JPS60227169A - 結核菌リン脂質抗体感作ラテツクス及びそれを用いた結核菌リン脂質の検出方法 - Google Patents
結核菌リン脂質抗体感作ラテツクス及びそれを用いた結核菌リン脂質の検出方法Info
- Publication number
- JPS60227169A JPS60227169A JP8289884A JP8289884A JPS60227169A JP S60227169 A JPS60227169 A JP S60227169A JP 8289884 A JP8289884 A JP 8289884A JP 8289884 A JP8289884 A JP 8289884A JP S60227169 A JPS60227169 A JP S60227169A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- phospholipid
- latex
- antibody
- sensitized
- mycobacterium tuberculosis
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、結核菌リン脂質抗体感作ラテックス及びそれ
を用いた結核菌リン脂質の検出方法に関し、更に詳しく
は、結核菌リン脂質を簡易かつ高精度に測定可能な結核
菌リン脂質抗体感作ラテックス及びをれを用いた結核菌
リン脂質の検出方法に関する。
を用いた結核菌リン脂質の検出方法に関し、更に詳しく
は、結核菌リン脂質を簡易かつ高精度に測定可能な結核
菌リン脂質抗体感作ラテックス及びをれを用いた結核菌
リン脂質の検出方法に関する。
結核、特に肺結核は非常に頻度の高い呼吸器疾患であり
（日本における年間患者数：約１０万人）、結核菌の感
染によって惹起されることは既に周知の通りである。現
在、この結核の診断法として、結核菌の分離培養、胸部
レントゲン所見、ツベルクリン反応などが用いられてい
る。この内、結核菌の分離培養は最も確実な診断法であ
るか、結核菌は発育が緩慢なため、分離培養には８〜１
２週間を要し、しかも、分離培養できるのは排菌者だけ
に限られ、大部分の患者である非枡菌者は培養陰性と診
断される。即ち、たとえ排菌者でも早期の診断は不可能
である。その点ではツベルクリン反応は短時間で結果が
得られるが、この反応は結核菌の感染の過去における既
往を示すだけであり、既往があれば、健康者でも、結核
以外の呼吸器感染症でも、はとんど、すべての人が陽性
を示すので、現疾患の診断には参考程度にしかならない
。そこで、最も高く評価されているのは胸部レントゲン
所見であるが、結核のみに特有の肺陰影所見というもの
は存在せず、肺真菌症、肺癌、肺吸虫症などとレントゲ
ン所見のみで確実に鑑別することは多くの場合不可能で
あることも周知の通りである。しかし、肺真菌症、肺吸
虫症、肺癌などと結核では治療薬も治療方針も全く異な
るので、早期における確実な診断は是非とも必要である
。
（日本における年間患者数：約１０万人）、結核菌の感
染によって惹起されることは既に周知の通りである。現
在、この結核の診断法として、結核菌の分離培養、胸部
レントゲン所見、ツベルクリン反応などが用いられてい
る。この内、結核菌の分離培養は最も確実な診断法であ
るか、結核菌は発育が緩慢なため、分離培養には８〜１
２週間を要し、しかも、分離培養できるのは排菌者だけ
に限られ、大部分の患者である非枡菌者は培養陰性と診
断される。即ち、たとえ排菌者でも早期の診断は不可能
である。その点ではツベルクリン反応は短時間で結果が
得られるが、この反応は結核菌の感染の過去における既
往を示すだけであり、既往があれば、健康者でも、結核
以外の呼吸器感染症でも、はとんど、すべての人が陽性
を示すので、現疾患の診断には参考程度にしかならない
。そこで、最も高く評価されているのは胸部レントゲン
所見であるが、結核のみに特有の肺陰影所見というもの
は存在せず、肺真菌症、肺癌、肺吸虫症などとレントゲ
ン所見のみで確実に鑑別することは多くの場合不可能で
あることも周知の通りである。しかし、肺真菌症、肺吸
虫症、肺癌などと結核では治療薬も治療方針も全く異な
るので、早期における確実な診断は是非とも必要である
。
このために、古くから結核菌抗体測定法が数多く開発さ
れてきた。しかし、結核菌抗体の多くは結核菌感染の既
往によって陽性を示し、現病変との関連が明確ではない
