CN108107216B - 一种组合标志物在制备胰腺癌预后判断试剂盒中的应用及其测定系统和方法 - Google Patents

一种组合标志物在制备胰腺癌预后判断试剂盒中的应用及其测定系统和方法 Download PDF

Info

Publication number
CN108107216B
CN108107216B CN201611038981.4A CN201611038981A CN108107216B CN 108107216 B CN108107216 B CN 108107216B CN 201611038981 A CN201611038981 A CN 201611038981A CN 108107216 B CN108107216 B CN 108107216B
Authority
CN
China
Prior art keywords
risk
pancreatic cancer
flna
capn2
shh
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201611038981.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108107216A (zh
Inventor
赵玉沛
李梢
郭俊超
张鹏
周立
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kant Shenzhen Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Tsinghua University
Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tsinghua University, Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences filed Critical Tsinghua University
Priority to CN201611038981.4A priority Critical patent/CN108107216B/zh
Publication of CN108107216A publication Critical patent/CN108107216A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108107216B publication Critical patent/CN108107216B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

胰腺癌是具有极差预后的肿瘤，识别其有效的预后标志物具有重要的临床意义。本发明人提出了一种基于组合标志物来进行胰腺癌患者预后风险评估的方法及其测定系统。其依据病例样本中组合标志物的表达情况，定量地计算其预后风险指数，并对病例进行高、低风险的分层。本发明涉及五个蛋白(CAPN2，DLV1，FLNA,SHH,GLI1，其中CAPN2，DVL1，FLNA对胰腺癌的预后意义为本发明首次确立)构成的组合标志物、可供检测标志物表达的免疫组化试剂盒以及预后风险评估和分层的确定系统等。在280例和120例胰腺癌患者中的案例实施结果表明，本发明能有效地预测胰腺癌患者预后风险，尤其对于具有高预后风险的胰腺癌亚群病人具有显著的预测效果。

