DK173838B1 - Fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af et blodpladecelleoverfladeantigen - Google Patents
Fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af et blodpladecelleoverfladeantigen Download PDFInfo
- Publication number
- DK173838B1 DK173838B1 DK198804265A DK426588A DK173838B1 DK 173838 B1 DK173838 B1 DK 173838B1 DK 198804265 A DK198804265 A DK 198804265A DK 426588 A DK426588 A DK 426588A DK 173838 B1 DK173838 B1 DK 173838B1
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- platelet
- platelets
- immunocomplex
- antibody
- antigen
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 title claims abstract description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 75
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 75
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 53
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 36
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 32
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 29
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 11
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 11
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 10
- 230000006800 cellular catabolic process Effects 0.000 claims description 10
- 230000002000 scavenging effect Effects 0.000 claims description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 102000015795 Platelet Membrane Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010010336 Platelet Membrane Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000023159 Platelet Glycoprotein GPIb-IX Complex Human genes 0.000 claims description 4
- 108010045766 Platelet Glycoprotein GPIb-IX Complex Proteins 0.000 claims description 4
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 claims 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 claims 1
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 180
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 54
- 208000028622 Immune thrombocytopenia Diseases 0.000 description 27
- 208000031981 Thrombocytopenic Idiopathic Purpura Diseases 0.000 description 27
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 23
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 20
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 19
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- 238000010911 splenectomy Methods 0.000 description 19
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 13
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 12
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 12
- 102100025306 Integrin alpha-IIb Human genes 0.000 description 12
- 101710149643 Integrin alpha-IIb Proteins 0.000 description 12
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 12
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 12
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 12
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 11
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 10
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 10
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 10
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 9
- 208000031261 Acute myeloid leukaemia Diseases 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 8
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 7
- 230000000702 anti-platelet effect Effects 0.000 description 7
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 7
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 7
- 230000004044 response Effects 0.000 description 7
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 230000003582 thrombocytopenic effect Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 230000000961 alloantigen Effects 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 4
- ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N theophylline Chemical compound O=C1N(C)C(=O)N(C)C2=C1NC=N2 ZFXYFBGIUFBOJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 206010060935 Alloimmunisation Diseases 0.000 description 3
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 102000008607 Integrin beta3 Human genes 0.000 description 3
- 108010020950 Integrin beta3 Proteins 0.000 description 3
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 201000003710 autoimmune thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 201000003067 thrombocytopenia due to platelet alloimmunization Diseases 0.000 description 3
- OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 2-[3-(dimethylamino)-6-dimethylazaniumylidenexanthen-9-yl]-4-isothiocyanatobenzoate Chemical compound C=12C=CC(=[N+](C)C)C=C2OC2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC(N=C=S)=CC=C1C([O-])=O OBYNJKLOYWCXEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 2
- 208000032467 Aplastic anaemia Diseases 0.000 description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 2
- 208000018240 Bone Marrow Failure disease Diseases 0.000 description 2
- 206010065553 Bone marrow failure Diseases 0.000 description 2
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000033776 Myeloid Acute Leukemia Diseases 0.000 description 2
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 2
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 230000005251 gamma ray Effects 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 2
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 238000007392 microtiter assay Methods 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 2
- 229960000278 theophylline Drugs 0.000 description 2
- 239000003634 thrombocyte concentrate Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IITIZHOBOIBGBW-UHFFFAOYSA-N 3-ethyl-2h-1,3-benzothiazole Chemical compound C1=CC=C2N(CC)CSC2=C1 IITIZHOBOIBGBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 102100040202 Apolipoprotein B-100 Human genes 0.000 description 1
- 108010008150 Apolipoprotein B-100 Proteins 0.000 description 1
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000029147 Collagen-vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010091326 Cryoglobulins Proteins 0.000 description 1
- CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N Cyclophosphamide Chemical compound ClCCN(CCCl)P1(=O)NCCCO1 CMSMOCZEIVJLDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 101000986086 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, A alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000986087 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000986084 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, C alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 208000037026 Invasive Fungal Infections Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100174574 Mus musculus Pikfyve gene Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010035030 Platelet Membrane Glycoprotein IIb Proteins 0.000 description 1
- 102100036851 Platelet glycoprotein IX Human genes 0.000 description 1
- 101710191888 Platelet glycoprotein IX Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010041660 Splenomegaly Diseases 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229960004397 cyclophosphamide Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L disodium;(2',7'-dibromo-3',6'-dioxido-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-4'-yl)mercury;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Na+].O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(Br)=C([O-])C([Hg])=C1OC1=C2C=C(Br)C([O-])=C1 BFMYDTVEBKDAKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 230000029036 donor selection Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 238000010185 immunofluorescence analysis Methods 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 231100000355 lymphocytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001391 lymphocytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 210000003593 megakaryocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N octoxybenzene Chemical compound CCCCCCCCOC1=CC=CC=C1 ZPIRTVJRHUMMOI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 210000004623 platelet-rich plasma Anatomy 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N prednisone Chemical compound O=C1C=C[C@]2(C)[C@H]3C(=O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 XOFYZVNMUHMLCC-ZPOLXVRWSA-N 0.000 description 1
- 229960004618 prednisone Drugs 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000007925 protein solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000001799 protein solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000163 radioactive labelling Methods 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002940 repellent Effects 0.000 description 1
- 239000005871 repellent Substances 0.000 description 1
- 229910052703 rhodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010948 rhodium Substances 0.000 description 1
- MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N rhodium atom Chemical compound [Rh] MHOVAHRLVXNVSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009758 senescence Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 238000002627 tracheal intubation Methods 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02F—OPTICAL DEVICES OR ARRANGEMENTS FOR THE CONTROL OF LIGHT BY MODIFICATION OF THE OPTICAL PROPERTIES OF THE MEDIA OF THE ELEMENTS INVOLVED THEREIN; NON-LINEAR OPTICS; FREQUENCY-CHANGING OF LIGHT; OPTICAL LOGIC ELEMENTS; OPTICAL ANALOGUE/DIGITAL CONVERTERS
- G02F1/00—Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics
- G02F1/29—Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics for the control of the position or the direction of light beams, i.e. deflection
- G02F1/31—Digital deflection, i.e. optical switching
- G02F1/313—Digital deflection, i.e. optical switching in an optical waveguide structure
- G02F1/3131—Digital deflection, i.e. optical switching in an optical waveguide structure in optical fibres
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56966—Animal cells
- G01N33/56977—HLA or MHC typing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02F—OPTICAL DEVICES OR ARRANGEMENTS FOR THE CONTROL OF LIGHT BY MODIFICATION OF THE OPTICAL PROPERTIES OF THE MEDIA OF THE ELEMENTS INVOLVED THEREIN; NON-LINEAR OPTICS; FREQUENCY-CHANGING OF LIGHT; OPTICAL LOGIC ELEMENTS; OPTICAL ANALOGUE/DIGITAL CONVERTERS
- G02F1/00—Devices or arrangements for the control of the intensity, colour, phase, polarisation or direction of light arriving from an independent light source, e.g. switching, gating or modulating; Non-linear optics
- G02F1/35—Non-linear optics
- G02F1/3515—All-optical modulation, gating, switching, e.g. control of a light beam by another light beam
- G02F1/3517—All-optical modulation, gating, switching, e.g. control of a light beam by another light beam using an interferometer
- G02F1/3519—All-optical modulation, gating, switching, e.g. control of a light beam by another light beam using an interferometer of Sagnac type, i.e. nonlinear optical loop mirror [NOLM]
-
- G—PHYSICS
- G02—OPTICS
- G02F—OPTICAL DEVICES OR ARRANGEMENTS FOR THE CONTROL OF LIGHT BY MODIFICATION OF THE OPTICAL PROPERTIES OF THE MEDIA OF THE ELEMENTS INVOLVED THEREIN; NON-LINEAR OPTICS; FREQUENCY-CHANGING OF LIGHT; OPTICAL LOGIC ELEMENTS; OPTICAL ANALOGUE/DIGITAL CONVERTERS
- G02F3/00—Optical logic elements; Optical bistable devices
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Nonlinear Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Optics & Photonics (AREA)
- Power Engineering (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Sampling And Sample Adjustment (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Description
i DK 173838 B1
Den foreliggende opfindelse angår immunologiske fremgangsmåder til bestemmelse af blodplade-histoforenelighedsty-pe og til karakterisering af antiblodplade-immunstatus for et individ.
5 Blodplade-histoforenelighedstypen og antiblodplade-im munstatus for et individ spiller begge vigtige roller ved styring af kliniske tilstande, der skyldes antiblodplade-im-munrespons. Antiblodplade-immunrespons, der resulterer i fremstillingen af blodplade-ødelæggende antistoffer, forekom-10 mer som et resultat af bl.a. graviditet, blodpladetransfu-sionsterapi og antiblodpladeautoimmunsygdom.
Af særlig interesse for den foreliggende opfindelse er blodpladetransfusionsterapi. Siden starten heraf for over 3/4 århundrede siden har blodpladetransfusionsterapi 15 spillet en stadig mere vigtig rolle ved den understøttende pleje af patienter med knoglemarvssvigt. Én forhindring mod fremskridt inden for dette område er imidlertid, at man har fundet, at en signifikant del af modtagere bliver modstandsdygtige mod gentagne transfusioner fra tilfældige 20 donorer. Blodplade-afvisning synes i mange tilfælde at skyldes antiblodplade-antistoffer i transfusionsmodtageren (do-natar) , der er fremkaldt som et resultat af alloimmunisering.
Alloimmunisering er den proces, ved hvilken et individ producerer antistoffer som respons på udsættelse for 25 et alloantigen. Et alloantigen er et antigen, typisk et protein, der eksisterer i alternative (alleliske) former i forskellige individer af samme art, og således inducerer et immunrespons, når én form overføres (som ved transfusion eller vævspodning) til individer af den samme art, der ikke 30 forud har været udsat for det. Klasse I-humane leukocytanti-gener (HLA) er én gruppe alloantigener, der findes på overfladen af blodplader, og som er i stand til at inducere alloantistoffer (antistoffer mod alloantigener) , der formidler blodpladeafvisning hos transfusionsmodtagere. Yankee et 35 al. påviste først, at transfusioner af HLA-afpassede blodplader fra enkelte donorer hyppigt resulterer i gode forøgelser DK 173838 B1 2 af blodpladetallet hos transfusionsmodtagere. Dette betyder, at krydstilpasning af donorblodplade- og modtager-HLA-type har vist sig at formindske blodpladeafvisningen hos transfusionsmodtagere .
5 Desværre er HLA-tilpassede blodpladedonorer kun til gængelige for en lille minoritet af alloimmuniserede patienter, og modtagernes respons på delvis tilpassede donor-blod-plader er mindre forudsigeligt. Erkendelsen af krydsreagerende grupper og den differentielle ekspression af visse 10 HLA-antigener (f.eks. B12) på blodpladerne har gjort et kvalificeret gæt under udvælgelsen af donor lettere. Imidlertid vil en fremgangsmåde til udvælgelse af donor-blodplader uden at skulle prøve sig frem være fordelagtig.
Karakterisering af et individs ant iblodplade-immunsta-15 tus er som før nævnt også vigtig ved styring af autoimmunsyg-domme. Én sådan sygdom er kronisk immunthrombocytopenisk purpura (ITP), et symdrom af destruktiv thrombocytopeni, der skyldes et antistof mod et blodplade-associeret antigen (McMillan, N. Engl. J. Med. 304; 1135-1147 (1981), og Kelton 20 et al., Semin. Thromb. Haemost. 8.; 83-104 (1982). Van Leeu-wen et al. (Blood ,59; 23-26 (1982)) tilvejebragte først bevis for, at autoantistoffer er til stede i nogle ITP-patienter.
De bemærkede, at af 42 antistof-eluater fra ITP-blodplader ville 32 binde til normale, men ikke til thrombastheniske 25 blodplader; de tilbageværende eluater binder til begge. Da thrombastheniske blodplader er mangelfulde m.h.t. blodplade-glycoproteiner (GP) Ilb og Illa, foreslog de, at disse ITP-patienter havde autoantistoffer mod ét af disse glycopro-teiner.
30 Direkte bevis for anti-glycoprotein-autoantistoffer ved kronisk ITP er tilvejebragt ved efterfølgende undersøgelser under anvendelse af flere forskellige fremgangsmåder. Woods et al har påvist binding af autoantistoffer fra ITP-patienter til GP Ilb/lIIa-komplekset eller til GP Ib, der 35 er bundet til mikrotiterbrønde med monoklonale antistoffer, og disse observationer blev bekræftet ved immunopræcipita- DK 173838 B1 3 tion, jf. Woods et al., Blood 63.,- 368-375 (1984) og Woods et al., Blood, 64; 156-160 (1984). Ved anvendelse af den førstnævnte metode bemærkede de anti-GPIIb/IIIa- eller anti-GPIb-autoantistoffer i ca. 10% af patienterne, hvilket er meget 5 mindre end den procentsats, der blev observeret ved de indirekte undersøgelser af van Leeuven et al., supra.
Andre forskere har også påvist antiblodplade-autoantistoffer i kroniske ITP-patienter under anvendelse af im-munoblotting (Mason et al., Br. J. Haematol. 56; 529-534 10 (1984) og Beardsley et al., J. Clin. Invest. .74; 1701-1707 (1984)), immunopræcipitation, (Woods et al., Blood 63; 368-378 (1984), Woods et al.. Blood 64.; 156-160 (1984) og Devine et al., Blood 64; 1240-1245 (1984)), inhibering af murin monoklonal anti-GPIIb/HIa-antistofbinding til ITP-blodpi ader 15 (Varon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80; 6992-6995 (19-83)) og krydset immunelektroforese (Szatkowski et al., Blood, 67; 310-315 (1986)). Nugent et al. ("Proceedings of the INSERM Symposium on utilization of monoclonal antibodies for the understanding and detection of platelet activity".
