JPH01105160A - 異常応答リンパ球の検出方法並びにこれに用いる検出用試薬及びキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、生体内又は輸液等に存在する形質転換細胞に
対し、異常応答を起こしているリンパ球の検出方法並び
にこれに利用される検出試薬及び検出用キットに関する
。

〔従来の技術及びその課題〕

生体内細胞が何らかの原因によフて形質転換された場合
、重篤な疾患が引き起こされることが知られている０例
えば癌遺伝子により形質転換された組繊細胞は癌細胞と
なって癌を惹起し、また、ＨＩＶウィルスにより形質転
換されたＴ４細胞は後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）
の原因となる。更に、肝炎もウィルスにより肝細胞が形
質転換されることが原因とされている。

従って、生体内に存在する形質転換細胞の存在及びその
量を測定することは、上記疾病及びその進行程度を判断
する上で極めて重要なことである。

しかしながら、従来、これら形質転換細胞の存在により
て生じる疾病の診断は、それぞれの疾病に起因する特有
の変化を生化学的、血液学的若しくは免疫学的に検出す
ることにより行われており、疾病の早期の段階では診断
が難しい場合も多く、また進行程度が判断しにくいとい
う欠点があった。更に各疾病毎にその診断に適した試薬
を準備しなければならないという問題点もあフな。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、癌やウィルス感染による各疾病を早期に
検出、診断する方法を開発すべく鋭意研究を行っていた
ところ、形質転換された細胞の存在下において異常応答
を起こしているリンパ球には共通の特徴があることを見
出した。

すなわち、本発明者等の研究によれば、ＨｒＶに感染し
たＴ細胞には、癌細胞において表現されている糖鎖の一
つが表現されていること、更に、この糖鎖は、これら形
質転換細胞に対し異常応答しているリンパ球にも表現さ
れていることを見出した。そして、異常応答リンパ球上
の糖鎖の表現は形質転換細胞より強く、このリンパ球上
の＊ｔ＊を検出することにより、該リンパ球が形質転換
細胞に対し異常応答を起こしていることが容易に判断で
きる事を見出した。

従って本発明は、リンパ球を含有する検体に次の式（Ｉ
） Ｆｕｃ　ａ　１−ｂ２Ｇａｕβ１　→４ＧＡｃＮＡｃβ
１＝３Ｇａｉβ１　”４Ｇｊ！ｃβ１−＋ＩＣｅｒｔ　
　　　　　　　（Ｉ） Ｆｕｃα１ で示される糖鎖を認識する抗体を作用させ、この抗体と
結合したリンパ球を検出することを特徴とする形質転換
細胞による異常応答リンパ球の検出方法並びに当該方法
に用いる試薬及びキットを提供するものである。

本発明の抗体が特異的に認識する糖鎖（Ｉ）はり、？抗
原として公知のものであり（Ｈａｋｏｍｏｒｉ。

Ｓ、、　Ｎｕｄｅｌｍａｎ、　Ｅ、、　Ｌｅｖｅｒｙ、
　Ｓ、Ｂ、、　ａｎｄ　Ｋａｎ−ｎａｇｉ、　Ｒ，：　
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５９．４８７２〜４６
８０゜１９８４）　、従って、本発明で用いる抗体とし
て例えば常法によって、動物をり、Ｙ抗原で免疫し、該
動物の抗体産生１ｍ胞から細胞融合の手段によってバイ
プリドーマを得、これから製造したモノクローナル抗体
を利用することもできる。また、本発明の抗体は粗製抗
体液、即ち、例えばり、″′抗体産生バイプリドーマ培
養上清液、あるいはマウス腹水のまま使用することもで
きるし、さらには硫酸アンモニウム分画やイオン交換ク
ロマトグラフィー、あるいはプロティンＡや抗原カラム
などによるアフィニティクロマトグラフィーにより精製
して使用することも可能である。