Description

一种组合标志物在制备胰腺癌预后判断试剂盒中的应用及其 测定系统和方法
技术领域
本发明涉及一种组合标志物、其在制备用于胰腺癌预后患者预后判断的组合物中的应用及其测定系统和方法。
背景技术
胰腺癌是一种具有极差预后的肿瘤，其死亡率与发生率基本持平。确定有预后价值的因子有着重要的临床意义。目前，虽然一些常见的临床病理指数，如淋巴结转移、神经浸润、TNM分期以及CA19-9等被认为具有一定的预后价值[1]，但仍然亟需发掘更有效的预后指标来指导胰腺癌的临床诊疗。
作为一种复杂疾病，胰腺癌并非由单个基因或其产物决定的，而是肿瘤发生发展过程中的多个病理过程的系统反应，因此将多个病理过程中具有代表性的分子组合起来，即组合标志物，可能能够更好地刻画其复杂性。实施上，目前也有文献报道在一些肿瘤中，由多个分子组成的组合标志物有着比单个分子以及临床病理指数更好的预后效果[3-5]，有些组合标志物甚至已经纳入到临床指南中[6]。因此，识别有效的组合标志物对于评估胰腺癌的预后风险具有重要的意义。
发明内容
根据本发明的一个方面，提供了检测一种组合标志物-PD-FLAGS的表达水平的试剂在制备用于胰腺癌预后患者预后判断的组合物中的应用，其中该组合标志物(简称PD-FLAGS)是五个蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1的组合，所述组合标志物PD-FLAGS由Risk score表征：
Risk score＝(-0.023*CAPN2)+(-0.035*DVL1)+(0.052*FLNA)+(-0.043*GLI1)+(0.015*SHH)
上式中，CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1分别表示各蛋白的定量数值，其中CAPN2、DVL1、FLNA对胰腺癌的预后意义为本发明首次确立。
根据本发明的另一个方面，提供了一种免疫组化检测试剂盒，用于免疫染色五个蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1，从而获取其在胰腺癌组织中的表达情况。
根据本发明的另一个方面，提供了一种胰腺癌预后风险测定系统，其特征在于：该系统用来测定一种与胰腺癌预后相关的组合标志物(PD-FLAGS)，该组合标志物是基于五个蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1的表达水平，所述系统包括：
免疫组化检测试剂盒(20)，用于免疫染色上述五种蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1的表达水平从而获取其在胰腺癌组织中的表达情况，
组织学积分计算单元(31)，用于确定五种蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1的在组织中的表达水平，包括：
获取CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1各自的蛋白染色强度以及阳性细胞比例分数，
得到上述五种蛋白染色强度分别与阳性细胞比例分数的乘积，从而获得五种蛋白分子各自的表达水平的定量数值，
c)风险指数计算单元(32)，用于根据上述五个蛋白的所述定量数值确定由Riskscore表征的风险指数，其中：
Risk score＝(-0.023*CAPN2)+(-0.035*DVL1)+(0.052*FLNA)+(-0.043*GLI1)+(0.015*SHH)，
上式中，CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1分别表示各蛋白的所述定量数值。
根据本发明的一个进一步的方面，上述免疫组化检测试剂盒包括：
试剂A：封闭液，为10％山羊血清；
试剂B：已稀释的即用型抗Calpain-2一抗；
试剂C：已稀释的即用型抗Dvl1一抗；
试剂D:已稀释的即用型抗FlnA一抗；
试剂E:已稀释的即用型抗shh一抗；
试剂F:已稀释的即用型抗Gli-1一抗；
试剂G：抗山羊生物素化二抗；
试剂H：链亲和素标记的HRP；
试剂I：20倍浓缩DAB底物溶液；
试剂J：20倍浓缩DAB底物缓冲溶液；
试剂K：20倍浓缩DAB显色溶液。
根据本发明的一个进一步的方面，上述的胰腺癌预后风险测定系统进一步包括：
一个成像装置，用于获取胰腺癌组织切片的显微图象；
一个阳性细胞图象识别单元，用于根据相应种类的阳性细胞的图像特征识别上述显微图象中的阳性细胞，该图像特征包括阳性细胞的着色强度、形状；
一个计数单元，用于计数所述阳性细胞的个数，该计数的结果被用于确定五种蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1的在组织中的表达水平。
根据本发明的另一个方面，提供了一种胰腺癌预后风险确定装置，其特征在于包括：
组织学积分计算单元，用于确定五种蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1的在组织中的表达水平，包括：
获取CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1各自的蛋白染色强度以及阳性细胞比例分数，
得到上述五种蛋白染色强度分别与阳性细胞比例分数的乘积，从而获得五种蛋白分子各自的表达水平的定量数值
风险指数计算单元，用于根据上述五种蛋白的所述定量数值确定由Risk score表征的风险指数，其中：
