아지는 원인이 될 수 있다.

또한, 투베르쿨린 검사와 인터페론 감마 분비 검사는 잠복 결핵 및 활동성 결핵을 진단할 수 있는 유용한 방법이지만, 잠복결핵과 활동성 결핵을 구별할 수는 없으므로 잠복 결핵 진단과 활동성 결핵 치료에 이용할 수 없다는 단점을 가지고 있다.

이밖에 활동성 결핵을 신속하게 진단하는 방법으로 혈청학적 진단 방법이 있다. 혈청학적 진단법은 약 90% 정도 결핵환자가 결핵 항원들에 대한 항체를 생성하므로, 이러한 결핵 항원 반응 항체를 검출하여 진단하는 것이다. 결핵이 활발하게 증식하는 경우 감염자의 혈청에서는 다양한 결핵 반응 항체가 검출된다. 중국과 인도 등을 포함하여 22개의 국가에서는 상용화된 혈청학적 진단 키트를 사용하고 있다.

그러나 혈청학적 진단법은 사람과 사람간의 면역반응의 다양성으로 인해 민감도가 25-75%로 변화가 심하다는 단점을 가지고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위한 방안으로 민감도가 높은 결핵 항원들을 선별하여 복합체를 만들어 사용하여 민감도를 높여야 하지만, 국내에서는 활동성 결핵을 진단하기 위한 상용화된 혈청학적 진단 키트가 없다는 문제가 있다.

이에, 본 발명자들은 새로운 결핵 특이적 항원을 찾고자 연구한 결과, 결핵 환자의 혈청에 의해 인식되는 항원들의 조합을 발굴하고, 이를 포함한 항원 조성물, 이를 이용한 결핵 진단방법 및 진단 키트를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 결핵 진단법의 문제점을 해결하기 위해 활동성 결핵뿐만 아니라 잠복 결핵까지 진단할 수 있는 복수의 항원을 포함하는 결핵 진단을 위한 항원 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 상기 복수의 항원을 포함하는 결핵 진단을 위한 항원 조성물을 포함하는 결핵 진단 키트 및 이를 이용한 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위해 38kDa, CFP-10 및 malate synthase를 포함하는 결핵 진단용 항원 조성물을 제공한다.

본 발명의 결핵 진단용 항원 조성물에 있어서, 38kDa 항원 100 중량부당 CFP-10 항원을 40 내지 60 중량부, malate synthase 항원을 40 내지 60 중량부 포함하는 것이 바람직하고, 특히, 상기 CFP-10 항원과 상기 malate synthase 항원을 같은 비율로 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 결핵 진단용 항원 조성물에 있어서, 상기 결핵 진단용 항원 조성물은 ESAT-6, 16KDa, Rv3872, Rv3878, MPT64, Ag85b, HBHA, Rv2660c, Rv2659, MPT51, TB16.3, TB9.7 및 TB51을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 결핵 진단용 항원 조성물에 있어서, 상기 결핵 진단용 항원 조성물은 38kDa 항원 100 중량부당 ESAT-6, 16KDa, Rv3872, Rv3878, MPT64, Ag85b, HBHA, Rv2660c, Rv2659, MPT51, TB16.3, TB9.7 및 TB51 항원을 각각 0.5 중량부 이상 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 결핵 진단용 항원 조성물을 포함하는 결핵 진단 키트를 제공한다.

본 발명은 또한, 시료와 본 발명의 결핵 진단용 항원 조성물을 반응시키는 단계; 및 항원-항체 복합체의 형성 여부를 측정하는 단계;를 포함하는 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공한다.

본 발명의 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법에 있어서, 상기 결핵 진단용 항원 조성물은 본 발명에 의한 항원 조성물로서, 38kDa, CFP-10, 및 malate synthase을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법에 있어서, 상기 결핵 진단용 항원 조성물은 본 발명에 의한 항원 조성물로서, ESAT-6, 16kDa, Rv3872, Rv3878, MPT64, Ag85b, HBHA, Rv2660c, Rv2659, MPT51, TB16.3, TB9.7 및 TB51을 더 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법에 있어서, 상기 결핵 진단 방법은 폐결핵을 진단하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법에 있어서, 상기 결핵 진단 방법은 잠복 결핵 감염자를 음성으로 판단하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 결핵 진단을 위한 항원 조성물, 이를 포함하는 결핵 진단 키트 및 이를 이용한 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법은 종래의 진단하기 어려운 활동성 결핵과 잠복 결핵을 24시간 내에 신속하게, 기존의 방법보다 적은 양의 혈액 샘플을 이용하여 진단 할 수 있으며, 혈장을 이용하여 진단하므로 혈액 세포를 이용하거나 객담을 이용하여 진단하는 방법에 비해 용이하고 정확하게 진단할 수 있다.

