SU1124030A1 - Способ идентификации галофильных вибрионов - Google Patents

Abstract

СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГАЛОАИЛЬНЫХ ВИБРИОНОВ путем выращивани  исследуемого материала на хштательной среде, отличающийс  тем, что,с целью ускорени  и упрощени  способа, вьфащивание осуществл ют в присутствии фага Vibrio alginolyticus 531,Vibrio alginolyticus 337 и/или Vibrio alginolyticus 532.

Description

(Л

c

Ю

1 Изобретение относитс  к микробио . логин, в частности к лабораторной диагностике галофильных вибрионов. - Известен способ вдентификации галофильных вибрионов путем выращивани  исследуемого материала на питательной среде с последующим перес TioM и идентификацией по биохимичес .КИМ тестам D J. Однако известный способ длителен и слржец в осуществлении, так как многоэтажен, требует набора индикаторных питательных сред. Цель изобретени  - ускорение и упрощение способа. Цель достигаетс  тем, что соглас но способу идентификации галофильны вибрионов путем вьтращиванн  исследу мого материала на питательной среде вьфащиваниё осуществл ют в присутствии фага Vibrio alginolyticus 531 Vibrio alginolyticus 337 и/или Vibrio alginolyticus 532. Фаг Vibrio alginolyticus 531 выделен при исследований мидий, вьиоэ ленных в Севастопольской бухте. Фаг Vibrio alginolyticus 531 хранитс  в коллекции бактериофагов Тбилисского НИИВС МЗ СССР под номером Ф-107 и характеризуетс  следующими признака ми. Морфологические и культуральные свойства. Головка вибрионов фага Vibrio alginolyticus имеет в проекции гексагональную форму размером 806 А 1-18 X А. Дпина отростка 1271 431 А,его диаметр 277 ±18 А. Доверительные интервалы средних величин определены дл  уров н  достоверности, равного 99% (р 0,01). Фаг 531 с сокращающимс  чехлом отростка, относитс  к 5-й морфологической группе по классификации А.С. Тихоненко. Фаг 531 активно репродуцируетс  на клетках индикаторного штамма Vibrio alginolyticus 434 в щелочном бульоне и бульоне Мартена с 3% NaCI при 37°С. При посевной дозе фага .2-10 мл и множественности инфекции - 10 в течение 6 ч в 1 мл среды накапливаетс  6-10 вибрионов Негативные колонии фага 531 воспроизвод тс  с помощью двуслойного метода Грациа, в качестве нижнего плотного сло  используют щелочной 2%-ный агар Мартена с 3% NaCI или 02 Другие среды дл  вьщелени  вибрионов (изготовленные в Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего Востока или в Московском институте вакцин и сьгоороток им. Мечникова) с повышенной концентрацией соли. На пластинки плотного агара выливают вторым слоем смесь расплавленного и охлазкденного до 45 С 0,7%-ного агаpa Мартена с 2% NaCI, 2-3 часовой бульонной культуры индикаторного штамма и 50-100 вибрионов фага в 0,1 мл среды. Через 16-18 ч при 20-25°С фибрионы фага 531 образуют в м гком слое агара с индикаторной культурой Vibrio alginolyticus 4892 мутные колонии округлой формы диаметром 3-4 tot. При нанесении капли фага 531 на газон индикаторного штамма непосредственно на плотном агаре или в слое м гкого агара наблюдаетс  неполный лизис. Фаг 531 полностью нейтрализуетс  гомологичной сывороткой и не нейтрализуетс  сыворотками к гетерологичным фагам галофильных и других вибрионов. Фаг Vibrio alginolyticus 531 в концентращш 8-10 лизирует 15% испытанных культзф галофильных вибрионов , нелйзирующихс  фагами 337 и 532. Фаг обладает высокой специфичностью в отношении галофильных вибрионов и не лизирует вибрионы вида Vibrio cholerae 01 и не 01 группы, а также микроорганизмы других родов и семейств: Aeromonas, Anaerogenes, Escherichia coli, Pseudomonas. Aeruginosa. Ha зтом основании фаг может быть использован дл  индентификации галофильных вибрионов как в составе поливалентно-го препарата, так и дл  фаготипировани  в качестве монофага. Штамм фага Vibrio alginolyticus 337 вьделен при исследовании краба, выловленного в Севастопольской бухте . Штамм фага Vibrio alginolyticus 337 хранитс  в коллекции бактериофагов Тбилисского НИИВС МЗ СССР под номером Ф-105 и характеризуетс  следующими признаками. Морфологические и культуральные свойства. Головка вибриона фага 337 в проекции имеет гексагональную форму, размерами 574 + 45 530 - 42 1. Дли .3

