RU2525428C2 - Способ диагностики туберкулеза - Google Patents
Способ диагностики туберкулеза Download PDFInfo
- Publication number
- RU2525428C2 RU2525428C2 RU2012147415/15A RU2012147415A RU2525428C2 RU 2525428 C2 RU2525428 C2 RU 2525428C2 RU 2012147415/15 A RU2012147415/15 A RU 2012147415/15A RU 2012147415 A RU2012147415 A RU 2012147415A RU 2525428 C2 RU2525428 C2 RU 2525428C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- mycobacterium tuberculosis
- washed
- tuberculosis
- smears
- antigen
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к медицине, в частности к области медицинской диагностики, и описывает способ диагностики туберкулеза путем проведения иммуноцитогистохимического исследования и выявления экспрессии антигена микобактерии туберкулеза. Способ характеризуется тем, что исследование биологического материала, нанесенного на предметное стекло, проводится с помощью модифицированного иммуноцитогистохимического метода и включает следующие стадии: получение биологического материала: мазков/соскобов, клеточных осадков биологических жидкостей, фиксацию их в ацетоне; обработку 1% раствором бихромата калия; обработку 3% раствором перекиси водорода; нанесение моноклональных антител к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза в разведении 1:20; инкубацию при температуре 3-5 градусов Цельсия в течение 12 часов; нанесение системы детекции EnVision и инкубацию при комнатной температуре; нанесение диаминобензидина; докрашивание гематоксилином; заключение в бальзам или другую среду, микроскопирование, диагностирование заболевания при выявлении антигена микобактерии туберкулез. Способ обеспечивает повышение точности выявления антигена микобактерии туберкулеза, уменьшение стоимости диагностики и возможность его применения в практическом здравоохранении. 2 ил.
Description
Данное изобретение относится к области медицинской диагностики, а именно к выявлению экспрессии антигена микобактерии туберкулеза путем постановки иммуноцитогистохимической реакции.
Наиболее известным морфологическим методом выявления и диагностики туберкулеза и ближайшим аналогом является бактериоскопическое исследование мазков/соскобов из очагов поражения, клеточных осадков биологических жидкостей на предмет обнаружения в них микобактерии туберкулеза (МБТ) с окраской препарата по Циль-Нильсену - так называемая простая бактериоскопия (Приказ Минздрава РФ №109 от 21.03.2003 "О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации"). Этот метод можно использовать и для парафиновых срезов, что имеет особую актуальность в патологической анатомии.
Методика этого способа диагностики заключается в следующем:
1. срезы/мазки помещают в дистиллированную воду;
2. погружают в раствор йодной кислоты, оставляют в ней на 10 минут;
3. промывают срезы/мазки в дистиллированной воде;
4. погружают срезы/мазки в раствор карбол-фуксина, оставляют на 30 минут;
5. промывают срезы/мазки в дистиллированной воде и просушивают при помощи фильтровальной бумаги;
6. наносят на срез/мазок 10 капель дифференцирующий кислотный буфер, оставляют на 1 минуту;
7. промывают срезы/мазки под проточной водой в течение 3 минут;
8. а. для срезов: наносят на срез 10 капель гематоксилина Майера, оставляют на 2 минуты;
б. для мазков: наносят на мазок 10 капель раствор метиленового синего и 5 капель активизирующего основного буфера, оставляют на 30 секунд;
9. промывают срезы в дистиллированной и проточной воде в течение 5 минут, мазки - под проточной водой;
10. дегидрируют в спиртах возрастающей концентрации, просветляют в ксилоле, заключают под покровное стекло (Приведенный пример окраски с использованием красителей фирмы ООО «БиоВитрум»).
Результат окраски: микобактерии окрашиваются в красный цвет на общем голубом или синем фоне. Морфологические характеристики: обычно микобактерии видны в виде тонких изящных палочек, но иногда можно обнаружить изогнутые или извитые варианты. Микроорганизмы, располагающиеся по одиночке, парами или в виде групп, хорошо выделяются на голубом фоне других компонентов препарата. Нередко бактериальные клетки могут располагаться в виде римской цифры V. Однако в случае обнаружения измененных форм кислотоустойчивых микроорганизмов положительный ответ должен быть подтвержден дополнительными методами исследования.
