EA014065B1 - Средство, обладающее свойством формировать клеточный иммунитет против mycobacterium tuberculosis h37 rv, способ получения его (варианты), рекомбинантный штамм и средство для диагностики туберкулеза - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области биофармакологии, препаративной биохимии, медицине и касается создания средства на основе туберкулезного комплекса, продуцируемого микроорганизмом, которое может найти применение в профилактике, лечении и диагностике туберкулеза. Безопасный для человека, животных и окружающей среды рекомбинантный штамм 2-9XL Acinetobacter johnsonii в составе своей хромосомы содержит фрагмент(ы) хромосомной ДНК М. tuberculosis H37 Rv, при помощи которого одновременно синтезируются несколько белков, формирующих во внешней мембране и капсульном веществе бактерии - стабильный видоспецифический туберкулезный гликопротеиновый комплекс. Простота работы с рекомбинантным штаммом 2-9XL, использование стандартных сред, стабильность синтеза видоспецифического туберкулезного комплекса, экономичная безопасная технология выделения и очистки туберкулезного комплекса делают данный микроорганизм перспективным продуцентом средства, обладающего свойством формировать Т- и В-клеточный иммунитет против возбудителя М. tuberculosis.

Description

Изобретение относится к области биофармакологии, препаративной биохимии, медицине и касается создания средства на основе туберкулезного комплекса, продуцируемого микроорганизмом, которое может найти применение в лечении и диагностике туберкулеза.

Важным звеном в решении проблемы туберкулеза является создание биологических вакцин и разработка методов быстрой и недорогой диагностики. Очевидно, что необходимо идентифицировать в возбудителе туберкулеза такие белки и формируемые ими комплексы, которые отвечали бы самым современным требованиям для достижения этих целей. У биологических вакцин основным критерием является безопасность для человека, наряду с высокой эффективностью, у диагностических препаратов - чувствительность и специфичность. Главными направлениями решения поставленной задачи являются: а) клонирование генов микобактерий в безопасном реципиенте и изучение свойств синтезируемых туберкулезных белков, б) выделение из микобактерий белков и их комплексов с последующей характеристикой свойств.

В литературе описана возможность создания геномной библиотеки М. 1иЬегси1о818 Н37 На и передачи фрагментов хромосомной ДНК возбудителя туберкулеза в реципиентные бактерии Е. сой ХЬ1-В1ие. Показано, что с определенного фрагмента хромосомной ДНК М. 1иЬегси1о818 Н37 На, который состоит из 1535 пар оснований и находится в составе плазмидного вектора ρΖχ7, возможен синтез туберкулезного белка с приблизительной массой 52,0 кДа. Этот белок локализуется на внешней мембране Е. сой ХЕ1-В1ие, наделяет рекомбинантный штамм возможностью проникать внутрь эукариотических клеток НеЬа и размножаться в них, что характерно для патогенных микобактерий. Однако авторами не указывается, что данный белок является индивидуальным (видоспецифичным) и может быть использован для диагностики возбудителя туберкулеза. Наоборот, аминокислотная последовательность изученного белка имеет гомологию как с патогенными микроорганизмами (ЫЧепа топосуЮЖ. §Ыде11а, 1ег81ша р8еибо1иЬегси1о818), так и с рядом белков человека, например β-адаптином (1).

Из фильтратов культуры М. 1иЬегси1о818 выделен и охарактеризован секретируемый белок МРТ63, имеющий молекулярную массу 18,0 кДа. Анализ нуклеотидной последовательности тр+63 гена показал, что он имеет открытую рамку считывания, кодирующую белок из 159 аминокислот и состоящую из 29 аминокислот сигнального пептида и 130 аминокислот зрелого МРТ63 белка. Рекомбинантный МРТ63 белок из клеток Е. сой и очищенный из культуральных фильтратов М. 1иЬегси1о818 были неразличимы в серологических реакциях и оказывали сильное воздействие на гуморальный иммунитет морских свинок, инфицированных вирулентным штаммом М. 1иЬегси1о818. Предполагалось использовать этот белок в качестве специфического реагента для диагностики кожного тестирования при заболевании туберкулезом, однако до настоящего времени этот белок и комплекс белка с сигнальным пептидом не нашли широкого применения (2).

Известно также описание и характеристика 4 главных секретируемых внеклеточных белков М. 1иЬегси1о818, выделенных из непатогенных быстро растущих микобактерий, которые обладают ферментативной активностью и присутствуют также в патогенных штаммах. Эти белки предполагается использовать для конструирования биологических вакцин, так как они индуцируют защитный иммунитет, однако до настоящего времени они не получили признания (3).

Таким образом, к настоящему времени не создан генно-инженерный микроорганизм, который мог бы синтезировать туберкулезные видоспецифические белки или их комплексы, пригодные для использования в диагностических целях или являться основой для создания биологической вакцины. Белки, выделяемые из патогенного штамма М. 1иЬегси1о818 или не патогенных микобактерий, также до настоящего времени не позволяют создать на их основе высокоспецифичные и чувствительные диагностические препараты или сконструировать биологические вакцины.

Задача изобретения заключается в получении генно-инженерным и микробиологическим способом рекомбинантного штамма 2-9ХЙ Асше1оЬас1ег рйпзопи - продуцента специфического туберкулезного комплекса М. 1иЬегси1о818 Н37 Ην, который может быть основой биологической вакцины против возбудителя туберкулеза и диагностикума для выявления больных туберкулезом людей с самыми разными формами заболевания и в различных стадиях болезни.

Для решения поставленной задачи предложен рекомбинантный штамм 2-9ХБ Асше1оЬас1ег ]ойпзоии, полученный генно-инженерным способом с последующей селекцией микробиологическим способом, являющийся продуцентом видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса (ТБ-антигена), который локализован на внешней мембране и в капсульном веществе бактерии и при выделении может быть использован как основа для получения биологической вакцины, диагностических и лекарственных средств.

Технический результат - получение высокоспецифичных и чувствительных препаратов.

Для решения поставленной задачи предложена группа изобретений, объединенных общим изобретательским замыслом.

Заявлено изобретение, представляющее собой средство, обладающее свойством формировать клеточный иммунитет против М. 1иЬегси1о818 Н37 Ην. Средство содержит видоспецифический гликопротеиновый туберкулезный комплекс М. 1иЬегси1о818 Н37 Ην (ТБ-антиген).

Кроме того, заявлены варианты способов получения видоспецифического гликопротеинового ту

- 1 014065 беркулезного комплекса М. 1иЬегси1о818 Н37 Κν (ТБ-антиген), а также рекомбинантный штамм 2-9ХБ Асте1оЬас1ег)о11п5опн УКРМ-9312 - продуцент видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса М. 1иЬегси1о818 Н37 Κν (ТБ-антигена) и средство для диагностики туберкулеза, содержащее вышеуказанный видоспецифический гликопротеиновый туберкулезный комплекс.

2-9ХБ АсшеЮЬасЮг]оНп5опй является генно-инженерным штаммом, полученным путем передачи в бактерии Κ-формы Р. 1и1агеп818 в составе векторной плазмиды рКТ двух фрагментов хромосомной ДНК М. 1нЬегси1о515 Н37 Κν и последующей селекции микробиологическим способом.

До настоящего времени при клонировании генов возбудителя туберкулеза (ТБ) в составе векторных плазмид использовали бактерий-хозяев, которые могли синтезировать только единичные белки ТБ. Выделение и изучение генно-инженерных белков ТБ (как и природных белков возбудителя туберкулеза) не привели к желаемому результату - созданию биологических вакцин, лекарственных препаратов, высокоспецифичных и чувствительных диагностикумов. Поэтому в мире продолжаются поиски новых белков микобактерий, с помощью которых возможно решение поставленных задач.

Вероятно, данное направление может быть ошибочным, так как видоспецифичность возбудителя туберкулеза формируется на уровне комплекса из нескольких белков (не менее трех), часть из которых должна быть гликозилирована, то есть содержать полисахаридную часть.

Показано, что при передаче фрагментов ДНК М. 1нЬегси1о515 Н37 Κν в составе векторной плазмиды рКТ в реципиент Κ-форму Р. Цйагещй и последующей селекции трансформанта определенным микробиологическим способом перенесенные фрагменты (фрагмент) встраиваются в хромосомную ДНК бактерии-реципиента и вызывают синтез туберкулезного полипептида. Первоначально этот полипептид формирует в бактерии-хозяине специфический рекомбинантный туляремийно-туберкулезный комплекс, связываясь с туляремийными белками, имеющими более высокую молекулярную массу. Однако данная конструкция, вероятно, для бактерии-хозяина неудобна и при дальнейшей селекции рекомбинантного штамма начинается синтез ТБ-белков более высокой молекулярной массы, которые замещают туляремийные.

