EA009817B1

EA009817B1 - Способ выявления туберкулезной инфекции

Info

Publication number: EA009817B1
Application number: EA200401038A
Authority: EA
Inventors: Александр Павлович Лысенко
Original assignee: Лысуха, Николай Николаевич
Priority date: 2004-06-07
Filing date: 2004-06-07
Publication date: 2008-04-28
Also published as: EA200401038A1

Abstract

Заявлен способ выявления туберкулезной инфекции путем инкубации биоматериала в стимуляторе роста ВКГ, посева на питательную среду ВКГ и культивирования. Отличие способа состоит в том, что после культивирования выросшую культуру смешивают с антисывороткой к антигенам возбудителя туберкулеза млекопитающих и отрицательной контрольной сывороткой для проведения реакции агглютинации и по образованию характерного агглютината судят о принадлежности культуры к возбудителям туберкулеза млекопитающих, причем антисыворотка получена путем инъекций животным негретых дезинтегрированных микобактерий туберкулеза с последующей адсорбцией её культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ.

Description

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии, а именно к способам микробиологической диагностики туберкулеза.

Для диагностики туберкулеза, как правило, используют методы, включающие отбор и посев биоматериала на питательные среды, культивирование и идентификацию выросших культур по морфологическим, культуральным, биохимическим, антигенным, патогенным и другим свойствам (И.Р. Дорожкова, С.А. Попов, В.А. Пузанов, Л.П. Мартынова, Микробиологические исследования при выявлении, диагностике и лечении туберкулеза. Ч. 3. М., 2000, 119 с; Микробиологическая диагностика туберкулеза и микобактериозов, в кн.: «Туберкулез». Под ред. А.Г. Хоменко. М., Медицина, 1996; «Наставление по диагностике туберкулеза животных», утв. ГУВ Госагропрома СССР 25.02.1986 г.; патент № 2193068 С2. ВИ, опубл. 20.11.2002 г., бюл. № 32).

Недостатками указанных методов являются их низкая чувствительность, значительные затраты времени (до 3 месяцев) и низкая эффективность при исследовании олигобациллярного материала, наличии в нем измененных форм возбудителя. Кроме того, идентификация изолятов общепринятыми методами дорога, трудоемка и требует сложного оборудования. Применение наиболее простого метода идентификации выделенных культур в реакции агглютинации ограничивается видами нетуберкулезных микобактерий, дающих стойкую суспензию бактериальной массы. Способ согласно патенту № 2193068 ВИ не применим к возбудителям туберкулеза млекопитающих, образующих сухие, трудно диспергируемые колонии.

Наибольшую надежность продемонстрировал способ диагностики туберкулеза, являющийся прототипом заявляемого изобретения (патент ИА № 43467 от 17.12.2001 г.).

Сущность данного способа состоит в том, что биологический материал подготавливают для посева и высевают на питательную среду. Биологический материал обрабатывают стимулятором роста 24-48 ч при температуре 36-38°С, после чего вместе со стимулятором роста высевают на питательную среду, включающую ферментативный пептон, картофельный крахмал, агар-агар, двууглекислый натрий, стимулятор кальцийзависимых ферментов, причем питательную среду готовят непосредственно перед высевом. Недостатками известного способа являются сложности и ошибки диагностики, обусловленные трудностями идентификации возбудителя туберкулеза, так как по морфологии, культуральным, биохимическим и патогенным свойствам изоляты со среды ВКГ не только трудно определить как возбудитель туберкулеза, но и отнести их к роду МусоЬас1егшш. Для верификации результатов необходима обработка культуры 10% едким натрием, пересев на среду Левенштейна-Йенсена без малахитового зеленого с последующим 1-2-месячным культивированием и идентификацией выросшей культуры в биопробе, по биохимическим тестам или методом ПНР (5).

Задачей, решаемой в рамках настоящего изобретения, является создание способа, позволяющего упростить, удешевить, сократить время анализа и повысить точность выявления возбудителя туберкулеза.