。中には、リン脂質抗体のように単なる感染の既往では
産生されにくいものもあるが、それでも健康者で５％が
陽性を示し、確実な診断を下しきれない。
れてきた。しかし、結核菌抗体の多くは結核菌感染の既
往によって陽性を示し、現病変との関連が明確ではない
。中には、リン脂質抗体のように単なる感染の既往では
産生されにくいものもあるが、それでも健康者で５％が
陽性を示し、確実な診断を下しきれない。
しかし、ヒトに結核菌感染が成立すると、先ず菌体成分
の血中への遊離、放出がおこり、抗原血症を起すので、
抗原となる菌体成分を特異的に検出することができれば
、結核を極めて早期に診断することが可能となる。この
場合、検出の対象となる抗原は、安定な物質で、すべて
の菌株に含まれる結核菌独自の抗原でなければならない
。また、感染によって血中に遊離した抗原は患者血中に
感染前から既に存在していた抗体と結合して、抗原抗体
結合物、即ち免疫複合体を形成し、遊離の抗原として存
在していることは少ないので、この免疫複合体から容易
に抗原を解離させて測定に供試しうるようなシステムが
可能な物質でなければならない。このような観点から、
本発明者は、抗原としてすべての結核菌菌株に含まれる
リン脂質を抗原として用いた。結核菌は、細胞壁中にリ
ン脂質を含有し、感染後、血中に放出される耐熱性の極
めて安定な物質である。このリン脂質はリン脂質抗体と
特異的に結合するので、免疫によって作製した結核菌菌
体抗体から抗リン脂質抗体を特異的に分離精製し、これ
をラテックスに感作し、逆受身ラテックス凝集反応によ
って、リン脂質抗原を検出する方法を確立し、本発明を
完成するに至った。この方法を用いれば、結核を極めて
簡単な操作で、発症初期に確実に診断することができる
。従来、血中に存在する微量の単独又は免疫複合体を構
成する結核菌抗原を検出する方法は知られていなかった
ので、抗原検出による早期診断は全く不可能であったが
、このリン脂質抗原の検出方法の発明により、早期にお
ける結核の診断とこれに基づく治療が可能となった。
の血中への遊離、放出がおこり、抗原血症を起すので、
抗原となる菌体成分を特異的に検出することができれば
、結核を極めて早期に診断することが可能となる。この
場合、検出の対象となる抗原は、安定な物質で、すべて
の菌株に含まれる結核菌独自の抗原でなければならない
。また、感染によって血中に遊離した抗原は患者血中に
感染前から既に存在していた抗体と結合して、抗原抗体
結合物、即ち免疫複合体を形成し、遊離の抗原として存
在していることは少ないので、この免疫複合体から容易
に抗原を解離させて測定に供試しうるようなシステムが
可能な物質でなければならない。このような観点から、
本発明者は、抗原としてすべての結核菌菌株に含まれる
リン脂質を抗原として用いた。結核菌は、細胞壁中にリ
ン脂質を含有し、感染後、血中に放出される耐熱性の極
めて安定な物質である。このリン脂質はリン脂質抗体と
特異的に結合するので、免疫によって作製した結核菌菌
体抗体から抗リン脂質抗体を特異的に分離精製し、これ
をラテックスに感作し、逆受身ラテックス凝集反応によ
って、リン脂質抗原を検出する方法を確立し、本発明を
完成するに至った。この方法を用いれば、結核を極めて
簡単な操作で、発症初期に確実に診断することができる
。従来、血中に存在する微量の単独又は免疫複合体を構
成する結核菌抗原を検出する方法は知られていなかった
ので、抗原検出による早期診断は全く不可能であったが
、このリン脂質抗原の検出方法の発明により、早期にお
ける結核の診断とこれに基づく治療が可能となった。
即ち、本発明は、表面に結核菌リン脂質抗体を担持した
ラテックス粒子を含有する結核菌リン脂質抗体感作ラテ
ックス及び該感作ラテツクスをヒトの体液もしくはその
希釈液と接触させ、凝集像を観察することを特徴とする
結核菌リン脂質の検出方法に関するものである。
ラテックス粒子を含有する結核菌リン脂質抗体感作ラテ
ックス及び該感作ラテツクスをヒトの体液もしくはその
希釈液と接触させ、凝集像を観察することを特徴とする
結核菌リン脂質の検出方法に関するものである。
次に、本発明を更に詳細に説明する。
本発明の感作ラテツクスを製造するために用いるラテッ
クスは、ポリスチレン、カルボキシル化ホＩＪスチレン
、アミン基を有するカルボキシル化ポリスチレン、ポリ
ビニルトルエン、スチレン−ブタジェン共重合体、カル
ボキシル化スチレン−ブタジェン共重合体、スチレン−