Risk score＝(-0.023*CAPN2)+(-0.035*DVL1)+(0.052*FLNA)+(-0.043*GLI1)+(0.015*SHH)，
上式中，CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1分别表示各蛋白的所述定量数值。
根据本发明的一个进一步的方面，上述的胰腺癌预后风险确定装置进一步包括：
风险分层单元，基于风险指数及预设的阈值条件，将病理样本分成高风险或低风险组。
根据本发明的另一个方面，提供了一种胰腺癌预后风险指标的测定方法，其特征在于：该胰腺癌预后风险指标是一种与胰腺癌预后相关的组合标志物(PD-FLAGS)，该组合标志物是基于五个蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1的表达水平，所述测定方法包括：
免疫组化检测步骤，免疫染色上述五种蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1的表达水平从而获取其在胰腺癌组织中的表达情况，
组织学积分计算步骤，用于确定五种蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1的在组织中的表达水平，包括：
获取CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1各自的蛋白染色强度以及阳性细胞比例分数，
得到上述五种蛋白染色强度分别与阳性细胞比例分数的乘积，从而获得五种蛋白分子各自的表达水平的定量数值
风险指数计算步骤，用于根据上述五种蛋白的所述定量数值确定由Risk score表征的风险指数，其中：
Risk score＝(-0.023*CAPN2)+(-0.035*DVL1)+(0.052*FLNA)+(-0.043*GLI1)+(0.015*SHH)
上式中，CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1分别表示各蛋白的所述定量数值。
根据本发明的一个进一步的方面，上述的胰腺癌预后风险指标的测定方法进一步包括：
利用成像装置获取胰腺癌组织切片的显微图象；
利用图象识别单元，根据相应种类的阳性细胞的图像特征，识别上述显微图象中的阳性细胞，该图像特征包括阳性细胞的着色强度、形状；
计数所述阳性细胞的个数，该计数的结果被用于确定五种蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1的在组织中的表达水平。
根据本发明的另一个方面，提供了一种胰腺癌预后风险确定方法，其特征在于包括：
组织学积分计算步骤，用于确定五种蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1的在组织中的表达水平，包括：
获取CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1各自的蛋白染色强度以及阳性细胞比例分数，
得到上述五种蛋白染色强度分别与阳性细胞比例分数的乘积，从而获得五种蛋白分子各自的表达水平的定量数值
风险指数计算步骤，用于根据上述五种蛋白的所述定量数值确定由Risk score表征的风险指数，其中：
Risk score＝(-0.023*CAPN2)+(-0.035*DVL1)+(0.052*FLNA)+(-0.043*GLI1)+(0.015*SHH)
上式中，CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1分别表示各蛋白的所述定量数值。
根据本发明的一个进一步的方面，上述的胰腺癌预后风险确定方法进一步包括：
风险分层步骤，基于风险指数及预设的阈值条件，将病理样本分成高风险或低风险组。
附图说明
图1是根据本发明的一个实施例的组合标志物测定系统的原理图。
图2A显示根据本发明的、基于LASSO COX PH模型的标志物组合的模型回归最优点。
图2B用于说明根据本发明的一个实施例的、基于风险指数来对病人进行高、低风险分层的方法。
图2C是基于本发明的分层方法得到的高、低风险两组病人的随时间变化的生存率分布图。其中高风险有56人(虚线表示)，低风险有224人。
图3A是在根据本发明的实施例中组合标志物的五个分子在癌旁、不同阶段的肿瘤中的免疫组化染色的结果。
图3B是在根据本发明的实施例中对120个病例的高、低风险分层结果以及随时间的生存概率分布图。
具体实施方式
本发明提供了一种基于组合标志物的肿瘤预后风险确定及分层系统。图1示出了根据本发明的一个实施例的组合标志物测定系统的原理框图。
首先，本发明人确定了一组由五个蛋白构成的组合标志物(10)，其对于胰腺癌患者预后风险判断具有显著的预后意义；第二，本发明提出了一个用于评价胰腺癌预后风险的免疫组化检测试剂盒(20)；第三，本发明提出了一种胰腺癌预后风险指标的测定方法和一种胰腺癌预后风险确定装置(30)。第四，本发明提出了一种胰腺癌预后风险测定系统。
根据本发明的一个方面，首次确立了蛋白CAPN2、DVL1和FLNA分别是与胰腺癌预后相关的标志物。
根据本发明的另一个方面，确立了一种与胰腺癌预后相关的组合标志物，该组合标志物是五个蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1的组合(10)，其中蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA均是本发明首次确立与胰腺癌预后相关的蛋白分子，其中组合标志物由Riskscore表征：