20 Amsterdam, Elsevier Science Publishers, 1986) og Asono et al. , (Blood 6J5; 1254-1260 (1985)) har tilvejebragt humane hybridomaer fra ITP-lymfocyter, der syntetiserer monoklonale antiblodplade-antistoffer. Nogle af disse er specifikke for blodpladeglycoproteiner (Nugent et al., supra).
25 Af de undersøgelser, der er anvendt til påvisning af antiglycoprotein-autoantistoffer ved kronisk ITP, er mikro-titerbrønd-undersøgelsen (Woods et al., Blood 63; 368-375 (1984) og Woods et al., Blood 64.; 156-160 (1984)) lettest at afpasse til klinisk anvendelse. Imidlertid antyder den 30 lave procentsats af positive undersøgelser (ca. 10%) i sammenligning med procentsatsen ifølge Leeuwen et al. (ca.
76%) at solubilisering af blodpladerne før antistof-sen-sitiveringen kan ændre nogle af epitoperne. Af denne grund er der udformet en undersøgelse (Immunobead®-undersøgelse) 35 for antiglycoprotein-autoantistoffer, hvor blodplader er sensitiverede før solubilisering deraf, for at drage fordel DK 173838 B1 4 af den mulighed, at de epitoper, der udtrykkes af blodplade-overfladeantigenerne, kan forblive mere stabile, når de er bundet til antistof. Ved denne undersøgelse kan man måle både blodpladeassocierede og plasma-autoantistoffer.
5 Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der en fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af et blod-pladecelleoverfladeantigen, hvilken fremgangsmåde er kendetegnet ved, at (a) der tilvejebringes en alikvot af blodplader, der skal 10 bestemmes, hvor alle blodplader i denne alikvot bærer det overfladeantigen, der skal påvises, med et immunokompleks, der indeholder et antistof mod dette antigen, der er immu-noreageret med dette antigen; (b) blodpladerne i denne alikvot lysebehandles til tilve-15 jebringelse af cellulært nedbrydningsmateriale, og når immu- nokomplekset er til stede i alikvotten, et solubiliseret immunokompleks; og (c) der udføres bestemmelse af tilstedeværelsen af dette solubiliserede immunokompleks fastgjort til en fastfaseunder- 20 støtning.
Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til bestemmelse af et blodplade-overfladeantigen-antistofkompleks i en prøve af blodplader, og denne fremgangsmåde er kendetegnet ved trinnene: 25 (a) prøven af blodplader lysebehandles til tilvejebrin gelse af et vandigt præparat, der indeholder solubiliseret blodpladeoverflade-antistofkompleks, (b) der dannes en opfangende reaktionsblanding ved at blande dette vandige præparat med en fast understøtning, der 30 er i stand til at immunoreagere med dette blodpladeoverflade-antigen-antistofkompleks, (c) denne opfangende reaktionsblanding opretholdes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at denne faste understøtning kan immunoreagere med ethvert af dette blodpladeover- 35 fladeantigen-antistofkompleks, der er til stede, til dannelse af et immunoreaktionsprodukt i fast fase, idet der ved opret- 5 DK 173838 B1 holdeisen dannes opretholdt fast understøtning, (d) der dannes en mærkningsreaktionsblanding ved at blande den opretholdte faste understøtning med et mærket antistofmolekyle, der er i stand til at immunoreagere med antigen- 5 antistofkomplekset af immunoreaktionsproduktet i fast fase, (e) mærkningsreaktionsblandingen opretholdes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at dette mærkede antistofmolekyle kan immunoreagere med ethvert immunoreaktionsprodukt i fast fase, der er dannet i trin (c) , til dannelse af et mærket 10 kompleks i fast fase, (f) der foretages bestemmelse af tilstedeværelsen af ethvert mærket kompleks i fast fase, der er dannet i trin (e) , og derved bestemmelse af tilstedeværelsen af ethvert blodpladeoverfladeantigen-antistofkompleks i prøven af blod- 15 plader.
Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til analyse af en prøve af blodplader for et blodpladeoverflade-antigen, og denne fremgangsmåde er kendetegnet ved trinnene: (a) der dannes en blodpladesensitiverende reaktionsblan-2 0 ding ved at sammenblande en prøve af blodplader med et antistofmolekyle, der er i stand til at immunoreagere med et blodpladeoverfladeantigen, til dannelse af et blodpladeim-munokompleks, (b) denne sensitiverende reaktionsblanding opretholdes i 25 et tidsrum, der er tilstrækkeligt til dannelse af dette blodplade immunokompleks, hvorved der dannes antistof-sensitiise-rede blodplader, (c) disse sensitiverede blodplader lysebehandles til tilvejebringelse af et vandigt præparat, hvilket præparat 30 indeholder solubiliseret blodpladeimmunokompleks, når dette immunokompleks er dannet i trin (b), (d) der dannes en opfangende reaktionsblanding ved at sammenblande det vandige præparat med en fast understøtning, der er i stand til at immunoreagere med dette solubiliserede 35 blodpladeimmunokompleks, (e) denne opfangende reaktionsblanding opretholdes i et DK 173838 B1 6 tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at denne faste understøtte kan immunoreagere med ethvert af dette tilstedeværende solubiliserede blodpiadeimmunokompleks, til dannelse af et immunoreaktionsprodukt i fast fase, hvor der ved denne opret-5 holdelse derved dannes en opretholdt fast understøtning, (f} der dannes en mærkningsreaktionsblanding ved at blande denne opretholdte faste understøtning med et mærket antistofmolekyle, der er i stand til at immunoreagere med dette blodpladeimmunokompleks på dette immunoreaktionsprodukt i 10 fast fase, (g) denne mærkningsreaktionsblanding opretholdes i en tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at det mærkede antistof-molekyle kan immunoreagere med ethvert af dette immunoreak-tionsprodukt i fast fase, der er dannet i trin (e) , til 15 dannelse af et mærket kompleks i fast fase, (h) der analyseres for tilstedeværelsen af ethvert mærket kompleks i fast fase, der er dannet i trin (g) , og derved for tilstedeværelsen af ethvert blodpladeoverfladeantigen i denne prøve af blodplader.
20 Betegnelsen "antistof" i dets forskellige grammatiske former anvendes heri som en kollektiv betegnelse, der henfører til en population af immunoglobulinmolekyler og/eller immunologisk aktive dele af immunoglobulinmolekyler, dvs. molekyler, der indeholder et antistofkombinationssted eller 25 paratop.
Et "antistofkombinationssted" er den strukturelle del af antistofmolekylet, der består af de variable og hyper -variable regioner af de lette og tunge kæder, der specifikt binder antigen.
30 Udtrykket "antistofmolekyle'’ i dets forskellige gram matiske former, der anvendes heri, omfatter både et intakt immunoglobulinmolekyle og en immunologisk aktiv del af et immunoglobulinmolekyle.
Eksempler på antistofmolekyler er intakte immunoglo-35 bulinmolekyler, i det væsentlige intakte immunoglobulinmolekyler, og de dele af et immunoglobulinmolekyle, der DK 173838 B1 7 indeholder paratopen, herunder de dele, der af fagfolk kendes som Fab, Fab' , F(ab')2 °9 F (v) .
Fab og F(ab1)2-delene af antistofferne fremstilles ved den proteolytiske reaktion af hhv. papain og pepsin på 5 i det væsentlige intakte antistoffer ved hjælp af kendte fremgangsmåder, jf f.eks. US patentskrift nr. 4.342.566.
Fab1-antistofdele er også velkendte, og de fremstilles ud fra F (ab') 2~clele efterfulgt af reduktion af de disulfidbindinger, der binder delene af de to tunge kæder, som med mer-10 captoethanol, og efterfulgt af alkylering af det fremkomne proteinmercaptan med et reagens, såsom iodacetamid. Et antistof, der indeholder intakte antistofmolekyler, er foretrukket, og de anvendes som illustrerende heri.
Betegnelsen "monoklonalt antistof" i dets forskellige 15 grammatiske former henfører til en population af én type antistofmolekyle med bestemt (kendt) antigen-specificitet.
Et monoklonalt antistof indeholder kun én type antistofkombinationssted, der er i stand til at immunoreagere med et særligt antigen, og det udviser således typisk en enkelt 20 bindingsaffinitet for det antigen. Et monoklonalt antistof kan derfor indeholde et bispecifikt antistofmolekyle, der har to antistofkombinationssteder, hvert immunospecifikt for et forskelligt antigen.
Som anvendt heri anvendes betegnelsen "biologiske 25 undersøgelsesbetingelser" til de betingelser, hvori et molekyle, der er anvendeligt ved opfindelsen, såsom et antistof, binder til et andet gavnligt molekyle, såsom en antigenepi top, inden for et pH-område på fra ca. 5 til ca. 9; og ved ionstyrker, der er fra ionstyrken af destilleret vand 30 til ionstyrken af en ca. 1 molær natriumchlorid-opløsning, og ved temperaturer på ca. 4°C til ca. 45°C.
Ordet "kompleks", der anvendes heri, henfører til produktet af en specifik bindemiddel-ligand reaktion. Et eksempel på et kompleks er et immunoreaktionprodukt, der er 35 dannet ved en antistof-antigen-reaktion.
Et "specifikt bindemiddel" er en molekylær entitet, DK 173838 B1 8 der er i stand til selektivit at binde en anden molekylær entitet eller ligand. Eksempler på specifikke bindemidler er paratopiske molekyler, komplementproteiner eller fragmenter heraf, S. aureus-protein A og lignende. Fortrinsvis 5 binder det specifikke bindemiddel dets ligand, når liganden er til stede som en del af et kompleks.
Den foreliggende opfindelse angår i store træk en fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af et celleoverfladeantigen. I overensstemmelse med denne fremgangsmåde 10 blandes celler, der skal undersøges, typisk blodceller, med et antistof, der er i stand til at immunoreagere med antigenet mens det er til stede på celleoverfladen. Den fremkomne blanding er en første immunoreaktionsblanding, og der henføres typisk til den som en cellesensibiliserende reaktions-15 blanding, da den tilvejebringer "antistofsensitiverede"-celler.
Celleoverfladeantigener, der vides at være klinisk anvendelige markører, hvis tilstedeværelse kan bestemmes ved hjælp af en fremgangsmåde ifølge den foreliggende opfin-20 delse, omfatter de, der bestemmer histoforenelighed, såsom et hovedhistoforenelighedskompleks (HFK)-antigen, især et humant leukocytantigen (HLA). Anvendelige celleoverfladeantigener omfatter også glycoproteiner (GP) , der omfatter membranassocierede receptorer, der binder Arg-Gly-Asp-inde-25 holdende proteiner. Sådanne glycoproteiner omfatter GPIb, GPIIb, GPIIIa og de celleoverfladekomplekser, der indeholder disse proteiner, såsom GPIIb/IIIa-komplekset.
Antistoffer, der er i stand til at immunoreagere med antigener på overfladen af celler, er kendte, og de er til-30 gængelige fra American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD.
Den celle-sensitiverende reaktionsblanding opretholdes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at der dannes et immunokompleks, der indeholder antistoffet og celleover-35 fladeantigenet, på den cellulære overflade. Som det er kendt afhænger det tidsrum, der kræves til immunokompleks-dan- DK 173838 B1 9 nelse, af flere forskellige faktorer, herunder temperatur og koncentration af reaktanterne. Typisk er tidsrummet forud bestemt for et givet sæt reaktionsbetingelser ved hjælp af kendte metoder før undersøgelsen udføres. Under biologiske 5 undersøgelsesbetingelser er opretholdelsestiden sædvanligvis fra minutter til timer, såsom fra 30 minutter til ca. 2 timer.
Opretholdelse af den celle-sensitiverende reaktion i en tid, der er tilstrækkelig til immunokompleksdannelse, 10 resulterer i produktionen af antistof-sensitiverede celler, der typisk adskilles ved vask og centrifugering fra ethvert andet ikke-immunoregeret antistof. Hvis cellerne har det celleoverfladeantigen, der undersøges for, vil de sensitiverede celler have et celleoverfladeassocieret immunokompleks.
15 Til bestemmelse af tilstedeværelsen af ethvert dannet celleoverfladeimmunokompleks lysebehandles de sensitiverede celler til tilvejebringelse af et vandigt præparat, der indeholder solubiliseret celleoverfladeprotein. Lyse kan udføres ved at blande de sensitiverede celler med en vandig 20 puffer, som vand eller saltvand, og et overfladeaktivt middel, der er i stand til at solubilisere celleoverfladeprotein. Overfladeaktive midler, der er i stand til at solubilisere celleoverfladeproteiner, omfatter detergenter, såsom polyoxyethylen (9) octylphenylether, der er tilgængelig 25 under navnet "Triton X-100" fra Rohm og Hass Co., Inc., Philadelphia, PA.
Lysereaktionsblandingen, der er dannet ved blanding af cellerne og det overfladeaktive middel, opretholdes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at det overfladeaktive 30 middel kan solubilisere (dissociere fra cellemembranen) cellernes overfladeprotein, herunder ethvert celleoverflade-immunokompleks, der er dannet. Typisk er det tidsrum, der anvendes til solubilseringen, forudbestemt, og sædvanligvis er det inden for området fra minutter til timer, såsom 35 fra ca. 15 minutter til ca. 2 timer.
Fremgangsmåder til påvisning af solubilisering af DK 173838 B1 10 celleoverfladeprotein er kendte, og de omfatter anvendelse af immunologiske fremgangsmåder til overvågning af lysereaktionsblandingens vandige fase for forekomst af et protein, der vides at være associeret med de cellers overflade, der 5 undersøges. F.eks. findes glycoproteinerne Ilb og Illa i forbindelse med overfladen af alle normale blodplader, og de kan anvendes som immunologiske markører af overfladepro-tein-solubilisering, når blodpladerne undersøges.