도 1, 도 2는 본 발명의 일 실시예에 의하여 대장균에서 제조된 결핵 항원을 전기영동(SDS-PAGE) 후 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 염색 및 HIS와 GST 항체를 이용하여 웨스턴 블럿(Western blot) 분석법에 의해 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의하여 활동성 결핵환자에서 검출된 시료에 대한 항원-항체 반응의 결과이다.

이하에서는 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 본 발명이 아래 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 결핵 항원 조성물의 제조

본 발명에 의한 결핵 항원 조성물은 (1) M. tuberculosis H37Rv DNA를 주형으로 하여 항원 특이적이며 제한효소를 함유한 프라이머를 이용하여 유전자를 증폭하는 단계 ; (2) 증폭시킨 유전자를 제한 효소로 처리한 후 대장균에서 증폭할 수 있는 플라스미드에 연결시키는 단계; (3) 결핵항원 유전자를 함유한 플라스미드로 대장균(E. coli)을 형질 전환하는 단계; (4) 형질전환된 대장균에서 효율적으로 단백질을 유도하는 단계; (5) 형질전환된 대장균에서 발현된 단백질을 확인하는 단계로 제조하였다.

먼저, 하기 표 1에서와 같이 결핵 항원을 선택하였다. 선택된 항원을 하기 표 1의 유전자 서열을 가진 프라이머를 사용하고 M. tuberculosis H37Rv genomic DNA를 주형으로 하여 증폭하였다. 증폭된 유전자 산물을 제한효소로 절단하여 정제한 후 연결(ligation)시켜서 플라스미드를 제조하고, 제조된 플라스미드로 대장균(E. coli BL21)을 형질 전환시켰다.

항원	primers	제한효소	vector
ESAT-6	F: cgggatcc ATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTC	BanHI	pGEX4T
	R: ccgctcgag CTATGCGAACATCCCAGTGACG	XhoI
CFP-10	F: cgggatcc ATGGCAGAGATGAAGACCGATG	BamH1	pGEX4T
	R: cggaattc TCAGAAGCCCATTTGCGAG	EcoRI
Rv3872	F: cggaattc ATGGAAAAAATGTCACATGATCCGATCG	EcoRI	pGEX4T
	R: ccgctcgag TTCGGCGAAGACGCCGGC	XhoI
HBHA	F: cggaattcgcc ATGGCTGAAAACTCGAACATTGATG	EcoRI	pGEX4T
	R: acgcgtcgac CTTCTGGGTGACCTTCTTGG	SalI
16kDa	F: cgggatcc ATGGCCACCACCCTTCCCGTTCA	BamHI	pET21a
	R: ccgctcgag GTTGGTGGACCGGATCTGAATGTG	XhoI
38kDa	F: cggaattc ATGCGTTTGCATACGCTGTTGGCC	EcoRI	pET21a
	R: ccgctcgag GCTGGAAATCGTCGCGATCAACG	XhoI
Mpt64	F: cggaattc ATGGCGCCCAAGACCTACTGCGA	EcoRI	pET21a
	R: ccgctcgag GGCCAGCATCGAGTCGATCGCGGAA	XhoI
Malate syn	F: cggaattc ATG ACAGATCGCGTGTCGGTGG	EcoRI	pET21a
	R: ccg ctcgag GCGGGCCGCATCGTCACCGGCC	XhoI
Ag85A	F: cgggatcc ATGCAGCTTGTTGACAGGGTTC	BamHI	pET21a
	R: cgagctctc GGCGCCCTGGGGCG	SacI
Ag85B Part	F: cggaattc ATGTTCTCCCGGCCGGGG	EcoRI	pET21a
	R: acgcgtcgac GCCGGCGCCTAACGAACT	SalI
Rv3878	F: cggaattc ATGGCTGAACCGTTGGCCG	EcoRI	pET21a
	R: ccgctcgag CAACGTTGTGGTTGTTGAGGG	XhoI
Rv2660c	F: cggaattc ATGATAGCGGGCGTCGACCAG	EcoRI	pET21a
	R: ccgctcgag GTGAAACTGGTTCAATCCCAG	XhoI
Rv2659	F: cggaattc ATGACGCAAACCGGCAAGCG	EcoRI	pET21a
	R: ccgctcgag CATCTCCTGGTTCTCGGCCAG	XhoI
CFP-10	F: cgggatcc ATGGCAGAGATGAAGACCGA	BamHI	pET21a
	R: cccaagctt GAAGCCCATTTGCGAGGACA	HindIII
ESAT-6	F: cccaagctt ATGACAGAGCAGCAGTGGAA	HindIII	pET21a
	R: ccgctcgag TGCGAACATCCCAGTGACG	XhoI
MPT51	F: cccaagctt ATGAAGGGTCGGTCGGCGCT	HindIII	pET21a
	R: ccgctcgag GCGGATCGCACCGACGATAT	XhoI
TB16.3	F: ccgaagctt ATGGTGGCGGACAAGACGAC	HindIII	pET21a
	R: ccgctcgag GCCCTCGACTCGTTTCTTCA	XhoI
TB9.7	F: ccggaattc ATGAACCTACGGCGCCATCA	EcoRI	pGEX4T
	R: ccgctcgag GGACCCGGGCAGCCCCGGCA	XhoI
TB51	F: ccgaagctt ATGGTGAAGAGCACCGTCGA	HindIII	pET21a
	R: ccgctcgag CGTTGTCGCTTCGTCGGACG	XhoI