Рассмотренный метод используется для массового обследования на туберкулез, в частности легких; преимущество его в быстроте получения результата и низкой стоимости исследования. Однако данный способ выявления МБТ обладает низкой чувствительностью, так как чтобы обнаружить микобактерии туберкулеза способом микроскопии, в 1 мл исследуемого материала должно содержаться не менее 10000 микробных клеток. Как указывается в вышеуказанном приказе, необходимо иметь в виду, что микроскопическое исследование не позволяет дифференцировать микобактерии комплекса Mycobacterium tuberculosis (возбудителей туберкулеза) от нетуберкулезных («атипичных») микобактерий - возбудителей микобактериозов. На основании микроскопического исследования возможно сделать заключение только о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых микобактерий. Это объясняется тем, что в природе существует большое число нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий, вызывающих микобактериозы, а также кислотоустойчивых сапрофитов, не вызывающих заболевания человека. Микроскопически они неотличимы от Mycobacterium tuberculosis.
Отрицательный результат микроскопического исследования не исключает диагноз туберкулеза, так как в мокроте или других биологических материалах от пациента может содержаться меньше микобактерий, чем может выявить данное исследование. Все сказанное определяет особую актуальность разработки новых высокоспецифичных и чувствительных способов выявления микобактерии туберкулеза. В настоящий момент иммуноцитогистохимическая диагностика все шире используется в практической медицине.
Протокол постановки иммуноцитогистохимической реакции (В.Н.Эллиниди, Н.В.Аникеева, Н.А.Максимова. Практическая иммуногимтоцитохимия. Методические рекомендации. Санкт-Петербург, 2002) имеет следующие этапы:
1. А. мазки фиксируют в ацетоне 3-5 минут; сушат при комнатной температуре, рабочее поле обводят водостойким маркером со стороны мазка, с обратной стороны перманентным маркером;
Б. парафиновые срезы депарафинизируют в ксилоловом спирте 2 раза по 5 минут, затем в 96% этиловом спирте по 3 минуты 2 раза,
2. мазки/срезы промывают в фосфатно-солевом буфере (рН 7,3-7,5);
3. мазки/срезы помещают в 3% раствор перекиси водорода - 10 минут;
4. срезы промывают в дистиллированной воде, затем помещают в теплый цитратный буфер (рН 6,0) на 3 минуты, кипятят в нем 4 минуты, остужают при комнатной температуре;
5. мазки/срезы промывают в 2 порциях фосфатно-солевого буфера (рН 7,3-7,5);
6. наносят первые (специфичные) антитела;
7. инкубируют 1 час в термостате при температуре 37 градусов Цельсия;
8. промывают в 2 порциях буфера (рН 7,3-7,5), убирают излишки жидкости;
9. наносят систему детекции EnVision (Dako), инкубируют 45 минут при комнатной температуре;
10. промывают в 2 порциях буфера (рН 7,3-7,5);
11. наносят диаминобензидин на 1-2 минуты;
12. промывают в буфере (рН 7,3-7,5), затем промывают в дистиллированной воде;
13. слабо докрашивают гематоксилином;
14. срезы дегидратируют в спиртах: в 2 этиловых спиртах 96%, карбоксилоле, ксилоле, в каждом по 3 минуты;
15.заключают в бальзам или другую среду;
16. микроскопируют.
Но как показывает наш опыт, при использовании «стандартного» протокола постановки иммуноцитогистохимической реакции обнаружить антигены микобактерии туберкулеза не удается. В литературе нет данных об использовании данного метода для диагностики туберкулеза путем иммуноцитогистохимического выявления экспрессии антигена микобактерии туберкулеза.
Задача изобретения: создание способа диагностики туберкулеза путем проведения иммуноцитогистохимического исследования для повышения точности выявления антигена микобактерии туберкулеза и возможного его применения в практическом здравоохранении.
Для реализации этой цели впервые предложен модифицированный иммуноцитогистохимический метод исследования биологического материала (мазки/соскобы, клеточные осадки биологических жидкостей). Данный метод основан на специфической реакции антиген - антитело. Он отличается простотой постановки реакции, высокой специфичностью и чувствительностью. Препараты можно просматривать в обычном световом микроскопе и фотографировать.
Предложенный метод отличается тем, что:
1. Перед нанесением перекиси водорода мазки обрабатываются 1% раствором бихромата калия, что способствует повышению проницаемости клеточных мембран и большей доступности выявляемого антигена для антител.