Det vandige solubiliserede proteinpræparat, der er 10 dannet efter opretholdelse af lysereaktionsblandingen, indeholder sædvanligvis cellulært nedbrydningsmateriale samt solubiliseret protein. I foretrukne udformninger adskilles det solubiliserede protein fra det cellulære nedbrydningsmateriale, typisk ved centrifugation.
15 Til påvisning af tilstedeværelse af ethvert dannet solubiliseret overfladeimmunokompleks blandes en del af det vandige solubiliserede proteinpræparat med en fast understøtning, der er i stand til specifikt at binde immunokom-plekset, hvorved der dannes en fast/væskefaseblanding (fast-20 holdelsesreaktion).
Faste understøtninger, der er i stand til specifikt at binde et solubiliseret overfladeimmunokompleks, består typisk af et specifikt bindemiddel, der er fæstet (operativt bundet) til en fast matrix. Fortrinsvis er det til den faste 25 fase fæstede specifikke bindemiddel et antistofmolekyle, der er i stand til at immunoreagere med det solubiliserede overfladeimmunokompleks. Det bør bemærkes, at et antistof, der er i stand til at immunoreagere med enten antigenet eller antistoffet på overfladeimmunokomplekset, kan anvendes.
30 Anvendelige faste matrikser er kendte af fagfolk.
Sådanne materialer er vanduopløselige og omfatter tværbundet dextran, der er tilgængeligt under navnet "SEPHADEX" fra Pharmacia, Piscataway, N.J.; agarose; polyvinylchlorid, polystyren, tværbundet polyacrylamid, nitrocellulose eller 35 nylon-baserede væv, såsom plader, strimler eller lignende; eller tuber, plader eller brønde af en mikrotiterplade, såsom DK 173838 B1 11 de, der fremstilles ud fra polystyren, polycarbonat eller polyvinylchlorid.
Når det er til stede som en del af en fast understøtning, er et specifikt bindemiddel typisk fæstet til en fast 5 matrix ved adsorption fra et vandigt medium, skønt andre typer af tilfæstning, der er kendte af fagfolk, såsom covalent kobling, kan anvendes.
Fast/væskefaseblandingen opretholdes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at ethvert solubiliseret over-10 fladeimmunokompleks, der er til stede, kan blive bundet af den faste understøtning, og derved danne et til en fastfase--bundet kompleks. Fortrinsvis adskilles den opretholdte understøtning herefter fra ethvert ikke-bundet protein, typisk ved hjælp af vask.
15 Undersøgelse af den opretholdte faste understøtning for tilstedeværelse af til den faste fase bundet kompleks tilvejebringer derved en fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af et overfladeantigen af interesse i celleprøven. Sådan undersøgelse udføres typisk ved at danne en 20 mærkningsreaktionsblanding ved at blande den opretholdte faste understøtning med et mærket specifikt bindemiddel, der er i stand til specifikt at binde immunokompleksdelen af komplekset i fast fase. Fortrinsvis er det mærkede specifikke bindemiddel i stand til at binde til enten antigenet eller 25 antistoffet af overfladeimmunokomplekset, når overfladeim-munokomplekset i sig selv er bundet til den faste understøtning .
Mærkningsreaktionsbiandingen opretholdes i et tidrum, der er tilstrækkeligt til, at det mærkede specifikke binde-30 middel kan reagere med (specifikt binde) ethvert immunokom-pleks i fast fase, der er til stede, og derved danne et mærket produkt i fast fase. Ethvert ikke-bundet mærket specifikt bindemiddel skilles herefter typisk fra den faste understøtning.
35 Tilstedeværelsen af ethvert dannet mærket produkt i fast fase bestemmes herefter ved hjælp af kendte undersøgel- DK 173838 B1 12 sesfremgangsmåder, hvilke afhænger af den anvendte type mærke, som det er velkendt. Tilstedeværelsen af mærket produkt i fast fase indikerer tilstedeværelse af overfladeantigenet af interesse i celleprøven.
5 Som det anvendes heri betyder betegnelsen "solubili- seret immunokompleks" et kompleks, der er dannet af et antistof, der er bundet til en celleoverfladeantigenepitop, hvis tilstedeværelse søges, der er dannet ved at omsætte antistoffet og celleoverfladeantigenepitopen efterfulgt af 10 lyse af cellen til dannelse af cellulært nedbrydningsmateriale og et solubiliseret immunokompleks. Immunokomplekset kan være til stede i den celleprøve, der analyseres som den er opnået fra en patient (donor) , som hvor celleprøven er en blodpladeprøve fra en patient med immunthrombocytopenisk 15 purpura (ITP), der indeholder autoantistoffer mod et blodpla-deantigen, såsom glycoprotein Ilb/IIIa-komplekset eller glycoprotein Ib. Immunokomplekset kan også dannes ved im-munoreaktion af alloantistoffer fra en patient med blodplader fra andre celler fra en eventuel donor. Immunokomplekset 20 kan yderligere dannes ved immunoreaktion af antistoffer mod et hovedhistoforenel ighedskompleks (HFK)-antigenepi top, såsom et HLA klasse I eller klasse II-antigenepitop, der er til stede på overfladen af cellen.
En anden analysemetode til påvisning af tilstedeværel-25 sen af et celleoverfladeantigen omfatter de trin, hvor der tilvejebringes en alikvot af celler, der skal undersøges. Cellerne i en sådan alikvot bærer et overfladeantigen, der skal påvises, med et immunokompleks, der indeholder et antistof mod antigenet, der søges immunoreageret med antigenet.
30 Her igen kan immunokomplekset, hvis det er til stede, være til stede i prøven, som det er opnået fra patienten (donoren) , eller det kan fremstilles efter opnåelse af celleprøven. Cellerne af alikvotten lysebehandles til tilvejebringelse af cellulært nedbrydningsmateriale, og når immunokom-35 plekset er til stede i alikvotten, til dannelse af et solubiliseret immunokompleks. Der undersøges herefter for tilstede- DK 173838 B1 13 værelsen af det solubiliserede immunokompleks.
Ved en foretrukken udførelsesform skilles det cellulære nedbrydningsmateriale, der dannes ved lyse/solubili-seringstrinnet, fra det solubiliserede immunokompleks ved 5 hjælp af enhver gængs metode, såsom centrifugering. Det fraskilte solubiliserede immunokompleks fæstes herefter til en understøtning på fast fase til dannelse af et til en fast fase fæstet immunokompleks. Tilfæstningen kan ske ved hjælp af fysisk adsorption, immunoreaktion under anvendelse af til 10 fast fase bundne antistoffer, der er rettet mod immunokom-pleksets antistoffer, som monoklonale museanti-menneskeantistoffer, der er tilgængelige American Type Culture Collection i Rockville, MD (ATCC) under accessionsnummeret HB43, eller ved at binde med S. aureus-protein A, der er overtrukket på 15 den faste understøtning. Der undersøges herefter for immuno-komplekset som et til en fast fase fæstet immunokompleks.
I en udførelsesform er cellerne i prøven blodplader.
I en sådan udførelsesform kan immunokompleksets antistoffer være autoantistoffer fra den donor (patient), hvorfra prøven 20 er udtaget, og disse autoantistoffer kan være rettet mod glycoprotein Ilb/IIIa-komplekset eller mod glycoprotein Ib.
I en anden udførelsesform er blodpladerne eller andre celler fra en første person (donor), og immunokompleksets antistoffer kan være alloantistoffer fra en anden person (donataren) , 25 som hvor krydstilpasning af blodplader eller andre celler fra en eventuel donor og serum eller plasma fra en patient (donator) sørger for immunokompleksets antistoffer. Immunokompleksets antistoffer kan også være rettet mod en gruppe celleoverfladeantigener, såsom et vævsafvisende relateret 30 antigen, som et antigen af HFK eller et HLA-antigen. Antistoffer rettet mod en epitop, der er til stede på i det væsentlige alle HLA-antigener, samt de, der er rettet mod individuelle HLA-specifikke antigenepitoper, er tilgængelige fra ATCC samt fra antiserumbanken hos National Institutes 35 of Health (NIH), Bethesda, MD.
Der tilvejebringes således også en fremgangsmåde til DK 173838 B1 14 undersøgelse af blodplade- eller anden cellulær forenelighed mellem en donor og en patient (donator) . Ved denne fremgangsmåde blandes en alikvot af serum eller plasma fra en patient, der mistænkes for at have alloantistoffer mod en 5 donorblodplade eller et andet cellulært antigen, med blodplader eller andre celler fra donoren til dannelse af en vandig væskeformig blanding. Den således dannede blanding opretholdes under biologiske undersøgelsesbetingelser i et forudbestemt tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at alle i serum 10 eller plasma tilstedeværende alloantistoffer kan immunorea-gere med blodpladen eller det cellulære antigen til dannelse af et immunokompleks. Blandingens blodplader eller andre celler lysebehandles til dannelse af cellulært nedbrydningsmateriale og et solubiliseret immunokompleks, når alloanti-15 stofferne og blodplader eller andet cellulært antigen er til stede i blandingen. Der undersøges herefter for tilstedeværelse af immunokomplekset. Hvis immunokomplekset findes ikke at være til stede er donor og donator forenelige og omvendt.
20 Den foreliggende opfindelse tilvejebringer også en fremgangsmåde til typebestemmelse af celler for tilstedeværelse af forskellige overfladeantigener, såsom HIA-antigener.
Her omsættes en alikvot af en celleprøve, der skal typebestemmes, med et antistof, der reagerer med en antigenepitop, 25 der er fælles for i det væsentlige enhver af den gruppe af celleoverfladeantigener, der skal undersøges for, såsom et monoklonalt antistof, der reagerer med HLA-antigenets grundstamme til dannelse af et immunokompleks. Cellerne lysebehandles herefter til tilvejebringelse af cellulært nedbryd-30 ningsmateriale og et solubiliseret immunokompleks. Det solu-biliserede immunokompleks omsættes herefter med indikerende paratopiske molekyler; dvs. hele antistoffer eller dele af antistoffer, der indeholder paratopet, som immunoreagerer med mindst et medlem af antigengruppen, såsom et HLA-speci-35 fikt antigenepitop, til dannelse af et andet immunokompleks.
Der undersøges herefter for tilstedeværelse af det andet DK 173838 B1 15 immunokompleks. Hvor HLA-antigener søges er de først nævnte antistoffer og de indikerende paratopiske molekyler tilgængelige fra ATCC og NIH.
Hvor der ønskes en fuldstændig profil af celleoverfla-5 deantigener, som hvor HLA-typebestemmelse udføres, er det ofte fordelagtigt at dele det solubiliserede immunokompleks i et stort antal alikvoter. Alikvoterne omsættes herefter individuelt med medlemmer af et panel af indikerende paratopiske molekyler, og der undersøges for tilstedeværelsen af 10 det andet immunokompleks fra hvert af panelmedlemmerne.
Undersøgelsesfremgangsmåderne ifølge den foreliggende opfindelse benytter en fast understøtning, der er i stand til specifikt at binde et solubiliseret immunokompleks. Anvendelige faste understøtninger består typisk af et specifikt 15 bindemiddel, der er fæstet (operativt bundet) til en fast matrix.
Et specifikt bindemiddel kan være bundet til et mærke eller et indikeringsmiddel og anvendes til dannelse af et mærket immunoreaktionsprodukt.
20 Betegnelserne "indikeringsmiddel" og "mærke", der anvendes heri, omfatter enkelte atomer og molekyler, der er 1 stand til at tilvejebringe et påviseligt signal, og som er i stand til at blive bundet til et antistof, eller til at blive anvendt separat.
25 Indikeringsmidlerne kan være et fluorescerende mærk ningsmiddel, der kemisk binder til antistoffer eller antigener uden at denaturere disse, til dannelse af et fluorochrom (farvestof), der er et anvendeligt immunofluorescerende sporstof. Egnede fluorescerende mærkningsmidler er fluoro-3 0 chromer, såsom fluoresceinisocyanat (FIC) fluoresceinisothio-cyanat (FITC), 5-dimethylamin-l-naphthalensulfonylchlorid (DANSC), tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), lissamin, rhodamin-8200-sulfonylchlorid (RB 200 SC) og lignende. En beskrivelse af immunofluorescensanalysefremgangsmåden findes 35 i Marchalonis et al., "Immunofluorescence Analysis", 189- 2 31, supra.
DK 173838 B1 16 I foretrukne udførelsesformer er den indikerende gruppe et enzym, såsom peberrodsperoxidase (PRP) , glucoseoxi-dase eller lignende. Hvor den væsentligste indikerende gruppe er et enzym, såsom PRP eller glycoseoxidase, kræves der 5 yderligere reagenser til at synliggøre den kendsgerning, at der er dannet et kompleks (immunoreaktionsprodukt). Sådanne yderligere reagenser til PRP omfatter hydrogenperoxid og et oxidationsfarvestof-forstadie, såsom diaminobenzidin. Et yderligere reagens, der er anvendeligt med glycoseoxidase, 10 er 2,2 '-azino-di-(3-ethyl-benzthiazol in-G-sulfonsyre) (ABTS) .
Radioaktive elementer er også anvendelige mærkningsmidler, og de anvendes illustrativt heri.
Et eksemplarisk radiomærkningsmiddel er et radioaktivt element, der tilvejebringer gammastråleemissioner. Elementer, 15 der i sig selv udsender gammastråler, såsom 124I, 125I, 128I, 13li, I321 og 51Cr repræsenterer en klasse af indikerende grupper af gammastråleemissionsproducerende radioaktive elementer. Især foretrækkes 1251. En anden gruppe anvendelige indikerende grupper er de elementer, såsom Hc, 18F, 1^0 og 20 13n, der i sig selv udsender positroner. De således udsendte positroner tilvejebringer gammastråler ved sammenstød med elektroner, der er til stede i den dyriske krop. Ligeledes anvendelige er en betaudsender, såsom 111^111^11111.
