JPS60111156A

JPS60111156A - 結核菌リン脂質感作血球

Info

Publication number: JPS60111156A
Application number: JP58217809A
Authority: JP
Inventors: Tetsuo Tomiyama; 哲雄富山
Original assignee: SEINAN SOGO KAIHATSU KK
Current assignee: SEINAN SOGO KAIHATSU KK
Priority date: 1983-11-21
Filing date: 1983-11-21
Publication date: 1985-06-17

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は結核菌リン脂質感作血球に関し、更に詳しくは
、結核菌リン脂質抗体を簡易かつ高精度に測定可能な結
核菌リン脂質感作血球に関する。

結核、特に肺結核は非常に頻度の高い呼吸器疾患であり
（日本における年間患者数：約１０万人）結核菌の感染
によって惹起されることは既に周知の通りである。現在
、この結核の診断法として、結核菌の分離培養、胸部レ
ントゲン所見、ツベルクリン反応などが用いられている
。この内、結核菌の分離培養は最も確実な診断法である
が、結核菌は発育が緩慢な為、分離培養には８〜１２週
間を要し、しかも、分離培養できるのは排菌者だけに限
られ、大部分の患者である非排菌者は培養陰性と判断さ
れる。すなわち、たとえ排菌者でも早期の診断は不可能
である。その点ではツベルクリン反応は短時間で結果が
得られるが、この反応は結核菌の感染の過去における既
往を示すだけであり、既往があれば、健康者でも、結核
以外の呼吸器感染症でも、はとんど、すべての人が陽性
を示すので、現疾患の診断には参考程度にしかならない
。そこで、最も高く評価されているのは胸部レントゲン
所見であるが、結核のみに特有の肺陰影所見というもの
は存在せず、肺真菌症、肺癌、肺吸虫症などとレントゲ
ン所見のみで確実に鑑別することは多くの場合不可能で
あることも周知の通りである。しかし、肺真菌症、肺吸
虫症、肺癌などと結核では治療薬も治療方針も全く異な
るので、早期における確実な診断は是非とも必要である
。

この為に、古くから結核の血清学的診断法が数多く研究
されてきた。その代表的なものとして、１９４８年にア
メリカ合衆国で発表されたミドルプルツク・デュボス反
応（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ　ＤｕｂｏｓＴｅｓｔ　；
　ＧｏＭｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ及びＲ，Ｄｕｂｏｓ　、
、Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍ
ｅｄｉｃｉｎｅ、　８８巻、５２１頁、１９４８年）と
１９５５年にオランダで発表されたポイデン反応（Ｂｏ
ｙｄｅｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　％　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏ
ｆ　Ｅｘｐｅｒｉ−ｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　
、　９３巻、１０７頁、１９５１年）がある。前者は結
核菌菌体の多糖体を赤血球に感作したもの、後者は培養
濾液中のツベルクリン蛋白質を赤血球に感作したものを
用い、受身血球凝集反応によって患者血清中の抗体を測
定し、診断しようとしたものである。しかし、これらの
反応Ｇよ、文献（Ｌ、Ｒ，Ｃｏ１ｅ、、Ｊ、Ｔ、Ｍａｔ
ｌｏｆｆ及びＲ，Ｆａｒｒｅｌｌ　：Ｊｏｕｒｎａｌ　
ｏｆ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、
１０２巻・６４７頁、１９５５年：伊藤忠雄他ミ慶応医
学、３０巻、２９１頁、１９５３年）にもみられる如（
、結核の発病とは無関係に結核菌の感染によってほとん
どすべてが陽性を示し、ツベルクリン反応と同様に感染
の既往の有無を示すだけで、現疾患の診断にはほとんど
無効であることが判明するに及んでほとんど応用されな
（なった。これに対し、結核菌リン脂質に対する抗体は
、単なる結核菌の感染だけでは産生されず、病理学的、
臨床的経過の軽重によく並行して産生されることが確認
された。このことは、文献（小野寺忠雄：結核の研究、
１２巻、２３頁、１９６０年；高橋義夫二日本細菌学会
誌、１５巻、９３５頁、１９６０年；　Ｙ、Ｔａｋａｈ
ａｓｈｉ及びＴ、Ｏｎ。

ｄｅｒａ　：　Ｃｏｍｐｔ、ｒｅｎｄ、Ｓｏｃ、Ｂｉｏ
ｌ、　１５４巻、８８７頁、１９６０年；　Ｙ、Ｔａｋ
ａｈａｓｈｉ他：　Ｃｏｍｐｔ、ｒｅｎｄ、　Ｓａｃ。

Ｂｉｏｌ、１５４巻、１１３２頁、１９６０年）に記載
されている。また、このことは、例えば高橋義夫（結核
、３６巻、４０９〜４２０頁、１９６１年）によると、
結核患者２０１人及びツベルクリン反応陽性の健康者１
００人につぃ′ζみると、多糖体を用いた反応では患者
、健康者の別なく　１００％陽性、蛋白を用いた反応で
は患者５５％、健康者４５％陽性に対し、リン脂質を用
いた反応では患者８０％、健康者５％が陽性であった。