2. На мазки/соскобы в качестве первых (специфических) антител наносят моноклональные мышиные антитела к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза (производства Vector Laboratories), адаптированные нами для постановки иммуноцитогистохимической реакции: разведение первых антител 1:20, инкубация осуществляется при температуре 3-5 градусов Цельсия в течение 12 часов.
3. В качестве вторых антител используется система детекции Dako REAL™ EnVision™ Detection Sistem. Длительность инкубации в растворе вторых антител 1 час при комнатной температуре. Используемая система (ЕnVision) основана на HRP-меченом полимере, который конъюгирован с вторичными антителами. Меченый полимер не содержит авидин или биотин. Следовательно, неспецифическое окрашивание при взаимодействии авидина с эндогенным биотином в исследуемой ткани исключено или значительно снижено. Эта система является высокочувствительной и, как следствие, оптимальное разведение первичных антител в 20 раз выше, чем при традиционном использовании РАР-способа, и в несколько раз больше, чем те, которые традиционно использовались для традиционных ABC или LSAB-методов.
В рамках предложенного проекта впервые используются антитела к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза, адаптированные нами для постановки иммуноцитогистохимической реакции. Обработка раствором бихромата калия, пролонгированное время инкубации при низкой температуре первых антител и использование в качестве системы детекции EnVision позволило получить высокоспецифичный и надежный метод выявления антигена микобактерии туберкулеза. Проводимая при этом оценка локализации антигена микобактерии туберкулеза, с учетом характерных патогистологических изменений дает возможность значительно повысить точность и объективность диагностики туберкулеза.
Предложенный впервые новый подход к способу выявления микобактерии туберкулеза и комплекс методических приемов, выполняемых в процессе иммуноцитогистохимического выявления микобактерии, является обязательным. Невыполнения их не дает объективных результатов или искажает конечный результат исследований, не позволяет провести соответствующую интерпретацию полученных данных.
Предложенный способ осуществляется следующим образом:
1. мазки/соскобы фиксируют в ацетоне 3-5 минут; сушат при комнатной температуре, рабочее поле обводят водостойким маркером со стороны мазка, с обратной стороны перманентным маркером;
2. мазки/соскобы промывают в фосфатно-солевом буфере (рН 7,3-7,5);
3. обрабатывают 1% раствором бихромата калия 3-4 минуты;
3. мазки/соскобы помещают в 3% раствор перекиси водорода - 20 минут;
4. мазки/соскобы промывают в 2 порциях фосфатно-солевого буфера (рН 7,3-7,5);
5. наносят моноклональные антитела к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза в разведении 1:20;
6. инкубируют 12 часов при температуре 3-5 градусов Цельсия;
7. промывают в 2 порциях буфера (рН 7,3-7,5), убирают излишки жидкости;
8. наносят систему детекции EnVision (вторые антитела), инкубируют 60 минут при комнатной температуре;
9. промывают в 2 порциях буфера (рН 7,3-7,5);
10. наносят диаминобензидин на 1-2 минуты;
11. промывают в буфере (рН 7,3-7,5), затем промывают в дистиллированной воде;
12. слабо докрашивают гематоксилином;
13. заключают в бальзам или другую среду;
14. микроскопируют.
Для получения достоверных результатов и исключения возможности неспецифических реакций обязательным условием является проведение контролей на качество реактивов и специфичность антисыворотки.
Для проведения контроля специфичности антисыворотки в качестве первого слоя наносят буфер (результаты должны быть отрицательными).
Оценка продукта реакции: антиген микобактерии туберкулеза выявляется в виде тонких или более утолщенных, изогнутых и извитых палочек коричневого цвета различной интенсивности окраски, разных размеров. Микобактерии могут располагаться одиночно или группами, принимая различные геометрические формы, иногда имеют сходство с кокками или в виде утолщенных образований, напоминающих мицелий грибов. Микобактерии могут располагаться в цитоплазме клеток, на клеточной оболочке и между клетками (свободно лежащие), в таком случае результат трактуется как положительный, при отсутствии продукта реакции результат трактуется как отрицательный.