При такой серьезной реконструкции в бактерии происходят не только изменения биохимических и фенотипических свойств рекомбинантного микроорганизма (по ряду свойств он становится похож на туберкулезные микобактерии), но меняется также и структура ДНК бактерии.

Заключение о видовой принадлежности штамма 9ха (2-9ХБ) с помощью анализа 168 РНК получено в ВКПМ ФГУП ГосНИИГенетика.

Анализ последовательностей 168 рРНК показал, что исследуемый штамм, заявленный как 9ха (2-9ХЬ), принадлежит к виду бактерий АсшеЮЬасЮг рйпзопй, причем со штаммом АсшеЮЬасЮг )оНп8опн 81гаш 42 гомология составляет 99%.

Основные свойства штамма 2-9ХЬ Асше1оЬас1ег )оНп8опй - суперпродуцента рекомбинантного туберкулезного антигена.

Культурально-морфологические свойства

При световой микроскопии (фиг. 1, 2. Световая микроскопия бактерий 2-9ХЬ Асте1оЬас1ег )о11п8опн. Окраска по Граму (набор красителей фирмы 8егуа). Культура 2-9ХЬ АсшеЮЬасЮг )оНп8опй выращена на туляремийной среде (РТ-агар с 1% глюкозой и добавками, рН 6,6) в течение трех суток при +32°С. А-Ув. 100Х3...; В-100Х9,3Х... (микроскоп Биомед-2, Россия). На представленных чертежах хорошо видно, что рекомбинантные бактерии 2-9ХЬ устойчивы к обесцвечиванию и склонны к агрегации (склеиванию). Капсула бактерий окрашивается сафранином в красный цвет) бактерии представляют собой неподвижные полиморфные мелкие кокковидные и палочковидные клетки размерами 0,4-1,0 мкм. При окраске по Граму бактерии устойчивы к обесцвечиванию, что производит впечатление грамположительного окрашивания. Образуют разнообразные по размерам и форме скопления клеток, что указывает на их высокую степень агрегации (склеивания). Агрегация бактерий связана с образованием специфической капсулы, которая хорошо прокрашивается сафранином. При утрате рекомбинантного туберкулезного антигена бактерии становятся истинно грамотрицательными.

Штамм 2-9ХЬ аэроб растет на простых и богатых средах (ауксотроф) при +32°С, однако может расти в интервале от +28 до +37°С. При росте бактерий на простых средах культура прекращает синтез рекомбинантного туберкулезного антигена. Необходимым фактором роста 2-9ХЬ является цистеин. Для максимального синтеза специфической капсулы, содержащей рекомбинантный туберкулезный антиген, предпочтительны богатые среды с витаминными и другими добавками.

В качестве стимулятора роста бактерий и формирования специфической капсулы возможно добавление в питательную среду 1% суспензии автоклавированных бактерий 2-9ХЬ и/или 10% автоклавированного капсульного вещества. Наиболее удобны для выращивания рекомбинантного штамма 2-9ХЬ питательные среды, используемые для выращивания туляремии, чумы, бруцеллеза и т.д. Посев культуры на питательные среды выдерживают в термостате от двух до семи суток. При росте бактерий 2-9ХЬ появляется характерный специфический нераздражающий запах. Штамм 2-9ХЬ плохо растет на жидких питательных средах и быстро теряет способность продуцировать рекомбинантный туберкулезный антиген.

На плотных питательных средах бактерии 2-9ХБ образуют колонии серо-белого цвета с желтоватым отливом. При титровании культуры до отдельных изолированных колоний возможна задержка роста

- 2 014065 до двух суток. По мере роста размеры колоний могут достигать диаметра 5-7 мм. Если чашки с посевом выдержать 2-3 суток в холодильнике (+4°С), колонии приобретают преимущественно желто-серую окраску. Колонии выпуклые с неровными краями, неблестящие, непрозрачные, при взятии петлей консистенция колоний плотная, легко снимается с поверхности питательного агара. При титровании культуры 2-9ХЬ на плотных питательных средах невозможно приготовить стандартную взвесь из-за высокой способности клеток к склеиванию (спонтанная агглютинация), поэтому титр бактерий не соответствует стандартному разведению (фиг. 3-5. Культурально-морфологические свойства 2-9ХЬ Лсшс1оЬас1сг )ο1ιηδοηΐΐ. Изолированные колонии рекомбинантного штамма 2-9ХЬ Лсшс1оЬас1сг)ο1ιη5οηίί. выросшие на ЕТагаре с цистеином и 1% глюкозой, рН 6,6 в течение трех суток при +32°С. Хранение в холодильнике (4°С) в течение пяти суток. Фиг. 3 - обычный фон; фиг. 4, 5 - белый фон; фиг. 5 - увеличенный фрагмент чашки Петри).

Стабильность популяции штамма 2-9ХЬ

При последовательных пересевах на плотных питательных средах, выращивании при различных температурных режимах, после хранения в лиофильно высушенном состоянии, ухудшении питательных свойств среды для выращивания и других неблагоприятных условиях, штамм 2-9ХЬ становится нестабильным и диссоциирует в другие формы. Диссоциация наиболее заметна после длительного выращивания изолированных колоний (фиг. 6-11). Диссоциация культуры 2-9ХЬ Асшс1оЬас1сг]ο1ιη5οηίί по культурально-морфологическим признакам.

Чашка Петри с диссоциациированной культурой 2-9ХЬ. Рост колоний различной морфологии при титровании культуры из лиофильно высушенного состояния. ЕТ-агар с 1% глюкозой, цистеином, рН 6,6. Время инкубации при +32°С 10 суток, хранение в холодильнике (+4°С).

Фиг. 6 - чашка Петри сфотографирована на белом фоне; фиг. 7 - чашка Петри сфотографирована на сером фоне.

Фиг. 8-11 - увеличенные фрагменты чашки Петри с колониями 2-9ХЬ различной морфологии.

Фиг. 8 (1) - крупная круглая белая непрозрачная плоская с выпуклым центром и ровным краем блестящая колония, легко снимется с агара петлей.

Фиг. 8 (2) - маленькая круглая серо-желтая непрозрачная выпуклая с ровным краем не блестящая колония, легко снимается петлей с агара.

Фиг. 9 - средняя круглая серо-желто-белая непрозрачная с выпуклым хорошо обозначенным центром и выраженным валиком по ровному краю не блестящая колония, легко снимается петлей с агара.

Фиг. 10 - средняя некруглая желтая непрозрачная с выраженным выпуклым центром неровной поверхностью и краем не блестящая колония, легко снимается петлей с агара.

Фиг. 11 - крупная некруглая желто-серая непрозрачная с выраженным выпуклым центром неровной поверхностью и краем неблестящая колония, легко снимается петлей с агара.

Биохимические свойства штамма 2-9ХБ

Бактерии при росте на плотных питательных средах расщепляют белки с выделением специфического не раздражающего запаха. При росте на богатых питательных средах способны синтезировать рекомбинантный туберкулезный антиген. Оксидазоположительные и каталазоотрицательные. Биохимические свойства рекомбинантного штамма 2-9ХБ Асшс1оЬас1сг)ο1ιη5οηίί до конца не изучены.

Иммунохимические свойства

Бактерии 2-9ХБ обладают очень высокой адгезивностью (способностью склеиваться) (см. фиг. 1, 2), что не позволяет проверить их агглютинабельность в реакции агглютинации.

В реакциях иммунодиффузии (РИД) и иммуноэлектрофореза с экспериментальными сыворотками, полученными на ультразвуковые дезинтеграты микобактерий вирулентного штамма туберкулеза М. 1иЬсгспШб Н37 Βν, антигены рекомбинантных бактерий 2-9ХБ не формируют линий преципитации. Вероятно, это связано с тем, что антитела на рекомбинантный ТБ-антиген возникают только в процессе развития инфекции в организме человека или животных и их титр не бывает большим. В случае выращивания микобактерий на питательных средах и последующей инактивации их ацетоном (или другими жесткими бактерицидными препаратами) этот антиген разрушается и поэтому на него нельзя получить специфические антитела.

В иммуноферментном анализе (ИФА) ТБ-антиген в ультразвуковых дезинтегратах бактерий и в очищенном виде взаимодействует с антителами сывороток крови больных туберкулезом людей и не взаимодействует с антителами в сыворотках крови здоровых людей. В иммуноблотинге ТБ-антиген не взаимодействует с антителами больных туберкулезом, так как не переносится на нитроцеллюлозную мембрану.