이와 같이 제조된 결핵 항원 조성물의 발현 여부를 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 후 쿠마씨 블루(Coomassie blue) 염색 및 HIS와 GST 항체를 이용하여 웨스턴 블럿 분석법에 의해 확인하고 그 결과를 도 1, 도 2에 나타내었다.

도 1, 도 2에서 결핵 항원 단백질 발현이 확인된 대장균은 12,000 rpm에서 1분간 원심 분리하여 세포를 수집하였다. 수집된 세포는 샘플 버퍼를 첨가하고 3분간 끓인 후 12,000 rpm에서 3분간 원심분리하여 상등액을 회수하여 결핵 항원 조성물을 제조하였다.

< 실시예 2> 활동성 결핵 환자의 결핵 진단을 위한 정보 제공

상기 실시예 1에서 제조된 결핵 항원 조성물의 활동성 결핵 환자에 대한 진단 결과를 알아보기 위해 상기 실시예 1에서 제조된 결핵 항원 조성물과 활동성 결핵 환자로부터 채취한 시료와 반응시키고 결과를 관찰하였다.

먼저, 활동성 결핵 환자로부터 혈액을 채취하고, 채혈한 혈액을 원심분리하여 혈청을 준비하였다.

상기 실시예 1에서 제조된 결핵 항원 조성물을 12% SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 전기영동하고 나이트로 셀룰로우스 막(nitrocellulose membrance)에 전이시킨 후 5% skim milk가 함유된 TBST buffer(10mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0.1% Tween 20)에서 브로킹하였다. 이후, 하나의 나이트로 셀룰로우스 막 (nitrocellulose membrance)에 상기 환자로부터 채취한 시료 6ul 와 1% skim milk를 포함하는 10 ml의 TBST buffer에서 약 12시간 동안 4℃에서 항원에 대한 반응을 실시하였다. 반응시킨 나이트로 셀룰로우스 막은 TBST buffer로 3번 세척한 후 2차 항체인 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase, HRP)가 결합되어 있는 인간 면역글로불린 G(horseradish peroxidase conjugated anti-human IgG)를 1:10,000으로 희석하여 10ml에서 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 3번의 세척 과정이 거쳐서 ECL 용액 A와 B를 1:1로 반응시킨 후 X-ray 필름에 노출시켜 결핵 항원 단백질에 대한 반응 여부는 검은 띠의 생성 여부로 판단하였다.

웨스턴 블롯을 실시한 결과는 도 3에 나타내고, 활동성 결핵 환자 각각에 대한 검출 결과는 표 2 에 나타내었다.

도 3에서 활동성 결핵 환자 P6의 경우 Rv3872, CFP-10, 16kDa, 38kDa, Malate synthase에 반응하는 항체를, 활동성 결핵환자 P17의 경우 16kDa과 38kDa에 반응하는 항체를, 활동성 결핵환자 P23 은 38kDa과 Rv3878에 강하게 반응하였고, Ag85b에는 상대적으로 약하게 반응하는 항체를 보유하였다. 활동성 결핵환자 P35 의 경우는 CFP-10, ESAT-6, 38kDa, malate synthae에 대하여 반응하는 항체를 보유하였다.

표 2에서 활동성 결핵환자의 혈액으로부터 분리된 혈장은 결핵 항원 조성물에 포함된 다양한 결핵 항원과 반응하는 것을 알 수 있다. 표 2에서 활동성 결핵 환자의 경우, 총 50명의 혈청에서 5명을 제외한 45명(90%)에서 항원 항체반응을 나타내었으며, 특히 40명(80%)은 아주 강한 반응을 보여주었다.