Mærkningen af specifikke bindemidler af protein er 25 velkendt af fagfolk. F. eks. kan antistoffer, der er tilvejebragt ved hjælp af hybridomaer, mærkes ved hjælp a£ metabolisk inkorporering af aminosyrer, der indeholder en isotop, der er tilvejebragte som en komponent i vævskulturmediet, jf. f.eks. Galfre et al., Meth. Enzymol. 73; 3-46 30 (1981). Teknikkerne med proteinkonjugation eller -kobling gennem aktiverede funktionelle grupper er særligt anvendelige, jf f.eks. Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., bind 8, Suppl. 7; 7-23 (1978) og US patentskrift nr. 4.493.-795. Fremgangsmåder til konjugering af enzymer til proteiner 35 kan findes i US patentskrifterne nr. 3.791.932 og 3.839.153. Endvidere kan sted-dirigeret koblingsreaktion udføres såle- DK 173838 B1 17 des, at mærket i det væsentlige ikke interfererer med immuno-reaktionen af den anden receptor med apo B-100, jf. f.eks. Rodwell et al., Biotech. 3.; 889-894 (1985).
5 Eksempler
Det er hensigten med de følgende eksempler, at de skal illustrere, men ikke begrænse den foreliggende opfindelse.
1. Karakterisering af antiblodpladeimmunstatus for auto- 10 immune individer_ A. Individer der undersøges.
Der blev undersøgt plasma- eller blodpiadeprøver, der er indsamlet mellem 1. januar 1982 og 1. juli 1986 fra 44 patienter med kronisk ITP, 20 kontrolindivider og 20 15 thrombocytopeniske kontroller (akut ikke-lymfocytisk leukæmi, 3 patienter; akut lymfoblastisk leukæmi, 2 patienter; rygmarvstransplantationspatienter med anti-HLA-antistoffer, 3 patienter; aplastisk anæmia, 2 patienter, non-Hodgkins lymfoma, 3 patienter (en med cryoglobuliner); cirrhosis, en 20 patient; sygdom med hastig formering af myelom, 3 patienter; og carcinoma på kemoterapi, 3 patienter). Patienter med ITP var thrombocytopeniske med et normalt antal eller forøget antal af megakaryocyter, og uden tegn på andre typer im-munthrombocytopenia.
25 B. Undersøgelser for antiglvcoprotein-autoantistof.
Specificiteten af både immunoperleanalysen og mikro-titeranalysen bestemmes ved hjælp af det anvendte monoklo-nale antiglycoprotein-antistof. Der anvendes de følgende murine monoklonale antistoffer; anti-GPIIb/IIIa-2A9, 3F5, 30 2G12 (tilvejebragt af Dr. V.L. Woods) - 2A9 er specifik for GPIIb og de andre er kompleks-specifikke; anti-GPIb-P3 (tilvejebragt af Drs. Zaverio Ruggeri og Theodor Zimmerman, Scripps Clinic); og antihuman IgG {American Type Culture Collection, Rockville, MD, ATCC HB-43). Monoklonale antistof-35 fer (50 μg) mærkes med 500 μΟΐ af 1251 under anvendelse af chloramin-T-fremgangsmåden. Alle inkubationer ved denne DK 173838 B1 18 undersøgelse sker ved stuetemperatur.
Det vides, at i detergentekstrakter danner GPIIb og GPIIIa et kompleks, og at GPIb danner kompleks med blodplade-glycoproteinerne IX og V. Derfor kan, som bestemt ved disse 5 to undersøgelser, anti-GPIIb/IIIa-autoantistoffer være mod epitoper på enten GPIIb eller GPIIIa, og anti-GPIb specifik for GPIb, GP V eller GP IX. Hvad angår denne rapport vil resultaterne imidlertid blive rapporteret som enten anti-GPIIb/IIIa eller anti-GPIb, idet der henføres til autoanti-10 stoffer mod GPIIb/IIIa-kompleksets proteiner eller mod GPIb--kompleksets proteiner.
C. Immunoperleundersøgelsen
Denne undersøgelse kan anvendes til at bestemme enten blodplade-associeret autoantistof eller plasmaautoantistof.
15 (i) Immunoperle-fremstilling.
Anti-IgG-overtrukne immunoperler fremstilles ved at inkubere polystyrenperler (Poly-Sep, Polysciences Inc., Warrington, PA) med murin monoklonal antihuman IgG (ATCC HB-43) i saltvand i 60 minutter ved et perle/antistof-vægt-20 forhold på 2000:1 {f.eks. 100 mg perler og 50 /ig anti-IgG i 2 ml saltvand). Perlerne centrifugeres herefter i 10 sekunder ved maksimumhastighed i en bordcentrifuge (International Clinical Centrifuge, Model 65133M). Efter at have vasket én gang med 10 ml 0,05% Tween-20 i phosphat-pufret saltvand, 25 pH 7,4 (PBS-Tween), blokeres ikke-specifikke bindingssteder ved inkubation af perlerne i 2% okseserumalbumin (BSA) i PBS-Tween i 60 minutter, efterfulgt af vask fire gange i PBS-Tween.
{i i) Klargøring af blodplader.
3 0 Blodplader fra EDTA-antikoaguleret blod fås fra en patient eller fra en normal donor, og de vaskes seks gange med 0,05 M isotonisk citratpuffer. Til fremstilling af antistof -sensitiverede blodplader inkuberes vaskede normale blodplader (108 i 0,1 ml) med 1,0 ml patient- eller kontrol-35 plasma, der indeholder PGE^ (1 μg/ml) og theophyllin (1 μΜ) , i 60 minutter ved stuetemperatur, og herefter vaskes DK 173838 B1 19 der fire gange med 0,05 M citratpuffer, der indeholder PGE^ og theophyllin. Patientblodplader (108) eller de antistof-sensitiverede blodplader resuspenderes i 900 μΐ citratpuffer, der indeholder leupeptin (100 /^g/ml) , hvorefter de 5 solubiliseres ved tilsætning af 100 μΐ 10%'s "Triton X-100". Kontrolprøverne behandles på ligende måde.
(iii) Undersøgelse
De solubiliserede blodplader fra hver prøve centrifugeres ved 12000 x g i 5 minutter. Forudgående studier viser, 10 at dette trin er nødvendigt, især ved undersøgelser af anti--GPIb-autoantistof, til forebyggelse af falsk hævede værdier. Supernataten inkuberes herefter i 60 minutter med 100 mg anti--IgG-overtrukne immunoperler, hvorved tillades binding af IgG og ethvert bundet antigen. Efter fire gange vask med 15 PBS-Tween, påvises tilstedeværelsen af specifikt antigen ved at inkuber perlerne med en 1,0 ml PBS-Tween, der indeholder ca. 400000 cpm 125I-monoklonalt antistof, der er specifikt for enten anti-GPIIb/HIa (en blanding af 3 monoklonale antistoffer, der er specifikke for ikke-konkurrerende steder, 20 2A9, 3F5 og 2G12) eller anti-GPIb (P3) i 60 minutter ved stuetemperatur, hvorefter der vaskes fire gange med PBS-Tween. Perlerne suspenderes igen i 1 ml puffer, og 0,5 ml fjernes til bestemmelse af radioaktiviteten. Data er udtrykt som et bindingsforhold mellem cpm i patientprøve og gennem- 2 5 snit lig cpm for tre kontrolprøver. Resultaterne for den gennemsnitlige procentvise variation af gentagne prøver af kontrolblodplader og blodplader, der er sensitiverede med kontrolplasma, er: anti-GPIIb/IIIa- hhv. 10,1 + 7,5 (14 undersøgelser) og 9,1 ± 8,1 (31 undersøgelser) og anti-GPIb-30 hhv. 6,8 ± 7,0 (17 undersøgelser) og 7,9 ± 7,6 (24 undersøgelser). Patiener med et bindingsforhold på >1,3 betragtes som positive (>2 S.D. i forhold til konotrol. Forudgående undersøgelser viser, at positiv reaktivitet kan fjernes ved adsorption af plasma med overskydende blodplader. Desuden
3 5 påvirker opbevaring af prøverne i op til 4 dage ved 4°C
ikke kontrolværdierne for blodplader eller plasma.
DK 173838 B1 20 D. Undersøgelse med mikrotiterbrønd
Der er forud publiceret detaljer (Woods et al., Blood 63; 368-375 (1984) og Woods et al., Blood 64; 156-160 (1984)-). Letvaskede blodplader (109 ml) eller CEM leukæmiske celler 5 (107 ml) i PBS, der indeholder leupeptin (100 μg/ml) , solubi- liseres i 1% "Triton X-100" i 30 minutter ved 4°C, hvorefter der ultracentrifugeres (100.000 x g i 60 minutter) . Lysateme opbevares ved -70°C. Mikrotiterbrønde overtrækkes natten over ved 5°C med 100 μΐ af enten anti-GPIIb/IIIa (2A9 eller 10 3F5) eller anti-GPIb (P3) ved en koncentration på 5 μς/πΐ.
Efter 6 gange vask med 200 μΐ PBS-Tween blokeres de tilbageværende bindingssteder i 50 minutter med 200 μΐ 2%'s BSA i PBS-Tween. Efter vask seks gange med PBS-Tween tilsættes 100 μΐ af blodpladelysat eller det antigen-negative 15 CEM-lysat, fortyndet 1:10, og der inkuberes i 50 minutter. Dette tillader binding af det specifikke blodpladeantigen til det til brønden bundne monoklonale antistof. Efter vask seks gange tilsættes egnede fortyndinger (1:10 for skanningsplasma, og højere fortyndinger hvis de er positive) af 20 patient- eller kontrolplasma, og der inkuberes i 50 minutter. Efter seks gange vask tilsættes 100 μΐ radiomærket murin monoklonal antihumant IgG (ca. 100.000 cpm), og efter inkubation i 50 minutter og endelig vask seks gange bestemmes radioaktiviteten for af hver brønd. Den procentvise variation 25 for gentagne forsøg med kontrolplamaer er -5,0 ± 7,7 for anti-GPIIb/IIIa og -1,9 ± 6,4 for anti-GPIb (Woods et al., Blood 63:368-375 (1984) og Woods et al., Blood, 64; 156-160 (1984)) . Prøver med en procentvis stigning på >11 betragtes som positive (>2 S.D.).
30 E. Resultater (i) Kroniske ITP-patienter
Til vurdering deles resultaterne i to grupper: (1) præ-splenektomi-patienter, den oprindelige undersøgelsesprøve udtages før splenektomi, skønt ved nogle af disse 35 patienter udføres også yderligere undersøgelser efter det kirurgiske indgreb; (2) post-splenektomi-patienter, patienten DK 173838 B1 21 undersøges først efter det kirurgiske indgreb.
(ii) Præ-splenektomiske undersøgelser (tabel I)
Seksogtyve patienter undersøges; 16 fik efterfølgende fjernet deres milt, og 8 opnår fuldstændig remission, seks 5 mislykkedes med splenektomi, og to blev tabt for opfølgning. Blodplade-associeret autoantistof bestemmes under anvendelse af immunoperleanalyse hos 7 af de af 26 patienter. Af disse var seks (85,7%) positive med forhold fra 4,9 til 30,1 (kontrolværdi < 1,3) ; fem havde anti-GPIl/HIa- og én havde anti-10 GPIb-antistoffer.
Tabel I
Anti-blodpladeglycoproteinautoant i stoffer 5 Pre-splenektomiske patienter med kronisk ΠΡ.
DK 173838 B1 22
Blodpla- Anti-GPIlb/IIIa Anti-GPlb
Patient deantal Re- Irimunoperle Brønd Inmunoperle Brønd 10 nr. pr. nm3 Splx spons PAIgG p-A$soc Plasma P-Assoc Plasma 1 2000 Ja ? -- 16,7 2,3 Neg -- 0,8 Neg 2 9000 Ja CR -- -- 0,8 Neg -- 1,0 Neg 15 3 9000 Ja CR -- -- 0,9 Neg -- 0,9 Neg 4 9000 Ja NR -- -- 4,5 Neg -- 0,9 Neg 20 5 10000 Nej -- -- -- 0,9 Pos(320) -- 1,0 Pos(80) 6 14000 Ja NR -- -- 1,5 Neg -- 1,1 Neg 7 18000 Ja CR 12962 -- 0,6 Neg -- 1,0 Neg 25 8 19000 Nej -- 4423 -- 1,4 Neg -- 0,9 Neg 9 20000 Nej -- 4873 -- 1,3 Neg -- 0,9 Neg 30 10 23000 Ja CR -- -- 1,7 Neg -- — Neg 11 34000 Ja CR 7353 -- 1,6 Neg -- -- Neg 12 39000 Nej -- 30990 -- 0,9 Neg -- 2,0 Neg 35 13 40000 Ja NR 3453 -- 1,0 Neg -- 0,9 Neg 14 40000 Ja NR -- 30,1 5,5 Neg -- 1,1 Neg 40 15 42000 Nej -- -- 0,6 0,7 Neg 1,0 1,2 Neg 16 46000 Nej -- 9036 -- 1,1 Neg -- 0,8 Neg 17 50000 Ja NR 11049 -- 0,9 Neg -- 0,9 Neg 45 18 50000 Ja NR 17143 16,1 3,9 Neg -- 0,8 Neg 19 50000 Nej -- -- 10,0 2,5 Neg -- 0,8 Neg 50 20 69000 Nej -- 7286 0,7 0,6 Neg 4,9 1,8 Neg 21 85000 Ja CR 1351 -- 1,2 Pos(640) -- -- Neg 22 100000 Nej -- ·· -- 0,9 Neg -- 1,2 Neg
5 Tabel I
Anti-blodpladeglycoproteinautoantistoffer
Pra-splenektomiske patienter med kronisk ITP, DK 173838 B1 23 10 Blodpla- Anti-GPIlb/IlIa Anti-GPIb
Patient deantal Re- Imnunoperle Brønd Imnunoperle Brønd nr. pr. rmr* Splx spons PAIgG P-Assoc Plasma P-Assoc Plasma 23 106000 Ja CR 5152 16,2 1,4 Neg .. .. Neg 15 24 112000 Nej -* 3537 -- 0,9 Neg -- 3(£ Pos(40) 25 145000 Ja ? 3692 -- 3,1 Neg -- i,i Neg 20 26 26100 Ja CR 3075 -- 0,8 Neg -- 1,2 Neg
Splx - splenektomi; CR - Normalisering af blokadeantallet; NR - intet respons eller tilbagefald 25 efter et oprindeligt respons, eller ? hvis opfølyiinger er gået tabt; PAIgG - blokade-assccie-ret IgG (ng/109 blpl); Imnunoperle - resultater af blokade-associeret (P-Assoc)- eller plasra-inmunoperle-undersøgelse udtrykt som et forhold mellem patient/kontrol-resul tater (positiv > 1,3); Brønd - resultater af undersøgelse med mikrotiterbrønd, udtrykt som negative (Neg) eller positiv (Pos), hvor titervardierne ved de positive undersøgelser er anført i parentes.