容易に入手できる抗体の一例としてはＢＭ−１として既
に公知の抗体（Ａｂｅ、　Ｋ、、　Ｍｃｋｉｂｂｉｎ。

Ｊ、Ｍ、、　ａｎｄ　Ｈａｋｏｍｏｒｉ、　Ｓ、：　Ｊ
、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、２５８゜１１７９３〜１１７
９７．１９８３）が挙げられる。

リンパ球を含有する検体としては、例えば血液、細胞組
織液、リンパ液、腹水、羊水、髄液等を使用することが
できる。血液を使用する場合は、血液０．１〜１０ｍｊ
２を採取し、通常血清、血漿、またはリンパ液として使
用するのが好ましい。

本発明方法において、前記抗体と結合したリンパ球は、
公知の方法により検出することができる。例えば、通常
の免疫学的測定方法である競合法によるラジオイムノア
ッセイ法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥｒＡ）、また
は蛍光抗体法（ＦＡＴ）により行うのが好ましい。これ
ら方法の操作、手順も通常の方法によって実施すること
ができる。より具体的には、通常の方法によって検体か
らＴ細胞を分離し、これをスライドに塗布し、この上に
本発明の抗体を滴下し、洗浄後、蛍光法、あるいは酵素
法により二次抗体で染色する方法が挙げられる。

更に血清、血漿に存在し、生体細胞を形質転換せしめる
ウィルス等の検出法としては、培養株化Ｔ細胞（Ｈ−９
、ＴＡＬＬ−１）を被検血清または血漿に晒し、血清ま
たは血漿に存在するウィルス等を感染せしめ、上記同様
にして被検血清または血漿中に存在するウィルス等を検
出することができる。

本発明抗体に標識として酵素をつける方法は蛋白質・核
酸・酵素、且、　（１１）　、１００７〜１０１３゜（
１９７５）に記載の方法に準じて行えばよい。抗体に蛍
光標識をつける方法には基礎生化学実験法６（生化学的
測定）、１６７頁に記載の方法に準じて行えばよい。こ
こで使用される二次抗体は抗体と結合力を持つ抗体であ
れば何でもよい。

例えば、キットに使用する一次抗体としての抗体で、ウ
サギ、ヤギ、マウスなど人以外の動物を免疫して血清や
腹水から得ることもできるし、各アイソタイプごとに、
前記の抗体に特異的に結合する抗体を購入して使用する
ことも可能である。また酵素標識あるいは蛍光標識のつ
いた二次抗体は上記方法で作成してもよいし、市販のも
のを購入してもよい。酵素基質液は抗体に担持された酵
素の種類によって適宜選択される。すなわち酵素がホー
スラデイツシュペルオキシダーゼであれば、３’　、３
’　−ジアミノベンジチン溶液、９−アミノ−９−エチ
ルカルバミゾール溶液など、アルカリフォスファターゼ
であれば、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルフ
ォスフェートＰ−トルイジン塩溶液などである。

発色剤も酵素によって適宜選択され、酵素がホースラデ
イツシュペルオキシダーゼであれば、５−アミノサリシ
リックアシッド、ｏ−フェニレンジアミンなど、アルカ
リフォスファターゼであれば、ｐ−ニトロフェニルフォ
スフェートなどである。

直接法は抗体自体を蛍光標識あるいは酵素標識し、これ
を用いるもので、二次抗体を用いる間接法に比べ染色の
ステップが少なくてすむが、バックグランドが高いとい
う欠点もある。

蛍光標識を用いる蛍光抗体法はステップが少なく簡便で
ある。

本発明方法は、式（Ｉ）のＷ娘を特異的に認識する抗体
を含有する試薬を用いることにより容易に実施されるが
、更に（１）蛍光標識をつけた本発明の抗体からなる直
接蛍光抗体法のキット、（２）本発明の抗体と該抗体と
結合し得る蛍光標識を担持する二次抗体からなる間接蛍
光抗体法のキット、（３）酵素標識をつけた本発明抗体
からなる直接酵素抗体法用のキット、及び（４）本発明
抗体と該抗体と結合し得る酵素標識を担持する二次抗体
からなる間接酵素抗体法用のキット等を利用することに
より、より容易かつ簡便に実施することができる。

