JPS60111159A - 結核菌リン脂質感作ラテックス及びそれを用いた結核菌リン脂質抗体の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は結核菌リン脂質感作ラテツクス及びそれを用い
た結核菌リン脂質抗体の検出方法に関し、更に詳しくは
、結核菌リン脂質抗体を簡易かつ高精度に測定可能な結
核菌リン脂質感作ラテツクス及びそれを用いた結核菌リ
ン脂質抗体の検出方法に関する。

結核、特に肺結核は弗素に頻度の高い呼吸器疾患であり
（日本におＬ−する年間思考°数：約１０万人）結核菌
の感染によって惹起されることは既に周知の通りである
。現在、この結核の診断法として、結核菌の分離培養、
胸部レントゲン所見、ツベルタリン反応などが用いられ
ている。この内、結核菌の分離培養は最も確実な診断法
であるが、結核菌は発育が緩慢な為、分離培養には８〜
１２週間を要し、しかも、分離培養できるのは排菌者だ
けに限られ、大部分の患者である非排菌者は培養陰性と
判断される。すなわち、たとえ排菌者でも早期の診断は
不可能である。その点ではツベルクリン反応は短時間で
結果が得られるが、この反応は結核菌の感染の過去にお
ける既往を示すだけであり、既往があれば、健康者でも
、結核以外の呼吸器感染症でも、はとんど、すべての人
が陽性を示すので、現疾患の診断には参考程度にしがな
らない。そこで、最も高く評価されているのは胸部レン
トゲン所見であるが、結核のみに特有の肺陰影所見とい
うものは存在せず、肺真菌症、肺癌、肺吸虫症などとレ
ントゲン所見のみで確実に鑑別することは多くの場合不
可能であることも周知の通りである。しかし、肺真菌症
、肺吸虫症、肺癌などと結核では治療薬も治療方針も全
く異なるので、早期における確実な診断は是非とも必要
である。

この為に、古くから結核の血清学的診断法が数多く研究
されてきた。その代表的なものとして、１９４８年にア
メリカ合衆国で発表されたミドルプルツク・デュポス反
応（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ　ＤｕｂｏｓＴｅｓｔ　ｉ
　Ｇ、　Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ及びＲ，Ｄｕｂｏｓ　
、　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、　８８巻、５２１頁、１９４８年）
と１９５５年にオランダで発表されたボイデン反応（Ｂ
ｏｙｄｅｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　％　Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉ−ｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
　−、９３巻、１０７頁、１９５１年）がある。前者は
結核菌菌体の多糖体を赤血球に感作したもの、後者は培
養濾液中のツベルクリン蛋白質を赤血球に感作したもの
を用い、受身血球凝集反応によって患者血清中の抗体を
測定し、診断しようとしたものである。しかし、これら
の反応は、文献（Ｌ、Ｒ，Ｃｏ１ｅ、、Ｊ、Ｔ、Ｍａｔ
ｌｏｆｆ及びＲ，Ｆａｒｒｅｌｌ　：Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、
１０２巻、６４７頁、１９５５年；伊藤忠雄他、慶応医
学、３０巻、２９１頁、１９５３年）にもみられる如く
、結核の発病とは無関係に結核菌の感染によってほとん
どすべてが陽性を示し、ツベルクリン反応と同様に感染
の既往の有無を示すだけで、現疾患の診断にはほとんど
無効であることが判明するに及んでほとんど応用されな
くなった。これに対し、結核菌リン脂質に対する抗体は
、単なる結核菌の感染だけでは産生されず、病理学的、
臨床的経過の軽重によく並行して産生されることが確認
された。このことは、文献（小野寺忠雄：結核の研究、
１２巻、２３頁、１９６０年；両横義夫：日本細菌学会
誌、１５巻、９３５頁、１９６０年；　Ｙ、Ｔａｋａｈ
ａｓｈｉ及びＴ、Ｏｎ。

ｄｅｒａ　：　Ｃｏｍｐｔ、ｒｅｎｄ、Ｓｏｃ、Ｂｉｏ
ｌ、　１５４巻、８８７頁、１９６０年ｉ　Ｙ、Ｔａｋ
ａｈａｓｈｉ他：　Ｃｏｍｐｔ、ｒｅｎｄ、　Ｓｏｃ。

Ｂｉｏｌ、１５４巻、１１３２頁、１９６０年）に記載
されている。また、このことは、例えば両横義人（結核
、３６巻、４０９〜４２０頁、１９６１年）によると、
結核患者２０１人及びツベルクリン反応陽性の健康者１
００人についてみると、多糖体を用いた反応では患者、
健康者の別なく　ｉｏ。