30 DK 173838 B1 24
Blodplade-associerede autoantistoffer hos tre af disse patienter (patient nr. 14, 18 og 23), blev også undersøgt efter splenektomi (tabel II). Hos den patient, der opnår fuldstændig remission (patient 23) kan de anti-GPIIb/IIIa-5 -autoantistoffer, der er til stede før splenektomien ikke længere påvises efter det kirurgiske indgreb. Hos de to andre fandtes autoantistofferne vedvarende til trods for splenektomien, og skønt begge opnåede en midlertidig forøgelse i blodpladeantallet efter det kirurgiske indgreb 10 (135.000/cm3 hos den ene og 313.000 pr. mm3 hos den anden), blev de begge alvorligt thrombocytopeniske (<20.000) inden for få uger efter det kirurgiske indgreb. I tabel II sammenlignes de blodplade-associerede IgG (PAIgG) værdier og de blodplade-associerede anti-GPIIb/HIa-værdier før og efter 15 splenektomien. Hos patient 23, der opnåede fuldstændig remission, og hos patient 14, der kun responderede delvist, varierede værdierne af begge bestemmelser samstemmende. Hos patient 18, hvis blodpladeantal blev normalt kort efter det kirurgiske indgreb, men som senere havde tilbagefald (blod-20 pladeantal 14.000/mm3), blev PAIgG-værdierne normale i overensstemmelse med blodpladeantallet, men imidlertid forblev det blodplade-associerede anti-GPIIb/IIIa forhøjet.
Plasmaautoantistoffer blev undersøgt hos alle patienter under anvendelse af begge undersøgelser; 16/26 (61,5%) 25 var positive i mindst én af undersøgelserne. Elleve havde cirkulerende anti-GPIIb/IIIa, og tre havde anti-GPIb-autoan-tistoffer, når de undersøges under anvendelse af immunoperle-undersøgelsen,· forholdene varierede fra 1,5 til 5,5. Af disse patienter med positive immunoperleundersøgelser var 30 kun én (patient 24) også positiv under anvendelse af mikro-titerundersøgelsen. To patienter, der er negative ved im-munoperleundersøgelsen (patient 5 og 21), er positive under anvendelse af mikrotiterundersøgelsen,- én af disse (patient 5) har antistof mod både GPIIb/lIIa og GPIb ved mikrotiter-35 undersøgelsen.
DK 173838 B1 25
Tabel II
5 Virkningen af splenektomi på anti-GPIIb/IIIa-autoantistof
og blodplade-associeret IgG
Blodpla- Anti- PAIgG
10 Prøve-* Behand- deantal GPII/IIIa (ng pr.
Patient dag ling (pr. mm3) forhold 109 blpl) Ϊ4 - 25 P 40.000 28,8 8.900 15 OP 96.000 21,2 5.847 +5 - 135.000 25,4 6.595 +52 - 109.000 31,1 19.500 20 18 -111 - 51.000 -- 17.140 0 P 118.000 16,1 4.400 25 +5 - 103.000 13,7 4.394 +8 - 313.000 11,3 2.611 30 23 - 1 P 106.000 16,2 5.152 +28 - 465.000 1,0 985 35 Kontrolværdier 180-400.000 <1,3 <3.300
Anti-GPIIb/IIIa-blodplade-associerede autoantistoffer mod 40 blodpladeglycoprotein Ilb/IIIa-komplekset, målt ved immuno-perleundersøgelsen; PAIgG - blodplade-associeret IgG; P-høj dosis prednison; * Antal dage før (-) eller efter splenektomi; dag 0 er dagen med det kirurgiske indgreb.
DK 173838 B1 26 (iii) Undersøgelser post-splenektomi (tabel III)
For alle patienter i denne gruppe mislykkedes det at opretholde et normalt blodpladeantal efter splenektomi. Blodplade-assosiceret autoantistof måles under anvendelse 5 af immunoperleundersøgelsen hos fire af de 18 patienter i denne gruppe. Tre var positive, en med autoantistoffer mod GPIIb/lIIa og de andre to mod GPIb.
Plasmaautoantistoffer kunne påvises under anvendelse af immunoperleundersøgelse hos ti af de 18 patienter (55%), 10 syv med anti-GPIIb/HIa og tre med anti-GPIb. Syv af de ti patienter med positive immunoperleundersøgelser havde også, vist ved hjælp af mikrotiterundersøgelsen, autoantistoffer af samme specificitet. To patienter (patienterne 9 og 12) er positive ved mikrotiterundersøgelsen men negative ved 15 immunoperlemetoden. En patient (patient 4) har autoantistoffer mod begge antigener.
Tabel III
Ant i-blodpiadeglycoproteinautoant i st of fer
5 Post-splenektomiske patienter med kronisk ITP
DK 173838 B1 27
Blodpta- Anti-GPIlb/IlIa Anti-GPlb deantal Inmunoperle Brønd Immunoperte Brønd
Patient (pr. mm?) PAIgG P-Assoc Plasma P-Assoc Plasma 10 - 27 1000 -- -- -- Neg -- 3,3* Pos<6400) 28 3000 -- -- 2,2 Neg -- < ) Neg 15 29 3000 6911 -- 1,0 Neg -- 1,0 Neg 30 3000 59800 - 1,3 Pos(40> - 2,6 Pos(80) 31 6000 -- 7,0** 9,4 Pos(640) -- 1,2 Neg 20 32 6000 -- -- 0,9 Neg -- 0,9 Neg 33 7000 53000 - 5,2 Pos(320) - 0,9 Neg 25 34 7000 -- -- 1,2 Neg 17,2 2,0 Pos(20) 35 9000 -- -- 0,6 Neg 1,0 0,9 Pos(40) 36 9000 -- -- 1,0 Neg -- 1,1 Neg 30 37 13000 -- -- 2,5 Neg -- 0,9 Neg 38 14000 -- 0,6 0,7 Neg 5,7 1,3 Pos(80) 35 39 21000 42396 -- 3,8 Neg -- 0,8 Neg 40 24000 6326 -- 0,9 Neg -- 1,1 Neg 41 34000 -- -- 0,6 Neg -- 1,0 Neg 40 42 40000 5650 -- 2,6 Neg -- 1,1 Neg 43 42000 19024 -- 1,0 Neg -- 0,9 Neg 45 44 117000 11795 -- 2,1 Pos(40) -- 1,1 Neg PAIgG - blodplade-associeret IgG (ng/10^ bipi); inmunoperle - resultater af blocfclade-associeret (P-Assoc)- eller plasma-firmunoperleundersøgelse, udtrykt som et forhold mellem patientAoritrol-50 resultater (positiv > 1,3); brønd · resultater af undersøgelsen med mikrotiterbrønd, udbrykt som negativ (neg) eller positiv (pos), hvor titerverdier af positive undersøgelser er vist i parentes.
*0,1 ml plasma anvendes til at sensibilisere blodplader.
**0,18 x 10® blodplader undersøges.
DK 173838 B1 28 (iv) Thrombocytopeniske kontroller
Blodplader (otte patienter) og plasma (20 patienter) fra patienter med ikke-immun thrombocytopenia undersøges under anvendelse af begge undersøgelser. Negative resultater 5 opnås ved hvert eksempel under anvendelse af både immunoper-leundersøgelsen og mikrotiterundersøgelsen (data er ikke vist).
F. Diskussion
De ovenfor anførte resultater illustrerer erfaringer 10 med to fremgangsmåder til måling af antiblodpladeantistoffer ved kronisk ITP: immunoperleundersøgelsen, der er i stand til at måle både blodplade-associerede - og plasmaautoanti-stoffer, og mikrotiterundersøgelsen, der kun er anvendelig til påvisning af plasmaantistoffer.
15 Blodplade-associerede autoantistoffer blev konstateret i ni af 11 ITP patienter (81,8%; syv med anti-GPIIb/IIIa og to med anti-GPIb). Skønt antallet af undersøgte patienter er for lille til statistisk vurdering, sås der positive undersøgelser med ca. den samme frekvens hos thrombocytope-2 0 niske patienter, der blev undersøgt for præ- eller post-spenektomi.
Plasmaautoantistoffer blev konstateret med en mindre frekvens; 28/44 var positive (63,6%). Ved anvendelse af immunoperleanalysen fik 24/44 patienter påvist cirkulerende 25 autoantistof (18 med anti-GPIIb/IIIa og 6 med anti-GPIb).
Der blev konstateret færre positive prøver ved anvendelse af mikrotiterundersøgelsen, som det tidligere er anført (Woods et al., Blood jS3; 368-375 (1984) og Woods et al.,
Blood 64^; 156-160 (1984)). Kun 12/44 patienter var positive 30 under anvendelse af denne undersøgelse (5 med anti-GPII/IIIa, 5 med anti-GPIb og 2 med begge). 3 patienter havde autoantistoffer, der kun kunne påvises med denne undersøgelse. Denne undersøgelse var positiv for næsten halvdelen af post-sple-nektomi-patientgruppen (alle der var modstandsdygtige), 35 mens kun 3 af de 26 patienter i den præ-operative gruppe var positive. Om denne analyse forudsiger mere alvorlig DK 173838 B1 29 sygdom, eller om det reflekterer laboratoriets tendens til at modtage prøver fra mere alvorligt ramte patienter, vides ikke.
Disse autoantistofundersøgelser har udprægede fordele 5 i forhold til undersøgelser for blodplade-associeret IgG (PAIgG). For det første tillader de direkte påvisning af enten blodplade-associerede eller plasmaautoantistoffer mod definerede blodpladeproteiner, hvorved den autoimmune natur af patientens sygdom bekræftes. Modsat måler PAIgG-under-10 søgelsen IgG på blodplader af ukendt specificitet. Tilpasningen af den PAIgG-undersøgelse, der anvendes af van Leeuwen et al., Blood 59; 23-26 (1982), hvor den relative binding til normale og thrombasteniske blodplader anvendes, kan tilvejebringe lignende dog indirekte information hos patien-15 ter med anti-GPIIb/IIIa-antistoffer, men fremgangsmåden er besværlig, og thrombasteniske blodplader er ikke tilgængelige for flere laboratorier. Det er af interesse, at raten ifølge opfindelsen af anti-GPIIb/IIIa-positivitet, hvor der anvendes kombinationen af undersøgelserne, er meget lig deres. For 20 det andet har autoantistofundersøgelsens resultater hos patienter med ikke-immun thrombocytopenia hidtil været fuldstændig negativ ved disse to analyser, mens PAIgG-resul-taterne er positive hos mange patienter med flere forskellige diagnoser (Mueller-Eckhardt et al., Br. J. Haematol. 52.; 49-25 58 (1982) og Kelton et al., Blood £0; 1050-1053 (1982)).
Skønt det synes sandsynligt, som foreslået ved undersøgelserne af Kelton et al. (supra), at positive PAIgG-resultater kan reflektere immunmedieret blodpladeødelæggelse, må det dog erkendes, at en forøgelse i PAIgG ikke nødvendigvis 30 viser tilstedeværelsen af autoantistof. En forskel mellem anti-GPIIb/IIIa- og PAIgG-resultater, der er konstateret hos en af ITP-patienterne (patient 18), understøtter denne påstand. Hendes autoantistof-værdier forblev forhøjede efter splenektomi, til trods for normalisering af både blodplade-35 antallet og PAIgG-resultaterne. Denne patient fik efterfølgende tilbagefald, hvilket antyder, at denne undersøgelse DK 173838 B1 30 kan være anvendelig til forudsigelse af det endelige udfald af splenektomi. Selvklart er disse data indledende. Skønt autoantistoffer ikke sås hos den gruppe af thrombocytopeniske kontrolpatienter, der er anført heri, synes det sandsynligt, 5 at når patienter med kollagen vaskular sygdom eller lymfoma skannes under anvendelse af disse undersøgelser kan positive resultater ses hos nogle af disse patienter, da de har vist sig at have andre typer autoantistoffer (f.eks. anti-RBC-antistoffer).
10 Forskellen i resultater mellem immunoperleundersøgel- sen og mikrotiterbrønd-undersøgelsen er af interesse. Det vides fra undersøgelsen af oprensede proteinantigener, at der er to typer epitoper: Sekvens og topografiske (Berzofsky, Science 22 9; 932-940 (1985)). Sekvensepitoper involverer 15 aminosyresekvenser af én sektion af proteinet, mens topografiske epitoper involverer regioner, der ligger fjernt fra hinanden i molekylesekvens, men tæt ved hinanden i det tredimensionale rum på grund af molekylets tertiære struktur.
