KR20110052295A - 소결핵 피내검사용 피내진단액 및 이를 이용한 소결핵 진단방법 - Google Patents

소결핵 피내검사용 피내진단액 및 이를 이용한 소결핵 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 소결핵 피내검사용 피내진단액 및 이를 이용한 소결핵 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Esat6, HspX, PhoS, MPB70, MPB64, MPB83, Ag85 및 SahH 의 재조합단백질을 포함하는 소결핵 피내검사용 피내진단액에 관한 것이며, 또한 Esat6, HspX, PhoS, MPB70, MPB64, MPB83, Ag85 및 SahH 의 재조합단백질을 포함하는 소결핵 피내검사용 피내진단액을 이용한 인간을 제외한 포유동물의 소결핵의 피내진단방법에 관한 것이다.
본 발명은 재조합단백질 혼합체를 이용하여 특이단백질만을 함유하며 함량과 조성이 표준화된 소결핵 피내진단액을 인체감염의 위험성 없이 대량으로 용이하게 생산 가능토록 하여, 기존의 진단액을 이용하는 것보다 더욱 안전하고 표준화된 소결핵 검진을 하게 하며, 소결핵 진단의 정확성을 높일 수 있게 한다.
소결핵, 피내진단, 피피디(PPD), 재조합단백질, 감작 기니픽

Description

소결핵 피내검사용 피내진단액 및 이를 이용한 소결핵 진단방법{Intradermal diagnostic composition for Cattle tuberculosis intradermal test and diagnostic method using the same}
본 발명은 소결핵 피내검사용 피내진단액 및 이를 이용한 인간을 제외한 포유동물의 소결핵 진단방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 Esat6, HspX, PhoS, MPB70, MPB64, MPB83, Ag85 및 SahH 의 재조합단백질을 포함하는 소결핵 피내검사용 피내진단액에 관한 것이며, 또한 Esat6, HspX, PhoS, MPB70, MPB64, MPB83, Ag85 및 SahH 의 재조합단백질을 포함하는 소결핵 피내검사용 피내진단액을 이용한 소결핵의 피내진단방법에 관한 것이다.
소결핵 감염에 있어서, 면역반응 특성상 체액성 면역반응보다 세포성 면역반응을 측정하는 방법이 주요 진단방법으로 공인되고 있으며, 피내검사법은 세포성 면역반응을 측정하는 진단법 중 하나로서 전 세계적으로 소결핵 진단법으로 공인되어 있다(재검토를 위해 De la Rua-Domenech 일행, 2006). 소결핵균은 주로 호흡기 로 감염되어 호흡기계와 관련 림프절에 결핵 결절을 형성하며, 말기에는 기침, 호흡곤란, 쇠약, 발열 등의 임상증상을 보인다. 소결핵을 진단할 만한 특징적인 임상증상이 없기 때문에 임상증상만으로는 소결핵을 진단할 수 없으며, 더욱이 결핵 병리진행이 거의 없는 감염초기에는 임상증상만으로 소결핵을 진단하는 것은 불가능하다.
소결핵균은 세포벽이 다량의 지질로 구성되어있기 때문에 세대시간이 24시간으로 보통세균보다 길어 증식이 느리다. 체내 감염시에도 감염균량이 극히 적은 초기에는 항체생성의 체액성 면역반응을 일으키지 못한다. 따라서, 감염 초기에는 1차적인 면역반응인 세포성 면역반응이 주된 방어기전이며, 또한 세포성 면역반응이 진단마커로 활용된다. 체액성 면역반응, 즉 결핵 특이 항체를 측정하여 진단하는 방법이 여러 연구자들에 의해 시도되고 있으며, 그 결과 주요한 체액성 면역 특이항원과 조기진단에 활용할 수 있는 특이항원도 밝혀졌다. 그러나, 결핵균 감염에 대한 숙주 체내의 면역반응은 1차적으로 세포성 면역반응이 주된 면역반응이며, 이어서 2차적으로 체액성 면역반응이 뒤따르기 때문에, 체액성 면역반응 진단법은 1차 면역반응인 세포성 면역반응을 이용한 진단법보다 더 앞서 진단하기는 극히 어렵다. 따라서, 결핵 전염의 조기 차단을 위해 세포성 면역반응을 이용한 진단법이 결핵 진단에 가장 우수한 진단법이며, purified protein derivative(PPD) 피내검진법, 인터페론 감마 측정법 등의 현행 세포성 면역반응을 이용한 진단법의 문제점을 극복하는 것이 결핵진단효율을 근본적으로 향상시키는 방법이다.