Поставленная задача решается в способе выявления туберкулезной инфекции путем инкубации биоматериала в стимуляторе роста ВКГ, его посева на питательную среду ВКГ и культивирования, после которого выросшую культуру смешивают с антисывороткой к антигенам возбудителя туберкулеза млекопитающих и отрицательной контрольной сывороткой для проведения реакции агглютинации и по образованию характерного агглютината судят о принадлежности культуры к возбудителям туберкулеза млекопитающих, причем в способе антисыворотка получена путем инъекций животным дезинтегрированных без нагревания микобактерий туберкулеза с последующей адсорбцией ее культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ, или она может быть получена путем инъекций животным возбудителя туберкулеза млекопитающих, выращенного на питательной среде ВКГ, с последующей адсорбцией культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенных на питательной среде ВКГ.

Кроме того, предметом данного изобретения является способ выявления туберкулезной инфекции путем инкубации биоматериала в стимуляторе роста ВКГ, его посева на питательную среду ВКГ и культивирования, в котором после культивирования выросшую культуру смешивают на предметных стеклах с очищенными антителами к антигенам возбудителя туберкулеза млекопитающих, выделенными из антисыворотки, и отрицательной контрольной сывороткой для проведения реакции агглютинации и по образованию характерного агглютината судят о принадлежности культуры к возбудителям туберкулеза млекопитающих, причем антисыворотка получена путем инъекций животным дезинтегрированных без нагревания микробактерий туберкулеза с последующей адсорбцией ее культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ, или антисыворотка может быть получена путем инъекций животным возбудителя туберкулеза млекопитающих, выращенного на питательной среде ВКГ, с последующей адсорбцией ее культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ.

Пример

Для осуществления способа штамм М. Ьот18 Уа11ее выращивают на среде Сотона 6 недель. Для инактивации в посевы добавляют фенол до концентрации 3-5%. Через 48 ч взвесь бактериальной массы в культуральной жидкости 15-20 мин обрабатывают ультразвуком (15-35 кГц, до 100 Вт/см). Дезинтеграт в соотношении 1:3 смешивают с неполным адъювантом Фрейнда и в дозе 300-500 мкг/кг (по белку антиге

- 1 009817 на) вводят овцам или молодняку крупного рогатого скота в 2-3 точки подкожно. Инъекции повторяют до 11 раз с интервалом 12-14 суток. Через 8-10 суток после последнего введения у животных общепринятым способом получают кровь и сыворотку.

Полученную антисыворотку проверяют на активность и специфичность. В качестве отрицательного контроля используют сыворотку здорового животного. Для этого культуры микобактерий М. Ьоу15 Уа11ее, М. Ьоу15 8, БЦЖ-1, М. 1иЬегси1о515 Η₃₇Βν, М. аушт 1603, М. Гогийит 342, 81арй, аигеик Со\\'ап 1, Е. сой смешивают в стерильных флаконах со стимулятором роста ВКГ из расчета 1 мг на 1 мл стимулятора. Смесь инкубируют 48 ч при 37°С и высевают на питательную среду ВКГ, разлитую в чашки Петри. Чашки инкубируют при 37°С до появления колоний.

На стеклянную пластинку с гладкой обезжиренной поверхностью наносят по 20 мкл антисыворотки и отрицательной контрольной сыворотки. К ним добавляют по 1 бактериологической петле бактериальной массы колоний указанных штаммов и тщательно перемешивают. За ходом реакции следят путем просмотра пластинки с помощью нижней подсветки осветителя ОИ-19 (табл. 1).