Den mest sandsynlige forklaring på den større procentsats 20 positive undersøgelser med immunoperleundersøgelsen er, at solubilisering af blodpladerne før inkubationen med antistoffet, der er nødvendig ved mikrotiterundersøgelsen, forstyrrer på en eller anden måde det antigene epitoper, mens inkubation af antistof og blodplader før solubilisering stabiliserer 25 det. Det postuleres her, at mikrotiterundersøgelsen måler sekvens eller stabile topografiske epitoper mens iimiunoperle-analysen ligeledes måler ustabile topografiske epitoper. Indledende undersøgelse i laboratoriet, hvor plasmaautoanti-stoffers evne til at udfælde GPIIb/IIIa-komplekset efter 3 0 inkubation af plasma med overflade-mærkede blodplader sammenlignes med evnen for udfældning af radiomærket oprenset GPIlb/lIIa, understøtter denne hypotese. Plasmaer, der er positive ved både mikrotiterundersøgelsen og immunoperleundersøgelsen (tre er undersøgt) , er i stand til at udfælde 35 både det oprensede GPIIb/IIIa-kompleks og komplekset fra overflademærkede blodplader, mens plamaer, der er positive DK 173838 B1 31 ved immunoperleundersøgelsen, men negative ved mikrotiterun-dersøgelsen (fire er undersøgt) , kun er i stand til at udfælde komplekset fra overflademærkede blodplader. Der skal selvfølgelig flere undersøgelser til for at bekræfte disse 5 indledende resultater.
Disse undersøgelser kan begge tilpasses til måling af andre endnu uidentificerede autoantistoffer, når egnede monoklonale antistoffer er tilgængelige. Da mange patienter med kronisk ITP ikke har påviseligt antistof, synes det sand-10 synligt, at autoantistoffer mod andre blodplade-associerede antigener (f.eks. phospholipider, glycolipider og lignende) er til stede.
Som resumé beskriver de foreliggende undersøgelser anvendelsen af to fremgangsmåder til måling af antistoffer 15 mod specifikke blodpladeproteiner. Resultaterne viser, at hoveddelen af patienterne med kronisk ITP har autoantistoffer mod enten blodplade-GPIIb/IIIa-komplekset eller mod GPIb.
De forskelle i frekvensen af positive resultater, der ses ved de to undersøgelser, frembyder tegn på epitoper, der 20 har varierende grader af stabilitet ved solubilisering.
2. Karakterisering af antiblodplade-immunstatus hos patienter med blodoladetransfusion._ A. Patient- oa donorpopulation 51 transfusionsepisoder, der involverer 7 patienter 25 med knoglemarvssvigt, blev undersøgt (tabel IV) . Alle var modstandsdygtige mod vilkårlige donorblodplader før starten af undersøgelsen. Transfusionsepisoder associeret med feber, infektion eller splenomegali blev ikke rutinemæssigt udelukket hvis god forøgelse fra enhver donor blev set inden for 30 24 timer. Ingen patient viste tegn på DIC under forsøgsperi oden. Patient nr. 1 blev udeladt fra undersøgelsen, da han blev modstandsdygtig over for alle donorer få dage før hans død, der er associeret med ARDS og mekanisk lufttilførsel. Patient nr. 2 blev udeladt fra undersøgelsen, da han blev 35 vedvarende febril og modstandsdygtig over for alle donorer.
Han blev senere bestemt at have en dissemineret svampeinfek- DK 173838 B1 32 tion. Donorer blev valgt fra familiemedlemmer, når det var muligt (n-16), ellers fra betalte frivillige fra samfundet (n-35) . HLA-afpasningen var som følger: A-9; B, B2X-5; C-19; D-8; ukendt, beslægtet-7, ukendt, ikke-beslægtet-3.
5
Tabel IV
Patientkarakteristikker
Vurderbare Antal for- 10 Alder/- transfu- skellige
Patient køn Diagnose sioner donorer Ϊ 42/M AA, allo-BMT 22 14 15 2 32/M ALL, auto-BMT 2 2 3 21/M AML 5 3 4 36/F AML 2 2 20 5 41/M AML 1 1 6 71/M AML 17 11 25 7 57/M 2°MDS->AML 2 2
Total 51 35 30 AA - aplastisk anæmi; allo-BMT - allogenisk knoglemarvstransplantation; auto-BMT - autolog knoglemarvstransplantation; AML - akut myelogen leukæmi; MDS - myel odysplast i sk syndrom.
35 B. Vurdering af transfusionens udfald Hver transfusionsepisode vurderes ved udregning af den korrigerede optællingsforøgelse efter en time (CCI) ud 40 fra den følgende standardformel:
optælling efter 1 time -præ-transfusions optælling X BSA
- = CCI efter 1 time
45 Antal overførte blodplader/loU
BSA = areal af kropsoverfladen i m2.
DK 173838 B1 33 Når det forefindes, beregnes også et senere CCI (8-24 timer). Et vellykket udfald defineres som en CCI efter 1 time på >7500. I ét tilfælde blev en CCI efter 1 på 7289 med en CCI på 4252 efter 6 timer betragtet som ’’vellykket", 5 når en transfusion fra en HLA-tilpasset søster eller bror, der er givet mindre end 24 timer senere, giver en CCI på 8391 efter 1 time og en CCI på 2670 efter 6 timer. I to tilfælde var blodpiadeoptællingerne efter 1 time ikke tilgængelige, et CCI <0 efter 8 timer, der ikke er associeret med 10 åbenbare ikke-immonologiske grunde til dårlig blodpladeover-levelse, blev betragtet som tegn på en transfusion med et ikke-vellykket udfald.
C. Murine monoklonale antistoffer HB-43 er et IgG-kappa-antistof, der er afledt fra 15 1410K67-cellelinien, der genkender Fc-delen af human IgG. HB-95 er et IgG2-antistof, der er afledt fra W6/32-cellelinien, der genkender en monomorf epitop på den tunge kæde af humane HLA-A, -B og C-antigener. Den intakte heterodimer kræves til fuldstændig ekspression af epitopen, skønt HB-95 20 binder svagt til isolerede tunge kæder. Begge cellelinier fås fra American Type Culture Collection (Rockville, MD) , og de blev anvendt til fremstilling af ascites i Pristane--påvirkede BALB/c mus, ud fra hvilke antistof oprenses ved hjælp af protein A-affinitetschromatografi.
25 125ι-mærkning udføres ved hjælp af chloramin-T-frem gangsmåden.
D. Fremstilling og opbevaring af blodplader (i) Normale blodplader
Blod fra normale voksne frivillige blev tappet over 30 i EDTA, og det blodpladerige plasma blev skilt fra ved centrifugering ved 400 x g i 10 minutter. Blodpladerne bringes på pelletform ved centrifugering ved 1000 x g i 15 minutter, hvorefter de vaskes fire gange med 1,0 ml 0,05 M citratpuffer (14,7 g natriumcitrat, 5,9 g natriumchlorid, 25,0 g dextrose 35 i 1000 ml destilleret H20; der er indstillet på pH 6,2 med 0,05 M citronsyre), hvorefter de resuspenderes i citratpuffer DK 173838 B1 34 til ca. 109/ml. Blodpladerne anvendes frisk, fremstillede eller opbevares i suspension ved 4°C i 24-48 timer.
(ii) Donorbiodplader
Ca. 3 ml blodpladekoncentrat fås ved afslutningen af 5 hver phorese-fremgangsmåde. Dette deles i 1 ml - alikvoter og centrifugeres ved 750 x g i 90 sekunder til fjernelse af røde celler. Blodpladerne centrifugeres ved 3000 x g i 5 minutter, hvorefter der vaskes fire gange. Blodpladekon-centratet kan opbevares i 24-48 timer ved 4°C før vask, 10 uden at påvirke undersøgelsesresultaterne.
(iii) Opbevaring af blodplader
For at vurdere virkningen af opbevaring på immunoper-leanalysen opbevares 1,0 ml blodpladealikvoter (1,3 x 109) fra to normale donorer både i suspension ved 4°C og ved 15 frysetørring i flydende nitrogen, hvorefter de undersøges ved intervaller på 1, 6, 15, 30 og 60 dage mod to kontrolplasmaer og to plasmaer, der vides at indeholde anti-HLA--antistoffer med høj titerværdi. De blodplader, der skal fryses, suspenderes i autolog plasma med 5% dimethylsulfoxid 20 i plastrør, hvorefter de fryses ved -70°C natten over, hvorefter de opbevares i flydende nitrogen. Efter optøning i 37°C varmt vandbad vaskes de to gange, hvorefter de resus-penderes i ca. 1 ml citratpuffer og tælles. Parallelle alikvoter suspenderes i normal saltvand ved 0,02% natriumazid 25 i plastrør, og de opbevares ved 4°C. Før undersøgelsen resus-penderes blodpladerne ved pipettering, hvorefter de vaskes to gange og optælles.
E. Fremstilling og opbevaring af plasma og serum
Alle undersøgelser udføres under anvendelse af plasma, 30 bortset fra hvor andet er anført. Plasma adskilles fra EDTA--antikoaguleret helt blod ved centrifugering ved 1000 x g i 15 minutter, og det opbevares i polypropylenrør. Forsøgsplasma fås ud fra modtagere før transfusionen og efter alle foregående transfusioner, når det er muligt. I intet tilfælde 35 blev forsøgsplamaet opnået efter den interessante transfusion. Positive kontrolplasmaer blev opnået ud fra individer, DK 173838 B1 35 der har fået mange transfusioner, hvilke individer har kendte anti-HLA-antistoffer med høj titerværdi og bredt spektrum, hvilket er vist ved immunoperleundersøgelse mod et panel af normale blodplader. Negative kontrolplasmaer blev opnået ud 5 fra normale frivillige, der ikke har fået transfusion eller været gravide. Både positive og negative kontrolplasmaer ultracentrifugeres ved 100.000 o/min. i 1 time. Alle plasmaer anvendes frisk fremstillede eller opbevares nedfrosset ved-70°C. Gentagen frysning og optøning undgås.
10 Sera fremstilles ud fra et lille antal positive og negative kontrolplasmaer ved inkubation i glasrør i nærværelse af CaCl og thrombin. Komplement blev inaktiveret med 0,02 M EDTA.
F. HLA-immunoperleundersøaelsen 15 Alikvotter af 108 donorbiodpiader sensitiveredes ved inkubation med 100 μΐ forsøgs- eller kontrolplasma i 1 time i plastrør. De sensitiverede blodplader vaskes tre gange, hvorefter de igen suspenderes i 900 μΐ citratbuffer, og de solubiliseres ved at tilsætte 100 μΐ 10%'s "Triton X-100".
20 Hvis undersøgelsen skal være fuldstændig samme dag, centrifugeres lysatet ved 3000 x g i 5 minutter, og supernatanten overføres til 15 ml polypropylenrør. Lysatet kan nedfryses ved -20°C efter solubilisering, og undersøgelsen kan fuldstændiggøres på et senere tidspunkt uden at resultaterne 25 påvirkes.
Immunoperlerne fremstilles ved at inkubere 6,35 mm polystyrenperler (#0023804, Pierce Chemical Co., Rodkford, 111.) med anti-humant IgG (HB-43, 10 μg pr. perle) i 500 μΐ pr. perle 0,01 M NaHCC>3-puffer (pH 8,5) i 1 time på en rota-3 0 tor. Efter at have vasket fire gange med 1,0 ml BPS-Tween inkuberes de i yderligere 1 time med 2% bovinserumalbumin (1 ml pr. perle) til blokering af resterende bindingssteder.
Efter fire yderligere vaske sættes én perle til hvert rør, der indeholder blodpladelysat, og det inkuberes med konstant 35 omrøring i 1 time. Under denne inkubation fæstner IgG-allo-antistoffer, der er bundet til blodpladen før solubiliserin- DK 173838 B1 36 gen, via Fc-delen til det til perlen bundne HB-43. Klasse I-HLA-antigenet forbliver bundet til Fab-delen af alloanti-stoffet efter solubiliseringen, og det bindes således indirekte til perlen. Perlerne vaskes yderligere fire gange i 5 PBS-Tween, hvorefter de inkuberes i 1 time med 400.000 cpm 125j_mær^et monoklonalt anti-HLA-antistof (HB-95) i 1 ml PBS-Tween. Efter fire endelige vaske tørres perlerne på et papirstykke, og de tælles i en Beckman-gammatæller. Alle inkubationer udføres ved stuetemperatur.
10 Undersøgelsen af interesse blev udført tredobbelt sammen med dobbeltforsøg med én positiv og to negative kontroller. En tekniker kan køre 24 samtidige undersøgelser på ca. 6 timer.
G. Undersøgelse for radioaktivt antiglobulin (RAGT) 15 RAGT udføres ved hjælp af en modifikation af frem gangsmåden ifølge LoBuglio et al. 27 . 108 vaskede blodplader sensitiveredes ved inkubation med 100 μΐ plasma i 1 time ved stuetemperatur, hvorefter de vaskes tre gange i citratpuffer.
En alikvot på 3 x 107 inkuberes i 30 minutter med 300.000 20 cpm l2^I-mærket antihumant IgG (HB-43). Tredobbelte 50 μΐ alikvoter, der indeholder 6 x 10δ blodplader anbringes som et lag over 200 μΐ 30% sucrose i 400 μΐ plastmikrocentrifu-gerør med spidse spidser, og der centrifugeres ved 11.000 x g i 5 minutter. Efter hurtig frysning ved -70°C fjernes de 25 spidser, der indeholder blodpladeknappen, og der optælles i en Beckman-gamma-tæller.
H. Resultater af transfusionsundersøgelse (i) Karakterisering af HLA-immunoperleundersøgelsen
Tredobbelte undersøgelser under anvendelse af 12 30 negative kontrolplasmaer mod samme antal normal blodplader gav en gennemsnitlig procentvariation på 8,7+/-9,0 (1 SD). Absolutte værdier for negative kontroller faldt i almindelighed inden for området 80-300 cpm. Et enkelt negativt kontrolplasma blev også undersøgt mod de samme blodplader 35 10 gange, hvilket gav en gennemsnitlig procentvis variation på 6,3+/-6,6%. Gennemførelse af undersøgelser under anven- DK 173838 B1 37 delse af citratpuffer i stedet for plasma gav resultater, der er sammenlignelige med de negative kontroller.