ジビニルベンゼン共重合体、ビニルトルエン−第三ブチ
ルスチレン共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、
ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、アクリロニ
トリル−ブタジェン−スチレン共重合体、ポリ酢酸ビニ
ルアクリレート、ポリビニルピロリドン、塩化ビニル−
アクリレート共重合体等の合成高分子ラテックス粒子か
らなるラテックスであり、更にこれらの合成高分子ラテ
ックス粒子の表面を非イオン界面活性剤等で処理したも
のであってもよい。上記した合成高分子ラテックスのな
かでもポリスチレンラテックスが好ましい。ラテックス
粒子の粒径は、通常０．０５〜１０ルであり、好ましく
は ０．１〜１．０川であるが、分析試験結果の再現性
をよくするためには、粒径分布の幅が狭いもの、例えば
、±５％以下のものが望ましい。
クスは、ポリスチレン、カルボキシル化ホＩＪスチレン
、アミン基を有するカルボキシル化ポリスチレン、ポリ
ビニルトルエン、スチレン−ブタジェン共重合体、カル
ボキシル化スチレン−ブタジェン共重合体、スチレン−
ジビニルベンゼン共重合体、ビニルトルエン−第三ブチ
ルスチレン共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸、
ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、アクリロニ
トリル−ブタジェン−スチレン共重合体、ポリ酢酸ビニ
ルアクリレート、ポリビニルピロリドン、塩化ビニル−
アクリレート共重合体等の合成高分子ラテックス粒子か
らなるラテックスであり、更にこれらの合成高分子ラテ
ックス粒子の表面を非イオン界面活性剤等で処理したも
のであってもよい。上記した合成高分子ラテックスのな
かでもポリスチレンラテックスが好ましい。ラテックス
粒子の粒径は、通常０．０５〜１０ルであり、好ましく
は ０．１〜１．０川であるが、分析試験結果の再現性
をよくするためには、粒径分布の幅が狭いもの、例えば
、±５％以下のものが望ましい。
また、使用されるラテックス粒子の比重は０．９〜１．
４であることが好ましい。
４であることが好ましい。
次に、抗体の精製に用いる結核菌リン脂質は、培養菌菌
体から公知のリン脂質の調製法により得ることができる
。この方法の具体例としては、Ｌ、 Ｎｅｇｒｅが１９
５０年に提案した方法が挙げられるが、この方法により
得られたリン脂質は粗製であるため、精製したものを用
いることが望ましい。
体から公知のリン脂質の調製法により得ることができる
。この方法の具体例としては、Ｌ、 Ｎｅｇｒｅが１９
５０年に提案した方法が挙げられるが、この方法により
得られたリン脂質は粗製であるため、精製したものを用
いることが望ましい。
この精製法としては、例えば、高橋の方法 （Ｙ。
Ｔａｋａｈａｓｈｉ、 Ａｍｅｒ、 Ｒｅｖ、 Ｒｅ５
ｐ、 Ｄｉｓ、、８５巻、７０８頁、１９６２年） 、
Ａｎｄｅｒｓｏｎ法（山村雄−１結核菌の生化学、八女
出版、１８６５年）、Ｌｅｄｅｒｅｒ法（同前）等が挙
げられる。
ｐ、 Ｄｉｓ、、８５巻、７０８頁、１９６２年） 、
Ａｎｄｅｒｓｏｎ法（山村雄−１結核菌の生化学、八女
出版、１８６５年）、Ｌｅｄｅｒｅｒ法（同前）等が挙
げられる。
この結核菌リン脂質を調製するには、先ず、結核菌の培
養により菌体を調製する必要があるが、これに用いる菌
株、培地は多量の菌体が得やすければ通常用いられるど
のようなものでもよく、菌株や培地に限定されるもので
はない。培養菌体は加熱又はアセトンによって死菌とし
た後、アセトン抽出を繰り返し、このアセトン抽出後の
菌体から３７〜４５℃のメタノールで抽出した抽出液を
とる。これを居発乾固した後、熱アセトンで処理して不
溶性の残渣を分取し、クロロポルムに溶解した後、アセ
トンを加えて生じた沈澱を分取する。
養により菌体を調製する必要があるが、これに用いる菌
株、培地は多量の菌体が得やすければ通常用いられるど
のようなものでもよく、菌株や培地に限定されるもので
はない。培養菌体は加熱又はアセトンによって死菌とし
た後、アセトン抽出を繰り返し、このアセトン抽出後の
菌体から３７〜４５℃のメタノールで抽出した抽出液を
とる。これを居発乾固した後、熱アセトンで処理して不
溶性の残渣を分取し、クロロポルムに溶解した後、アセ