Отношение к фагам данного вида

Для рекомбинантного штамма 2-9ХБ АсшеЮЬаЛег )ο1ιη5οηίί до настоящего времени собственные фаги не обнаружены.

Генетические особенности

Штамм 2-9ХБ АсшеЮЬасЮг )ο1ιη5οηίί в составе хромосомной ДНК содержит как минимум одну вставку фрагмента хромосомной ДНК М. ФЬегси^кщ Н37 Βν, но возможны и две вставки.

- 3 014065

Продуктивность

Рекомбинантный штамм 2-9ХБ является продуцентом туберкулезного антигена (ТБ-антигена) гликопротеиновой природы. Белки, синтезирующиеся с фрагмента хромосомной ДНК М. 1иЬегси1ок1к Н37 Κν, формируют на внешней мембране бактерии 2-9ХБ и в ее капсульном веществе видоспецифический гликопротеиновый комплекс (фиг. 12-14).

При получении ультразвуковых дезинтегратов бактерий (УЗД) этот комплекс разбивается и присутствует в виде нескольких белков. При концентрировании УЗД трихлоруксусной кислотой белки ТБ-антигена собираются в специфический рекомбинантный туберкулезный комплекс. При щадящем выделении рекомбинантного ТБ-антигена из бактерий 2-9ХБ его молекулярная масса в денатурирующем 8Ό8-ΡΆΆ6 находится в интервале от 55,0 до 75,0 кДа (фиг. 12-14).

На представленный гликопротеиновый комплекс у лабораторных животных формируется длительный напряженный В- и Т-клеточный иммунитет против М. 1иЬегси1ок1к Н37 Κν.

При изучении антителопродукции (формирования В-клеточного иммунитета) на рекомбинантный ТВ-антиген проводили иммунизацию морских свинок и кроликов с целью получения гипериммунных сывороток. Для иммунизации использовали кроликов весом 2,5-3 кг. 1 мл ТБ-антигена в концентрации 1 мг, смешанный с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда, вводили подкожно в отдел спины в области лопаток. Иммунизацию повторяли три раза с недельным интервалом и двукратным увеличением дозы. По окончании первичного цикла иммунизации через 4 недели проводили внутримышечно повторное введение препаратов, начиная с 2 мг и кратно увеличивая дозу до 8 мг. Иммунизацию морских свинок проводили подкожно в отдел спины в область лопаток ТВ-антигеном в дозе 300 мкг/мл с неполным адъювантом Фрейнда. Через три недели введение препарата повторяли.

Антительный ответ у лабораторных животных оценивали через 21 день после последнего введения ТВ-антигена. Для этого проводили забор крови, получали сыворотку и проверяли наличие специфических ТВ-антител в реакции диффузной преципитации и иммуноферментным методом.

Показано, что выработка специфических антител происходит уже после первичного введения препарата. При дальнейших инъекциях титры антител в сыворотках возрастали. По завершению циклов иммунизации были получены гипериммунные сыворотки с высоким содержанием ТВ-антител. В иммуноферментном анализе с использованием ТВ-антигена, взятого для иммунизации, титры антител у морских свинок составили 1:6400, а у кроликов - 1:409600 и выше, в реакции диффузной преципитации титры были 1:8 и 1:16-1:32 соответственно.

Таким образом, присутствие рекомбинантного ТВ-антигена в организме животных вызывает перестройку их иммунной системы по В-типу. Длительное присутствие ТБ-антигена или повторное его введение делает перестройку иммунной системы стойкой, на что указывает возрастание титров специфических антител в сыворотках крови животных.

У больных туберкулезом людей и бактерионосителей специфический В-клеточный иммунитет определяется с помощью ТБ-антигена в иммуноферментных тест-системах (ИФА), на нитроцеллюлозных фильтрах (иммуноблотинг, дот-блот) и в других реакциях с использованием клинических жидкостей (сыворотка крови, мокрота, плевральная жидкость, спинно-мозговая жидкость и другие), содержащих специфические антитела.

Изучение образцов сывороток крови больных туберкулезом и здоровых людей на наличие специфических антител представлено в табл. 1.

- 4 014065

Таблица 1

Определение наличия антител к возбудителю туберкулеза человека в образцах сывороток крови разных групп людей иммуноферментным методом (метод определения представлен в примере 4).

Образцы сывороток крови от обследованных групп	Количество образцов сывороток	Показатели оптической плотности (ОП)
ОП>0,6 0,3>ОП<0,6 ОП<0,3
Больные из фтнзиопульмонологин с диагнозом туберкулез легких (МБТ+ и МБТ—)
ТБ больные ГИСК (МБТ+ и МБТ-) {в %}	227 (100%	162 (71,4%)	39 (17,2%)	26 (11,4%)
Доноры (Здоровые люди)
Доноры ГИСК ВИЧ, ВГВ, ВГС - {в %}	45 100%	-	6 13,3%	39 86,7%

Группы риска
Аноним, доноры ГИСК (сифилис?) {В %}	60 100%	4 6,7%	9 15,0%	47 78,3%
Солдаты срочной	33	2	2	29
службы, персонал БИОНОМ {в %}	100%	6,1%	6,1%	87,8%
Спортсмены	22	4	5	13
ГИСК	100%	18,2%	22,7%	59,1%
{в %}
Студенты	20	3	3	14
ГИСК	100%	15%	15%	70%
{в %}
Группы с возможными перекрестными реакциями
Больные ГИСК	44	1	4	39
(ВГВ + и ВГС +) (в %}	100%	2,3%	9,1%	88,6%
Вакцинированн	10	1	3	6
ые ГИСК ВГВ + {в %}	100%	10%	30%	60%

Примечание: образцы сывороток представлены Гос. НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича (ГИСК) и ООО БИОНОМ. Обследовано 460 человек. ОП>0,6 - указывает на наличие антител в сыворотках крови к возбудителю туберкулеза; 0,3>ОП<0,6 сомнительный результат (серая зона); ОП<0,3 - указывает на отсутствие антител к возбудителю туберкулеза; МБТ+ - диагноз туберкулез подтвержден выделением микобактерий от больного; МБТ- - диагноз туберкулез подтвержден клинико-рентгенологическими методами. ВИЧ - вирус иммунодефицита человека; ВГВ - вирус гепатита В; ВГС - вирус гепатита С.

Выводы

1. Из 227 образцов сывороток крови больных туберкулезом в 71,4% обнаружены антитела к возбудителю туберкулеза М. 1иЬегси1о818 Н37 Κν.

2. В 45 образцах сывороток крови доноров (здоровых людей) не обнаружено антител к возбудителю туберкулеза М. 1иЬегси1о818 Н37 Κν.

3. В группах риска в образцах сывороток крови наличие антител к возбудителю туберкулеза М. 1иЬегси1о818 Н37 Κν варьирует от 2,3 до 18,2%.

Изучение специфической активности ТВ-антигена в формировании Т-клеточного иммунитета про

- 5 014065 водили путем постановки кожных туберкулиновых проб на морских свинках. Для этого группам морских свинок вводили туберкулезную вакцину ВСС (внутрикожно по 0,5 мг в 0,2 мл разводящей жидкости) и взвеси микробных клеток вирулентных штаммов МусоЬас1етшт 1иЬегси1о818 Н37К.У. К.1К.У. а также атипичных штаммов М. кащаА. М. татшит (внутрибрюшинно в дозе 10⁶ микробных клеток на животное). Через 4 недели после инфицирования опытных и контрольных морских свинок использовали для постановки внутрикожной пробы Манту по общепринятой методике (Инструкция по применению аллергена туберкулезного очищенного сухого для накожного. подкожного и внутрикожного применения (сухого очищенного туберкулина). Главное управление лечебно-профилактической помощи Минздрава СССР. Москва. 11 августа 1986 г.). Концентрация препаратов. вводимых внутрикожно. составляла 10 мкг по общему белку в 100 мкл разводящей жидкости. Специфическую аллергическую реакцию замедленного типа в виде местной реакции возникающего клеточного инфильтрата (папулы) учитывали в миллиметрах через 24 ч. Препаратом сравнения служил сухой очищенный туберкулин (ТиЬегси1шит беригаШт щссит) производства РАО БИОПРЕПАРАТ. Санкт-Петербургского НИИ Вакцин и Сывороток - ΡΡΌ-Ε-2 (доза для внутрикожного введения-25 ТЕ).