на отростка 1034 22 А. Доверительные интервалы средних величин определены дл  уровн  достоверности, равного 99% (р 0,01). Фаг 337 с коротким отростком и относитс  к 3-й морфологической группе по классификации А.С. Тихоненко.

Фаг 337 активно репродуцируетс  в щелочном бульоне Мартена (рН 7,67 ,8) с 3% NdCI на клетках индикаторного штамма Vibrio alginolyticu N 26.2. При посевной дозе фага 5-10 и множественности инфекции 5 через 3,5 ч при 35-37°С в 1 мл среды накапливаетс  2 10 вибрионов. Негативные колонии фага 337 воспроизвод тс  с помощью двуслойного метода Грациа. В качестве нижнего плотного сло  используют щелочной 2%-ный агар Мартена с 3% NaCI или. другие щелочные среды дл  вьщелени  вибрионов (изготовленные в Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего Востока или в Московском институте вакцин и сывороток им. Мечникова). На пластинки плотного агара вьшивают вторым слоем смесь расплавленного и охлажденного до 45С 0,7%-ного Мартена с 2% NaCI, с 0,2 мл 2-3 часовой бульонной культуры индикаторного штаима и 50100 вибрионов фага в 0,1 мл бульон Через 16-18 ч при 20-25°С вибрионы фага 337 образуют в м гком слое агара с индикаторной культурой Vibrio alginolyticus 262 негативны колонии округлой формы с прозрачным центром и узким мутным ободком по периферий.

При нанесении капли фага 337 на газон- индикаторного штамма непосредственно на плотном агаре или в слое м гкого агара происходит полны лизис культуры.

Фаг Vibrio alginolyticus 337 полностью нейтрализуетс  гомологичной сьюороткой и не нейтрализуетс  сыворотками к гетерологичным фагам галофильных и других вибрионов , обладает узким диапазоном и лизирует 3% культур галофильных вибрионов, не лизирующихс  другими фагами. Фаг специфичен и не лизирует представителей вида Vibrio cholerae 0,1 01 группы, а также микроорганизмы других родов и семейств: Aeromonas anaerogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa. Ha этом основании фаг

4030 . Л

может бьпь использован дл  идентификации галофильных вибрионов как в составе поливалентного препарата, так и дл  фаготипировани  в качестве монофага.

Штамм фага Vibrio al|inolyticas 532 вьщелен при исследовании мидий, вьтовленных в Севастопольской бухте .

Фаг Vibrio alginolyticus 532 хранитс  в коллекции бактериофагов Тбилисского НИИВС МЗ СССР под номером Ф-105 и характеризуетс  следующими признаками.

Морфологические и культуральные свойства.

Головка вибрионов фага 532 имеет в проекции гексагональную форму, размером 1138 ±65 X -1062164 А Дпина отростка 2599 i162 X, ширина 270 ±11 А. Доверительные интервалы средних величин определены дл  уровн  достоверности, равного 99% (р 0,01). Фаг 532 с сокращающимс  чехлом отростка относитс  к 5-й морфологической группе по Т.Н. Тихоненко.

Фаг 532 активно репродуцируетс  на клетках индикаторного штамма . Vibrio alginolyticus 532 с щелочном бульо.не Мартена с 2-3% NaCI при 35-37С. При посевной дозе фага 1-10 мл среды и множественности инфекции 1/15 в течение 3,5 ч в 1 мл среды накапливаетс  1,5-10 вибрионов фага.