Описанный способ подкреплен примерами конкретного выполнения. Было проведено исследование мазков с операционного материала от 16 больных с остеомиелитом, в 9 случаях был выявлен антиген микобактерии туберкулеза. В качестве примера приводим иммуноцитохимическое исследование мазка с операционного материала от больного Жданова А.А., 19.06.08 г.р., № и/б 2086, находившегося на лечении в период с 17.02.10. по 19.01.11 г. с диагнозом: туберкулезный (БЦЖ по клинико-лабораторным данным) остит проксимального эпиметафиза левой плечевой кости, осложнившийся абсцессом. Данный случай интересен тем, что при наличии клинико-лабораторных данных, свидетельствующих о развитии туберкулезного процесса, при микроскопии мазков операционного материала, окрашенных по Циль-Нильсену, микобактерии туберкулеза не были выявлены. В связи с этим было проведено иммуноцитогистохимическое исследование для уточнения этиологии заболевания. В результате проведенной нами иммуноцитогистохимической окраски мазков с операционного материала от данного больного были выявлены микобактерии туберкулеза, представленные на рисунке 1 и 2, где позиция 1 - микобактерии туберкулеза.
Положительный эффект от использования заявляемого изобретения заключается в следующем:
Иммуноцитогистохимический способ диагностики туберкулеза позволяет обнаружить антиген микобактерии туберкулеза в тех случаях, когда рекомендуемые способы, в частности бактериоскопия с окраской по Циль-Нильсену, не позволяет выявить возбудителя. Положительная иммуноцитогистохимическая реакция дает возможность говорить о наличии только микобактерии туберкулеза. Данный способ выявляет даже единичные микобактерии. Докраска гематоксилином помогает оценить локализацию антигена, характер морфологических изменений, что также способствует повышению точности диагностики.
Исследование надежно, специфично, чувствительно. Метод достаточно прост, возможно, его широкое применение в практическом здравоохранении для быстрого выявления микобактерии туберкулеза и, соответственно, своевременного назначения этиологической и патогенетической (противотуберкулезной) терапии.
Предлагаемый способ имеет экономическую значимость, т.к. при этом не требуется применения дополнительного лабораторного оборудования.
Claims (1)
- Способ диагностики туберкулеза путем проведения иммуноцитогистохимического исследования, включающий выявление наличия антигена микобактерии туберкулеза, характеризующийся тем, что берут мазки/соскобы, клеточные осадки биологических жидкостей, фиксируют их в ацетоне; сушат; промывают в фосфатно-солевом буфере, обрабатывают 1% раствором бихромата калия; помещают в 3% раствор перекиси водорода; промывают; наносят моноклональные антитела к РАВ-антигену микобактерии туберкулеза в разведении 1:20; инкубируют при температуре 3-5 градусов Цельсия в течение 12 часов; промывают; наносят систему детекции EnVision и инкубируют при комнатной температуре; промывают; наносят диаминобензидин; промывают; слабо докрашивают гематоксилином; заключают в бальзам или другую среду, микроскопируют и при выявлении антигена микобактерии туберкулеза диагностируют заболевание.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012147415/15A RU2525428C2 (ru) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | Способ диагностики туберкулеза |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2012147415/15A RU2525428C2 (ru) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | Способ диагностики туберкулеза |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2012147415A RU2012147415A (ru) | 2014-05-20 |
| RU2525428C2 true RU2525428C2 (ru) | 2014-08-10 |
Family
ID=50695407
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2012147415/15A RU2525428C2 (ru) | 2012-11-07 | 2012-11-07 | Способ диагностики туберкулеза |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2525428C2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2627448C1 (ru) * | 2016-04-05 | 2017-08-08 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Способ иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах |
| RU2794855C1 (ru) * | 2022-01-24 | 2023-04-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" | Способ диагностики туберкулеза |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA009817B1 (ru) * | 2004-06-07 | 2008-04-28 | Лысуха, Николай Николаевич | Способ выявления туберкулезной инфекции |
| CN101382548A (zh) * | 2008-10-10 | 2009-03-11 | 中国人民解放军总医院第二附属医院 | 结核抗体多抗原elisa检测试剂盒及制备方法 |
| RU2455364C2 (ru) * | 2010-07-02 | 2012-07-10 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородская государственная сельскохозяйственная академия" | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции |
-
2012