キットには本発明抗体及び二次抗体を含有させる。また
このキットには、例えばグリセロールや牛血清蛋白等の
安定化剤及び／又は保存剤を添加することができる。こ
の抗体試薬は、凍結乾燥してもよく、該キットには水溶
性−もしくは水と混和し得る溶媒を含有させることがで
きる。更に抗体試薬には、再構成された試薬系を一定の
ｐＨに保つために緩衝液及び／又は試料が悪化するのを
防止するための保存剤及び／又は安定化剤を配合するこ
ともできる。緩衝液はキット試薬の必須成分ではないが
、本発明測定法を実施する際に、ｐＨを５．０〜９．０
程度とするものを用いるのが好ましい。また再構成剤は
、好ましくは水を含んだものであるが、水の一部又は全
部を水と混和し得る溶媒で置き換えることもできる。こ
の水と混和し得る溶媒としては、よく知られている例え
ばグリセリン、アルコール類、グリコールエーテル類等
を例示できる。

本発明方法により検出される異常応答を起こしたリンパ
球は、形質転換細胞の存在を反映するものである。ここ
で形質転換細胞は、細胞のウィルス感染、癌化等により
生じるものであり、例えば各種癌、エイズ、肝炎等のば
か一部精神疾患、自己免疫疾患の原因となるものである
。

しかしながら、本発明で検出されるリンパ球は形質転換
された細胞そのものでないことは、後記実施例から明ら
かである。すなわち、例えばＨＩＶに感染するリンパ球
は、Ｔ４細胞でありＴ８細胞ではないが、Ｌ、Ｙ抗原に
対し最も強く反応するのは、ＨＩＶに感染しないＴ６細
胞であることが示されている。

〔本発明の効果〕

本発明によれば、形質転換細胞に対するリンパ球の異常
応答を直接検出することができるので、各疾病の診断の
ほか疾病の進行程度等を直接に判断することができる。

また、形質転換細胞そのものでなくこれに対し異常応答
したリンパ球を検出するものであるので、血液等の体液
を利用することができ、試験も容易なものである。

〔実施例〕

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明する。

実施例１゜ 健常人及び形質転換細胞の存在が原因とされ若しくは原
因と疑われている各種疾患患者の末梢血を取り、二重染
色フローサイトメトリーを行い、Ｔ細胞上のり、Ｙ抗原
の存在を調べた。被験者は健常人（２７例）、癌患者（
１０例）、ＨＩＶ患者（ａｏ例）、精神分裂病患者（３
１例）、肝炎患者（１３例）、ギランバレー症候群患者
（１例）、セザリー症候群患者（１例）であり、結果を
表１にまとめた。

なお、二重染色フローサイトメトリーは、被検者静脈か
らヘバリナイズした血液１０ｍｆｔを採血し、これにＫ
ＡＣ−２（５％シリカ懸濁液、日本抗体研究所）を１　
　ｍｆｔ加え、責食細胞除去のため、３７℃で１時間反
応させた後、この血液をフィコールハイバーク勾配遠心
分離を行い、単核細胞画分を得た。次いで、このリンパ
球（５〜１０ｘｌＯ’ｃｅｌｌ／１００μｆＬ）にＢＭ
−１抗体５μｇ／ｍｌＬのものを１００μＬ加えて１時
間反応させた後、生理食塩水含有リン酸緩衝液（ＰＢＳ
）で１回洗浄した。次いでＦＩＴＣ標識した抗マウスＩ
ｇＭ　　（Ｔａｇｏ社製）１５μｓ／ｍｌ！の濃度の溶
液をｉｏｏμＬ加えて３０分間反応させた後、ＰＢＳで
１回洗浄した。次いでＴ細胞マーカー（Ｂｅｃｔｏｎ　
ＤｉｃｋＩｎｓｏｎ社製）のＣＤ　３　（Ｐａｎ−Ｔマ
ーカー）、またはＣＤ４（ヘルパー／インデュサーＴマ
ーカー）、またはＣＤ８（サプレッサー／キラーエマ−
カー）を１０μ℃加え、３０分間反応し、Ｐｕｓで１回
洗浄した。洗浄後、１．５％のホルマリンＰＢＳを１　
ｍＬ加え、氷冷水中で１５分間固定後、ＰＢＳで１回洗
浄した。これに３００μｍのＰＢＳを加えて細胞懸濁液
を調製し、測定に供した。測定はＦＩＴＣ標識ＢＭ−１
抗体を検出するためには励起波長４８８１ｍ、蛍光波長
５２０ｎｍで蛍光強度を測定した。また、フィコエリシ
ン（Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｉｎ）で直接標識されたＴｍ
ｍママ−カー測定は励起波長４８８ｎｍ、蛍光波長５８
０　ｎｍで蛍光強度を測定することにより行った。