한편, 전세계적으로 5천만 두 이상 감염이 되어있는 소결핵은 PPD 피내검진 법을 공인진단법으로 하고 있으며, 선진국에서는 소결핵 근절을 목표로 PPD 피내검진에서 양성으로 판정되면 살처분하여 결핵 전염을 근본적으로 차단하고 있다. 소결핵 피내진단액인 PPD는 결핵균을 세계 최초로 분리한 로버트 코흐(Robert Koch)가 결핵을 치료할 목적으로 개발하였던 old tuberculin(OT)이 결핵을 진단할 수 있다는 사실이 알려지면서 진단에 이용되어왔다. 이후, OT는 heat concentrated synthetic medium(HCSM), purified protein derivative(PPD)로 개량 발전해왔다(재검토를 위해 Landi, 1963; Lepper 일행, 1977).
현재 세계적으로 널리 쓰이고 있는 소결핵 PPD는 Mycobacterium bovis AN5를 종균주로 하여 생산되고 있으며, 이 균주는 영국의 소결핵가검물 분리균이다. 우선, PPD 생산을 위해 소결핵균을 대량배양해야 한다. 결핵균 대량 배양액으로부터 단백질을 trichloroacetic acid, ammonium sulfate 등 화학적인 방법으로 침전시키는데, 각국에서는 각기 고유의 생산방법으로 PPD를 생산하고 있다(재검토를 위해 Seibert와 Glenn, 1941; Landi와 Held, 1971). 한편, 국제 표준품은 세계보건기구(WHO)에서 인정한 영국 National Institute for Biological Standards and Control(NIBSC)에서 생산한 PPD이다. PPD 생산은 인수공통 전염병원체인 결핵균을 대량배양한다는 점에서 생산시 인체감염의 위험성이 크다(재검토를 위해 Thoen 일행, 2006). 또한, PPD는 배양기간과 단백질 침전방법에 따라 단백질의 함량과 조성이 달라질 수 있기 때문에 표준화된 제품을 생산하기 곤란하다(재검토를 위해 Landi, 1963). PPD의 최종생산과정은 인체에 유해한 에테르(Ether)를 사용하며, 최종 세척과정에서 환경오염을 유발할 수 있는 아세톤(Acetone)등 화학물질을 사용하 여 생산과정에서 인체위해성과 환경오염의 위험이 있다.
PPD는 결핵균이 배양시 분비되는 단백질과 가열살균시 세포가 파괴되면서 배출되는 단백질 등 결핵균 유래 단백질 복합체이다. 결핵균이 이론상 발현가능한 단백질은 약 4,000종인데, 이들 단백질들은 결핵균 이외의 mycobacteria , norcardia , corynebacterium 등에서 유래한 단백질들과 공통항원성을 갖는다. 특히, 환경내에 존재하는 Mycobacterium avium 등과는 75% 정도의 유사성을 가진다. 이러한 항원적 유사성 때문에 소결핵균 PPD는 환경마이코박테리아 등 비결핵성 마이코박테리아에 감염된 소가 결핵양성으로 잘못 진단되어 살처분 되는 경제적인 손실을 일으킬 수 있다. PPD는 생산과정이 복잡하고 특히, 단백질 침전방법에 따라 단백질 조성과 함량이 달라질 수 있기 때문에, 매번 생산시 단백질 조성과 함량에 미묘한 차이를 가져온다(재검토를 위해 Landi와 Held, 1979; Whipple 일행, 2001). 이러한 단백질 조성과 함량의 차이로 인하여 생산롯트별로 소결핵의 진단결과가 다르게 나타날 수 있는 문제점이 있다(재검토를 위해 Tameni 일행 1998). 소결핵은 국가적으로 근절프로그램을 시행하고 있는 질병이기 때문에 양성우에 대한 살처분과 보상금을 소유자에게 지불하고 있기 때문에 이러한 결핵진단의 오류는 막대한 경제적 피해를 가져올 수 있다.