また、活動性と非活動性の結核についてみると、多糖体
と蛋白抗原による反応は相関を示さなかったが、リン脂
質抗原を用いる反応では活動性の度合と抗体価がよく相
関したと報告している。以上のように結核菌リン脂質を
抗原に用いて、リン脂質抗体を測定するならば、゛結核
の診断は非常に正確に、しかも活動性の程度をよく判断
できることが知られている。このリン脂質による血清反
応としては主に受身血球凝集反応（Ｙ、Ｔａｋａｈａｓ
ｈｉ及びに、Ｏｎｏ　：Ａｍｅｒ、Ｒｅｖ、Ｒｅ５ｐ、
Ｄｉｓ、、８３巻、３８１頁、１９６１年）とカオリン
凝集反応（Ｙ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ　：　Ａｍｅｒ、Ｒ
ｅｖ。

Ｒｅ５ｐ、　Ｄｉｓ、、８５巻、７０８頁、１９６２年
）が行われてきた。しかし、前者は手生赤血球を用いる
方法であるために保存性がなく、感作当日しか使用する
ことができない。従って、検査のたびに感作血球を開裂
しなければならないので多くの労力を要し、しかも不安
定な生血球を使うため安定な結果を得ることが非常に困
難であるという欠点があった。

カオリン凝集反応も検査のたびに試薬を調製しなければ
ならず、反応もやや煩雑で、しかも判定は反応試験管を
遠心して、１本ずつ振盪による凝集像をみなければなら
ず、容易に実施できる反応とは言い黙いという欠点があ
った。

本発明の目的は、上記した欠点の解消にあり、すなわち
、結核菌リン脂質抗体を簡易かつ高精度に測定可能な結
核菌リン脂質感作血球の提供にある。

本発明者は、これら従来法の難点を解決し、結核菌リン
脂質抗体を容易かつ特異的に比較的短時間で測定し、結
核を高い精度で早期に診断する方法を開発すべく鋭意研
究を重ねた結果、結核菌リン脂質を保存性の高い固定赤
血球に感作して結核菌リン脂質感作血球を製造し、これ
を用いて体液中の結核菌リン脂質抗体を受身赤血球凝集
反応（以下ｒＰＨＡＪと略す）により非常に、簡便容易
に測定す・ることに成功し、本発明を完成するに至った
。

すなわち、本発明の結核菌リン脂質感作血球は、固定赤
血球にカップリング剤を介して結核菌リン脂質を結合さ
せて成るものである。

本発明の感作血球に用いる赤血球は固定赤血球であるが
、これを調製するための赤血球はヒツジ、ヤギ、ウシ、
ウマ、ウサギ、ワニ、ニワトリ、七面鳥、ヒト等から常
法に従って得られる。固定赤血球は次の様にして調製さ
れる。すなわち、アルセパ−（Ａｌｓｅｖｅｒ　）液に
懸濁させた生卵血球を一酸化炭素ガスで処理し、この赤
血球にホルマリンを加えて固定化する。

本発明に用いるカンプリング剤としてはタンニン酸、グ
ルタルアル、デヒド、塩化クロムなどが使用できるが、
中でもタンニン酸が好ましい。

本発明に用いる結核菌リン脂質は、公知のリン脂質の調
製法により得ることができる。この方法の具体例として
は、Ｌ、Ｎａｇｒｅが１９５０年に提案した方法が挙げ
られるが、この方法により得られたリン脂質は粗製であ
るため、副反応を起こす可能性があり、精製したものを
用いることが望ましい。この精製法としては、例えば、
両横の方法（Ｙ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ、Ａｍｅｒ、Ｒｅ
ｖ、Ｒｅ５ｐ、Ｄｉｓ、、８５巻、７０８頁、１９６２
年）　、Ａｎｄｅｒｓｏｎ法（山村雄−５結核菌の生化
学、共立出版、１９６５年）　、Ｌｅｄｅｒｅｒ法（同
前）等が挙げられる。