Таблица 1

Специфичность антисыворотки в РА

Виды микобактерий, выращенных на среде ВКГ	Отрицательная сыворотка	Антисыворотка М.Ьоутз
Μ.βονίί Уа11ее	0	++++
БЦЖ-1	0	++++
Μ.Βονΐί 8	0	++++
М.1иЬегси1о815 Η₃₇Κν	0	++++
8(арЬ. аигеиз Сои/ап 1,	+	++++
Е.соП	++	++++
М.Гогйшит 342	+	+++
МЛеггае 17522АТСС	0	+++
М.аушт 1603	0	+++
М.рЫе! 1889	0	++++
М.т1гасе11и1аге 5658	0	++++

++++ - четкая агглютинация с образованием крупно- или мелкохлопьевого агглютината с просветлением жидкости и образованием характерной картины после высушивания и окрашивания;

+ - образование небольших хлопьев без просветления жидкости.

Из-за наличия агглютинации со штаммами нетуберкулезных микобактерий, а также немикобактериальной флорой антисыворотку и отрицательную сыворотку адсорбируют культурами, дающими агглютинацию. Для этого колонии соответствующих культур снимают в питательной среде ВКГ бактериологической петлей и суспендируют на 24 ч в 3% водном растворе фенола из расчета 5-10 мг/мл. После инактивации культуры осаждают центрифугированием при 3000 д в течение 10-15 мин. Надосадочную жидкость удаляют. Бактериальную массу культуры вносят в антисыворотку из расчета 2-10 мг/мл. Смесь инкубируют 1 ч при 37°С и 10-12 ч при 3-10°С. Бактериальную массу удаляют центрифугированием при 3000 д в течение 10-15 мин, антисыворотку проверяют в реакции агглютинации (табл. 2).

Таблица 2

Специфичность истощенных сывороток в РА

Виды микобактерий, выращенных на среде ВКГ	Отрицательная сыворотка	Антисыворотка Μ.Πονίδ
Μ.6ονΪ8 УаПее	0	++++
БЦЖ-1	0	_\|—\|—
Μ.Βονΐδ 8		++++
М.1иЬегси1о515 Η₃₇Κν	0	++++
81арЬ. аигеиз Сочуап 1,	0	4
Е.соП	0	0
МТоПиПит 342	0	. +
МЛеггае 17522АТСС	0	0
М.аушт 1603	0	0
Μ.ρΠΙεί 1889	0	0
М.1п1гасе11и1аге 5658	0	+

- 2 009817

При необходимости процесс адсорбции повторяют. Готовые сыворотки лиофилизируют или консервируют общепринятыми способами.

Для выявления туберкулезной инфекции стерильную кровь смешивают в равных объемах со стимулятором роста ВКГ, и инкубируют 48 ч при 37°С, и высевают на свежеприготовленную среду ВКГ, разлитую по 15 мл в чашки Петри и по 5,5 мл в короткие пробирки с резиновыми пробками. Посевы помещают в термостат при 37°С.

При наличии туберкулезной инфекции через 2-5 суток на поверхности среды ВКГ регистрируют рост росинчатых или восковидных колоний. В мазках, окрашенных по Циль-Нильсену, обнаруживают полиморфные палочки и кокки, ветвящиеся и шарообразные структуры синего цвета.

Для идентификации изолятов антисыворотку и контрольную отрицательную сыворотку наносят по 20 мкл на стеклянную пластинку с обезжиренной поверхностью. Бактериальную массу исследуемой колонии смешивают с антисывороткой и отрицательной контрольной сывороткой. Реакцию учитывают через 5-7 мин, пользуясь нижней подсветкой ОИ-19.

В табл. 3 приведены результаты посева крови 20 коров, реагировавших на туберкулин неблагополучного по туберкулезу стада и исследования в РА изолятов.

Таблица 3

Инв. номер коровы	Реакция на туберкулин в мм	Посев на среду ВКГ
Туберкулезные изменения на убое	Пробирки	Чашка Петри	РА
6119	5		0	+	4-4-4-
49/849	4		4-	п	4-4-4-
6541	3		+	4-	4-4-4-
3224	4		+	4-	+44-+
3797	3		+	0	4-4-4-4-
3253	6		+	п	4-4-4-
3207	10		+	4-	+4-+
3436	5		4-	П	4+4-
947/147	3	+	4-	4-	4-4-4-4-
740	4		4-	0	44-
3228	6		П	п	-
800	7		4-	+	4-
1000	8	+	+	4-	4-4-4-4-
3071	6		0	4-	+4-4-
400	3		4-	4-	++
7170	4		4-	0	+++
1200	4		0	0	-
984	5		+	4-	++++
800	6		4-	4-	++++
7199	9		+	+	++++
Контроль	0		0	0	0

- рост отсутствует; + - характерный рост;

п - пророст.