소결핵에 대한 세포성 면역 특이항원은 여러 연구자들에 의해 개별 단백질 항원이 가지고 있는 인터페론 생산능 여부로 동정되었다(재검토를 위해 Covert 일행, 2001). 이렇게 동정된 세포성 면역 특이항원 즉, T세포 특이항원은 유전자 재조합단백질 생산기술을 이용하여 재조합단백질이 생산되었고, 단일 재조합단백질로 써 피내진단액으로서의 가치가 조사되어 왔다(재검토를 위해 Palmer와 Waters, 2006). 특히, MPB64는 단일 재조합단백질로서 특이항원을 포함하는 패취를 피부에 직접 부착하여 기니픽에서 피내진단항원으로서 가능성을 제시하기도 하였다(재검토를 위하여 Nakamura RM 일행, 1998과 2001). 이후 다른 T세포 특이항원들이 밝혀져서 피내진단법보다 더 정밀한 세포성 면역반응 진단법인 인터페론 감마 진단법에 적용하여 소결핵을 검사할 소에서 채취한 전혈을 자극하는 항원으로의 효용성이 조사되었다. 그 결과, 인터페론 검사에서 Esat6, CFP10 등의 결핵균 조기 분비항원들에 대한 조기진단 항원으로서의 가치를 많은 연구자들이 보고하여 왔다(재검토를 위해 Welsh 일행, 2002; Aagaard 일행 2006).
본 발명은 소결핵 피내검사용 진단액의 효율성을 높이고자 하며, 기존의 피내진단액을 대체할 수 있는 재조합단백질로 구성된 피내진단액을 개발하는 데 그 목적이 있으며, 궁극적으로 소결핵의 원활한 피내진단액 생산공급을 꾀함으로써 대량의 피내진단액을 신속하고 안전하게 생산하여 소결핵 조기진단 및 확산방지를 도모하고자 함이다.
상기의 과제를 해결하고자, 본 발명은 Esat6, HspX, PhoS, MPB70, MPB64, MPB83, Ag85 및 SahH 의 재조합단백질을 포함하는 소결핵 피내검사용 피내진단액을 제공한다. 또한 본 발명은 Esat6, HspX, PhoS, MPB70, MPB64, MPB83, Ag85 및 SahH 의 재조합단백질을 포함하는 소결핵 피내검사용 피내진단액을 이용한 인간을 제외한 포유동물의 소결핵 피내진단방법을 제공한다.
본 발명은 재조합단백질 혼합체를 이용하여 특이단백질만을 함유하며 함량과 조성이 표준화된 소결핵 피내진단액을 인체감염의 위험성 없이 대량으로 용이하게 생산 가능토록 하여, 기존의 진단액을 이용하는 것보다 더욱 안전하고 표준화된 소결핵 검진을 하게 하며, 소결핵 진단의 정확성을 높일 수 있게 할 것이다.
본 발명은 Esat6, HspX, PhoS, MPB70, MPB64, MPB83, Ag85 및 SahH 의 재조합단백질을 포함하는 소결핵 피내검사용 피내진단액을 제공한다.
본 발명은 또한 Esat6, HspX, PhoS, MPB70, MPB64, MPB83, Ag85 및 SahH 의 재조합단백질을 포함하는 소결핵 피내검사용 피내진단액을 이용한 인간을 제외한 포유동물의 소결핵의 피내진단방법을 제공한다.
또한 본 발명의 피내진단방법에서 상기 재조합단백질은 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)로부터 추출한 chromosomal DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 얻어진 것일 수 있다.
이하 본 발명의 소결핵 피내검사용 피내진단액 및 이를 이용한 인간을 제외한 포유동물의 소결핵의 피내진단방법에 대하여 보다 상세하게 설명한다.