この結核菌リン脂質を調製するには、先ず、結核菌の培
養による菌体を調製する必要があるが、これに用いる菌
株、培地は多量の菌体が得やすければ通常用いられるど
のようなものでもよく、菌株や培地に限定されるもので
はない。培養菌体は加熱又はアセトンによって死菌とし
た後、アセトン抽出を繰り返し、このアセトン抽出後の
菌体から３７〜４５℃のメタノールで抽出した抽出液を
とる。これを蒸発乾固した後、熱アセトンで処理して不
溶性の残渣を分取し、クロロホルムに溶解した後、アセ
トンを加えて生じた沈澱を分取する。

これをメタノールに溶解し、４℃に保存する。

本発明の感作血球を製造するには次の様に行なう。すな
わち、カップリング剤を用いて赤血球を処理し、カップ
リング剤処理血球（赤血球表面にカップリング剤が結合
した赤血球）を得る。

次に、抗原である結核菌リン脂質をカップリング剤処理
血球に感作させる為には、該処理血球と抗原とを水、生
理食塩水、ｐｎ　５．５〜１０、好ましくはｐＨ６，４
〜７．２の各種緩衝液等の中で、濃度１〜５％の処理血
球と抗原とを約４〜４０℃において３０〜６０分ゆるや
かに攪拌しながら接触させることによって行なう。緩衝
液としては、例えばリン酸塩緩衝食塩水、グリシン緩衝
食塩水などである。感作終了後は水性溶媒、例えばこれ
ら緩衝液で洗浄することにより、処理血球に吸着されな
い抗原を完全に除去する。さらに、この感作血球は蛋白
質をふくむ希釈液に懸濁させて感作血球の抗原未感作部
分を蛋白質で飽和しておくとよい。

希釈液としては、例えばグリシン緩衝食塩水、リン酸塩
緩衝食塩水等に生血清アルブミン（以下ｒＢｓＡＪと略
す）約０．１％などを加えたものを用い、０．０１〜０
．５％のナトリウムアジド（Ｎ、ａＮ３　）を加えてお
く。

このようにして得られた感作血球は０．５重量％程度に
希釈液に懸濁させた状態で氷室に保存してもよいし、凍
結乾燥しておいてもよい。凍結乾燥する為には希釈液に
安定剤として各種アミノ酸類、特にグリシン又はグルタ
ミン酸ナトリウム及びデキストランを、それぞれ０．２
〜２重景％及び０．３〜３重量％加えた培地に５％程度
に懸濁してから液体窒素あるいは液体空気中などで急速
凍結してから凍結乾燥する。凍結乾燥により保存期間は
さらに延長され、通常２年以上安定である。しかも、凍
結乾燥品は、使用の際、単に希釈液を加えるのみで新鮮
調製品と同様の品質的に安定した感作血球が得られる。

本発明の結核菌リン脂質感作血球は結核菌リン脂質抗体
により凝集されるので、人の体液もしくはその希釈液と
結核菌リン脂質感作血球とを接触させると、体液中又は
その希釈液中に結核菌リン脂質抗体が存在する場合には
、この抗体によって感作血球が凝集する。この反応をマ
イクロタイター法で行なう場合、マイクロプレート上に
管底凝集像として認めることができる。すなわち、プレ
ートに一定量の希釈液を滴下分注し、次いで第１大目に
一定量の血清を加え、グイリュータ−で順次希釈する。

これに結核菌リン脂質感作血球を滴下分注し、一定時間
後に管底凝集像を判定する。

本発明の感作血球は次の点で極めて大きな利点を有して
いる。すなわち、担体として固定赤血球を用いている為
、非常に安定であり、凍結乾燥が可能となり、もし凍結
乾燥すれば２年以上保存ができる。従って、この感作血
球を使用する時には希釈液を加えて熔解するだけで、い
つでも新鮮調製品を全く同様に使用できる。また、同一
の調製品を毎回使うため、感作血球の条件は全く同一と
なり、検査結果は常に安定して一定の感度で測定できる
ようになる。本発明の感作血球を用いれば、従来、反応
のたびに試薬を調製し、しがも複雑なカオリン凝集反応
等に頼っていた体液中の結核菌リン脂質抗体濃度を極め
て容易かつ簡便に定量することができ、結核を正確かつ
早期に診断できることのみならず、治療効果の正確な判
定、予後の予測を行なうこともできる。固定赤血球を用
いる結核菌リン脂質凝集反応に関しては現在までに文献
は全くなく、固定赤血球を用いるＰＨＡは全く新規であ
る。

また、本発明の感作血球は、結核菌免疫血清又は結核患
者血清にのみ反応し、この血清に抗原を加えて中和した
後は、感作血球は全く反応しないこと、未感作血球は、
上記の陽性反応を示す血清に全く反応しないことから、
この感作血球は結核菌リン脂質が結合しているものであ
るといえる。

以上、詳述したとおり、本発明の結核菌リン脂質感作血
球は、結核菌リン脂質抗体を簡易かつ高精度に測定可能
であり、その結核診断用薬剤としての価値は極めて大で
ある。