Негативные колонии фага 532 воспроизвод тс  с помощью двуслойного метода Грациа. В качестве нижнего плотного сло  используют щелочной 2%-ный агар Мартена с 3% NaCI или другие плотные щелочные среды дл  вБиелени  вибрионов (изготовленные в Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего Востока 1ти в Московском институте вакцин и сывороток им. Мечникова) с повьш1енной кон центрацией соли. На пластинки плотного агара выливают вторым слоем смесь расплавленного и охлажденного до 45 ° С 0,7%-ного агара Мартена с 2% NaCI, 0,2 мл 2-3-часовой бульонной культуры индикаторного штамма и 50-100 вибрионов фага в П,1 мл среды. Через 16-18 ч при 20-25 С вибрионы фага 532 образуют в м гком слое агара с индикаторной культурой Vibrio alginolyticus 532 колонии округлой 5 формы с прозрачным центром и мутной периферией, диаметром 2-3 мм. При нанесении капли фага 532 на газон индикаторного штамма непосред ственно на плотной среде или в м гком слое агара наблкщаетс  лизис культуры. Фаг Vibrio alginolyticus 532 полностью нейтрализуетс  гомологичной сывороткой и не нейтрализуетс  сыворотками к гетерологичным фагам галофильных и других вибрионов. Фаг Vibrio alginolyticus 532 лизирует 40% испытанных культур Vibrio alginolyticus и обладает вы сокой специфичностью в отношении гальфильных вибрионов. Он не лизирует вибрионы вида Vibrio cholerae 01 и не 01 группы, а .также микроорганиз 6 1 других родов и семейств: Aeromonasanaerogenes, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, В св  зи с этим он может, быть использован дл  идентификации галофильных вибри онов как в составе поливалентного препарата, так и дл  фаготипировани  в качестве мопофага. Пример 1. Использова.ние фа га Vibrio alginolyticus 531 дл  иде тификации культур галофильных вибрионов . Из испражнений больного острой кишечной инфекцией, подозрительйой по клиническому течению на забо левание вызванное галофильными вибрионами, была вьделена культура грамотрицательных бактерий. Ццентификащто этой культуры с помощью фага Vibrio alginolyticus 531 прово д т следующим образом. Культуру засевают в бульон Мартена с 3% NaCI и помещают в термостат на 3 ч.(0,2 мл вьфосшей культу ры смешивают с 5 мл расплавленного 06 и охлажденного до 0,7%-ного агара Мартена с 2% NaCI и наливают вторым слоем на пластинки 2%-ного аг,ара Мартена с 3% NaCI в чашках Петри. После подсушивани  на поверхность м гкого агара с культурой нанос т .стерильной пипеткой каплю фага Vibrio alginolyticus 531. Посевы оставл ют при комнатной температуре. Через 18 ч на месте нанесени  капли фага наблюдают просветление газона культуры, свидетельствующее о ее растворении. Лизис изучаемой культуры под действием фага Vibrio alginolyticus 531 позвол ет идентифицировать ее как галофильный вибрион. Пример 2. Вьаделенна  культура не лизировалась фагом Vibrio alginolyticus 531. По методике, описанной в примере 1, быпа определена ее чувствительность к фагу 337. Лизис изучаемой культуры под действием фага Vibrio alginolyticus 337 свидетельствует о ее принадлежности к галофильным вибрионам. Пример 3. Вьщеленна  культура не лизируетс  ни одним из фагов Vibrio alginolyticus (531 и 337). По методике, описанной в примере 1, была определена ее чувствительность к фагу Vibrio alginolyticus 532. Лизис иззгчаемой культуры под действием фага Vibrio alginolyticus 532 свидетельствует о ее принадлежности к галофильным вибрионам . Аналогичным образом были идентифицированы кзльтуры, вьщеленные из морской воды и гидробионтов, а также определена чувствительность музейных культур к фагам 531, 337,532. Использование предложенного спо- . соба позволит в короткие сроки ироводить идентификацию галофильных вибрионов менее трудоемким способом.

Claims (1)

1. СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГАЛОФИЛЬНЫХ ВИБРИОНОВ путем вырашивания исследуемого материала на питательной среде,отличающийся тем, что,с целью ускорения и упрощения способа, выращивание осуществляют в присутствии фага Vibrio alginoIyticus 531, Vibrio alginolyticus 337 и/или Vibrio alginolyticus 532.

   SU »„1124030

   1 1124030