トンを加えて生じた沈澱を分取する。
これをメタノールに溶解し、４°Ｃに保存する。
結核菌菌体抗体は、常法に従って、抗体産生能を有する
動物を結核菌で免疫することにより容易に得ることがで
きる。
動物を結核菌で免疫することにより容易に得ることがで
きる。
次に、結核菌菌体抗体からリン脂質抗体を分取精製する
には次の方法に従う。先ず、菌体抗体中にリン脂質を混
合して免疫複合体を作らせ、遠心し〒分取する。これを
生理食塩水などで充分に洗浄して純粋なリン脂質免疫複
合体とし、これにＰＨ２，８の酢酸緩衝液を加えると抗
原と抗体が解離するので、遠心して上清の抗体分画のみ
を分取し、ｐＨを中性にする。
には次の方法に従う。先ず、菌体抗体中にリン脂質を混
合して免疫複合体を作らせ、遠心し〒分取する。これを
生理食塩水などで充分に洗浄して純粋なリン脂質免疫複
合体とし、これにＰＨ２，８の酢酸緩衝液を加えると抗
原と抗体が解離するので、遠心して上清の抗体分画のみ
を分取し、ｐＨを中性にする。
次に、リン脂質抗体をラテックス粒子に感作させるため
には、ラテックス粒子と抗体とを生理食塩水、ｐＨ５，
５〜１０、好ましくはｐＨ６，４〜７．６の各種緩衝液
等の中で、濃度０．０５〜３％のラテックス粒子と抗体
とを４〜４０℃において３０分〜２４時間ゆるやかに攪
拌しながら接触させることによって行なう。緩衝液とし
ては、例えば、リン酸塩緩衝食塩水、グリシン緩衝食塩
水等が挙げられる。感作終了後、水性溶媒、例えば、こ
れら緩衝液で洗浄することにより、ラテックス粒子に吸
着されない抗体を完全に除去する。更に、このラテック
スは希釈液に懸濁させてラテックス粒子の抗体未感作部
分を蛋白質で飽和しておくとよい。
には、ラテックス粒子と抗体とを生理食塩水、ｐＨ５，
５〜１０、好ましくはｐＨ６，４〜７．６の各種緩衝液
等の中で、濃度０．０５〜３％のラテックス粒子と抗体
とを４〜４０℃において３０分〜２４時間ゆるやかに攪
拌しながら接触させることによって行なう。緩衝液とし
ては、例えば、リン酸塩緩衝食塩水、グリシン緩衝食塩
水等が挙げられる。感作終了後、水性溶媒、例えば、こ
れら緩衝液で洗浄することにより、ラテックス粒子に吸
着されない抗体を完全に除去する。更に、このラテック
スは希釈液に懸濁させてラテックス粒子の抗体未感作部
分を蛋白質で飽和しておくとよい。
希釈液としては、例えば、グリシン緩衝食塩水、リン酸
塩緩衝食塩水等に牛血清アルブミン（以下ｒＢＳＡＪと
略記する）約０．１％を加えたものを用い、０．０１〜
０．５％のアジ化ナトリウム（ＮａＮ：＋）を加えてお
く。
塩緩衝食塩水等に牛血清アルブミン（以下ｒＢＳＡＪと
略記する）約０．１％を加えたものを用い、０．０１〜
０．５％のアジ化ナトリウム（ＮａＮ：＋）を加えてお
く。
このようにして得られた感作ラテツクスは０．２５重量
％程度に希釈液に懸濁させた状態で氷室に保存すること
が好ましい。
％程度に希釈液に懸濁させた状態で氷室に保存すること
が好ましい。
本発明のリン脂質抗体感作ラテックスは結核菌リン脂質
により凝集されるので、先ずヒトの血清などの体液を蒸
留水で４倍に希釈し、これを １００℃でｌＯ〜２０分
程度加熱して、免疫複合体を構成する抗体部分を失活さ
せてリン脂質を遊離の状態にし、この溶液又はその希釈
液にリン脂質抗体感作ラテックスを接触させると、加熱
体液又はその希釈液中に抗原が存在すれば感作ラテツク
スは凝集反応を起す。
により凝集されるので、先ずヒトの血清などの体液を蒸
留水で４倍に希釈し、これを １００℃でｌＯ〜２０分
程度加熱して、免疫複合体を構成する抗体部分を失活さ
せてリン脂質を遊離の状態にし、この溶液又はその希釈
液にリン脂質抗体感作ラテックスを接触させると、加熱
体液又はその希釈液中に抗原が存在すれば感作ラテツク
スは凝集反応を起す。
この反応をマイクロタイター法で行なう場合、マイクロ
プレート上に管底凝集像として認めることができる。即
ち、プレートに一定量の希釈液を滴下分注し、次いで、
＠１穴目に一定量の加熱体液を加え、グイリュータ−で
順次希釈する。これに感作ラテツクスを滴下分注し、一
定時間後に管底凝集像を判定する。この場合、濃度既知
の標準リン脂質抗原を併用するならば、この標準物質に
ついての凝集値から比例計算することにより未知の体液
濃度を計算することが容易であり、未知体液中のリン脂
質濁度をめることができる。
プレート上に管底凝集像として認めることができる。即
ち、プレートに一定量の希釈液を滴下分注し、次いで、