소결핵은 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)가 호흡기와 소화기 계통에 감염되어 초기에는 임상증상이 거의 없으나, 말기에는 기침, 콧물, 설사, 변비, 쇠약 등의 임상증상을 보일 수 있는 만성소모성 질병이다. 마이코박테리움 보비스는 대부분의 온혈동물에서 병원성을 나타내고, 사람에게도 감염되어 결핵을 일으키므로, 동물에서의 결핵방제는 공중보건상 매우 중요하다. 또한, 사람결핵을 일으키는 마이코박테리움 튜버클로시스(Mycobacterium tuberculosis)의 유전자는 마이코박테리움 보비스와 99.5% 동일하다. 소결핵의 공중보건상 중요성으로 소결핵 공인진단법인 피내검사법으로 검사 후, 양성소는 매몰 또는 소각 등의 방법으로 살처분하는 강력한 근절프로그램을 전세계적으로 실시하여 근본적으로 사람감염을 차단하고 있다.
소결핵 공인진단법으로 쓰이고 있는 피내검사법은 소결핵 특이항원을 피내접종하여 국소적인 지연형 과민반응을 관찰하는 것이다. 피내접종된 소결핵 특이항원은 피내에 분포하고 있는 탐식세포인 랑게르한스 세포(Langerhans cell)에 탐식되어 세포 표면에 소결핵 특이항원 에피톱(epitope)들이 제시된다. 제시된 항원 에피톱에 특이적으로 반응할 수 있는 기억 T 세포와 결합하여 외래 항원에 대한 면역반응이 활발히 일어나게 된다. 일련의 면역반응중 인터페론(interferone), 인터류킨(interleukin), 티엔에프(TNF) 등의 염증성 싸이토카인(cytokine)이 분비되어 접종부위에 종창과 경결을 일으키게 된다.
소결핵의 원인균인 마이코박테리움 보비스는 느리게 증식하며, 면역세포에 탐식되어도 탐식세포 내에서 생존할 수 있기 때문에 그만큼 항체를 유발할 수 있는 항원량이 부족하기 때문에 감염시 체액성 면역보다는 세포성 면역이 주된 숙주의 방어기전이 된다. 따라서, 미약한 항체반응을 진단하기보다 세포성 면역반응을 측정하는 것이 소결핵 개체를 조기에 효율적으로 최대한 진단할 수 있는 방법이다. 따라서, 소결핵의 주요 면역반응인 세포성 면역반응을 이용한 피내진단법이 전세계적으로 공인진단법으로 사용되고 있다.
피내검사법은 소결핵균으로부터 추출한 단백질을 진단항원으로 하여 소의 미근부 추벽 또는 경측부의 피내에 접종하여 종창여부로 결핵감염여부를 판정하고 있 다. 진단항원으로 사용되는 피피디(PPD, purified protein derivative)는 마이코박테리움 보비스를 액체배지에 배양하고, 배양상층액으로부터 단백질을 침전하는 과정을 거쳐 생산된다. 이러한 피피디의 생산과정은 우선, 소결핵균을 배양하는 과정이 최소 8주 걸리므로, 진단액 원료 생산기간이 너무 길다는 단점이 있다. 이는 소결핵균 세포벽에 지질성분이 많이 함유되어 있는 특징 때문에 세대시간이 24시간정도로 다른 일반세균에 비해 아주 길다. 또한, 배양액 취급시 마이코박테리움 보비스가 실험자에게 감염될 위험성도 배제할 수 없다.
한편, 마이코박테리움 보비스를 배양하여 단백질을 침전시킨 현재의 피피디 피내진단액에는 마이코박테리움 에이비움(Mycobacterium avium)등의 환경 중에 존재하는 마이코박테리아, 노카디아(Norcardia) 등의 세균과 공통항원 때문에 환경마이코박테리아나 노카디아 등에 감염된 개체도 피내진단에서 양성반응 보일 수 있다. 한편, 배양상층액으로부터 생산된 피피디 피내진단액은 생산되는 롯트별 구성성분 차이 때문에 진단결과에 미묘한 차이를 나타낼 수 있다.
길고 복잡한 생산과정, 생산자 감염위험, 롯트별 생산품 차이, 비특이반응 등의 현행 피피디 단점을 극복하고자, 본 발명에서는 소결핵 특이항원에 대한 재조합단백질만으로 구성되어 비특이반응이 없는 재조합 PPD(Remix)를 생산하여 기존 진단액과 비교하여 생물학적 역가를 평가하였다. 본 발명이 실용화되면, 생산과정이 간편해지고, 소결핵균 인체감염의 위험이 줄어들며, 균일생산이 가능하기 때문에 표준화가 용이하고, 생산량도 손쉽게 대량화할 수 있어 진단액 적기공급이 가능하게 된다.