％陽性、蛋白を用いた反応では患者５５％、健康者４５
％陽性に対し、リン脂質を用いた反応では患者８０％、
健康者５％が陽性であった。また、活動性と非活動性の
結核についてみると、多糖体と蛋白抗原による反応は相
関を示さなかったが、リン脂質抗原を用いる反応では活
動性の度合と抗体価がよく相関したと報告している。以
上のように結核菌リン脂質を抗原に用いて、リン脂質抗
体を測定するならば、結核の診断は非常に正確に、しか
も活動性の程度をよく判断できることが知られている。

このリン脂質による血清反応としては主に受身血球凝集
反応（Ｙ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ及びに、Ｏｎｏ　：Ａｍ
ｅｒ、Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｐ、Ｄｉｓ、、８３巻、３８１頁
、１９６１年）とカオリン凝集反応（Ｙ、Ｔａｋａｈａ
ｓｈｉ　：　Ａｍｅｒ、Ｒｅｖ。

Ｒｅ５ｐ、　Ｄｉｓ、、８５巻、７０８頁、１９６２年
）が行われてきた。しかし、前者は手生赤血球を用いる
方法であるために保存性が全くなく、その都度感作血球
を調製しなければならないので多くの労力を要し、しか
も安定な結果を得にくい欠点があった。また、人の血清
中には羊血球に対する非特異的凝集素が含まれている為
に、予め吸収処理をしなければならず、しかも、その為
の対照試験を要する。これに対し、カオリン凝集反応は
担体に対する抗体が存在しない点で有利であるが、この
試薬も反応のたびに調製しなければならず、反応もやや
煩雑で、しかも判定は反応試験管を遠心して、１本ずつ
振盪による凝集像をみなければならず、容易に実施でき
る反応とは言い難いという欠点があった。

本発明の目的は、上記した欠点の解消にあり、すなわち
、結核菌リン脂質抗体を簡易かつ高精度に測定可能な結
核菌リン脂質感作ラテツクス及びそれを用いた結核菌リ
ン脂質抗体の検出方法の提供にある。

本発明者は、これら従来法の難点を解決し、結核菌リン
脂質抗体を容易かつ特異的に比較的短時間で測定し、結
核を高い精度で早期に診断する方法を開発すべく鋭意研
究を重ねた結果、結核菌リン脂質を保存性の高いラテッ
クス粒子に感作して結核菌リン脂質感作ラテツクスを製
造し、これを用いて試料を何ら前処理することなく体液
中の結核菌リン脂質抗体を受身ラテックス凝集反応（以
下、ｒＰＬＡＪと略す。）により非密に簡便容易に測定
することに成功し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、表面に結核菌リン脂質を担持した
ラテックス粒子を含有する結核菌リン脂質感作ラテック
ス；及び該感作ラテ・ノクスをヒトの体液もしくはその
希釈液と接触させ、凝集像を観察することを特徴とする
結核菌リン脂質抗体の検出方法に関するものである。

本発明の感作ラテツクスを製造するために用し）るラテ
ックスとしては、例えば、スチレン、ビニルトルエン、
クロロスチレン、メタクリル酸メチル、塩化ビニル、塩
化ビニリデンなどの均一重合体もしくは共重合体；カル
ボキシル化ポリスチレン、アミノ基ををするカルボキシ
ル化ポリスチレン、スチレン−ブタジェン共重合体、カ
ルボキシル化スチレン−ブタジェン共重合体、スチレン
−ジビニルベンゼン共重合体、ビニルトルエン−第三ブ
チルスチレン共重合体、ポリエステル、ポリアクリル酸
９ポリメタクリル酸、ポリアクリロニトリル、アクリロ
ニトリル−ブタジェン−スチレン共重合体、ポリ酢酸ビ
ニルアクリレート、ポリビニルピロリドン、塩化ビニル
−アクリレート共重合体などの合成高分子ラテックス粒
子からなるラテックスが挙げられ、さらにこれらの合成
高分子ラテックス粒子の表面を非イオン界面活性剤等で
処理したものを用いてもよい。上記した合成高分子ラテ
ックスのなかでもポリスチレンラテックスが好ましい。

ラテックス粒子の粒径は、０．０１〜１０μであり、好
ましくは０．５〜１．０μであるが、分析試験結果の再
現性を良くするためには、粒径分布の幅が狭いもの、例
えば±５％以下のものが望ましい。また、使用されるラ
テックス粒子の比重は０．９〜１．４であることが好ま
しい。