Результаты экспериментов показали. что ТВ-антиген. полученный из рекомбинантного штамма 2-9ХЬ. вызывает местную кожную реакцию у сенсибилизированных свинок (реакция гиперчувствительности замедленного типа). причем некоторые из них по размерам папулы (12-15мм) были сопоставимы с референс-препаратом. Отмечена достоверная разница в размерах кожной реакции у животных. инфицированных вирулентным туберкулезным штаммом. атипичными штаммами и ВСО. что указывает на видовую специфичность ТВ-антигена. Но. в отличие от туберкулина. местная аллергическая реакция в ответ на внутрикожное введение ТБ-антигена возникала и у части контрольных животных. что. вероятно. связано с недостаточной очисткой ТВ-антигена как сложного гликопротеинового комплекса. Однако очевидно. что на исследуемый ТБ-антиген формируется стойкий видоспецифический Т-клеточный иммунитет.

Следовательно. ТВ-антиген весьма перспективен как диагностический препарат для определения наличия специфического Т-клеточного иммунитета у больных и инфицированных туберкулезом людей и как биологическая вакцина.

Патогенность для лабораторных животных

Рекомбинантный штамм 2-9ХЬ не обладает остаточной вирулентностью для всех видов лабораторных животных.

Согласно Заключению по проверке на остаточную вирулентность лиофильно высушенной культуры штамма 2-9ХЬ Лсше1оЬас1ег )ο1ιη5οηίί . проведенному в НИЦ Токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов. значение БО₅₀ для линейных мышей Ва1Ь/с и золотистых хомяков превышает 1χ10⁷ микробных клеток и 5χ10⁷ микробных клеток соответственно. Штамм 2-9ХЬ Лсше1оЬас1ег )ο1ιηδοηίί авирулентен для морских свинок и кроликов (значение ΕΌ₅₀>1χ 10⁹ микробных клеток на животное).

Таким образом. на основании показателя остаточной вирулентности (патогенности) штамм 2-9ХЬ Лсше1оЬас1ег)ο1ιη5οηίί может быть отнесен к 4 группе микроорганизмов по Международной классификации.

Копии Заключения по проверке на остаточную вирулентность лиофильно высушенной культуры 2-9ХЬ Лсше1оЬас1ег НИЦ ТБП прилагаются.

Условия и состав сред для хранения и поддержания штамма

Музейная культура штамма 2-9ХЬ Лсше1оЬас1ег хранится при температуре +4°С на косяках ЕТ-среды с добавками глюкозы и цистеина до 2 месяцев. а в лиофильно высушенном состоянии в сахарозо-желатиновой среде до 5 лет.

Среда для культивирования

Рекомбинантный штамм 2-9ХЬ Лсше1оЬас1ег )ο1ιη5οηίί культивируется на плотной ЕТ-среде с добавками глюкозы и цистеина при +32°С.

Технологические особенности при культивировании

Рекомбинантный штамм 2-9ХЬ плохо растет в жидких питательных средах и быстро теряет способность продуцировать ТБ-антиген. Поэтому наращивание биомассы для последующего выделения ТБ-антигена проводят только на плотных питательных средах.

Матричную культуру выращивают на косячках при +32°С в течение 2-3 суток. затем смывают бактерии физиологическим раствором и с одного косячка засевают один-два матраса. Матрасы инкубируют в термостате в при +32°С в течение 3-4 суток. затем выросшую биологическую массу смывают дистиллированной водой и центрифугированием освобождаются от растворимых компонентов питательной среды. Из очищенной от компонентов питательной среды биологической массы начинают выделение рекомбинантного ТБ-антигена. Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса (ТБ-антигена) из рекомбинантного штамма 2-9ХЬ Лсше1оЬас1ег )ο1ιη5οηίί.

На плотную питательную среду (косячки) рН 6.6. состоящую из сердечно-мозгового агара. гидролизованного гемоглобина. цистеина и глюкозы в соответствующих пропорциях или ЕТ-агара рН 6.6 (про

- 6 014065 изводство ФГУП ГНЦ ПМ, Оболенск, Россия) с добавлением цистеина и глюкозы петлей делают посев культуры 2-9ХЬ. Посев инкубируют в термостате при +32°С в течение двух суток. Двухсуточную культуру смывают физиологическим раствором и готовят суспензию бактерий в концентрации 5x10 микробных клеток (м.к.) в одном миллилитре. [Получение суспензии бактерий 2-9ХЬ весьма сложно, так как культура смывается хлопьями, которые при перемешивании очень плохо разбиваются]. Для получения большого количества биологической массы полученную суспензию высевают на матрасы из расчета один косячок на 1-2 матраса (в один матрас наливают 400,0 мл питательной среды). Посев инкубируют в термостате при +32°С в течение трех суток. С одного матраса трехсуточную культуру 2-9ХЬ смывают 30 мл физиологического раствора. Из взвеси смытой культуры готовят мазок для световой микроскопии и окрашивают его по Граму. [Популяция бактерий рекомбинантного штамма 2-9ХЬ при небольших изменениях состава питательной среды, температурного режима или иных условий может быстро диссоциировать в формы, которые не продуцируют ТБ-антигена. При окраске по Граму эти бактерии грамотрицательные, бактерии-продуценты ТБ-антигена - устойчивы к обесцвечиванию и выглядят как грамположительные (фиг. 1, 2). В выросшей биомассе 2-9ХБ количество грамотрицательных бактерий не должно превышать 5-10%].

Суспензию смытых с матраса бактерий центрифугируют (Весктап 02-21, И8А) при 9000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость, содержащую растворимые компоненты питательной среды, отбрасывают, а осадок суспендируют в 40 мл охлажденной деионизованной воды и все последующие процедуры делают при +4°С. Далее проводят обработку культуры 2-9ХБ 0,5 N раствором ΝαΟΗ, доводя рН от 6,0 до 9,0. Происходящее при этом растворение капсулы бактерий, содержащих видоспецифический рекомбинантный ТБ-антиген, ведут дробно, добавляя ΝαΟΗ небольшими порциями и тщательно перемешивая суспензию в течение нескольких часов. Обработанную таким образом суспензию бактерий оставляют в холодильнике (+4°С) на ночь (15-16 ч).

На следующий день суспензию бактерий 2-9ХБ центрифугируют при 12000 об/мин в течение 40 мин. Водную фракцию, содержащую растворенную капсулу рекомбинантного штамма 2-9ХБ, отделяют от осадка. В связи с неполным растворением капсулы повторяют процедуру обработки осадка щелочью в той же последовательности.

Полученную первую порцию препарата капсулы 2-9ХБ на холоде нейтрализуют 0,5 N раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) до рН 6,0 и, так как он содержит достаточно большое количество бактерий, центрифугируют при 15000 об/мин в течение 40 мин. Осадок отбрасывают, а надосадочную жидкость закисляют 0,5 N ТХУ до рН 3,0-3,5. При этом ТБ-антиген собирается в комплекс и начинает выпадать в осадок. Препарат оставляют в холодильнике (+4°С) на ночь (15-16 ч). Выпавший за ночь ТХУ-осадок в этом растворе может храниться при +4°С до двух недель без утраты специфической активности находящегося в нем ТБ-антигена. На ночь в холодильнике оставляют вторую порцию препарата для формирования осадка ТБ-антигена.

На третий день первую порцию препарата с выпавшим осадком центрифугируют при 9000 об/мин в течение 30 мин. Надосадок отбрасывают. Из расчета на один матрас осадок растворяют в 1-2 мл РВ8-буфере (0,0067 М КН₂РО₄, 0,0067 М №₂НРО₄, 0,138 М №С1, 0,0027 М КС1 рН 7,0). В растворе РВ8-буфера содержится преимущественно видоспецифический ТБ-антиген (фиг. 12. Электрофорез ТБ-антигена рекомбинантного штамма 2-9ХБ Асше!оЬас!ет]о1ш5опи. 16% 8Э8-РАА0 электрофорез белков рекомбинантного штамма 2-9ХБ. 60-170ν. 60 мин. Трис-глициновый буфер рН 8,3.

М - маркеры: 67,0; 45,0; 25,0; 17,0; 12,3 кДа.

- белки ультразвукового дезинтеграта 2-9ХЬ.

Стрелкой указан двойной белок ТБ-антигена, который не проявляет специфической активности. 2 белки ультразвукового дезинтеграта, переосажденного трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Стрелкой указан ТБ-антиген в сборке. Этот белковый комплекс проявляет специфическую активность.), который уже проявляет специфическую активность, но требует дополнительной очистки).

С оставленной на ночь второй порцией препарата повторяют все необходимые процедуры (нейтрализуют 0,5 N ТХУ до рН 6,0, освобождаются от оставшихся клеток, закисляют 0,5 N ТХУ до рН 3,0-3,5 и раствор с выпадающим осадком оставляют на ночь). Выпавший за ночь ТХУ-осадок может храниться при +4°С до двух недель без утраты специфической активности находящегося в нем ТБ-антигена.