次に本発明を調製例及び実施例によってさらに詳細に説
明するが、本発明はその要旨を超えない限りこれらによ
って限定されるものではない。

■製桝上−猜挨皿悲ｌ胆ｉ生週１結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕ
ｌｏｓｉｓ）　Ｈ３７Ｒｙ様をツートン培地で３７℃で
８週間培養し、得られた菌体を１００’Ｃで６０分加熱
して死菌とした。

これを約１０容のアセトンで４回抽出を繰り返し、抽出
後の菌体に５容のメタノールを加え、４５℃で５時間ず
つ３回抽出した。抽出液を合わせて、これを減圧で乾固
し、５容のアセトンを加え、８０℃の水溶中で１時間処
理した後、残渣を集め５容のクロロホルムに溶解した。

これにアセトンを加えて、生じた沈渣を集め、減圧で乾
固した後、メタノールに溶解した。５５ｇの菌体がら１
．３５ｇのリン脂質を得た。

−＋１２．　−　の−１ニワトリから得られた新鮮血液にアルセパ−（Ａｌｓｅ
ｖｅｒ　）液を等量加え、フラスコ中で都市ガス（ＣＯ
ガス含有）を３０分間ふき込んだ後直ちに固定液〔５％
のクエン酸ソーダを加えた生理食塩水＋３７％ホルマリ
ン（容量比２９：ｌ））を等量加え、３７℃の定温器中
で２４時間放置するが、この間時々振とうする。その後
純水で５回、生理食塩水で５回洗浄する。ナトリウムア
ジドを０．１％加えたｐＨ７，２のリン酸緩衝食塩水に
１０％になるように固定赤血球を懸濁させ氷室に保存す
る。

この固定赤血球は１年以上安定であった。

率　の゛　１２．５％の調製例２において得られた固定赤血球を含む
リン酸緩衝生理食塩水（ｐｎ　７．２　）に１：１００
．０００のタンニン酸／リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ　）
を等量加え、３７℃で１５分間タンニン酸処理を行なっ
た後、ＰＢＳで１回洗浄し、原量のＰＢＳに懸濁させて
タンニン血球液を調製した。このタンニン血球液に等量
の調製例１．において得られた抗原液を加え、３７℃で
３０分間処理した後、ＰＢＳで１回、ｐＨ７，２のＰＢ
ＳにＢＳＡｏ、１％、ＮａＮ　０．１％を加えた希釈液
で１回洗浄し、原量の半量の凍結乾燥媒〔上記希釈液に
グリシン０．５％、デキストランＴ１０（ファルマシア
社、スエーデン）０．７％を加えたもの〕に懸濁し凍結
乾燥する。

２１　吋１ン′　の巳Ｖ型マイクロプレートの各穴に希釈液を０．０２５ｍ１
ずつ分注し、第１大目に希釈液で１７１００に希釈した
血清を０．０２５ｍ１加えた。グイリュータ−で順次倍
数希釈した。これに実施例で得られた結核菌リン脂質感
作睡球を０．０２５ｍ１ずつ分注し、マイクロミキサー
でよく混和した後、室温に２時間以上静置し、凝集の終
末点を測定し、陽性を示す血清の最大希釈倍数の逆数を
とって抗体価とした。

この方法を用いて、結核菌培養等により診断の確定して
いる活動性肺結核患者１０例、健康者４２例につき血中
抗体価を測定した結果は次表の通りであった。

表０人血清中の結核菌リン脂質ＰＨＡ抗体価の測定以上
の結果から明らかな如く、健康者はツヘルクリン陽性、
陰性を問わず、ＰＨＡ反応は常に陰性を示したのに対し
、活動性肺結核患者ではいずれも陽性で、１６０〜５１
２０と高値を示した。

このＰＨＡ反応を用いれば０．０２５ｍ１以下の試料で
、短時間で極めて容易にかつ高い精度で結核菌リン脂質
抗体を定量することができ、本発明の感作血球は結核の
診断、治療結果の判定に特に適しているといえる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）固定赤血球にカンブリング剤を介して結核菌リン
脂質を結合させて成る結核菌リン脂質感作血球。
（２）カップリング剤がタンニン酸である特許請求の範
囲第１項記載の感作血球。
（３）安定剤を含んでいる特許請求の範囲第１項記載の
感作血球。
（４）安定剤がグリシン及びデキストランである特許請
求の範囲第３項記載の感作血球。
（５）希釈液に対するグリシン及びデキストランの濃度
が、それぞれ０．２〜２重量％及び０．３〜３重量％で
ある特許請求の範囲第４項記載の感作血球。