활동성 결핵환자에 대해 민감도가 높게 반응한 항원으로는 38kDa(68%, 50명의 활동성 결핵환자에서 34명 검출), CFP-10(46%, 50명의 환자 중 23명 검출), malate synthase (26%, 50명의 환자 중 13명 검출), ESAT-6(26%, 50명의 환자 중 13명 검출)로 나타났다. 특히 38kDa, CFP-10, malate synthase를 혼합하여 사용하였을 경우 90%의 활동성 결핵환자를 검출할 수 있다.

활동성 결핵 환자들로부터 채취한 시료에 대한 항원 항체 반응 결과로부터 상기 실시예 1에서 제조된 결핵 항원 조성물이 진단 효율이 90% 이상의 효율을 가지고 결핵 진단을 위한 정보를 제공하는 것을 알 수 있다.

비교예로서 활동성 결핵 환자에 대한 배양 검사와 도말 검사를 수행하고 그 결과를 표 2에 함께 나타내었다. 표 2의 배양검사 (culture)와 도말검사(smear)의 반응 결과에서 +++는 강한 항원 항체 반응을 보이는 경우, +/-의 경우는 반응시간이나 조건에 따라 나타나는 경우를 보여준다.

< 실시예 3> 정상인과 잠복 결핵 감염자 에 대한 결핵 항원의 진단

상기 실시예 1에서 제조된 결핵 항원 조성물이 잠복 결핵 감염자를 진단할 수 있는지 알아보기 위해, 정상인과 잠복 결핵 감염자로부터 채취한 시료를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 2와 동일하게 하여 상기 실시예 1에서 제조된 결핵 항원 조성물을 반응시키고 그 결과를 표 3에 나타내었다.

표 3에서 본 발명의 결핵 항원 조성물과 반응시킨 결과에서는 정상인 10명 중에 한 명(N10)이 본 발명의 결핵 항원 조성물 중 Rv3872에서 약하게 반응을 보였으며, 38kDa에서 아주 희미하게 반응을 나타내었다. 또 다른 정상인(N7)에서 아주 희미하게 반응하였다.

비교예로서 정상인과 잠복 결핵 감염자에 대한 배양 검사, 도말 검사 및 인터페론 감마 분비 검사를 수행하고 그 결과를 표 3에 함께 나타내었다. 비교예로서 수행한 배양 검사(culture)와 도말 검사(smear)는 정상인(N) 및 잠복 감염자 모두에 대해 음성을 나타내고, 인터페론 감마 분비 검사의 경우 정상인은 음성으로 검출되고, 잠복결핵감염자는 양성으로 검출되어 배양 검사(culture), 도말 검사(smear) 및 인터페론 감마 분비 검사의 경우 정상인과 잠복 결핵 감염자와의 검사 결과의 차이가 없었다.

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결핵균의 항원인 38kDa, CFP-10 및 malate synthase를 38kDa 항원 100 중량부당, CFP-10 항원을 40 내지 60 중량부, malate synthase 항원을 40 내지 60 중량부 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 항원 조성물.
제 2 항에 있어서,
상기 결핵 진단용 항원 조성물은 결핵균의 항원인 ESAT-6, 16KDa, Rv3872, Rv3878, MPT64, Ag85b, HBHA, Rv2660c, Rv2659, MPT51, TB16.3, TB9.7 및 TB51 항원을 더 포함하는 것인 결핵 진단용 항원 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 결핵 진단용 항원 조성물은 결핵균의 항원인 38kDa 항원 100 중량부당 결핵균의 항원인 ESAT-6, 16KDa, Rv3872, Rv3878, MPT64, Ag85b, HBHA, Rv2660c, Rv2659, MPT51, TB16.3, TB9.7 및 TB51 항원을 각각 0.5 중량부 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단용 항원 조성물.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 의한 항원 조성물을 포함하는 결핵 진단 키트.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 하나의 항에 의한
시료와 결핵 진단용 항원 조성물을 반응시키는 단계; 및
항원-항체 복합체의 형성 여부를 측정하는 단계; 를 포함하는 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법.
삭제
제 6 항에 있어서,
상기 결핵 진단 방법은 폐결핵을 진단하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법.
제 6 항에 있어서,
상기 결핵 진단 방법은 잠복 결핵 감염자를 음성으로 판단하는 것을 특징으로 하는 결핵 진단을 위한 정보 제공 방법.