＠１穴目に一定量の加熱体液を加え、グイリュータ−で
順次希釈する。これに感作ラテツクスを滴下分注し、一
定時間後に管底凝集像を判定する。この場合、濃度既知
の標準リン脂質抗原を併用するならば、この標準物質に
ついての凝集値から比例計算することにより未知の体液
濃度を計算することが容易であり、未知体液中のリン脂
質濁度をめることができる。
本発明の感作ラテツクスは次の点で極めて大きな利点を
有している。即ち、体液中にはラテックスそのものに対
する非特異的凝集素、即ち担体に対する抗体が全く存在
しえず、また実際に発見されていないので、マイクロプ
レートのウェルに加熱した体液もしくはその希釈液を入
れ、これに感作ラテツクスを滴下するだけでよい。即ち
、リン脂質抗原の定量は極めて容易かつ簡便であり、特
別の技術を全く要しない。しかも抗体は精製されている
ので極めて特異的であり、しかも感度は人体液中の測定
に不足はないし、同時に多数の検体の定性及び／又は定
量を行なうことができる。
有している。即ち、体液中にはラテックスそのものに対
する非特異的凝集素、即ち担体に対する抗体が全く存在
しえず、また実際に発見されていないので、マイクロプ
レートのウェルに加熱した体液もしくはその希釈液を入
れ、これに感作ラテツクスを滴下するだけでよい。即ち
、リン脂質抗原の定量は極めて容易かつ簡便であり、特
別の技術を全く要しない。しかも抗体は精製されている
ので極めて特異的であり、しかも感度は人体液中の測定
に不足はないし、同時に多数の検体の定性及び／又は定
量を行なうことができる。
本発明の感作ラテツクスを用いれば、従来全く検出する
方法がなかった体液中の結核菌抗原濃度を短時間に容易
かつ簡便に定量することができ、結核の早期診断が正確
に行なえるようになり、早期から適切な治療を行なうこ
とができるようになる。
方法がなかった体液中の結核菌抗原濃度を短時間に容易
かつ簡便に定量することができ、結核の早期診断が正確
に行なえるようになり、早期から適切な治療を行なうこ
とができるようになる。
現在、結核菌抗原血症の診断方法は全く知られておらず
、脂質抗体感作ラテックスを記載した文献は全くなく、
脂質抗体感作ラテックスを用いる結核菌抗原の凝集反応
は全く新規である。
、脂質抗体感作ラテックスを記載した文献は全くなく、
脂質抗体感作ラテックスを用いる結核菌抗原の凝集反応
は全く新規である。
また、この感作ラテツクスは対応するリン脂質にのみ反
応し、他のグラム陽性桿菌抗原に全く反応しないこと、
未感作ラテックスはリン脂質に全く反応しないことから
、この感作ラテツクスは結核菌リン脂質抗体が結合して
いるものであるといえる。
応し、他のグラム陽性桿菌抗原に全く反応しないこと、
未感作ラテックスはリン脂質に全く反応しないことから
、この感作ラテツクスは結核菌リン脂質抗体が結合して
いるものであるといえる。
次に、本発明を調製例及び実施例によって更に詳細に説
明するが、本発明はその要旨を超えない限りこれらによ
って限定されるものではない。
明するが、本発明はその要旨を超えない限りこれらによ
って限定されるものではない。
結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ） Ｈ３７Ｒｖ株をツートン培地で３７℃で
８週間培養し、得られた菌体を １００°Ｃで６０分加
熱して死菌とした。これを約１０容のアセトンで４回抽
出を繰り返し、抽出後の菌体に５容のメタノールを加え
、４５℃で５時間ずつ３回抽出した。抽出液を合わせて
、これを減圧で乾固し、５容のアセトンを加え、８０
’Ｃ！の温浴中で１時間処理した後、残渣を集め５容の
クロロホルムに溶解した。これにアセトンを加えて、生
じた沈渣を集め、減圧で乾固した後、メタノールに溶解
した。５５ｇの菌体から １．３５ｇのリン脂質を得た
。
ｌｏｓｉｓ） Ｈ３７Ｒｖ株をツートン培地で３７℃で
８週間培養し、得られた菌体を １００°Ｃで６０分加
熱して死菌とした。これを約１０容のアセトンで４回抽
出を繰り返し、抽出後の菌体に５容のメタノールを加え
、４５℃で５時間ずつ３回抽出した。抽出液を合わせて
、これを減圧で乾固し、５容のアセトンを加え、８０
’Ｃ！の温浴中で１時間処理した後、残渣を集め５容の
クロロホルムに溶解した。これにアセトンを加えて、生
じた沈渣を集め、減圧で乾固した後、メタノールに溶解
した。５５ｇの菌体から １．３５ｇのリン脂質を得た
。