また、これらの重合体のうち、本発明の検出方法におい
て使用される感作ラテツクスのラテックスとしては、例
えばスチレン、ビニルトルエン。

クロロスチレン、メタクリル酸メチル、塩化ビニル、塩
化ビニリデン等の均一重合体もしくは共重合体ラテック
スなどが有利に用いられ、これらのラテックスのなかで
もクロロスチレン、メタクリル酸メチル、塩化ビニリデ
ンの均一重合体あるいはこれらと他のモノマー（例えば
スチレン）との共重合体などが好都合に用いられる。こ
れらのラテックス粒子は従来通常の血清学的凝集反応担
体として使用されているポリスチレン粒子（比重１．０
５）より高比重であり、とりわけ比重１゜１〜１．４程
度のものを使用するのが好ましく、比重１．１５以上の
ものを使用するのが更に好ましい。

これ等のラテックス粒子としては、一般に平均粒子径０
．１〜１μ程度のものを用いることが出来るが、とりわ
け０．３〜１．６μ程度の粒子径を持つものを用いると
マイクロプレートのウェル内で約１０時間以内で完全に
沈降し実施上好都合である。

上記したラテックス粒子としては、特開昭５１−９７１
６号公報記載の方法に従ってエチレンオキシド系非イオ
ン界面活性剤を吸着させたものを用いるのが好ましい。

このエチレンオキシド系非イオン界面活性剤としては、
エチレンオキシドとポリオキシプロピレングリコールの
ブロックコポリマー、ポリオキシエチレンアルキルエー
テル。

ポリオキシエチレンアルキルアリルエーテルなどが好都
合に用いられる（特開昭５１−９７１６号公報参照）。

本発明に用いる結核菌リン脂質は、公知のリン脂質の調
製法により得ることができる。この方法の具体例として
は、Ｌ、Ｎｅｇｒｅが１９５０年に提案した方法が挙げ
られるが、この方法により得られたリン脂質は粗製であ
るため、副反応を起こす可能性があり、精製したものを
用いることが望ましい。この精製法としては、例えば、
高欄の方法（Ｙ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ、　Ａｍｅｒ、Ｒ
ｅｖ、Ｒｅ５ｐ、Ｄｉｓ、、８５巻、７０８頁、１９６
２年）、へｎｄｅｒｓｏｎ法（山村雄−１結核菌の生化
学、共立出版、１９６５年）　、Ｌｅｄｅｒｅｒ法（同
前）等が挙げられる。

本発明の感作ラテツクスを製造するには、先ず、結核菌
の培養による菌体を鋼製する必要があるが、これに用い
る菌株、培地は多量の菌体が得やすければ通常用いられ
るどのようなものでもよく、菌株や培地に限定されるも
のではない。培養菌体は加熱又はアセトンによって死菌
とした後、アセトン抽出を繰り返し、このアセトン抽出
後の菌体から３７〜４５℃のメタノールで抽出した抽出
液をとる。これを蒸発乾固した後、熱アセトンで処理し
て不溶性の残渣を分取し、クロロホルムに熔解した後、
アセトンを加えて生じた沈澱を分取する。

これをメタノールに熔解し、４℃に保存する。

次に、抗原である結核菌リン脂質をラテックス粒子に感
作させる為には、該ラテ・ノクス粒子と抗原とを水、生
理食塩水、ｐ）ｌ　５．５〜１０、好ましくはｐＨ６，
４〜７．６の各種緩衝液等の中で、濃度０．０５〜３％
のラテックス粒子と抗原とを約４〜４０℃において３０
分〜２４時間ゆるやかに攪拌しながら接触させることに
よって行なう。緩衝液としては、例えばリン酸塩緩衝食
塩水、グリシン緩衝食塩水などである。感作終了後は水
性溶媒、例えばこれら緩衝液で洗浄することにより、ラ
テ・７クス粒子に吸着されない抗原を完全に除去する。

さらに、このラテックスは蛋白質をふくむ希釈液に懸濁
させてラテックス粒子の抗原未感作部分を蛋白質で飽和
してお（とよい。

希釈液としては、例えばグリシン緩衝食塩水、リン酸塩
緩衝食塩水等に牛血清アルブミン（以下ｒＢｓＡＪと略
す）約０．１％などを加えたものを用い、０．０１〜０
．５％のナトリウムアジド（ＮａＮ３　）を加えておく
。