Полученные результаты показывают инфицированность животных возбудителем туберкулеза даже при отсутствии на убое видимых туберкулезных изменений.

При посеве материала в чашки Петри рост возбудителя получают в 60%, пророст посторонней микрофлоры - в 20% и отрицательный результат - в 20%. При посеве материала на пробирки рост возбудителя получают в 85%, пророст посторонней микрофлоры - в 5% и отрицательный результат - в 10%.

Для облегчения учета результатов реакции агглютинации к смеси культуры с сыворотками добавляют по 10 мкл раствора бриллиантового синего К-250 с рН 7. В случае отрицательной реакции краска быстро расходится по капле, при этом интенсивность окрашивания уменьшается. При положительной реакции интенсивность окрашивания не изменяется, а агглютинат окрашивается в синий цвет;

предметные стекла, на которых ставилась реакция, высушивают на воздухе, 1-2 с фиксируют над пламенем, окрашивают карболовым фуксином (1:5) в течение 3-5 мин, обесцвечивают 3% соляно-кислым спиртом в течение 30-60 с, промывают дистиллированной водой и высушивают. При положительной реакции на предметном стекле остается окрашенная поверхность по контуру капли с характерными разрывами, идущими от центра. При отрицательной реакции окраска отсутствует, сохраняется контур капли или она гомогенная без разрыва (фигура).

-3 009817

Таким образом, проведенные исследования подтверждают возможность повышения эффективности бактериологической диагностики туберкулеза, о чем свидетельствуют корректности методик и технических решений, положенных в основу заявляемого способа.

Способ прошел успешную проверку областных ветеринарных лабораториях Республики Беларусь, в баклабораториях противотуберкулезных учреждений г. Киева.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ выявления туберкулезной инфекции путем инкубации биоматериала в стимуляторе роста ВКГ, посева на питательную среду ВКГ и культивирования, отличающийся тем, что после культивирования выросшую культуру смешивают с антисывороткой к антигенам возбудителя туберкулеза млекопитающих и отрицательной контрольной сывороткой для проведения реакции агглютинации и по образованию характерного агглютината судят о принадлежности культуры к возбудителям туберкулеза млекопитающих.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что антисыворотка получена путем инъекций животным дезинтегрированных без нагревания микобактерий туберкулеза с последующей адсорбцией культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что антисыворотка получена путем инъекций животным возбудителя туберкулеза млекопитающих, выращенного на питательной среде ВКГ с последующей адсорбцией ее культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ.
4. Способ выявления туберкулезной инфекции путем инкубации биоматериала в стимуляторе роста ВКГ, посева на питательную среду ВКГ и культивирования, отличающийся тем, что после культивирования выросшую культуру смешивают на предметных стеклах с очищенными антителами к антигенам возбудителя туберкулеза млекопитающих, выделенными из антисыворотки, и отрицательной контрольной сывороткой для проведения реакции агглютинации, и по образованию характерного агглютината судят о принадлежности культуры к возбудителям туберкулеза млекопитающих.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что антисыворотка получена путем инъекций животным дезинтегрированных без нагревания микобактерий туберкулеза с последующей адсорбцией ее культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ.
6. Способ по п.4, отличающийся тем, что антисыворотка получена путем инъекций животным возбудителя туберкулеза млекопитающих, выращенного на питательной среде ВКГ с последующей адсорбцией ее культурами атипичных микобактерий и банальной микрофлоры, выращенными на питательной среде ВКГ.