Risk score＝(-0.023*CAPN2)+(-0.035*DVL1)+(0.052*FLNA)+(-0.043*GLI1)+(0.015*SHH)。
根据本发明的又一个方面，提供了一种免疫组化检测试剂盒(20)，用于免疫染色上述五个蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1，从而获取其在胰腺癌组织中的表达情况。
根据本发明的又一个方面，提供了一种胰腺癌预后风险确定装置(30)，该装置用来测定上述五个蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1的表达水平、预后风险指数，包括：
a)组织学积分计算单元(31)，用于计算CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1的在组织中的表达水平，包括：
获取CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1各自的蛋白染色强度以及阳性细胞比例分数，
得到上述五个蛋白染色强度分别与阳性细胞比例分数的乘积，
b)风险指数计算单元(32)，用于根据上述五个蛋白的乘积进行加权求和计算，其权重为预定义的数值。
根据本发明的一个进一步的方面，上述预后风险确定装置(30)进一步包括：
c)风险分层单元(33)，基于风险指数及预设的阈值条件，将病理样本分成高风险或低风险组。
根据本发明的又一个方面，提供了一种胰腺癌预后风险测定装置，该测定装置通过测定基于上述五个蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1的表达水平的与胰腺癌预后相关的组合标志物，从而确定胰腺癌预后风险，包括：
a)免疫组化检测试剂盒(20)，用于免疫染色上述五个蛋白分子从而获取其在胰腺癌组织中的表达情况，
b)组织学积分计算单元(31)，用于计算CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1的在组织中的表达水平，包括：
获取蛋白染色强度以及阳性细胞比例分数，
得到蛋白染色强度与阳性细胞比例分数的乘积，
把该乘积作为表达水平的定量数值，
c)风险指数计算单元(32)，用于根据上述五个蛋白的定量数值进行加权求和计算，其权重为预定义的数值。
为了确定胰腺癌预后风险标志物，本发明人首先利用自主研制的CIPHER预测方法[7]，结合组学数据，确定出23个胰腺癌预后候选标志物，其中12个已报道与胰腺癌预后相关，11个尚未报道过与胰腺癌预后相关(表1)。并利用免疫组化检测了23个标志物在280例胰腺癌患者样本中的表达，分析了标志物与患者预后的关系。其中首次确立了预测出的CAPN2、DVL1、FLNA三个标志物与胰腺癌的预后显著相关。
表1.胰腺癌预后候选标志物列表
Figure BDA0001160425420000061
进一步地，基于候选标志物的表达，本发明人利用LASSO Cox PH回归模型[8]分析了具有显著预后意义的组合标志物，得到了一组由5个蛋白CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1构成的组合标志物及其预后风险指数(risk index,RI)的计算模型：
Risk score＝(-0.023*CAPN2)+(-0.035*DVL1)+(0.052*FLNA)+(-0.043*GLI1)+(0.015*SHH).
该组合标志物的成分的选择依据为：在模型回归最优点处具有非零系数的变量(图2A)。单因素的Kalplan-Meier分析总生存率(OS)的结果表明：RI与病人术后存活率之间存在显著的关联，其秩和检验的P值小于0.0001。
图2A显示根据本发明的、基于LASSO COX PH模型的标志物组合的模型回归最优点；其中，虚线表示回归模型在最优点的参数值，标志物组合筛选的标准为：在参数最优点处所对应的非零系数的变量(FLNA、SHH、CAPN2、GLI1、DVL1)。
然后，本发明人基于风险指数对病例进行高、低风险分组。分组的阈值是利用XTile工具来确定的，其结果为0.014。XTile的原理是通过遍历所有的风险分数，找出能使所分开的两组病人预后差异最大的点[9]，如图2B所示。图2B用于说明根据本发明的一个实施例的、基于风险指数来对病人进行高、低风险分层的方法；其中，找出能使所分开的两组病人预后差异最大的点(0.014)，高于该点的为高风险组，低于该点的为低风险组。风险分数高于所确定的阈值的病人归为高风险组，低于阈值的归为低风险组。本发明人发现280个胰腺癌病人中有56个为高风险组，剩余的224个为低风险组，高、低风险组病人预后存在显著的差异(p<0.0001,风险比HR 2.1,95％CI 1.51-3.05)，如图2C所示。在图2C中，曲线代表了病人在不同的时间点的生存概率，可以看出，在不同的时间点上低风险组病人的存活率均比高风险组高，表明该高、低风险分组结果具有显著的预后可区分性。
依据以上的方法和结果的有效性，本发明人进一步开发了一套便捷、实用的系统，用来检测组合标志物的表达、计算病例风险指数以及预后风险分层结果，并在实施案例中进行详细说明。
实施例
为了验证本发明在胰腺癌患者中对其生存预测的价值，本发明人独立地对120例胰腺癌患者病例进行了分析。患者年龄从40岁到89岁不等(中位年龄66岁)，术后当天开始随访，随访时间从2个月到96个月不等，中位随访期为11个月。
组合标志物表达的检测