このようにして得られた感作ラテツクスは０．２５重量
％程度に希釈液に懸濁させた状態で氷室に保存してもよ
いし、凍結乾燥しておいてもよい。凍結乾燥する為には
希釈液に安定剤として各種アミノ酸類、特にグリシン又
はグルタミン酸ナトリウム及びデキストランを、それぞ
れ０．２〜２重量％及び０．３〜３重量％加えた培地に
２．５％程度に懸濁してから液体窒素あるいは液体空気
中などで急速凍結してから凍結乾燥する。凍結乾燥によ
り保存期間はさらに延長され、通常２年以上安定である
。しかも、凍結乾燥品は、使用の際、単に希釈液を加え
るのみで新鮮調製品と同様の品質的に安定した感作ラテ
ツクスが得られる。

本発明の結核菌リン脂質感作ラテツクスは結核菌リン脂
質抗体により凝集されるので、人の体液もしくはその希
釈液と結核菌リン脂質感作ラテツクスとを接触させると
、体液中又はその希釈液中に結核菌リン脂質抗体が存在
する場合にしよ、この抗体によって感作ラテ・ノクスが
凝集する。この反応をマイクロタイター法で行なう場合
、マイクロプレート上に管底凝集像として認めることが
できる。すなわち、プレートに一定量の希釈液を滴下分
注し、次いで第１大目に一定量の体液を加え、グイリュ
ータ−で順次希釈する。これに結核菌リン脂質感作ラテ
ツクスを滴下分注し、一定時間後に管底凝集像を判定す
る。

本発明の感作ラテ・ノクスは次の点で極めて大きな利点
を有している。すなわち、体液中にはラテックスそのも
のに対する非特異的凝集素、すなわち担体に対する抗体
が全く存在しえず、また実際に発見されていないので被
検体液を何等前処理する必要がなく、またその為の確認
試験も必要としない。マイクロプレートのウェルに体液
もしくはその希釈液を入れ、これに感作ラテ・ノクスを
滴下するだけでよい。すなわち結核菌リン脂質抗体の定
量は極めて容易かつ簡便であり、特別の技術を要しない
。しかも抗原が精製されているので特異的であり、しか
も感度は人体液中の測定に充分であり、同時に多数の検
体の定性及び又は定量を行なうことができる。

本発明の感作ラテツクスを用いれば、従来、反応のたび
に試薬を調製し、しかも複雑なカオリン凝集反応等に頼
っていた体液中の結核菌リン脂質抗体濃度を極めて容易
かつ簡便に定量することができ、結核を正確かつ早期に
診断できるようにしたことの他に治療効果の正確な判定
、予後の予測を行なうこともできる。

結核菌リン脂質ラテックス凝集反応に関しては、現在ま
でに、「結核菌リン脂質をラテックスに感作することは
不可能であった」とする文献（Ｔ、Ｍ。

Ｄｉｅｔｚ　、　ｅｔ　ａｌ、＾ｍｅｒ、Ｒｅｖ、Ｒｅ
５ｐ、Ｄｉｓ、、９５巻、６３８〜６４２頁、１９６７
年）が１例あるのみで、結核菌リン脂質をラテックスに
感作できたとする文献は全くなく、感作ラテツクスを用
いる凝集反応は全く新規である。

また、本発明の感作ラテツクスは結核菌免疫血清又は結
核患者血清にのみ反応し、この血清に抗原を加えて中和
した後は、この感作ラテツクスは全く反応しないこと、
未感作ラテックスは上記の陽性反応を示す血清に全く反
応しないことから、この感作ラテツクスは結核菌リン脂
質が結合しているものであるといえる。

以上、詳述したように、本発明によれば、結核菌リン脂
質抗体を簡易かつ高精度に測定可能であり、その実用的
価値は極めて大である。

次に本発明を調製例及び実施例によってさらに詳細に説
明するが、本発明はその要旨を超えない限りこれらによ
って限定されるものではない。

調製例１゜ 結核菌リン脂質の調製 結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）　Ｈ３７Ｒｙ様をツートン培地で３７℃で
８週間培養し、得られた菌体を１００℃で６０分加熱し
て死菌とした。

これを約１０容のアセトンで４回抽出を繰り返し、抽出
後の菌体に５容のメタノールを加え、４５℃で５時間ず
つ３回抽出した。抽出液を合わせて、これを減圧で乾固
し、５容のアセトンを加え、８０℃の水溶中で１時間処
理した後、残渣を集め５容のクロロホルムに溶解した。