結核菌菌体を生理食塩水に約１０日／ＩＩｎになるよう
に懸濁し、この菌液を約２．５Ｋｇのウサギの耳静脈に
１回１．０＋ｊＬずつ、２日おきに１ｏ回注射して免疫
し、最後の免疫から１週間後に頚動脈から全裸崩を行な
い、常法通り血清を分離し、５６℃で３０分加熱して抗
結核菌菌体抗体を得た。
に懸濁し、この菌液を約２．５Ｋｇのウサギの耳静脈に
１回１．０＋ｊＬずつ、２日おきに１ｏ回注射して免疫
し、最後の免疫から１週間後に頚動脈から全裸崩を行な
い、常法通り血清を分離し、５６℃で３０分加熱して抗
結核菌菌体抗体を得た。
調製例１で作成したリン脂質２００ｍｇを、１／１５
）リン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２） １容と生理食塩水３
容との混合液（以下ｒＰＢｓＪと略記する） ｌ０ｍＭ
に懸濁し、これに調製例２で作成した菌体抗体１０ｍＪ
Ｌを加えた。室温で８ｏ分反応させた後、１０．００Ｏ
ｒｐｍで６０分遠心して、リン脂質−リン脂質抗体結合
物を分取し、ＰＢＳで３回洗浄した後、０、Ｉ Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ２，８） １０ｍ１ニ懸濁シタ。室温で３
０分スターラーで攪拌して、抗体を解離させてから、
１０．００Ｏｒｐｍ６０分遠心して、−上清を分取し、
ＰＨを中性にしてリン脂質抗体を得た。
）リン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２） １容と生理食塩水３
容との混合液（以下ｒＰＢｓＪと略記する） ｌ０ｍＭ
に懸濁し、これに調製例２で作成した菌体抗体１０ｍＪ
Ｌを加えた。室温で８ｏ分反応させた後、１０．００Ｏ
ｒｐｍで６０分遠心して、リン脂質−リン脂質抗体結合
物を分取し、ＰＢＳで３回洗浄した後、０、Ｉ Ｍ酢酸
緩衝液（ｐＨ２，８） １０ｍ１ニ懸濁シタ。室温で３
０分スターラーで攪拌して、抗体を解離させてから、
１０．００Ｏｒｐｍ６０分遠心して、−上清を分取し、
ＰＨを中性にしてリン脂質抗体を得た。
ＰＢＳにラテックス［武田薬品工業■製、ＳＤＬ ５８
（比重１．１８、粒径０．９ＩＬ） ］をソノ粒子濃度
が０．２５％になるように懸濁し、これに、更にＰＢＳ
を用いて １：１６０になるように希釈した調製例３の
リン脂質抗体を等量加え、室温に３時間保ち３．００Ｏ
ｒｐｍで１０分遠心分離してラテックス粒子を分取し、
ＰＢＳ、次いで希釈液で洗浄した後、希釈液に０．２５
％になるように懸濁してリン脂質抗体感作ラテックスを
得た。この感作ラテツクスは、結核菌リン脂質とマイク
ロプレート上で凝集した。また、リン脂質抗体を感作し
ないラテックスは同一の条件でリン脂質を加えても凝集
しなかった。即ち、この感作ラテツクスは結核菌リン脂
質に特異的に反応して凝集することが確認できた。
（比重１．１８、粒径０．９ＩＬ） ］をソノ粒子濃度
が０．２５％になるように懸濁し、これに、更にＰＢＳ
を用いて １：１６０になるように希釈した調製例３の
リン脂質抗体を等量加え、室温に３時間保ち３．００Ｏ
ｒｐｍで１０分遠心分離してラテックス粒子を分取し、
ＰＢＳ、次いで希釈液で洗浄した後、希釈液に０．２５
％になるように懸濁してリン脂質抗体感作ラテックスを
得た。この感作ラテツクスは、結核菌リン脂質とマイク
ロプレート上で凝集した。また、リン脂質抗体を感作し
ないラテックスは同一の条件でリン脂質を加えても凝集
しなかった。即ち、この感作ラテツクスは結核菌リン脂
質に特異的に反応して凝集することが確認できた。
なお、希釈液としては、１／８０ Ｍ、ｐＨ７，２のリ
ン酸塩緩衝食塩水にＢＳＡＯ，１％とアジ化ナトリウム
０．１％とを加えたものを用いた。
ン酸塩緩衝食塩水にＢＳＡＯ，１％とアジ化ナトリウム
０．１％とを加えたものを用いた。
供試血清は蒸留水でｌ：４とし、 １００℃で２０分加
熱した。
熱した。
Ｖ型マイクロプレートの各穴に希釈液を０．０２５ｍ文
ずつ分注し、第１六目にｌ：４加熱血清０．０２５ｍ文
を加えた。他方、標準リン脂質３２ｎｇ／ｍ文を別の列
の第１大目に同じ＜Ｏ，Ｑ−２５＋Ｊ１加えた。
ずつ分注し、第１六目にｌ：４加熱血清０．０２５ｍ文
を加えた。他方、標準リン脂質３２ｎｇ／ｍ文を別の列
の第１大目に同じ＜Ｏ，Ｑ−２５＋Ｊ１加えた。
ダイリュータ−で順次倍数希釈した。実施例１で得られ
たリン脂質抗体感作ラテックスを０．０２５＋ｓＪＬず