［結　果コ 表１ ＊　　Ｐ、Ｓ、（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ　５ｔａｔｕ
ｓ）＊＊　　ＣＤＣ： 米国防疫センター（ＣＤＣ）による）ＩＩＶ感染症の分
類Ｘ−線、あるいはＣＴ画像上１らかに癌を認められる
進行癌患者１０例（Ｐ、５．３及び４の患者５例、ｐ、
ｓ、ｏ　、　　ｉ及び２の患者５例）について、ＢＭ−
１と各種Ｔ−ｃｅｌｌマーカーとの組合わせによる測定
を行った結果、Ｔ−ｃｅｌｌのサブセットであるＣＤ４
（ヘルパー／インデューサーＴｅ１ｆ）　、［：Ｄ８　
（サプレッサー／キラーＴ　ｃｅｌｌ）上にり、Ｙの発
現が認められ、特にｐ、ｓ、の大き・）−症例について
はＣＤａ上に強い発現が認められた。

またＨＩＶの場合キャリアーと言われるＣＤＣｌ！、あ
るいは持続的な全身性リンパ節腫張のＣＤ　ＣＩＩＩに
対し、臨床症状に現れ発症したＣＤＣｒＶではり、Ｙの
発現が強く認められた。

ＨＢＶに感染した貴石を認める急性期の肝炎患者及び慢
性期の肝炎患者についても同様に解析した。その結果急
性期肝炎患者において：Ｄ８上に特に強いり、Ｙの発現
が認められ、近年ａｙｔｏｊＯＸｌｃ　Ｔ細胞（ＣＤ８
陽性細胞）が劇症肝炎の病因とする考えがあり、この結
果は非常に興味深いものと言える。

更に、精神分裂病についても活動期及び静止期患者の末
梢リンパ球の解析の結果、活動期患者末梢リンパ球は異
常な染色パターンを示し、Ｔ細胞に高いり、Ｙの発現を
認めた。一方静止期患者末梢リンパ球も異常なパターン
は示すものの、Ｌ、Ｙの発現率については正常人のそれ
とは有位差が認められなかった。

更にまた、発症時の１例のギランバレー症候群患者リン
パ球についての染色結果は異常な染色パターンを示し、
Ｔ細胞に高いり、Ｙの発現を認め、また、未知のウィル
スの感染が疑われ、ヘルパーＴ細胞の機能先進等が報告
され、一種の白血病に分類されるセザリー症候群患者に
ついてもヘルパーＴ細胞のマーカーＣＤ４陽性細胞にり
、Ｙの異常な染色像を認めた。

これらの結果から、ウィルス感染又は癌化細胞（形質転
換細胞）の存在によって異常応答したリンパ球がり、Ｙ
抗原を発現し、この抗原の検出により各種疾病患者の発
症予知、症状の把握が可能であることが示された。