首先，运用根据本发明的免疫组化检测试剂盒(20)来获得基于五个蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH、GLI1的组合标志物在120病理标本中的表达。该试剂盒利用免疫组化(IHC)来衡量组合标志物的表达水平。采用10％福尔马林缓冲液固定石蜡包埋手术样本，组织切片为4微米/张。
本实施例中的试剂盒，包括以下组分：
(1)试剂A：封闭液，为10％山羊血清；
(2)试剂B：已稀释的即用型抗Calpain-2一抗；
(3)试剂C：已稀释的即用型抗Dvl1一抗；
(4)试剂D:已稀释的即用型抗FlnA一抗；
(5)试剂E:已稀释的即用型抗shh一抗；
(6)试剂F:已稀释的即用型抗Gli-1一抗；
(4)试剂G：抗山羊生物素化二抗；
(5)试剂H：链亲和素标记的HRP；
(6)试剂I：20倍浓缩DAB底物溶液；
(7)试剂J：20倍浓缩DAB底物缓冲溶液；
(8)试剂K：20倍浓缩DAB显色溶液。
根据本发明的一个具体实施例，上述试剂B-F原装进口分装即用型抗体，稀释倍数为1：500；试剂G原装进口分装即用型抗体，稀释倍数为1：400；试剂A、G、H、I、J、K为原装进口分装。
根据本发明的一个具体实施例，除试剂盒中包含的上述试剂，用户可自行配制或购买以下试剂：
(1)蒸馏水或去离子水；
(2)3％H 2O 2；
(3)二甲苯；
(4)75％、85％、95％酒精及无水乙醇；
(5)10mM TBS溶液(pH7.2～7.4)：三羟基氨基甲烷1.21g，氯化钠7.6g，加蒸馏水800mL，浓盐酸调pH值至7.2～7.4，最后定容至1000mL；
(6)10mM pH6.0柠檬酸缓冲液：柠檬酸0.38g，柠檬酸三钠2.45g，加蒸馏水900mL，浓盐酸调pH值至6.0，最后定容至1000mL；
(7)苏木精溶液；
(8)中性树脂。
利用上述试剂盒检测胰腺癌组织中组合标志物的表达：
(1)组织包埋：10％的中性福尔马林固定胰腺癌组织标本2h，用流水反复冲洗以去除固定液，将标本放置入75％酒精过夜，然后采用酒精梯度脱水，75％酒精1h，85％酒精1h，95％酒精1h，无水乙醇2次，每次1.5h，然后置于二甲苯中浸泡1.5h，60℃烘箱中浸蜡1h包埋，冷却后4℃保存备用；
(2)石蜡切片：修整蜡块，调整切片机(SLEE石蜡切片机CUT5062)将切片厚度设为3～4μm，连续切片，置于60℃温水漂浮展平，平铺于涂有阳离子树脂的载玻片上；
(3)烤片：将待做切片置于切片架上，于60℃恒温烤箱中至少烤1h；
(4)脱蜡：切片放入盛有二甲苯的容器中脱蜡3次(即二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，每次10min；
(5)水化：切片经下行酒精水化，无水乙醇5min，95％乙醇2次(每次2min)，85％乙醇2min；75％乙醇2min，蒸馏水冲洗1分钟；
(6)抗原修复：高压锅中加入柠檬酸缓冲液1000ml，将装有切片的切片架浸入缓冲液中，高温高压修复2分45秒，用TBS洗涤3次，每次2min；
(7)3％H 2O 2滴加在切片上，室温静置15min，TBS洗涤3次，每次2min；
(8)封闭：滴加试剂A于切片上，需完全覆盖组织切片，室温孵育10min后吸干液体，无需冲洗；
(9)加一抗：不同的切片分别滴加试剂B(抗Calpain-2一抗)、试剂C(抗Dvl1一抗)、试剂D(抗FlnA一抗)、试剂E(抗shh一抗)、试剂F(抗Gli-1一抗)，需完全覆盖组织切片，37℃湿盒孵育2hr或4℃过夜；
(10)洗涤：TBS-T洗涤(3×5min)；
(11)加二抗：试剂G(滴加生物素化二抗)，需完全覆盖组织切片，37℃湿盒中孵育30min；
(12)洗涤：TBS洗涤3次，每次5min；
(13)加HRP-SA：滴加试剂H(链亲和素标记的HRP)，需完全覆盖组织切片，37℃湿盒中孵育30min；
(14)洗涤：TBS洗涤3次，每次5min；
(15)制备DAB显色液：需现用现配，以染一张切片为例，取2.5ul试剂I加入到50ul蒸馏水中并混匀，再分别向上述液体中加入2.5ul试剂J及2.5ul试剂K，混匀；
(16)显色：滴加上述DAB显色液于切片上，需完全覆盖组织切片，显微镜下观察显色，蒸馏水冲洗终止显色；
(17)复染：苏木精复染3min，盐酸酒精分化；
(18)封片：75％酒精浸泡2min，85％酒精浸泡2min，95％酒精浸泡2min，无水乙醇浸泡2min，然后置于二甲苯中浸泡15min，更换二甲苯后再浸泡15min，中性树脂封片；
(19)结果判读：显微镜下观察染色的胰腺癌组织切片，阳性结果成棕黄色颗粒样染色，随机选择5个高倍视野(10*40)计数阳性细胞个数。阳性细胞数比例0-5％、6-25％、26-50％、51-75％及76-100％分别判定为0、1、2、3、4分。每张切片阳性细胞的着色强度按无着色、淡黄色、棕黄色及棕褐色分别判读为0、1、2、3分。
如图3A展示了组合标志物在癌旁、I期肿瘤以及II期肿瘤中的表达情况。
根据本发明的一个实施例，可以自动实现上述步骤(19)的结果判读。例如，可以拍摄胰腺癌组织切片的显微图象，再通过图象识别技术获得阳性细胞的各读数结果。即，根据本发明的预后风险确定装置(30)可以包括：
一个成像装置，用于获取胰腺癌组织切片的显微图象；
一个阳性细胞图象识别单元，用于根据相应种类的阳性细胞的图像特征(着色强度、形状等)识别上述显微图象中的阳性细胞；
一个计数单元，用于计数所述阳性细胞的个数，该计数的结果被用于确定五种蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1的在组织中的表达水平。