For at undersøge muligheden for, at analysen kan genkende antiblodpladeantistoffer rettet mod ikke-HLA-anti-5 gener, afprøves plasmaer fra 18 patienter med det kliniske syndrom ITP mod normale blodplader. Syv af disse havde plas-maautoantistoffer mod glycoprotein Ilb/IIIa-komplekset, 2 havde autoantistoffer mod glycoprotein Ib, og de resterende gav negative resultater for begge disse autoantistoffer.
10 Tre plasmaer gav positive resultater ved immunoperleundersø-gelsen, to med GPIIb/lIIa-autoantistoffer og en med et stærkt antiblodpladeautoantistof uden påviselig specificitet. Alle tre patienter havde en fortid med graviditet og/eller transfusion, hvilket antyder samtidig forekomst af alloantistof-15 fer.
Syv positive og syv negative kontroller blev gennemført under anvendelse af serum, og resultaterne blev sammenlignet med resultater opnået under anvendelse af plasma. Der blev ikke konstateret nogen signifikant forskel 20 mellem negative kontroller. Den absolutte værdi for positive serumkontroller udgør i gennemsnit 60% af plasmaværdierne.
Man gik ikke glip af nogle positive undersøgelser ved at anvende serum.
(ii) Fortolkning af undersøgelsesresultater 25 Det gennemsnitlige undersøgelsesresultat deles med gennemsnittet for de negative kontroller, hvilket giver et undersøgelses/kontrolforhold (UKF). Forsøg med 12 normale gav en gennemsnitlig normal UKF på 1,00 +/-0,14 (1 SD) . En UKF på <1,43 blev oprindeligt defineret som negativ for at 30 omfatte tre standardafvigelser. I praksis er UKF'er mellem 1,43 og 3,0 forbundet med vellykkede udfald af transfusion i 5 af 6 tilfælde (tabel V). Dette blev fortolket som tegn på, at immunoperleanalysen kan påvise niveauer af alloantistof under det, der er nødvendigt til signifikant at påvirke 35 overlevelsen af blodplader. Af dette ikke skyldes vilkårlig variation, understøttes af den iagttagelse, at alle 9-A-til- DK 173838 B1 38 passede transfusioner er associerede med UKF'er <1,43. Af kliniske grunde betragtes en UKF på </=3,0 som "negativ", og det forudsiger et vellykket udfald af en transfusion.
En UKF på >/=2,0 blev erfaringsmæssigt betragtet som 5 negativ for RAGT ved lignende retrospektiv analyse af data.
Tabel V
Transfusionsepisoder med UKF'er mellem 1,43 og 3,00 10
Gennemsnitlig CPM for Gennemsnitlig CCI efter
Patient undersøgelse CPM for kontrol UKF 1 time 3.5 - 1 344 197 1,75 2659 2 390 150 2,61 17396 20 3 123 81 1,53 11481 4 380 166 2.29 10298 5 505 169 2,99 12269 25 6 266 143 1,86 11538 30 UKF - Undersøgelse/kontrol-forhold; CPM - y-tællinger pr. minut (iii) Korrelation med udfald af transfusion
Hver værdifuld transfusionsepisode kategoriseres 35 efter om immunoperleundersøgelsen var positiv (UKF>3,0) eller negativ (UKF</=3,0), og om udfaldet var vellykket (CCI efter 1 time >/=7500) eller ikke-vellykket (CCI <7500 efter 1 time) . Data for både immunoperleundersøgelse og RAGT er opsummeret i tabel VI. Immunoperleundersøgelsen er 40 positiv i 18 episoder; 16/18 (88,9%) har ikke-vellykkede udfald. I 33 tilfælde er undersøgelsen negativ; 29/33 (87,9%) har vellykkede udfald. Den gennemsnitlige CCI efter 1 time er 2199 for positive undersøgelsesepisoder og 13072 for negative undersøgelsesepisoder.
DK 173838 B1 39
Tabel VI
Samnenhang mellem iimmnoperte- og RAGT-undersøgelse og udfald af transfusion 5 Positiv undersøgelse Negativ undersøgelse CCI<7500 CO7500 CCl<7500 CCI>7500 lonutoperle 16/18 (88,9¾) 2/18 (11,1¾) 4/33 (12,IX) 29/33 (87,9¾) 10 RAFT 15/21 (71,4¾) 6/21 (28,6%) 5/30 (16,7%) 25/30 (83,3%)
Enogtyve episoder er RAGT-positive; 15/21 (71,4%) har et ikke-vellykket udfald. Af de 30 RAGT-negative episoder 15 har 25/30 (83,3%) et vellykket udfald. Den gennemsnitlige CCI efter 1 time er 3897 for RAGT-positive episoder og 11.118 for RAGT-negative episoder.
I et enkelt tilfælde (der involverer patient 1) gav en donor, der oprindeligt er associeret med en positiv im-20 munoperleundersøgelse og et ikke-vellykket udfald, en negativ undersøgelse og et vellykket udfald én måned senere. Den oprindelige transfusion blev givet umiddelbart før forberedelse til BMT med cyclophosphamid i høj dosis og total bestråling af en knude, hvilket antyder, at de alloantistof-25 producerende lymfocytter fjernes, efterfulgt af forsvinden af forud dannet antistof.
Afsættes UKF mod CCI-resultaterne efter 1 time fra dette forsøg, påvises definitionen mellem positive og negative resultater, hvor der ikke er noget mellemliggende areal 30 hvor CCI er proportional med UKF.
(iv) Fejlklassificerede transfusionsepisoder
Af seks episoder, der fejlklassificeres ved immunoper-leundersøgelsen, er kun én (det tilfælde, der er forbundet med granulocyttransfusion) korrekt klassificeret ved hjælp 35 RAFT. Seks af de 11 episoder, der er fejlklassificeret ved hjælp af RAFT, er korrekt klassificeret ved hjælp af immun- DK 173838 B1 40 perleundersøgelsen. I 5 tilfælde gav begge undersøgelser misvisende resultater.
Ved den første episode, der ved immunoperleundersøg-else viser positiv/vellykket udfald (patient 1) er UKF 5,3 5 og CCI efter 1 time på 16.897. Blodpladeoptællingen efter 6 timer er faldet til under niveauet fra før transfusionen. Det andet tilfælde (patient 6) har en UKF på 253,7 (den anden højeste, der blev optegnet under forsøget) , og en CCI på 10.806 efter 1 time og en CCI på 1965 efter 16 timer. Når den samme 10 donor anvendes igen 4 uger senere er UKF 183 og CCI efter 8 timer 0. Begge patienter havde ikke-vellykkede udfald med andre donorer, der er associerede med en positiv immunoperle-undersøgelse.
De 4 tilfælde med undersøgelsen, der er negative/har 15 ikke-vellykket udfald, er alle associerede med potentiel ikke-alloantistof-relaterede grunde til dårlig overlevelse af blodplader. Den første (patient 2) er associeret med feber, og den opstod 5 dage før patienten blev modstandsdygtig over for alle donorer og blev udeladt fra forsøget (se 20 patient- og donorpopulation-afsnittet). De andre 3 tilfælde involverede patient nr. 1: det første opstod, da blodplader blev indgivet samtidig med en granulocyttransfusion i forbindelse med febril reaktion, og de andre to efter, at patienten har fået foretaget intubation til ARDS, men før han 25 blev modstandsdygtig over for alle donorer.
(v) Mulighed for at anvende opbevarede blodplader
De gennemsnitlige forhold mellem positiv kontrol/ne-gativ kontrol for begge blodpladedonorer ved hvert tidsinterval er fremvist i tabel VII. Resultaterne indikerer nogen 30 forringelse af den antigene integritet eller tilgængelighed mellem 1 og 5 dage hvorefter der ikke kan påvises nogen yderligere hovedforringelse gennem det længste undersøgte interval (60 dage) . Blodplader, der er opbevaret i suspension ved 4 °C, opretholdt den antigene integritet svagt bedre end 35 frosne blodplader, skønt forskellen ikke er tydelig. Skønt de her anvendte anvendte positive kontroller forblev tydeligt DK 173838 B1 41 positive under forsøget, er det tænkeligt at plasmaer med lavere titere af anti-HLA-antistof kan blive negative, når de undersøges mod opbevarede blodplader. Der er ikke noget signifikant tab af blodplader på grund af opbevaring under 5 forsøgsperioden.
Tabel VII
Resultater for immunoperleundersøgelse under anvendelse af blodplader, der er opbevaret nedfrosset i flydende nitrogen 10 og i suspension ved 4°C
Opbevarings- Opbevaringsdage måde 1 6 15 30 40 15 Blodpladedonor #1 4 °C 53,81 26,7 23,9 25,7 21,0 flydende N2 32'6 20,7 23,9 25,3 10,5
Blodpladedonor #2 20 4 °C 103,0 33,5 49,3 53,1 48,6 flydende N2 71,5 30,6 35,6 40,5 32,0
Data anført som gennemsnitlige forhold mellem positiv kontrol/negativ kontrol 25 H. Diskussion af resultaterne ved transfusionsforsøg Ved dette forsøg tilpasses immunoperleanalysen til karakterisering af antiblodplade-alloantistoffer mod klasse I HLA-antigener, og resultaterne blev anvendt til problemet 30 med blodpladekrydsafpasning. Resultaterne indikerer, at forsøget har tilstrækkelig forudsigende værdi til at berettige anvendelse i yderligere skala som et middel til at forudsige, hvorvidt en blodpladetransfusion bliver vellykket. Ideelt har eventuelle donorer blodplader opbevaret, når de indtræder 35 i en donorgruppe. Når der træffes en patient med et dårligt respons mod blodplader fra en vilkårlig donor, kan hans DK 173838 B1 42 eller hendes plasma undersøges mod et lille panel af normale blodplader, der er valgt at repræsentere de gængse HLA-anti-gener. Hvis undersøgelsen er negativ, kan det formodes, at der findes et andet problem end alloimmunisering mod HLA-5 antigener, og omkostninger i forbindelse med blodplader fra en enkelt donor er undgået. Hvis undersøgelsen er positiv, indikeres HLA-afpassede blodplader. I hoveddelen af tilfæl-dene, hvor disse ikke er tilgængelige, kan de bedste tilpasninger trækkes frem fra donorgruppen, og de opbevarede blod-10 plader undersøges, og de, der har en negativ undersøgelse, udvælges. Skønt de udførte opbevaringsforsøg kun strækker sig over 60 dage, antyder andre forsøg, at meget længere opbevaringsperioder er mulige.
En potentiel ulempe ved immunoperleundersøgelsen er 15 dens HLA-specificitet. Mange forfattere har antydet, at alloantistoffer mod blodpladespecifikke antigener er skyld i nogle procent mislykkede transfusioner, hvilket sædvanligvis er baseret på dårligt respons mod HLA-identiske blodplader og/eller mangel påviseligt lymfocytotoksisk antistof.
20 Imidlertid har det været vanskeligt at påvise alloant i stoffer mod blodpladespecifikke antistoffer afgørende her, og deres sande betydning forbliver uvis. Herman et al. anvendte Western blots til at iagttage 7 patienter, der er modstandsdygtige mod HLA-afpassede blodplader, og de var ude af stand 25 til at påvise antistof mod blodpladespecifikt antigen på glycoprotein Ilb/IIIa-molekylet. De konkluderede, at antistofferne mod de blodpladespecifikke antigener ikke i almindelighed er til stede. De her omhandlede resultater med kun 1/51 tilfælde af dårligt udfald af transfusionen, hvor RAGT 30 er positiv og immunoperleundersøgelsen negativ, synes at understøtte dette. Det synes mere sandsynligt, at ikke erkendte ikke-immunologiske faktorer er skyld i mange, hvis ikke alle disse tilfælde. For nærværende synes det imidlertid at være klogt at vurdere tilstedeværelsen af antistof 35 mod andre blodplade-associerede antigener ved hjælp af RAGT eller en lignende ikke-HLA-specifik undersøgelse i tilfælde, DK 173838 B1 43 hvor HLA-specifik immunoperleundersøgelsen er negativ over for dårlig overlevelse af blodplader.
Claims (13)
1. Fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af et blodpladecelleoverfladeantigen, kendetegnet ved, at 5 (a) der tilvejebringes en alikvot af blodplader, der skal bestemmes, hvor alle blodplader i denne alikvot bærer det overfladeantigen, der skal påvises, med et immunokompleks, der indeholder et antistof mod dette antigen, der er immu-noreageret med dette antigen; 10 (b) blodpladerne i denne alikvot lysebehandles til til vejebringelse af cellulært nedbrydningsmateriale, og når immunokomplekset er til stede i alikvotten, et solubiliseret immunokompleks; og (c) der udføres bestemmelse af tilstedeværelsen af dette 15 solubiliserede immunokompleks fastgjort til en fast faseunderstøtning .
2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter trinnene: (i) forud for trin (a) blanding af blodplader med et 2 0 antistof, der kan immunoreagere med et blodpladecelleoverfla- deantigen til dannelse af en blodplade-sensitiverende reaktionsblanding, og (ii) opretholdelse af den blodplade-sensitiverende reaktionsblanding i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til dan- 25 nelse af et immunkompleks indeholdende antigenet og antistoffet, hvorved der dannes blodplader, der kan anvendes i trin (a) .
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at antistofferne i immunokomplekset er autoanti- 30 stoffer.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendeteg net ved, at autoantistofferne er rettet mod blodpladegly-coprotein Ilb/IIIa-komplekset eller glycoprotein Ib.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendete g- 35 net ved, at blodpladerne er fra en første person, og antistofferne er alloantistoffer fra en anden person. DK 173838 B1
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at immunokompleksets antistoffer er rettet mod et hoved-hi stoforenelighedskompleksant igen.