На следующий день вторую порцию препарата растворяют в 1-2 мл РВ8-буфера. Он содержит преимущественно видоспецифический ТБ-антиген.

Наличие ТБ-антигена, полученного вышеописанным способом, регистрируют в 8Э8-РАА0 электрофорезном геле (фиг. 12).

ТБ-антигены первой и второй порций объединяют и подвергают дальнейшей очистке.

В результате проведенных экспериментов установлено, что а) рекомбинантный видоспецифический ТБ-антиген локализуется во внешних структурах бактерий 2-9ХБ (внешняя мембрана и капсульное вещество) и может быть выделен и сконцентрирован путем вышеописанных процедур, б) при проведении вышеописанных процедур бактерии рекомбинантного штамма 2-9ХБ практически не разрушаются и доля получаемого ТБ-антигена достаточно высока в сравнении с другими, присутствующими в растворе белками, липидами и полисахаридами бактерий. Таким образом, можно считать, что приведенный при

- 7 014065 мер является наиболее экономичным получением ТБ-антигена из рекомбинантного штамма 2-9ХБ Асше1оЬас1ег(οΐιηδοηίί. но он не исключает возможности получения его любым другим способом (разрушение бактерий с помощью ультразвука. или путем замораживания-оттаивания. или иным способом с последующей концентрацией ТБ-антигена).

Пример 2. Получение видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса (ТБ-антигена) из рекомбинантного штамма 2-9ХБ Асше1оЬас1ет (οΐιηδοηίί.

На плотную питательную среду (косячки) с рН 6.6. состоящую из сердечно-мозгового агара. гидролизованного гемоглобина. цистеина и глюкозы в соответствующих пропорциях или БТ-агара рН 6.6 (производство ФГУП ГНЦ ПМ. Оболенск. Россия) петлей делают посев культуры 2-9ХБ. Посев инкубируют в термостате при +32°С в течение трех суток. Трехсуточную культуру смывают физиологическим раствором и готовят суспензию бактерий в концентрации 5х10⁹ микробных клеток (м.к.) в одном миллилитре.

Полученную суспензию высевают на матрасы из расчета один косячок на 1-2 матраса (в один матрас наливают 400.0 мл питательной среды). Посев инкубируют в термостате при +32 С в течение трех суток. С одного матраса трехсуточную культуру 2-9ХБ смывают 30 мл физиологического раствора. Из взвеси смытой культуры готовят мазок для световой микроскопии и окрашивают его по Граму (контроль наличия ТБ-антигена в рекомбинантных бактериях 2-9ХБ).

Суспензию смытых с матраса бактерий центрифугируют (Весктап 62-21. И8А) при 9000 об/мин в течение 30 мин. Надосадочную жидкость. содержащую растворимые компоненты питательной среды. отбрасывают. а осадок суспендируют в 40 мл охлажденной деионизованной воды и все последующие процедуры делают при +4°С. Далее проводят обработку культуры 2-9ХБ 0.5 N раствором ΝαΟΗ. доводя рН от 6.0 до 9.0. Происходящую при этом процедуру растворения капсулы бактерий. содержащих видоспецифический рекомбинантный ТБ-антиген. ведут дробно. добавляя ΝαΟΗ небольшими порциями и тщательно перемешивая суспензию в течение нескольких часов. Обработанную таким образом суспензию бактерий оставляют в холодильнике (+4°С) на ночь (15-16 ч).

На второй день суспензию бактерий 2-9ХБ центрифугируют при 12000 об/мин в течение 40 мин. Надосадочную жидкость (частично растворенную капсулу рекомбинантного штамма 2-9ХБ. содержащую ТБ-антиген). отделяют от осадка (бактерии 2-9ХБ. сохранившие и не сохранившие капсулу). К осадку добавляют 40 мл деионизованной воды и повторяют процедуру растворения капсулы. получая вторую порцию препарата.

Полученный препарат капсулы 2-9ХБ нейтрализуют 0.5 N раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) до рН 6.0. а затем добавляют сульфат аммония [(ΝΗ₄)₂8Ο₄] до 30% насыщения. Раствор оставляют на ночь при +4°С для выпадения осадка. На следующий день препарат центрифугируют при 12000 об/мин в течение 40 мин. Осадок отбрасывают (он преимущественно содержит целые бактерии и их крупные фрагменты). К надосадочной жидкости. содержащей преимущественно ТБ-антиген. добавляют сульфат аммония до 100% насыщения. Препарат оставляют на ночь при +4°С для выпадения осадка.

Вторую порцию препарата капсулы 2-9ХБ нейтрализуют 0.5 N раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) до рН 6.0. а затем добавляют сульфат аммония [(ΝΗ₄)₂8Ο₄] до 30% насыщения. оставляют на ночь при +4°С для выпадения осадка.

На следующий день препарат ТБ-антигена. выпавшего в осадок при 100% осаждении сульфатом аммония. центрифугируют при 12000 об/мин в течение 40 мин. Надосадок отбрасывают. осадок растворяют в 2.0 мл РВ8-буфера рН 7.0 (из расчета на один матрас) и диализуют против большого объема РВ8-буфера.

В течение суток объемы РВ8-буфера меняют не менее трех раз для полного удаления из диализного мешка сульфата аммония.

Вторую порцию препарата. содержащего 30% сульфата аммония. центрифугируют при 12000 об/мин в течение 40 мин и осадок отбрасывают. надосадок насыщают до 100% сульфатом аммония и оставляют на ночь при +4°С.

На следующий день препарат второй порции ТБ-антигена. выпавшего в осадок при 100% осаждении сульфатом аммония. центрифугируют при 12000 об/мин в течение 40 мин. Надосадок отбрасывают. осадок растворяют в 2.0 мл РВ8-буфера рН 7.0 (из расчета на один матрас) и диализуют против большого объема РВ8-буфера.

В течение суток объемы РВ8-буфера меняют не менее трех раз для полного удаления из диализного мешка сульфата аммония.

Присутствие сконцентрированного ТБ-антигена в РВ8-буфере после диализа первой и второй порций препарата контролируют в 8Э8-РАА6 электрофорезе (фиг. 13. Электрофорез ТБ-антигена рекомбинантного штамма 2-9ХБ АсшеЮЬас1ег (оЕпюпй. 16% 8Э8-РАА6 электрофорез белкового комплекса 2-9ХБ. выделенного сульфатным переосаждением. 60-170ν. 60 мин. Трис-глициновый буфер рН 8.3. М - маркеры: 67.0; 45.0; 25.0; 17.0; 12.3 кДа. 1-2 - белки очищенного ТБ-антигена на 8ерйайех 6200. Стрелками указан белковый ТБ-антигена в сборке. Этот белковый комплекс проявляет специфическую активность).

ТБ-антигены первой и второй порций объединяют и подвергают дальнейшей очистке.

- 8 014065

Таким образом, получение и концентрирование видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса (ТБ-антигена) из рекомбинантного штамма 2-9ХБ возможно не только с помощью осаждения его из щелочных лизатов трихлоруксусной кислотой до рН 3,5-4,0, как показано в примере 1. Возможно использование методов осаждения ТБ-антигена с помощью различных солей, например сульфата аммония, или иных методов, элюаты содержат очищенный ТБ-антиген с молекулярной массой от 55,0 до 75,0 кДа и наличием углеводов от 20 до 50%.

Пример 3. Очистка видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса (ТБ-антигена), полученного из рекомбинантного штамма 2-9ХБ Асше1оЬас1ег )ο1ιη5οηίί.

Дальнейшую очистку специфического туберкулезного антигена 2-9Х проводят путем фракционирования макромолекул гель-фильтрацией при низком давлении с использованием в качестве матрицы Сефадекса 0-200.

Объединенные сконцентрированные ТБ-антигены в РВ8-буфере, полученные путем осаждения лизатов 0,5 N ТХУ или 100% осаждением сульфатом аммония (пример 2.), наносят на колонку размером 25x600. В качестве элюента используют 50 мМ раствор трис-НС1, рН 7,5, с добавлением 100 мМ №1СТ скорость элюции - 25 мл/ч. Пики собирают, измеряют белок по методу, описанному Брэдфордом (4). Общее содержание углеводов определяют фенольным методом (5). В зависимости от способа осаждения ТБ-антигена из растворенной капсулы микробной клетки (примеры 1 и 2), объема наносимого образца и концентрации белка элюаты содержат очищенный ТБ-антиген с молекулярной массой от 55,0 до 75,0 кДа и наличием углеводов от 20 до 50%.

Специфические туберкулезные рекомбинантные антигены хранят при +4°С в лиофильно высушенном состоянии.