病例预后风险确定与分层
得到组合标志物的判读结果后，首先利用预后风险计算装置(30)中的组织学积分计算单元(31)计算组合标志物中各自的表达水平。随后利用风险指数计算单元(32)，基于其表达水平，计算病例样本的风险指数RI。运用单因素的Kalplan-Meier分析总生存率(OS)的结果表明：该RI与病人术后存活率之间存在显著的关联，其秩和检验的P值小于0.0001，如表2所示。同时，相比其他临床指数(如T分期、N分期以及TNM分期等)，该风险指数的预后关联性更强。进一步，本发明人利用多因素的COX比例风险模型分析发现，该风险指数是独立于临床指标的预后因子(P<0.01)。以上结果表明，利用利用该计算装置得到的预后风险指数能够独立地预测胰腺癌病人的预后风险，且不受年龄、性别、组织学分级、淋巴结阳性比率等因素的影响。
表2.实施案例中120例病人的单因子及多因子预后性能分析
Figure BDA0001160425420000101
进一步利用风险分层单元(33)对病人进行分层。在120例病人中，高风险有101例，低风险有19例。Kalplan-Meier分析发现，高风险组病人的术后两年存活率为0％，而低风险组病人的术后两年存活率为20％，两组之间存在显著的预后风险(风险比：3.18,95％CI:1.89-5.37,P<0.0001),如图3B所示。结果证明，利用该分层单元能够有效对病人进行高、低风险分层。
在独立样本中实施本发明的癌症预后组合标志物、预后风险分数计算、分层方法以及装置，结果表明其能够有效地预测胰腺癌病例的预后风险，并能准确地对病例的高、低风险进行分层，因而更有力地证明了发明的有效性。
该发明能实现快速、安全、方便、有效地预测胰腺癌患者预后不良风险，尤其对于具有高预后风险的亚群病人具有较好的预测效果，为胰腺癌术后治疗提供依据。
此外，本发明所述的胰腺癌指胰导管癌(pancreatic ductal adenocarcinoma,PDAC)。
参考文献:
[1].Winter,J.M.,C.J.Yeo and J.R.Brody,Diagnostic,prognostic,andpredictive biomarkers in pancreatic cancer.JOURNAL OF SURGICAL ONCOLOGY,2013.107(1SI):p.15-22.
[2].Barabasi,A.,N.Gulbahce and J.Loscalzo,Network medicine:a network-based approach to human disease.NATURE REVIEWS GENETICS,2011.12(1):p.56-68.
[3].Paik,S.,et al.,A multigene assay to predict recurrence oftamoxifen-treated,node-negative breast cancer.NEW ENGLAND JOURNAL OFMEDICINE,2004.351(27):p.2817-2826.
[4].O'Connell,M.J.,et al.,Relationship Between Tumor Gene Expressionand Recurrence in Four Independent Studies of Patients With Stage II/IIIColon Cancer Treated With Surgery Alone or Surgery Plus Adjuvant FluorouracilPlus Leucovorin.JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY,2010.28(25):p.3937-3944.
[5].Zhang,J.,et al.,Prognostic and predictive value of a microRNAsignature in stage II colon cancer:a microRNA expression analysis.LANCETONCOLOGY,2013.14(13):p.1295-1306.
[6].NCCN.Clinical Practice Guidelines in Oncology:breast cancer(version 3.2014).2014.http://www.nccn.org/professionals/physician_gls/pdf/breast_risk.pdf(accessed March 2,2015).
[7].Wu,X.,et al.Network-based global inference of human diseasegenes.MOLECULAR SYSTEMS BIOLOGY 2008；4:189
[8].Tibshirani,R.,The lasso method for variable selection in the coxmodel.STATISTICS IN MEDICINE,1997.16(4):p.385-395.
[9].Camp,R.L.,M.Dolled-Filhart and D.L.Rimm,X-tile:A new bio-informatics tool for biomarker assessment and outcome-based cut-pointoptimization.CLINICAL CANCER RESEARCH,2004.10(21):p.7252-7259.