つ分注し、マイクロミキサーでよく混和した後、室温に
１０時間静置し、凝集の終末点を測定し、標準リン脂質
と比較してリン脂質濃度を計算した。
たリン脂質抗体感作ラテックスを０．０２５＋ｓＪＬず
つ分注し、マイクロミキサーでよく混和した後、室温に
１０時間静置し、凝集の終末点を測定し、標準リン脂質
と比較してリン脂質濃度を計算した。
この方法によってヒト血清中リン脂質濃度を測定した結
果は表の通りであった。
果は表の通りであった。
表から明らかな如く、血中リン脂質は、結核患者でのみ
検出された。即ち、血中リン脂質抗原濃度を測定するこ
とは結核の早期診断に極めて有用であるといえる。
検出された。即ち、血中リン脂質抗原濃度を測定するこ
とは結核の早期診断に極めて有用であるといえる。
本発明の感作ラテツクスを用いれば０．０２５ｍＭ程度
の微量の試料を加熱するだけで極めて容易に結核菌抗原
を定量することができるので臨床診断に特に適している
といえる。
の微量の試料を加熱するだけで極めて容易に結核菌抗原
を定量することができるので臨床診断に特に適している
といえる。
Claims (5)
- （１）表面に結核菌リン脂質抗体を担持したラテックス
粒子を含有する結核菌リン脂質抗体感作ラテックス。 - （２）ラテックス粒子の比重が０．８〜１．４である特
許請求の範囲第１項記載の感作ラテツクス。 - （３）表面に結核菌リン脂質抗体を担持したラテックス
粒子を含有する結核菌リン脂質抗体感作ラテックスをヒ
トの体液もしくはその希釈液と接触させ、凝集像を観察
することを特徴とする結核菌リン脂質の検出方法。 - （４）ラテックス粒子の比重が０．９〜１．４である特
許請求の範囲第３項記載の検出方法。 - （５）凝集反応をマイクロタイター法によって行なうこ
とを特徴とする特許請求の範囲第３項又は第４項記載の
検出方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8289884A JPS60227169A (ja) | 1984-04-26 | 1984-04-26 | 結核菌リン脂質抗体感作ラテツクス及びそれを用いた結核菌リン脂質の検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8289884A JPS60227169A (ja) | 1984-04-26 | 1984-04-26 | 結核菌リン脂質抗体感作ラテツクス及びそれを用いた結核菌リン脂質の検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60227169A true JPS60227169A (ja) | 1985-11-12 |
Family
ID=13787075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8289884A Pending JPS60227169A (ja) | 1984-04-26 | 1984-04-26 | 結核菌リン脂質抗体感作ラテツクス及びそれを用いた結核菌リン脂質の検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60227169A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030028059A (ko) * | 2001-09-27 | 2003-04-08 | (주)시로텍코리아 | 항-결핵균 항체를 포함하는 결핵균 항원 진단키트 |
| EA009817B1 (ru) * | 2004-06-07 | 2008-04-28 | Лысуха, Николай Николаевич | Способ выявления туберкулезной инфекции |
-
1984
- 1984-04-26 JP JP8289884A patent/JPS60227169A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20030028059A (ko) * | 2001-09-27 | 2003-04-08 | (주)시로텍코리아 | 항-결핵균 항체를 포함하는 결핵균 항원 진단키트 |