Наличие очищенного ТБ-антигена и его структуру, полученного вышеописанным способом, регистрируют в 8Ό8-ΡΑΑΟ электрофорезном геле (фиг. 14. Электрофорез ТБ-антигена рекомбинантного штамма 2-9ХБ Лсше1оЬас1ег ίοΐιηκοηίί. 17% 8Ό8-ΡΑΑΟ электрофорез рекомбинантного белкового ТБ-комплекса 2-9ХБ по Лэмли. 60-170ν. 60 мин. Трис-глициновый буфер рН 8,3.

М - маркеры: 67,0; 45,0; 25,0; 17,0; 12,3 кДа.

1-2 - белки очищенного ТБ-антигена на 8ерйабех 0200.

Вертикальными стрелками указан ТБ-антиген в сборке. Этот белковый комплекс проявляет специфическую активность. Боковыми стрелками указаны компоненты белкового комплекса).

Получение очищенного ТБ-антигена возможно не только путем фракционирования макромолекул гель-фильтрацией с использованием в качестве матрицы различных носителей, но и с помощью ионообменной хроматографии.

Пример 4. Использование очищенного видоспецифического ТБ-антигена в диагностике туберкулеза человека.

При латентных, хронических и острых формах заболевания человека туберкулезом в его крови формируются антитела, являющиеся специфическими для данного возбудителя - М. 1иЬегси1о8к Н37 Βν, что позволяет проводить диагностику заболевания по указанному признаку.

Для поиска специфических антител используют тест-систему, которая представляет собой непрямой иммуноферментный анализ с разделением фаз, где в качестве твердого носителя используют 96-луночные планшеты. Подложкой для ЕЫ8Л служит туберкулезный антиген, полученный из рекомбинантного штамма 2-9Х путем хроматографического фракционирования.

В лунки планшет вносят по 100 мкл антигена в концентрации 10 мкг/мл в фосфатном буфере и инкубируют 18 ч при комнатной температуре. Ячейки троекратно отмывают забуференным физиологическим раствором, рН 7,2, (ЗФР) с 0,05% Т\гееп 20 и забивают в течение часа 1% раствором бычьего сывороточного альбумина в ЗФР. После троекратной отмывки в лунки 1-го вертикального ряда планшета вносят по 100 мкл нативной сыворотки крови, несодержащей специфических антител в разведении 1:200 (отрицательный контроль), а с 3-го по 12-й вертикальные ряды - ЗФР в том же объеме.

Затем в каждую лунку 2-го вертикального ряда добавляют по 200 мкл исследуемых сывороток в разведении 1:100 и восьмиканальной автоматической пипеткой титруют двукратным шагом, из последнего ряда удаляют 100 мкл. Для разведения сывороток использовали ЗФР рН 7,2. Планшеты инкубируют 1 ч при 37°С. В качестве положительного контроля используют сыворотку крови с заведомо известным высоким титром специфических антител (калибровка). Одну из лунок планшета (последнюю) отводят для контроля субстрата, прибавляя к 10 мкл конъюгата 100 мкл субстрата. После удаления несвязавшихся антител пятикратной отмывкой планшета ЗФР-0,05% Тетееп 20 в объеме 170 мкл к иммуноглобулинам добавляют для вторичного связывания по 100 мкл антивидовых 1дО антител к иммуноглобулинам А, М, О, конъюгированных пероксидазой хрена (81дша), в рабочем разведении 1:5000.

Реакционную смесь инкубируют 1 ч при 37°С, после чего ячейки пятикратно отмывают ЗФР-Тетееп 20. Раствор субстрата готовят добавлением 3 мкл 30% Н₂О₂ к 10 мл свежеприготовленного 0,04% хромогена ΑζΒΤδ (АрйНеш) в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере, рН 5,0 и по 100 мкл раствора добавляют в каждую лунку.

Для проявления цветной реакции планшету инкубируют при +37°С в течение часа, вносят по 100 мкл 1% 8Ό8 для остановки ферментативной реакции и измеряют величину светоадсорбции при

- 9 014065

405 нм на вертикальном фотометре фирмы В1о-Каб, модель 680. Результаты сравнивают с бланком лунок вертикального ряда, в которых находилась сыворотка, несодержащая специфических антител. Очищенный рекомбинантный ТБ-антиген взаимодействует только с антителами сывороток крови больных туберкулезом людей и не взаимодействует с антителами сывороток крови здоровых людей.

Таким образом, рекомбинантный ТБ-антиген 2-9ХБ можно использовать в диагностических целях на твердофазном носителе, нитроцеллюлозной мембране и в других тест-системах, с помощью которых идентифицируются специфические антитела, которые вырабатываются организмом человека на присутствие или размножение в нем возбудителя туберкулеза - М. 1иЬегси1о818 Н37 Κν. Специфические антитела, вырабатываемые человеком в ответ на проникновение и развитие в нем возбудителя туберкулеза, могут быть не только в сыворотке крови, но и в других клинических жидкостях (мокроте, экссудате, моче и т.д.).

Полученные на очищенный рекомбинантный ТБ-антиген моноклональные антитела или гипериммунные сыворотки различных животных (кроликов, мышей, морских свинок и другие) можно использовать в диагностических методах при поиске в клинических жидкостях человека (мокрота, экссудат, материал при микробиопсии и т.д.) как микобактерий туберкулеза, так и их специфических компонентов.

Приведенные выше примеры выделения и использования рекомбинантного видоспецифического туберкулезного антигена, полученного из безопасного для человека и животных генно-инженерного штамма 2-9ХБ Асше1оЬас1ег (оНпкопи указывают на то, что данный микроорганизм найдет широкое применение в здравоохранении и медицине как источник полезного продукта, используемого в диагностике, профилактике и лечении туберкулеза человека.

Учитывая свойства рекомбинантного штамма Асше1оЬас1ег (оНпкопп 9ХЬ, данный микроорганизм депонирован 29.11.05 во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ФГУП ГосНИИГенетика за индексом УКРМ Β-9312.

Список литературы

1. 8. Аггиба, С. ΒοιηΓίιη. Κ. РОдИй, Т. Ншта-Вугоп, Ь.А. Рбеу С1ошпд οί М. 1иЬегси1о818 ΌΝΆ Ггадтеп! Ак8ос1а1еб \νί11ι Еп1гу апб 8шуКа1 1пк1бе Се1к, 8с1епсе, 1993, N261 (5127), р. 1454-1457.

2. С. Мапса, К. БуаксНепко, Н.С. А1кег, Ό. И8а1, Κ. Со1апдей, М.Ь. Сеппаго Мо1еси1аг С1ошпд, РипПсабоп апб 8его1од1са1 С11агас1еАа1юп οί МРТ63, а Nονе1 Апйдеп 8есге1еб Ьу МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818.

3. С. Най, ВаГуи Бее, М.А. Ηοινίΐζ Н|д11-Бе\^ге1 Не1его1одоик Ехргеккюп апб 8есге1юп ίη Кар1б1у Сгсшшд №пра11юдешс МусоЬас1епа οί Роиг Ма)ог МусоЬас1егшт 1иЬегси1о818 Ех1гасе11и1аг Рго1етк Сопыбегеб То Ве Беабшд Уассше Сапб1ба1ек апб Эгид Тагде18, 1пГесйоп апб 1ттипйу, 1ипе, 1997, р. 23212328.

4. ВгебГогб. Апа1. Вюсйет., 72, 248 (1976), а также Апа1. Вюсйет., 86, 142 (1978).

5. Герхардт Ф. Методы общей бактериологии, 1984, т.2.

- 10 014065

Перечень последовательностей <110> пг

Общество с ограниченной ответственностью «БИОТЭК»; Кисличкин Николай Николаевич

ОЬзсЪезГто в одгашсйеппоу оАеЫсеппойуи «ВЮТЕК»; ΚίδΙϊοΗάη №ко1ау кйкоИеуюк <120> Средство, обладающее свойством формировать клеточный иммунитет против МусоЬас1епит 1иЬегси1оз1з Н37 Ку, способ получения его (варианты), рекомбинантный штамм и средство для диагностики туберкулеза.