実施例２゜ ＨＩＶ感染細胞の抗原発現の時間経過：５０μｇ７ｍＪ
ｌのゲンタマイシンを含む、１０％熱不活化牛脂児血清
を添加したＲＰＭＩ−１６４０で培養したＴＡＬＬ−１
細胞３Ｘ１０’個／ｍ℃に１μｇ／ｍｊ２のポリブレン
（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　（：ａｍ−ｐａｎｙ
、　Ｓｔ、　Ｌｏｕｔｓ、ＭＯ）を含むＨＩＶ　（リバ
ース・トランスクリブターゼ活性として５８０００ｃｐ
ｍ／ｍｆＬ）を第１図の矢印で示す１，３．６日目に加
えた。次いで、細胞表面に表現されてくるＨＩＶ抗原を
測定した。

測定は抗ｐ２４モノクローナル抗体、ＡＩＤＳ患者血清
、及びＢＭ−１抗体を用い、サイトフローメトリーによ
って、陽性細胞の割合を出した。

図中・□・はＢＭ−１抗体との反応性、Ｏ−一一一〇は
患者血清との反応性、△・・・・・△は抗ｐ２４との反
応性をそれぞれ示す。

コノ結果、ＴＡＬＬ−１細胞はＨＩＶ感染後、１８日目
からＢＭ−１抗体と強く反応する陽性細胞に転すること
が判った。

実施例３゜ 膜抗原のサイトフルオロメトリック分析：ＨＩＶ感染及
び未感染（７）Ｈ−９、又はＴＡＬＬ−１細胞の５Ｘ１
０’個に各種の精製抗体１００μＬを混合し、４℃で６
０分間反応させた後、ＲＰＭＩ−１８４０培地で２回洗
浄する。次いで、ＦＩＴＣ結合−抗マウス−１ｇＭ　、
又はＩｇＧ　（Ｔａｇｏ、　Ｉｎｃ、。

Ｃｏｄｅ　Ｎｏ、４３５２）ヤギＦ　（ａｂ）　２フラ
グメントの３５倍希釈液の１００μｍを加えて、４℃で
３０分間反応後、細胞をＲＰＭＩ培地で２回洗浄し、１
．５％フォルマリン−ＰＢＳで固定した。精製したマウ
スＩｇＭ　　（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏ
ｎ　）を対照群の第一抗体として用いた。サイトフロー
メトリーはＥＰＩＣ５−Ｃ（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｎｉｃｓ　）を用いた。その結果を第２図に示す
。

図中ＩａはＨＩＶ未感染Ｈ−９細胞をマウスＩｇＭ　子
処理、ＩｂはＨＩＶ感染Ｈ−９細胞をマウスＩｇＭで処
理、ＩＩ　ａはＨＩＶ未感・染Ｈ−９細胞をモノクロー
ナル抗体ＢＭ−１で処理、ＩＩ　ｂはＨＩＶ感染Ｈ−９
細胞をモノクローナル抗体ＢＭ−１で処理した結果を示
す。ｍ　ａはＨＩＶ未感染ＴＡＬＬ−１細胞をマウスＩ
ｇＭで処理、ｍ　ｂはＨＩＶ感染ＴＡＬＬ−１細胞をマ
ウスＩｇＭで処理、ＩＶａはＨＩＶ未感染ＴＡＬＬ−１
細胞をモノクローナル抗体ＢＭ−１で処理、ｒＶｂはＨ
ＩＶ感染ＴＡＬＬ−１細胞をモノクローナル抗体ＢＭ−
１で処理した結果をそれぞれ示している。

この結果、Ｉｌ　ｂ　、及びＩＶｂの２群が蛍光強度の
強いところに現れている。即ち、Ｈ−９、ＴＡＬＬ−１
細胞共に、ＨＩＶ感染後、モノクローナル抗体ＢＭ−１
で処理した群で蛍光強度の増加が認められた。

実施例４゜ 更に、）ＩＩＶ感染前と感染後の各種抗体に対する反応
性の割合を調べた結果を第３図に示す、ここに示す様に
株化Ｔ−細胞（Ｈ−９゜ＴＡ、ＬＬ−１）はＨＩＶで感
染した時のみ、抗体ＢＭ−１と強く反応することが判る
。