따라서, 본 발명의 재조합단백질로 구성된 피내진단액이 소결핵 진단에 사용된다면, 소결핵의 감염 및 확산을 조기에 차단하는 데 크게 기여할 것이다.
이하 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다. 다만, 이하의 실시예는 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 권리범위를 이에 한정하고자 하는 것은 아니다.
<실시예 1> 사용균주 및 배양조건
PPD-B(bovine PPD tuberculin) 생산을 위한 균주로는 마이크로박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) AN5(ATCC 35726)를 사용하였으며, PPD-A(avian PPD tuberculin)생산을 위한 균주로는 마이크로박테리움 에이비움(Mycobacterium avium) D4를 사용하였다. 동결건조되어 -70℃에 냉동보관되어 있던 균주를 Lowenstein-Jensen 사면배지(LJ, Lowenstein-Jensen medium base (Difco Co.) 37.2 g, D.W. 600 ㎖, whole eggs 1,000 ㎖)에 접종하여 37℃에서 8주간 배양한 균을 스파툴라 루프(spatula loop)로 소톤(Sauton) 배지(asparagine 4.8 g, citric acid 2.4 g, MgSO4 0.6 g, K2HPO4 0.6 g, ferric ammonium citrate 0.06 g, glycerine 72 ㎖, ZnSO4 0.0096 g, CuSO4 0.0012 g, ammonia water 2.70 ㎖, DW 1,200 ㎖, pH 7.2)를 10 ㎖씩 소분한 배양액의 액면에 균체를 부유시켜 37℃에서 8주간 배양하여 종균주로 사용하였다. 8주간 배양된 종균주를 200 ㎖ 소톤배지 배양병에 다시 37℃ 에서 8주간 배양하여 대량 배양액을 얻었다.
<실시예 2> PPD의 제조
상기 실시예 1에서 8주간 배양한 균액의 잡균오염 유무를 육안 및 항산성 염색으로 확인하여 오염여부를 확인한 후, 배양된 균액을 잘 흔들어 균막을 배지 중에 완전히 가라앉혀 진탕부유시키고 100℃ 증기압에서 3시간 동안 살균하였다. 살균된 것을 실온에서 냉각한 후, 60 mesh 동망과 여과지로 여과하여 투명한 황갈색의 튜버클린(tuberculin) 원액을 HCl이나 NaOH를 넣어 pH를 8.0으로 맞추고 40% TCA(trichloroacetic acid)용액을 튜버클린 원액 부피의 1/10되게 넣은 후, 5℃에서 3시간 동안 침전시켰다. 이 용액을 6,000rpm에서 30분간 원심분리한 후 상층액은 버리고 채취한 침전물을 1% TCA 용액, 아세톤(acetone), 에테르(ether)로 각각 두 번씩 세척한 후 37℃에서 하룻밤 두어 건조시켰다. 건조된 분말을 4℃에 보관하면서 PPD 튜버클린(tuberculin)으로 사용하였다.
<실시예 3> 유전자재조합 항원 생산
1. 유전자재조합 항원 생산을 위한 Template DNA 추출은 마이크로박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) AN5로부터 chromosomal DNA를 추출하였다. SahH와 MPB70, MPB83, MPB64, Esat6를 encoding하는 유전자는 M. bovis AN5 chromosomal DNA를 주형으로 하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하여 획득하였다. PCR을 수행하기 위해 다음의 oligonucleotide primer(서열번호 1 내지 10)는 유전자은 행(Accession No. M33916, M25386)에서 정보를 얻어 작성하였다(이하 표 1 참조).