Claims (6)

1.检测一种组合标志物的表达水平的试剂在制备用于胰腺癌患者预后风险判断的组合物中的应用，其中该组合标志物是五个蛋白分子CAPN2，DVL1，FLNA,SHH,GLI1的组合，所述组合标志物由Risk score表征：
Risk score＝(-0.023*CAPN2)+(-0.035*DVL1)+(0.052*FLNA)+(-0.043*GLI1)+(0.015*SHH)
上式中，CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1分别表示各蛋白的定量数值。
2.一种胰腺癌预后风险测定系统，其特征在于：该胰腺癌预后风险测定系统用来测定一种与胰腺癌预后相关的组合标志物，该组合标志物是五个蛋白分子CAPN2，DVL1，FLNA,SHH,GLI1的组合，所述胰腺癌预后风险测定系统包括：
免疫组化检测试剂盒(20)，用于免疫染色上述五种蛋白分子CAPN2，DVL1，FLNA,SHH,GLI1的表达水平从而获取其在胰腺癌组织中的表达情况，
组织学积分计算单元(31)，用于确定五种蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1的在组织中的表达水平，包括：
获取CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1各自的蛋白染色强度以及阳性细胞比例分数，
得到上述五种蛋白染色强度分别与阳性细胞比例分数的乘积，从而获得五种蛋白分子各自的表达水平的定量数值，
风险指数计算单元(32)，用于根据上述五个蛋白的所述定量数值确定由Risk score表征的风险指数，其中：
Risk score＝(-0.023*CAPN2)+(-0.035*DVL1)+(0.052*FLNA)+(-0.043*GLI1)+(0.015*SHH)，
上式中，CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1分别表示各蛋白的所述定量数值，
所述组合标志物由Risk score表征。
3.根据权利要求2所述的胰腺癌预后风险测定系统，其特征在于所述免疫组化检测试剂盒包括：
试剂A：封闭液，为10％山羊血清；
试剂B：已稀释的即用型抗Calpain-2一抗；
试剂C：已稀释的即用型抗Dvl1一抗；
试剂D:已稀释的即用型抗FlnA一抗；
试剂E:已稀释的即用型抗shh一抗；
试剂F:已稀释的即用型抗Gli-1一抗；
试剂G：抗山羊生物素化二抗；
试剂H：链亲和素标记的HRP；
试剂I：20倍浓缩DAB底物溶液；
试剂J：20倍浓缩DAB底物缓冲溶液；
试剂K：20倍浓缩DAB显色溶液。
4.根据权利要求2或3所述的胰腺癌预后风险测定系统，其特征在于进一步包括：
一个成像装置，用于获取胰腺癌组织切片的显微图象；
一个阳性细胞图象识别单元，用于根据相应种类的阳性细胞的图像特征识别上述显微图象中的阳性细胞，该图像特征包括阳性细胞的着色强度、形状；
一个计数单元，用于计数所述阳性细胞的个数，该计数的结果被用于确定五种蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1的在组织中的表达水平。
5.一种胰腺癌预后风险确定装置(30)，其特征在于包括：
组织学积分计算单元(31)，用于确定五种蛋白分子CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1的在组织中的表达水平，包括：
获取CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1各自的蛋白染色强度以及阳性细胞比例分数，
得到上述五种蛋白染色强度分别与阳性细胞比例分数的乘积，从而获得五种蛋白分子各自的表达水平的定量数值
风险指数计算单元(32)，用于根据上述五种蛋白的所述定量数值确定由Risk score表征的风险指数，其中：
Risk score＝(-0.023*CAPN2)+(-0.035*DVL1)+(0.052*FLNA)+(-0.043*GLI1)+(0.015*SHH)，
上式中，CAPN2、DVL1、FLNA、SHH以及GLI1分别表示各蛋白的所述定量数值。
6.根据权利要求5所述的胰腺癌预后风险确定装置(30)，其特征在于进一步包括：
风险分层单元(33)，基于风险指数及预设的阈值条件，将病理样本分成高风险或低风险组。
CN201611038981.4A 2016-11-24 2016-11-24 一种组合标志物在制备胰腺癌预后判断试剂盒中的应用及其测定系统和方法 Active CN108107216B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611038981.4A CN108107216B (zh) 2016-11-24 2016-11-24 一种组合标志物在制备胰腺癌预后判断试剂盒中的应用及其测定系统和方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201611038981.4A CN108107216B (zh) 2016-11-24 2016-11-24 一种组合标志物在制备胰腺癌预后判断试剂盒中的应用及其测定系统和方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108107216A CN108107216A (zh) 2018-06-01
CN108107216B true CN108107216B (zh) 2020-03-31