ここで使用した抗体は次の文献により調製した。

ＦＨ−２（Ｆｕｋｕｓｈｉ、　Ｙ、、　ｅｔ　ａｔ、、
　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２５９．４６８１〜４６８５．１９８４　）Ａｌｌ：Ｆ
Ｈ−１８（Ｆｕｋｕｓｈｉ、　Ｙ、、　ｅｔ　ａｔ、、
　Ｊ、Ｂｌｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２５９．４６８１〜４６８５．１９８４　
）ＦＨ−６（Ｆｕｋｕｓｈｉ、　Ｙ、、　ｅｔ　ａｌ、
、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

２５９．１０５０１〜１０５１７．１９８４）に■−１
（にａｉｚｕ、　Ｔ、、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、Ｂｉｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、。

２１ｉ１，１１２５４　〜１１２５８．１９８６）実施
例５゜ ヒト末梢血リンパ球の分離と免疫蛍光染色：ＡＩＤＳ、
又はＡＲＣ患者静脈からヘバリナイズした血液１０ｍＡ
を採取し、これにＫＡＣ−２（５％５ｉｌｉｃａ　５ｕ
ｓｐｅｎｓｉｏｎ、Ｊａｐａｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅ
ａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を２　ｒｎｌｌ加
え、寅食細胞除去後、３７℃で１時間反応させる。ＫＡ
Ｃ−２処理した血液をフィコールハイバーク勾配遠心分
離を行い単核細胞画分を得た。このリンパ球を各種の抗
体を用いて免疫蛍光染色を行った。この結果を第４図に
示す。

図中ＡはＡＩＤＳ患者のＴ細胞の光学顕微鏡写真を、Ｂ
は蛍光顕微鏡写真である。また、ＣはＡＲＣ患者のＴ細
胞の光学顕微鏡写真を、Ｄはその蛍光顕微鏡写真を示す
。

第４図Ｂに示すようにＡＩＤＳ患者のリンパ球は抗体Ｂ
Ｍ−１と強く反応するが、ＡＲＣ患者のリンパ球は第４
図りに示すようにＡＩＤＳ患者に比較して、その蛍光染
色の度合は弱かった。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＨＩＶ感染感染脳細胞養日数と陽転　　率の
関係を示す図面である。 第２図は、ＨＩＶ感染及び未感染Ｔ細胞について、各種
の精製抗体を用いて行ったサイトフルオロメトリック分
析の結果を示す図面である。 第３図は、各種抗体とＴ細胞との反応性を示す図面であ
る。 第４図は、生物であるヒト末梢血リンパ球の免疫蛍光染
色の結果を示す図面である。 以　　上 第１図 ＨＩＶ感染後の培養日数 第２図 対数螢光強度→ く−←

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、リンパ球を含有する検体に、次の式（ I ）▲数式
   、化学式、表等があります▼（ I ） で示される糖鎖を特異的に認識する抗体を作用させ、こ
   の抗体と結合したリンパ球を検出することを特徴とする
   形質転換細胞による異常応答リンパ球の検出方法。 ２、次の式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で示される糖鎖を特異的に認識する抗体を含有する形質
   転換自己細胞による異常応答リンパ球検出試薬。 ３、（１）標識化合物を結合した、次の式（ I ）▲数
   式、化学式、表等があります▼（ I ） で示される糖鎖を特異的に認識する抗体、 （２）シリカ懸濁液及び （３）リンパ球固定液 を含有する形質転換自己細胞による異常応答リンパ球検
   出用キット。 ４、リンパ球を含有する検体に次の式（ I ）▲数式、
   化学式、表等があります▼（ I ） で示される糖鎖を特異的に認識する抗体を作用させ、こ
   の抗体と結合したＴ＿４細胞を検出することを特徴とす
   るＨＩＶ感染Ｔ細胞の検出方法。 ５、次の式（ I ） ▲数式、化学式、表等があります▼（ I ） で示される糖鎖を特異的に認識する抗体を含有するＨＩ
   Ｖ感染Ｔ細胞の検出試薬。