[표 1] 본 실험에 사용된 프라이머(Oligonucleotide primers used in this study)
Abbreviation Sequence(5'-3') Direction
SahH F(서열번호 1) GGA TCC ATG ACC GGA AAT TTG GTG Forward
SahH R(서열번호 2) GTC GAC TTA GTA GCG GTA GTG GTC Reverse
MPB70 F(서열번호 3) GGA TCC GGC GAT CTG GTG GGC CCG Forward
MPB70 R (서열번호 4) GTC GAC TTA CGC CGG AGG CAT TAG Reverse
MPB83 F(서열번호 5) GGA TCC ATG ATC AAC GTT CAG GCC AAA Forward
MPB83 R(서열번호 6) CTC GAG TTA CTC CGG GGG CAT CAG Reverse
MPB64 F(서열번호 7) GGA TCC TAC CAG TCC GCG ATA CCG Forward
MPB64 R(서열번호 8) GTC GAC CTA GGC CAG CAT CGA GTC Reverse
Esat6 F(서열번호 9) GGA TCC ATG ACA GAG CAG CAG TGG Forward
Esat6 R(서열번호 10) GTC GAC TTA CGA ACC GCT ACC GCC CCA Reverse
2. SahH, MPB70, MPB83, MPB64, Esat6 항원을 제작하기 위한 유전자 증폭은 thermocycle(mycycler; BioRad)로 (94℃, 5분) × 1 cycle, (94℃, 1분, 45℃, 1분, 72℃, 1분) × 28 cycles, (94℃, 1분, 60℃, 1분, 72℃, 10분) × 1 cycle로 사용하였다. PCR반응이 완전히 끝난 후, 1.5%의 agarose gel을 만들어 PCR product를 전기영동하여 Target gene의 size를 확인하고 Geneclean Kit(MP biochemical, #1101-400, France)를 사용하여 증폭된 DNA를 추출하였다. 추출된 PCR amplicon DNA는 pDrive T-Vector(QIAGEN, #231124, USA)에 cloning하여 유전자 염기서열을 확인하였다(도 1 참조).
3. 대장균 발현 vector인 pGS vector(BIONOTE Inc., Korea)는 insert gene PCR시 사용된 primer의 linker site인 BamHI(NEB, #R0136S, USA), SalI(NEB, #R0138S, USA)으로 restriction하여 준비하였다. SahH, MPB70, MPB64, Esat6는 Vector와 동일한 restriction enzyme인 BamH과 Sal으로, MPB83은 BamH과 Sal과 ligation될 수 있는 Xho(NEB #R0146S, USA)으로 절단하고 agarose gel에 전기 영동하여 Geneclean Kit(Bio 101)를 이용해 추출하여 사용하였다.
준비된 vector와 insert는 T4 DNA ligase(Roche, 10481220001, Germany)를 이용해 16℃ overnight ligation시키고 이 ligate를 competent cell (Top10F')에 형질전환 시켰다. 형질전환은 heat-shock방법을 이용했다. Transformation은 -70℃에 보관된 competent cell을 꺼내 ice위에서 해동시킨 후 ligate 5 ㎕를 넣고 약 3초간 조심스럽게 혼합한 후 얼음에서 10분간 정치시켰다. 반응물이 혼합된 competent cell의 tube를 42℃의 항온수조에 90초간 정치시켜 heat shock을 주고 즉시 얼음에 넣어 주었다. 이에 항생제가 첨가되지 않은 LB액체 배지를 1 ㎖ 넣어주어 37℃, 1시간 incubation을 시킨 후, selection marker로 항생제 암피실린이 포함된 LB agar plate에 100 ㎕의 균액을 도말하고 37℃조건으로 overnight 배양하였다.
LB agar plate에 자란 colony를 액체 LB 배지에 접종하여 cell이 자랐을 때 Wizard DNA miniprep Kit(Promega, #A1460, USA)를 이용해서 DNA를 추출하고 추출한 DNA를 SahH, MPB70, MPB64, Esat6은 BamHI과 SalI으로, MPB83은 BamH과 Hind로 절단하고 이를 전기 영동하여 vector에 각 항원유전자인 insert가 cloning 되었는지를 확인하였다. SahH, MPB70, MPB64, Esat6, MPB83 유전자가 ligation된 것이 확 인된 plasmid를 대장균 발현용 균주인 BL21에 형질 전환시켜서 SahH, MPB70, MPB64, Esat6, MPB83의 재조합 단백질을 발현하는 대장균을 획득하였다.