<130>

<150> 1Ш2007117342 <151> 2007-05-10 <160>2 <210>1 <211>5321 <212>ΌΝΑ <213> Му соЪаСТепит ШЬегси1оз18 НЗ 7Κν <400>1

£с§д§сасса	даФдасдд!	81с£сд£сс§	аддаайсдс	сасс2с£с1£	сдссаддасд	60
§са(§с1£дс	£с(£8с1сдд	йдсадсдса	ада^сдсй	§ё1сдаа1с1	сссШсдса	120
сассдсааас	§с1а£Гс£дс	дддссвсдса	£1§асе.ссдс	айддс1дсс	1сс1ссддас	180
§сас§£с§ас	сасдааддса	шддцсаадд	дссссассса	дсассддсас	«ё£1£сааа	240
ададДдсс	дсдсаадсХд	сгададдааТ	Ё£с1ддсса1		сас!асса§с	300
1сааа§асаа	ас1§с§с§1а	садсйсдос	сдса£с§£§с			360
{сддсаЮса	сддсдааадс	да^асаадс	•сдссаасд!	дагайссаа	сс§а1ссаад	420
а1с§ссдсд§	ссдсассаю	сгдйддйс	дсдассадаа	сас§ис§§1	дс££аас1ас	480
дссаааадсд	дс1§а!дасс	сг§а!ссасс	1с1ддс1с§1	ссассдсйс	ааддсдсадд	540
с££1§сас1а	с§1сас§ссс	ассдасдаса	ассХс(асса	§асс1с§аад	а1даа§1с£с	600
а1ддааЮ1(	сассдад§1с	аассад§а§§	1§§§сда£а1	са1с«1сдсс	дад^даасс	660
асссдсдса!	с£ссдаас(д	с1§ас§ссс£	а1с§д£1е£с	дс1дс££аа§	П§а1сас§а	720

- 11 014065

аццаддсдХа	дссацсцсХц	ссаасХдХсХ	Хй8£82ссаа	сс£§ё1д1дс	цХсдадДхщ	780
сдсасаХсдс	§ааас§с§аа	ддаХасХаХс	адасддсдХс	Х£С£д(£ОСС	Х§Хс£,ааеаХ	840
сса§с§сасс	££С£ЙСаСС	Хдс§1С88сс	сдсддХсдсе	асХассаХсд	СС£ССССС§Х	900
йасддсссд	дсасссд^д	аеаадаацее	с১а§сай	Хдессдаф	Хдйдасдсс	960
сдадйааас	£садс££Х§а	§£Х§ассаас	££ΐ£0(0£ί£	йдйдаадс	ссдадасддх	1020
дй§ссХ১	йсдссасдс	ссдасдссад	с1§ссс§ас£	ИсХадайс	ссдадасХсс	1080
дссНдсадс	£С£«С££Са	сс(££Исса	§а££ссс§аа	ахдссдддсс сдасдйдсс	1140
даадсседаХ	дсдсХХссаХ	с^ссасХей	даадаадссс	§аа8ас£.§££ 1§е1§ §Х§да	1200
дЙГссдаае	ССС£3££С§С	1с§1§а18Н 8а1с§ёёа18	ХХааХсддХс	ссаа§сс£сс	1260
диддсддк	аадйсадда	дедаЮеддд	ааХддХдаад	сс££££а1с§ ХаассдддсХ	1320
сдХдсссссд	сХсаасддаа	саХХсаассс	аааеддайа	аХсдсдааас	садддаХсеХ	1380
аассдддлс	§1§ссссс§с	хсаасддаас	айсаассса	ааеддайаа	Хсдсдааасс	1440
а§8§а1с§1§	аса§с§н§8	ха§сасс§сх	са§с§§ааХа	йсааассаа	асддайаас	1500
асХдааХссс	1£§а1§сса§	ас1сс১§1	§сс§ссддсс	адсдХдасдс сХааХасдаа	1560
Декаде	8§8а1888зс	сдаХдХадсс	сдХдаадаХа	ссаасаасо! Хааасддаад	1620
НедЦдааа	§.1оато.й§,а	сс§.§ХаХссХ	даХдХХааХс	£Хаа§8§£ва ХдсдддаааХ	1680
адддасдссд	ддааеддща	1с££ассдас	ассасссадс	дсдйсаддс	ХсаасддааХ	1740
ассаадааХа	дХааХаХсад	дсассасааХ	сддассдаса	ссассса§с§	сдИсаддсХ	1800
саасадааХа	ссаддааХад	ХааХаХссдд	сассасааХс	д§асс§асас	сасссадсдс	1860
дйсаддсХс	аасддаахас	саддааХадХ	аахаХссддс	ассасааХсд	дассдасасс	1920
ассса§с§с£	йс১сХса	асддааХасс	аадааХадХа	аХаХссддса	ссасаахсдо	1980
ассдасасса	СССа£С£С21	1с১сХсаа	сддааХасса	ддааХаоХаа	ХаХсс§§сас	2040
сасааХсдда	сс§аХ§ссас	сайсасйс	дасдсхсадХ	8§дахд§с§§	дааХдсХеао	2100
(£ΐ§ίθί£33	ХадссааХса	£ассс1£8та	аХсдсессХс	сасад1аХ§с	сдХХдсХдХа	2160
длдсссдад	а1с১е,с£с	се.§.Х§йаа§	дХсдссааХд	Хйссссадс	еддхдйдаа,	2220
£1с§сс£а§§	йХаддХасс	сс§Х§йддс	еКссссддд	йдаддХсдс	ссдХдйддХ	2280
£кдсс££с§	йдХадсХдс	с1£1£йд1а£сисс1дс£	йдссдайс	садХёйдас	2340
ОЙ£СС££Х£	йдаасаддс	ссдХейддс	дХХдсссасд	йасссаддс	сддХдйдХа	2400
§Й§СС££а£	йдссдаХдс	сдасдйХсс	ейсссхеад	йдаадаадс	сдаХдйдсс	2460
§хх§сс.§§а§	йдаа§аа§с	С§аХ£Й£СС	дсХдссддад	йсадсдссс	сдааХссдас	2520
ехдайдхец	ссддХцадсс	сдаХассааХ	аХХХссадХд	сссдХдХХдс	сдаацссдах	2580
дйдссдйа	ссдаХдЙсд	сдаа§ссд1а	дйдйдссд	ссдаХдйсс	сааадссааХ	2640
£«£1£Са£В	дссХссдХса	ассссддасс	сдХдХйдса	аасссааддХ	ХдйдсХдсс	2700
дасдйХсса	ааассдаад!	Хдйдсйсс	даХдШссд	ааассдааас	йссдйдсс	2760

- 12 014065

да^Шссд	с1асс§аа§1	Бйадсгасс	дасдШссд	саасссасд!	1д1ад1сдсс	2820
дадцШдсд	Й§сссаа§1	1§ад1ё18сс	дйжйддсд	аадссцаад!	1даа1аасд1	2880
сссассЗдсд	дсдйдсдса	Щаагссддс	дадйддсгд	1с§д1ейас	сдасдссдда	2940
д^ааадесс	да1ц1с”с1а	десссадсд!	8εί£βί£ίί8	(ададдойд	адасКЧдЦ	3000
дссдаадйс	аадайсссд	а^сащдд	ссс§ас£йа	аддаа1ссдд адйдссдад	3060
айсссадса	а(§йссада	адссадаТсс	£ссс£аасс£	асдйсссда	аасссдагд!	3120
§сс£сссд1а	СС§С(£Й£а	адаадсссца щас^йейЩ	д1дд1сдад1	йссдаадсс	3180
(§§§§1ёссс	дсгаГйсда	Гс£££а(§й	дассддсссд	аддс(дссдд асас^сдас	3240
дсссаасдад	айдадддда	(с^дайдд	спаддГадГд.	а§£§2£СС2а Г§£С£СС2СС	3300
саса!саа1а	сссаасадда	Й8сс8§аа§	1дад1адсса	(сссддааса	ссд1ааасдд	3360
§сс(аассс1	ссдсссасаТ	саа1асссаа	сдддайдсс	ддаадСдад!	адссаксдд	3420
§аасасс§1а	аас££§сс(а	асссксдсс	сасакаа!а	сссаасддда	йдссддаад	3480
фадЧадсса	1сс§8§ааса	ссдБааасцд	дсс1аассс1	ссасссаса!	саайюссаа	3540
сё§аа1а§сс	§§сааас1а1	аассасссда	(аадаадЩд	а1дддасс§а	Шдассас!	3600
сас1дхсасд	1аа1с1§§а§	ддааЮсддд	даааааХддс	££ааК§С2£	§аа1с(садд	3660
а§1£сс1а§с	1д1а1с§а1а	1§с1ассс§§	дсс1а1дс(2	ссаасдд1дд	даШасдсс	3720
даа1аа£сс£	а1сдсаа£С2	§а§асдс§88 да[сдааа1с	ца1сссасд1	1аа1дасс1д	3780
даасдссда!	а§с1с1১с	сааШдаай	1адад1да1с	ддсддда^!	1да1ддддсс	3840
аасдадЛдсс	сс££1асЩ	1да1дссса§	сссда(д§с§	ддаасад1аа	(аддсддаас	3900
аПдаТсддс	сссассаасд	с1сс£2аас1	дйаа1дссс	аддссдат	сдддааТдд!	3960
§а1£§ас䧧	а1£цща1цц	дцссдасдда дссдаддссд	Пдадд1с1а	§§ссадсадс	4020
		адаагссда!	саа§ссс1§8	1а21сдсс1с	дссадаадаа	4080
£СС§Й§С1§	(адйдссад	адйдааЮс	аСС£81£112	асдйдссдд	(дйгсссас	4140
ёссд^дйд	১й§сс§8	ддйдаадаа	2СС1£1£Й8	дадс1дсссд 12йдаа2(с	4200
£ССС§(£Й§	аадйдссга	дайдаадс!	£ССС21дЙ2.	1адйдсссд	1дйдссда1	4260
§сса§1§й§	асда^ссцц	сдйцаадаа	8ССС£1£Й£	дсйддсссд	1дйдссда1	4320
ассс£1дй§	1а£С(§.§1ас	с1да§йссс	дагдссдаад	ШСС£§1£С	сс21ап§сс	4380
§а1§сс§а1£	Й£СС§£Г§С	сЗдадйдаа	саадссдаТа	Й§СС£81СС	ссдадйсса	4440
§ссдсс§аас	сссй-с!^!	1ё£сёссд§1	даддссдаад	ссда1дй1с	СдЙ£ССС21	4500
дйдссоааа	сс§а1§1йс	С£Й£СС§81	дйдсссаад	ссаасдйд!	1£С1£СС£ае	4560
аШссаадд	ссдаадйд!	(дссессада	аШаддсЧд	сссааайса	ааа1§ссаа§	4620
§Иа£С§£С£	ссса1с1ц(с	сдаадсссда	дШдссадд	сс!аадс1аа	даШдссад	4680
сасасссйд	даас^да	1С8СС£С§81	дасдасддсс	дссддадсдд ссдссаас{д	4740
ддсдезсадд	(сййсада!	{С1£С£8С££	с£са£1£аас	ддсдЮаддд ссдасдссас	4800