これにアセトンを加えて、生じた沈渣を集め、減圧で乾
固した後、メタノールに熔解した。５５ｇの菌体から１
．３５ｇのリン脂質を得た。

実施例１ ３：玄　！ン　威　−一・・クスの゛　１１／１５Ｍリ
ン酸塩緩衝液（ｐＨ７，２）　１容と生理食塩水３容と
の混合液（以下「ＰＢＳ」と略す）にラテックス〔成田
薬品工業（株）製、５ＤＬ５９（比重１．１８、粒径０
．９μ）〕をその粒子濃度が０．２５％になるように懸
濁し、これに、メタノールに熔解した結核菌リン脂質０
．２ｍｇ／ｍｌを等量加え、ゆっくり攪拌しながら室温
に３時間保った。３０００ｒｐｍで１０分遠心分離して
感作ラテツクス粒子を分取し、ＰＢＳ、次いで希釈液で
洗浄した後、希釈液に０．２５％になるように懸濁して
結核菌リン脂質感作ラテツクスを得た。この感作ラテツ
クスは、結核菌免疫ウサギ血清に凝集反応を示したが、
この血清に精製結核菌リン脂質を加えた後に感作ラテツ
クスを加えた場合は全く凝集がおこらなかった。

また結核菌リン脂質を感作しないラテ・ノクスは同一の
条件で上記の免疫血清を加えても凝集しなかった。すな
わち、この感作ラテ・ノクスは結核菌リン脂質抗体に特
異的に反応して凝集することが確認できた。

希釈Ｗｌハ１　／　６０　Ｍ、　ｐＨ７，２のリン酸塩
緩衝食塩水にＢＳＡを０．１％になるように加えたもの
である。

士　１ン　亭　−−・・クスの゛　士り量上述のように
して調製した感作ラテ・ノクスを、グリシン０．５重量
％、デキストランＴ−１００，７重量％含有した希釈液
に２．５％となるように浮遊させ、液体窒素中に浸漬し
て急速凍結させてから凍結乾燥した。

実施例２ 渋ｊ−１ン　のＩ Ｖ型マイクロプレートの各穴に希釈液を０．０２５ｍ１
ずつ分注し、第１大目に希釈液で１　：　１００に希釈
した血清を０．０２５ｍ１加えた。ダイリュークーで順
次倍数希釈した。これに実施例１で得られた結核菌リン
脂質感作ラテックスを０．０２５ｍ１ずつ分注し、マイ
クロミキサーでよく混和した後、室温に１０時間以上静
置し、凝集の終末点を測定し、陽性を示す血清の最大希
釈倍数の逆数をとって抗体価とした。　この方法を用い
て、結核菌培養等により診断の確定している活動性肺結
核患者１゜例、健康者４２例につき血中抗体価を測定し
た結果は次表の通りであった。

表３人血清中の結核菌リン脂質ＰＬＡ抗体価の測定以上
の結果から明らかな如く、健康者はツベルクリン陽性、
陰性を問わず、ＰＬＡ反応は常に陰性を示したのに対し
、活動性肺結核患者ではいずれも陽性で、３２０〜５１
２０と高値を示した。

このＰＬＡ反応を用いれば０．０２５ｎ＋１以下の試料
で、何等の前処理もせずに、極めて容易に高い精度で結
核菌リン脂質抗体を定量することができ、本発明は結核
の診断、治療結果の判定に特に適しているといえる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）表面に結核菌リン脂質を担持したラテックス粒子
   を含有する結核菌リン脂質感作ラテツクス。 （２）ラテックス粒子の比重が０．９〜１．４である特
   許請求の範囲第１項記載の感作ラテツクス。 （３）表面に結核菌リン脂質を担持したラテックス粒子
   を含有するラテフクスにさらに安定剤を加えた特許請求
   の範囲第１項記載の感作ラテツクス。 （４）安定剤がグリシン及びデキストランである特許請
   求の範囲第３項記載の感作ラテツクス。 く５）希釈液に対するグリシン及びデキストランの濃度
   が、それぞれ０．２〜２８％及び０．３〜３重量％であ
   る特許請求の範囲第４項記載の感作ラテツクス。 （６）表面に結核菌リン脂質を担持したラテックス粒子
   を含有する結核菌リン脂質感作ラテツクスをヒトの体液
   もしくはその希釈液と接触させ、凝集像を観察すること
   を特徴とする結核菌リン脂質抗体の検出方法。 （７）ラテックス粒子が高比重ラテックス粒子である特
   許請求の範囲第６項記載の検出方法。 （８）凝集反応をマイクロタイター法によって行なうこ
   とを特徴とする特許請求の範囲第６項記載の検出方法。