유전자 재조합된 SahH, MPB70, MPB64, Esat6, MPB83 항원을 발현하는 대장균 균주를 삼각 플라스크에 넣어 18시간 이상 진탕배양하였다. 배양된 균주를 발효기에 접종하여 37℃에서 약 2시간 배양하고 균주가 증식하여 600 ㎚에서 흡광도 값이 약 0.6~0.8이 될 때까지 배양하였다. 균주가 흡광도 0.6~0.8 내외로 증식한 것을 확인한 후 IPTG(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)를 2.5 mM 되도록 첨가하여 추가로 약 5시간을 배양한 후, 균 배양액을 회수하여 원심방법으로 균체를 회수하여 SDS-PAGE과 Western blot을 수행하여 발현된 유전자재조합 항원을 확인하였다(도 2 참조).
4. 유전자 재조합 SahH, MPB70, MPB83 항원을 발현하는 대장균 균주를 배양하여 회수한 균체를 초음파 파쇄기(VCX750; Sonics&materials)로 처리하여 파쇄하고 8,000rpm, 20분, 4℃로 원심분리(VS24SMTi; Vision Science)하여 침전을 회수하였다. 항원이 함유된 침전을 6M guanidine용액으로 용해하였다. 용해된 항원은 DEAE-sepharose gel을 이용하여 Ion exchange chromatography법으로 항원을 정제하였다. 즉, 용해된 Inclusion body용액을 6M guanidine용액으로 평형된 gel에 반응시키고 NaCl gradient를 실시하여 각 분획들을 SDS-PAGE 방법으로 분석하여 유전자 재조합 SahH, MPB70, MPB83, Esat6, MPB64 항원이 함유된 fraction만을 선별하였다. HspX, PhoS, Ag85 재조합단백질도 상기와 같은 방법으로 생산하였다.
<실시예 5> 기니픽(guinea pig) 감작
M. bovis AN5와 M. avium D4 균주를 배양한 후, 가열처리에 의해 살균한 다음, 균을 제거하여 37℃에서 건조시켰다. 건조된 균체의 중량을 측정하여 최종농도가 10 mg/㎖ 이 되게 incomplete Freund's adjuvant (IFA)와 혼합하였다. IFA와 혼합된 균체를 400 g의 건강한 기니픽의 양쪽 후지 대퇴부 근육내에 0.5 ml씩 접종하였다. 균체 접종 6주 후에 재조합단백질과 PPD에 대한 피내진단액 역가시험을 실시하였다.
<실시예 6> 재조합단백질과 PPD의 역가 비교
1. 감작 6주째에 기니픽의 배부 털을 제거하고 한쪽에는 재조합단백질을 다른 한쪽에는 PPD를 접종하였다. PPD와 재조합단백질은 Tween80이 함유된 희석액 (Na2HPO4·H2O 7.6 g, KH2PO4 1.45 g, NaCl 4.8 g, D.W. to 1,000 ml, 1% Tween80 0.5 ㎖)으로 부유시켜 접종하였다. 희석액 재조합단백질의 농도는 1 mg/㎖로 맞춘 것을 원액으로 1,000배 희석하여 기니픽 배부의 피내접종부위에 0.1 ug/0.1 ㎖ 씩 접종하였다. PPD도 재조합단백질과 같은 농도와 양으로 접종하였다. 접종 후 24시간 후에 피내접종부위에서 발적된 부위의 장경과 단경을 버어니아 캘리퍼스로 측정한 후 평균을 계산하여 피내반응 직경(mm)으로 하였다.
단일 재조합단백질로서 Esat6, HspX, PhoS와 PPD-B 피내반응 직경을 비교한 결과, 모두 유의한 차이를 보였다(도 3 참조, p<0.01). 그러나, Esat6, HspX, PhoS, MPB70, MPB64, MPB83, Ag85 및 SahH 의 8종의 재조합단백질 혼합체와 PPD-B는 동등한 반응을 보였다(도 3 참조). Esat6, HspX, PhoS의 피내반응 평균직경은 각각 2.3 ㎜, 1.2 ㎜, 1.6 ㎜ 이었으며, 이때 PPD-B의 피내반응 평균직경은 각각 16.1㎜, 16.7 ㎜, 15.3 ㎜이었다(도 3 참조).