Family

ID=62203634

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201611038981.4A Active CN108107216B (zh) 2016-11-24 2016-11-24 一种组合标志物在制备胰腺癌预后判断试剂盒中的应用及其测定系统和方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108107216B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110456054B (zh) * 2019-08-13 2022-07-05 臻悦生物科技江苏有限公司 胰腺癌检测试剂、试剂盒、装置及应用
CN111206098B (zh) * 2020-02-10 2023-02-21 中山大学肿瘤防治中心（中山大学附属肿瘤医院、中山大学肿瘤研究所） p38γ在制备胰腺癌预后诊断试剂中的应用
CN113234833A (zh) * 2021-07-09 2021-08-10 北京泱深生物信息技术有限公司 一种胰腺癌的预后标志物、预后风险评估模型及其应用
CN113234834A (zh) * 2021-07-09 2021-08-10 北京泱深生物信息技术有限公司 一组用于胰腺癌预后的基因及其应用
CN113234835A (zh) * 2021-07-09 2021-08-10 北京泱深生物信息技术有限公司 预后相关基因及风险模型预测胰腺癌预后的应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1852974A (zh) * 2003-06-09 2006-10-25 密歇根大学董事会 用于治疗和诊断癌症的组合物和方法
CN1981054A (zh) * 2004-05-14 2007-06-13 加利福尼亚大学董事会 用抗wnt2单克隆抗体和sirna治疗癌症的方法
WO2012031008A2 (en) * 2010-08-31 2012-03-08 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1852974A (zh) * 2003-06-09 2006-10-25 密歇根大学董事会 用于治疗和诊断癌症的组合物和方法
CN1981054A (zh) * 2004-05-14 2007-06-13 加利福尼亚大学董事会 用抗wnt2单克隆抗体和sirna治疗癌症的方法
WO2012031008A2 (en) * 2010-08-31 2012-03-08 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Calpain system protein expression in carcinomas of the pancreas, bile duct and ampulla;Sarah J Storr, et al.;《BMC Cancer》;20121231;第12卷;第1-9页 *
Filamin A mediates HGF/c-MET signaling in tumor cell migration;Alex-Xianghua Zhou, et al.;《 International Journal of Cancer》;20100427;第128卷;第839-846页 *
Inhibition of β-Catenin signaling suppresses pancreatic tumor growth by disrupting nuclear β-Catenin/TCF-1 complex: Critical role of STAT-3;Kartick C. Pramanik，et al.;《Oncotarget》;20150321;第1-14页 *
Sonic Hedgehog and Gli1 Expression Predict Outcomein Resected Pancreatic Adenocarcinoma;Raphael Marechal, et al.;《Clinical Cancer Research》;20141231;第1215-1224页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108107216A (zh) 2018-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108107216B (zh) 一种组合标志物在制备胰腺癌预后判断试剂盒中的应用及其测定系统和方法
US20220051804A1 (en) Image Analysis for Breast Cancer Prognosis
Holten-Rossing et al. Optimizing HER2 assessment in breast cancer: application of automated image analysis
CN110157801B (zh) 一种组合标志物及其在制备胃癌发生风险预测试剂盒中的应用及其测定系统和方法
CN108169490B (zh) 一组用于评估胶质母细胞瘤预后的联合蛋白及其应用
Aleskandarany et al. TOMM34 expression in early invasive breast cancer: a biomarker associated with poor outcome
Saldanha et al. 5-Hydroxymethylcytosine is an independent predictor of survival in malignant melanoma
CN105861692A (zh) 研究前列腺癌复发和转移的方法
CN109541209A (zh) 食管鳞状细胞癌微环境细胞标志物分子模型及其应用
CN115201478A (zh) 一种检测乳腺癌组织粒淋比的免疫双标试剂盒及其应用
Mahajan et al. AWARDS
Jonmarker Jaraj et al. Intra-and interobserver reproducibility of interpretation of immunohistochemical stains of prostate cancer
Kumar et al. Diagnostic utility of immunohistochemistry in concordance with mRNA analysis of PRAME in the stratification of high-risk uveal melanoma patients
CN112946276A (zh) I期肺腺癌患者术后复发风险预测系统及其应用
JP6675716B2 (ja) 免疫因子を指標とした肺腺癌の予後演算式作成方法と予後推定方法
CN111936858A (zh) 一种胃癌极早期细胞标志和胃癌前病变早期细胞标志及其在诊断试剂盒中的应用
CN116559462A (zh) 用于肿瘤患者预后的生物标志物组及其用途
CN113970638B (zh) 确定胃癌极早期发生风险及评估胃癌前病变进展风险的分子标志及其在诊断试剂盒中的应用
CN114990218A (zh) 一种预测肺癌脑转移的试剂盒
CN112229998B (zh) 一种卵巢癌的预后诊断标志物Claudin22及其应用
Serrero et al. Immunohistochemical detection of progranulin (PGRN/GP88/GEP) in tumor tissues as a cancer prognostic biomarker
Nambirajan et al. AWARDS
RU2763839C1 (ru) Способ многофакторного прогноза рака молочной железы
CN106124764B (zh) 以hoxb9和pbx1作为生物标志物的胃癌检测试剂盒及应用
RU2777052C1 (ru) Способ количественной оценки уровня экспрессии белка С23/нуклеолина в гистологических препаратах

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230531

Address after: 518054, 201, Zhonggang Building, Building M-6, Maqueling Industrial Zone, Maling Community, Yuehai Street, Nanshan District, Shenzhen City, Guangdong Province

Patentee after: Kant (Shenzhen) Biotechnology Co.,Ltd.

Address before: 100730 Beijing city Dongcheng District Wangfujing Park No. 1

Patentee before: PEKING UNION MEDICAL COLLEGE Hospital

Patentee before: TSINGHUA University