| EA009817B1 (ru) * | 2004-06-07 | 2008-04-28 | Лысуха, Николай Николаевич | Способ выявления туберкулезной инфекции |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Dienstag et al. | Faecal shedding of hepatitis-A antigen | |
| US5187065A (en) | Method and materials for detecting lyme disease | |
| US3999944A (en) | Detection of breast cancer | |
| US4233286A (en) | Low affinity IGM-latex particles and assay therewith for immune complexes | |
| US4210622A (en) | Kit for assay of immune complexes | |
| US4141965A (en) | Assay of immune complexes | |
| Haddad et al. | Immediate hypersensitivity reactions to food antigens detection of human IgE antibodies in vitro and exploration of immunologic mechanisms using the rat mast cell system | |
| Marcucci et al. | A new method for IgE detection in nasal mucosa | |
| US3900558A (en) | Method of measuring histamine release from mast cells | |
| KR920002183B1 (ko) | 성인 t세포 백혈병 바이러스 항체 검출용 시약의 제조방법 | |
| JPS60227169A (ja) | 結核菌リン脂質抗体感作ラテツクス及びそれを用いた結核菌リン脂質の検出方法 | |
| JPH01105160A (ja) | 異常応答リンパ球の検出方法並びにこれに用いる検出用試薬及びキット | |
| Duboczy et al. | Latex agglutination test for tuberculosis | |
| Duboczy et al. | Further studies with the direct latex agglutination test in tuberculosis | |
| JPS6333103B2 (ja) | ||
| EP1575520B1 (en) | A process for preparation of an agglutination reagent for rapid detection of typhoid | |
| JPS60227170A (ja) | 結核菌リン脂質抗体感作血球及びそれを用いた結核菌リン脂質の検出方法 | |
| RU2376604C2 (ru) | Способ выявления антигена или антитела в иммуноферментном анализе | |
| JPS60111159A (ja) | 結核菌リン脂質感作ラテックス及びそれを用いた結核菌リン脂質抗体の検出方法 | |
| JPS62174659A (ja) | 抗レジオネラ菌多糖体抗体感作ラテツクス | |
| JPS60209179A (ja) | 肺炎マイコプラズマ脂質抗原レシチン複合物感作ラテツクス試薬及びそれを用いた肺炎マイコプラズマ抗体の検出方法 | |
| Sato et al. | Treponema pallidum specific IgM haemagglutination test for serodiagnosis of syphilis. | |
| JPS6161067B2 (ja) | ||
| Dietz et al. | Use of latex particles in serology of tuberculosis | |
| EP0370960A1 (en) | Neopterin as a marker in a diagnostic screening test kit to detect retrovirus diseases |