2. 대표적인 환경마이코박테리아인 Mycobacterium avium에서 재조합단백질 혼합체의 비특이반응을 조사하기 위하여 M. avium으로 감작시킨 기니픽에서 역가를 PPD-B와 PPD-A와 비교하였다. 그 결과, 재조합단백질 혼합체(Remix)는 PPD-B와 마찬가지로 PPD-A와 유의성 있는 차이를 보였다(도 4 참조, p<0.01). Remix와 PPD-A의 피내반응 평균직경은 각각 2.6 ㎜과 14.9 ㎜이었으며, PPD-B와 PPD-A의 경우는 1.5 ㎜와 15.1 ㎜이었다(도 4 참조).
본 발명의 피내진단액은 재조합단백질을 이용한 소결핵 피내검사용 피내진단액으로서, 기존의 방법보다 더욱 쉽고 경제적으로 소의 결핵을 검출하는 방법을 제공함으로써 우리나라의 축산업의 발전에 이바지할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 균주 마이코박테리움 보비스(M. bovis) AN5로부터 추출된 chromosomal DNA을 이용하여 PCR 증폭시킨 SahH, MPB70, MPB83, MPB64 및 Esat6의 재조합생성물을 나타내며, 상기 PCR 증폭된 생성물을 1.5% agarose gel을 이용하여 전기영동하고, 이를 ethidium bromide로 염색한 것을 나타낸 것이다.
도 2는 SDS-PAGE와 Western blotting을 이용하여 SahH, MPB70, MPB83, Esat6 및 MPB64 세포발현 분석결과를 나타낸 것이다.
도 3은 소결핵균 감작 기니픽에서 재조합단백질 진단액과 기존 진단액의 피내반응 결과를 보여준다(Mycobacterium bovis AN5로 감작시킨 기니픽의 피내접종 결과로, PPD-B는 소결핵균 PPD(정제단백질, purified protein derivative); Esat6, HspX 및 PhoS는 재조합단백질; 및 Remix는 재조합단백질 복합체;를 나타낸다.).
도 4는 조결핵균 감작 기니픽에서 재조합단백질 진단액과 기존 진단액의 피내반응(Mycobacterium avium D4로 감작시킨 기니픽의 피내접종 결과로, PPD-B는 소결핵균 PPD; PPD-A는 조결핵균 PPD; 및 Remix는 재조합단백질 복합체;를 나타낸다.)결과를 보여준다.
<110> National Veterinary Reseach and Quarantine service <120> Intradermal diagnostic composition for Cattle tuberculosis intradermal test and diagnostic method using the same <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a forward primer for PCR of SahH <400> 1 ggatccatga ccggaaattt ggtg 24 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a reverse primer for PCR of SahH <400> 2 gtcgacttag tagcggtagt ggtc 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a forward primer for PCR of MPB70 <400> 3 ggatccggcg atctggtggg cccg 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a reverse primer for PCR of MPB70 <400> 4 gtcgacttac gccggaggca ttag 24 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a forward primer for PCR of MPB83 <400> 5 ggatccatga tcaacgttca ggccaaa 27 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a reverse primer for PCR of MPB83 <400> 6 ctcgagttac tccgggggca tcag 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a forward primer for PCR of MPB64 <400> 7 ggatcctacc agtccgcgat accg 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a reverse primer for PCR of MPB64 <400> 8 gtcgacctag gccagcatcg agtc 24 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a forward primer for PCR of Esat6 <400> 9 ggatccatga cagagcagca gtgg 24 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a reverse primer for PCR of Esat6 <400> 10 gtcgacttac gaaccgctac cgcccca 27

Claims (3)

  1. Esat6, HspX, PhoS, MPB70, MPB64, MPB83, Ag85 및 SahH 의 재조합단백질을 포함하는 소결핵 피내검사용 피내진단액.
  2. Esat6, HspX, PhoS, MPB70, MPB64, MPB83, Ag85 및 SahH 의 재조합단백질을 포함하는 소결핵 피내검사용 피내진단액을 이용한 인간을 제외한 포유동물의 소결핵의 피내진단방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 재조합단백질은 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis)로부터 추출한 chromosomal DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하여 얻어진 것임을 특징으로 하는 소결핵 피내검사용 피내진단액을 이용한 인간을 제외한 포유동물의 소결핵의 피내진단방법.
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KR20200134683A (ko) * 2019-05-23 2020-12-02 주식회사 중앙백신연구소 소결핵 진단용 감작 항원이 코팅된 반응용기 및 이의 용도

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