- 2012-11-07 RU RU2012147415/15A patent/RU2525428C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EA009817B1 (ru) * | 2004-06-07 | 2008-04-28 | Лысуха, Николай Николаевич | Способ выявления туберкулезной инфекции |
| CN101382548A (zh) * | 2008-10-10 | 2009-03-11 | 中国人民解放军总医院第二附属医院 | 结核抗体多抗原elisa检测试剂盒及制备方法 |
| RU2455364C2 (ru) * | 2010-07-02 | 2012-07-10 | Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Белгородская государственная сельскохозяйственная академия" | Способ идентификации микобактерий с помощью полимеразной цепной реакции |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Эллиниди В.Н., Аникеева Н.В., Максимова Н.А. Практическая иммуногимтоцитохимия. Методические рекомендации. Санкт-Петербург, 2002. Лабораторные методы исследования в клинике. Справочник. Меньшиков В. В., Делекторская Л. Н., Золотницкая Р. П. и др.; Под ред. В. В. Меньшикова. М.: Медицина, 1987,—368 с. Майорова, А. А. Идентификация нетуберкулезных микобактерий и выбор оптимальной комбинации методов для их видовой дифференциации. Автореферат к диссертации на соискание ученой степени кандидат биологических наук. Оболенск, 2007. * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2627448C1 (ru) * | 2016-04-05 | 2017-08-08 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Ставропольский государственный аграрный университет" | Способ иммуногистохимического выявления антигенов в препаратах органов продуктивных и непродуктивных животных длительного хранения в фиксаторах |
| RU2794855C1 (ru) * | 2022-01-24 | 2023-04-25 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза" | Способ диагностики туберкулеза |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2012147415A (ru) | 2014-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Reimão et al. | Laboratory diagnosis of cutaneous and visceral leishmaniasis: current and future methods | |
| Borchardt et al. | A comparison of the sensitivity of the InPouch TV, Diamond's and Trichosel media for detection of Trichomonas vaginalis. | |
| Silva et al. | Comparison of the sensitivity of three methods for the early diagnosis of sporotrichosis in cats | |
| Li et al. | Crossover subsets of CD4+ T lymphocytes in the intestinal lamina propria of patients with Crohn’s disease and ulcerative colitis | |
| Chuang et al. | Helicobacter pylori with stronger intensity of CagA phosphorylation lead to an increased risk of gastric intestinal metaplasia and cancer | |
| Nikiforov et al. | Plague: Clinics, diagnosis and treatment | |
| Bruno et al. | Evaluation and development of diagnostic methods for Renibacterium salmoninarum causing bacterial kidney disease (BKD) in the UK | |
| Zhou et al. | Pooled PCR testing strategy and prevalence estimation of submicroscopic infections using Bayesian latent class models in pregnant women receiving intermittent preventive treatment at Machinga District Hospital, Malawi, 2010 | |
| Kahama et al. | Parameters associated with Schistosoma haematobium infection before and after chemotherapy in school children from two villages in the coast province of Kenya | |
| Marn et al. | Amoebic liver abscess with negative serologic markers for Entamoeba histolytica: mind the gap! | |
| Gual et al. | First case report of Toxoplasma gondii-induced abortions and stillbirths in sheep in Argentina | |
| RU2525428C2 (ru) | Способ диагностики туберкулеза | |
| Ahmed et al. | The consequence of delayed fixation on subsequent preservation of urine cells | |
| Bhargava et al. | Revisiting the role of the slit-skin smear in the diagnosis of Indian post-kala-azar dermal leishmaniasis | |
| Mulki et al. | Oral rinse as a simpler approach to exfoliative cytology: A comparative study | |
| Teixeira et al. | Evaluation of the agreement between clinical and laboratorial exams in the diagnosis of leprosy | |
| Galan et al. | Detection of Borrelia in Ixodes scapularis ticks by silver stain, immunohistochemical and direct immunofluorescent methods | |
| CN109557310A (zh) | 一种判断癌症预后的标志物及其应用 | |
| Liu et al. | Diagnosis of placental malaria in poorly fixed and processed placental tissue | |
| Harris et al. | Measuring autophagy in macrophages | |
| Burrough et al. | Spatial distribution of putative growth factors in the guinea pig placenta and the effects of these factors, plasma, and bile on the growth and chemotaxis of Campylobacter jejuni | |
| CN102095860B (zh) | 梅毒特异性IgG抗体免疫印迹试剂盒及其制备方法 | |
| Rahbar et al. | Imprint cytology: a simple, cost effectiveness analysis for diagnosing Helicobacter pylori, in west of Iran | |
| RU2513999C1 (ru) | Способ ранней диагностики тяжести и прогнозирования исхода острого лучевого поражения | |
| US20170160275A1 (en) | Blood-based lateral-flow dipstick assay for detection of enteric fever |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20171108 |