7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendete g- 5 net ved, at hoved-histoforenelighedskompleksantigenet er et HLA-antigen.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at den yderligere omfatter: (i) adskillelse af det cellulære nedbrydningsmateriale 10 fra ethvert i trin (b) tilstedeværende solubiliseret im- munokompleks; (ii) fastgørelse af ethvert af det tilstedeværende fraskilte solubiliserede immunokompleks til en fast faseunderstøtning til dannelse af et til en fast fase fastgjort immunokompleks; 15 og (iii) efterfølgende bestemmelse af tilstedeværelse af immunokomplekset som et til en fast fase fastgjort immunokom-pleks.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendete g-20 net ved, at blodpladerne i trin (i) er blodplader fra en prospektiv donor, og at antistoffet er til stede i serum eller plasma fra en patient, hvilken fremgangsmåde tjener til bestemmelse af blodpladeforenelighed mellem en prospektiv donor og patient.
10. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg net ved, at antistoffet i trin (i) reagerer med en antigen epitop fælles for i det væsentlige hele gruppen af søgte celleoverfladeantigener, hvilken fremgangsmåde tjener til typebestemmelse af celler for tilstedeværelsen af en gruppe 30 celleoverfladeantigener.
11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at grupperne af celleoverfladeantigener er HLA-antigenerne.
13. Fremgangsmåde til bestemmelse af et blodplade-35 overfladeantigen-ahtistofkompleks i en prøve af blodplader, kendetegnet ved trinnene: DK 173838 B1 (a) prøven af blodplader lysebehandles til tilvejebringelse af et vandigt præparat, der indeholder solubiliseret blodpladeoverflade-antistofkompleks, (b) der dannes en opfangende reaktionsblanding ved at 5 blande dette vandige præparat med en fast understøtning, der er i stand til at immunoreagere med dette blodpladeoverflade-antigen-antistofkompleks, (c) denne opfangende reaktionsblanding opretholdes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at denne faste under- 10 støtning kan immunoreagere med ethvert af dette blodplade-overfladeantigen-antistofkompleks, der er til stede, til dannelse af et immunoreaktionsprodukt i fast fase, idet der ved opretholdelsen dannes opretholdt fast understøtning, (d) der dannes en mærkningsreaktionsblanding ved at blande 15 den opretholdte faste understøtning med et mærket antistofmolekyle, der er i stand til at immunoreagere med antigen-antistofkomplekset af immunoreaktionsproduktet i fast fase, (e) mærkningsreaktionsblandingen opretholdes i et tidspe-rum, der er tilstrækkeligt til, at dette mærkede antistof- 2. molekyle kan immunoreagere med ethvert immunoreakt ionsprodukt i fast fase, der er dannet i trin (c) , til dannelse af et mærket kompleks i fast fase, (f) der foretages bestemmelse af tilstedeværelsen af ethvert mærket kompleks i fast fase, der er dannet i trin 25 (e) , og derved bestemmelse af tilstedeværelsen af ethvert blodpladeoverfladeantigen-antistofkompleks i prøven af blodplader .
13. Fremgangsmåde til analyse af en prøve af blodplader for et blodpladeoverfladeantigen, kendetegnet 30 ved trinnene: (a) der dannes en blodpladesensitiverende reaktionsblanding ved at sammenblande en prøve af blodplader med et antistofmolekyle, der er i stand til at immunoreagere med et blodpladeoverfladeantigen, til dannelse af et blodpladeim-35 munokompleks, <b) denne sensitiverende reaktionsblanding opretholdes i DK 173838 B1 et tidsrum, der er tilstrækkeligt til dannelse af dette blod-pladeimmunokompleks, hvorved der dannes antistof-sensitive-rede blodplader, (c) disse sensitiverede blodplader lysebehandles til 5 tilvejebringelse af et vandigt præparat, hvilket præparat indeholder solubiliseret blodpladeimmunokompleks, når dette immunokompleks er dannet i trin (b), (d) der dannes en opfangende reaktionsblanding ved at sammenblande det vandige præparat med en fast understøtning, 10 der er i stand til at immunoreagere med dette solubiliserede blodpladeimmunokompleks, (e) denne opfangende reaktionsblanding opretholdes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at denne faste understøtning kan immunoreagere med ethvert af dette tilstedevæ- 15 rende solubiliserede blodpladeimmunokompleks, til dannelse af et immunoreaktionsprodukt i fast fase, hvor der ved denne opretholdelse derved dannes en opretholdt fast understøtning, (f) der dannes en mærkningsreaktionsblanding ved at blande denne opretholdte faste understøtning med et mærket antistof- 20 molekyle, der er i stand til at immunoreagere med dette blodpladeimmunokompleks på dette immunoreaktionsprodukt i fast fase, (g) denne mærkningsreaktionsblanding opretholdes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til, at det mærkede antistof- 25 molekyle kan immunoreagere med ethvert af dette immunoreak-tionsprodukt i fast fase, der er dannet i trin (e) , til dannelse af et mærket kompleks i fast fase, (h) der analyseres for tilstedeværelsen af ethvert mærket kompleks i fast fase, der er dannet i trin (g) , og derved 30 for tilstedeværelsen af ethvert blodpladeoverfladeantigen i denne prøve af blodplader.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US93612586 | 1986-12-01 | ||
| US06/936,125 US4810632A (en) | 1986-12-01 | 1986-12-01 | Cell surface antigen detection method |
| US12490587 | 1987-11-24 | ||
| US07/124,905 US5176998A (en) | 1986-12-01 | 1987-11-24 | Cell surface antigen detection method |
| US8703129 | 1987-11-25 | ||
| PCT/US1987/003129 WO1988004432A1 (en) | 1986-12-01 | 1987-11-25 | Cell surface antigen detection method |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK426588D0 DK426588D0 (da) | 1988-07-29 |
| DK426588A DK426588A (da) | 1988-07-29 |
| DK173838B1 true DK173838B1 (da) | 2001-12-10 |
Family
ID=26823073
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198804265A DK173838B1 (da) | 1986-12-01 | 1988-07-29 | Fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af et blodpladecelleoverfladeantigen |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5176998A (da) |
| EP (1) | EP0290595B1 (da) |
| JP (1) | JP2803824B2 (da) |
| AT (1) | ATE123341T1 (da) |
| AU (1) | AU594554B2 (da) |
| DE (1) | DE3751331T2 (da) |
| DK (1) | DK173838B1 (da) |
| FI (1) | FI95082C (da) |
| NO (1) | NO172910C (da) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5176998A (en) * | 1986-12-01 | 1993-01-05 | The Scripps Research Institute | Cell surface antigen detection method |
| US5525461A (en) * | 1991-11-01 | 1996-06-11 | T Cell Diagnostics, Inc. | Therapeutic and diagnostic methods using total leukocyte surface antigens |
| US5731425A (en) * | 1994-10-28 | 1998-03-24 | Eastman Kodak Company | Polypeptide surface marker for cells |
| US6984526B2 (en) | 1995-02-08 | 2006-01-10 | University Of South Florida | Spectrophotometric method for determining the viability of a sample containing platelets |
| US6330058B1 (en) | 1999-04-14 | 2001-12-11 | University Of South Florida | Spectrophotometric method and apparatus for blood typing |
| US6379903B1 (en) | 1999-10-08 | 2002-04-30 | Sigma-Aldrich Co. | Purification of recombinant proteins fused to multiple epitopes |
| AU2009322607B2 (en) | 2008-12-01 | 2015-05-14 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Methods and compositions for detection of complement fixing antibodies |
| WO2012070964A1 (ru) * | 2010-11-22 | 2012-05-31 | Farber Boris Slavinovich | Модифицированные олигопептиды с противораковыми свойствами и способ их получения |
| EP3435080A1 (en) | 2013-03-14 | 2019-01-30 | The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University | Methods of detecting donor-specific antibodies |
| US10527613B2 (en) | 2015-11-10 | 2020-01-07 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Biomarker detection methods and systems and kits for practicing same |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4342566A (en) * | 1980-02-22 | 1982-08-03 | Scripps Clinic & Research Foundation | Solid phase anti-C3 assay for detection of immune complexes |
| US4443427A (en) * | 1982-06-21 | 1984-04-17 | Sidney Farber Cancer Institute, Inc. | Monoclonal antibody |
| US4643971A (en) * | 1983-03-11 | 1987-02-17 | Sloan-Kettering Institute | Monoclonal antibodies to human bladder and ureter cancers and method |
| DE3484505D1 (de) * | 1983-12-19 | 1991-05-29 | Daiichi Pure Chemicals Co Ltd | Immuntest. |
| US4695538A (en) * | 1984-06-01 | 1987-09-22 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Human monoclonal antibodies to cell surface antigens |
| JPS6181798A (ja) * | 1984-07-23 | 1986-04-25 | ベクトン・デイツキンソン・アンド・カンパニ− | 細胞リセプタ−の回収 |
| US4670394A (en) * | 1984-11-16 | 1987-06-02 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Isolation and culture of adrenal medullary endothelial cells producing blood clotting factor VIII:C |
| US4810632A (en) * | 1986-12-01 | 1989-03-07 | Scripps Clinic And Research Foundation | Cell surface antigen detection method |
| US5176998A (en) * | 1986-12-01 | 1993-01-05 | The Scripps Research Institute | Cell surface antigen detection method |
-
1987
- 1987-11-24 US US07/124,905 patent/US5176998A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-25 EP EP88900625A patent/EP0290595B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-25 AT AT88900625T patent/ATE123341T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-25 AU AU10876/88A patent/AU594554B2/en not_active Expired
- 1987-11-25 JP JP63500784A patent/JP2803824B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-25 DE DE3751331T patent/DE3751331T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-07-29 NO NO883367A patent/NO172910C/no not_active IP Right Cessation
- 1988-07-29 DK DK198804265A patent/DK173838B1/da not_active IP Right Cessation
- 1988-07-29 FI FI883585A patent/FI95082C/fi not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-10-28 US US07/967,449 patent/US5336597A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5176998A (en) | 1993-01-05 |
| NO883367L (no) | 1988-07-29 |
| NO172910B (no) | 1993-06-14 |
| ATE123341T1 (de) | 1995-06-15 |
| FI883585A0 (fi) | 1988-07-29 |
| JPH01501571A (ja) | 1989-06-01 |
| FI95082C (fi) | 1995-12-11 |
| DK426588D0 (da) | 1988-07-29 |
| AU594554B2 (en) | 1990-03-08 |
| DE3751331D1 (de) | 1995-07-06 |
| DE3751331T2 (de) | 1996-02-01 |
| NO883367D0 (no) | 1988-07-29 |
| DK426588A (da) | 1988-07-29 |
| FI95082B (fi) | 1995-08-31 |
| NO172910C (no) | 1993-09-22 |
| FI883585A (fi) | 1988-07-29 |
| EP0290595A1 (en) | 1988-11-17 |
| US5336597A (en) | 1994-08-09 |
| EP0290595A4 (en) | 1990-12-19 |
| JP2803824B2 (ja) | 1998-09-24 |
| AU1087688A (en) | 1988-06-30 |
| EP0290595B1 (en) | 1995-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Smith et al. | C4d fixing, luminex binding antibodies—a new tool for prediction of graft failure after heart transplantation | |
| JP5807300B2 (ja) | 試料中のｃ反応性蛋白質の測定方法及び測定試薬 | |
| EP0512301B1 (en) | Method for detecting inflammation | |
| WO1988004432A1 (en) | Cell surface antigen detection method | |
| JPH06505332A (ja) | 総白血球表面抗原を用いた治療法及び診断法 | |
| DK173838B1 (da) | Fremgangsmåde til påvisning af tilstedeværelsen af et blodpladecelleoverfladeantigen | |
| WO1995032426A1 (en) | Improved evaluation of transplant acceptance | |
| DK174032B1 (da) | Sæt samt fremgangsmåde til immunometrisk dosering, der kan anvendes på hele celler | |
| BRPI0918233B1 (pt) | métodos de triagem para a lesão pulmonar aguda e doença do enxerto contra hospedeiro relacionada à transfusão ou transplante, kits e uso de polipeptídeos | |
| Kekomäki et al. | A new platelet alloantigen, Tua, on glycoprotein IIIa associated with neonatal alloimmune thrombocytopenia in two families | |
| Pandey et al. | Effects of different sensitization events on HLA alloimmunization in renal transplant cases; a retrospective observation in 1066 cases | |
| JPH03502401A (ja) | ヒト抗Ｒｈ（Ｄ）モノクローナム抗体 | |
| JPH01105160A (ja) | 異常応答リンパ球の検出方法並びにこれに用いる検出用試薬及びキット | |
| Osti et al. | Acute haemolysis by cold antibody during SARS-CoV-2 infection in a patient with Evans syndrome: a case report and literature review | |
| KR890002632B1 (ko) | Atl 바이러스 항체 측정용 시약의 제조방법 | |
| Inami et al. | Micro-hemagglutination tests for detection of native and single-strand DNA antibodies and circulating DNA antigen | |
| US10648980B2 (en) | IgG subtyping assay for identifying transplantable tissue samples | |
| JPH11502307A (ja) | 競合的結合アッセイ | |
| RU2817215C2 (ru) | Способ диагностики аллоиммунной тромбоцитопении новорожденных | |
| Rabellino et al. | Antigen heterogeneity of human B and T lymphocytes. | |
| Boisvert et al. | The detection of platelet antibodies using a modified platelet immunofluorescence test | |
| Vojvodić et al. | HLA antibody screening strategy in patients awaiting kidney transplantation | |
| Duursma | Neutrophil cytoplasmic antibodies: their clinical associations and an improved method for their detection. | |
| FR2573533A1 (fr) | Procede de detection ou de titration d'immunoglobulines dirigees contre un antigene particulier et dispositif pour la mise en oeuvre de ce procede. | |
| Katznelson et al. | AIMS OF CHAPTER |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| B1 | Patent granted (law 1993) | ||
| PUP | Patent expired |