- 13 014065

сдссда1дсс	ссддса1дд1	аддссдаса!	сассдасаса	1сда1ддссс	асаХсХдйс	4860
£!а!§с£§сс	{сааСсдсад	сда!сдссдд	адсаййдс	ссдаадаадХ йдадаасас	4920
саа!дасасс	адд1сддадс	цдйддссдс	сассадсдсс	ддйдсасса	Гсдссдсссд	4980
дасадссЧсд	аас!сддсса	сдадддссдс	ддсйдддй	дссдассдс! дддсс1дддс	5040
сдс!дссдсд	дсаадсса!с	с1адд!ас§д	сдс!ассдса	дсддссаХсд ссдссдаХда	5100
сдд(ссдадс	сасдайсдс	сдассаддсс	сдасд!сасд	дадйдааад	аддссдсЩс	5160
сдаддссаа!	йха!сдсса	д駧1ссса	ддсдассдсд	дссцссдаса 1ддд«с1да	5220
йссдссссд	ссдаа!а1да	дддссдадЦ	да(сй(дд(	ддсааХдйд	ааааайса!	5280
ддссссдас!	Пссс1д§£!	дсассдааП	саХддсддс!	С		5321
<130>
<150>	КИ2007117342
<151>	2007-05-10
<210>	2
<211>	1280
<212>	ΌΝΑ
<213>	МусоЪас1ег1иш 1иЬегси1о815 Η37Κ.Υ
<400>	2
ссд1са!саа	сдаайсдсд	аа!§ссдасд	сдсХдсасса	сддсд1сд!д	дХадсдадс	60
ассаас(сдд	айсдЮдас	саШсдссд	дайсдд!д!	сдгассаасс	дддйдсддд	120
(сд1сс1ссс	адсддакаа	сссад1дд1с	са§дссадс(	ссадсасдсс	ддссдссдас	180
адсХсдйй	с§асс1сса!	с1сдаассдд	д1дсд1дасд	адсс§1асдд	дссдаШсд	240
дсдссдссда	сдаСсассас	садд1се.дсс	дддЮдаса!	сдаддХсдХс	ссайдсддс	300
ддсддХдсдд	䧧1§ааасс	ссддддсддс	дасддсадсд	сддсда!ддс	дссаддддсс	360
1сддсд!ссХ	сдгсдасддс	сдссдсхдсс	даса!с1дс!	сдсдсдссй	ддссдссадс	420
1сддсса1д1	сдаддйддс	сгсддссадд	сссссдд!са	ддйддссй	даХсддсдаа	480
сдсдссдсад	ссассйдда	йссдсахса	сасадд!сда	дсадсадсдс	сдссаХсХсд	540
1сдд1с§а§1	ад§1дд1дас	сссддсс1с!	1сдасддсдд	ссасдаХддс	аХсдйдХдд	600
ссса!садсс	с§д1дссдс§	ддХссадссд	агдадсдсд!	дсдссаддсг	дасссд1дсс	660
дсссаддасд	ас!сддсд(д	ссадсддс!с	ассасддса!	ссадсдсдда	сйддсйсд	720
сс§1аддсдс	се.1сдссдсс	дааса(дсса	сддйдддсд	адссдддсад	сассасд!дс	780
адссдсдасд асддсссаса	сда1§1с§с§ дсадсасй!	йсддсдссд са1с1сса!с	айдХсдаса Хсддсдсдсд	ддссдссдах аассддссХс	садссдйдс сдасаддСсс	840 900
ссдассасдс	§<ддсдсс§с	даасдддаас	адсадсд!сд	д.дд1с1дсдс	дХсй!да1д	960
!даа!сдас1	дсддсссаад	дсШсдд(с	!дйсддХдс	сдаХссайс	дассадддсд	1020
!сдас£1с8§	адХаддасдс	саХдйсдсс	дсдассадсс	асадсдссдс	дссдХаасдд	1080
£С£18£1сдс	да!асадсдг	дсдд1адаас	дссадссдс!	сс!сдХсдад	сйддад§1а	1140
д1сдсдаХда	сдд1ддс1сс	дссд1сдадс	адссдадсса	ссассдасдс	ддсда1сдаа	1200
сссйсдаад	сдссдд!сас	сасддсааст	ХсдссдссдХ	адсддссддд	йсддддйс	1260

Claims (5)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Рекомбинантный штамм 2-9ХЬ Асте1оЬае1ег )оНпкопй νΚΡΜ-9312 - продуцент видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса Μ. 1иЬегси1ок1к Н37 Κν (ТБ-антигена), депонирован в ВКПМ ФГУП ГосНИИГенетика.
2. 2. Способ получения видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса МусоЬас1епиш 1иЬегси1ок1к Н37 Κν (ТБ-антигена), характеризующийся тем, что культуру рекомбинантного штамма 2-9ХЬ Асте1оЬас1ег )оНпкопй выращивают на питательной среде при 32°С в течение 2-3 суток, смывают физиологическим раствором, полученную суспензию бактерий центрифугируют, осадок суспендируют в воде при +4°С, обрабатывают раствором ΝαΟΗ до рН 6,0-9,0, через 15-16 ч полученную суспензию центрифугируют, осадок подвергают повторной процедуре обработки раствором ΝαΟΗ, а надосадочную жидкость, содержащую растворенную капсулу бактерий штамма 2-9 ХЬ, нейтрализуют 0,5 N раствором ТХУ до рН 6,0, центрифугируют, к надосадочной жидкости добавляют 0,5 N раствор ТХУ до рН 3,0-3,5, раствор выдерживают 15-16 ч до получения комплекса ТБ-антигена, при этом с порцией осадка, повторно обработанного раствором ΝαΟΗ, проводят нейтрализацию раствором ТХУ с вышеуказанной последовательностью, 1 и 2 растворы с комплексом ТБ-антигена, выпавшим после обработки ТХУ, центрифугируют полученные осадки, содержащие ТБ-антиген, растворяют в ΡΒδ-буфере, растворы объединяют и подвергают очистке путем фракционирования гель-фильтрацией на Сефадексе 0-200 или с помощью ионообменной хроматографии, элюаты содержат очищенный ТБ-антиген с молекулярной массой от 55,0 до 75,0 кДа и наличием углеводов от 20 до 50%.
3. 3. Способ получения видоспецифического гликопротеинового туберкулезного комплекса МусоЬас1епиш 1иЬегси1ок1к Н37 Κν (ТБ-антигена), характеризующийся тем, что культуру рекомбинантного штамма 2-9ХЬ Асте1оЬас1ег)оНпкопй выращивают на питательной среде при 32°С в течение 3 суток, смывают физиологическим раствором, полученную суспензию бактерий центрифугируют, осадок суспендируют в воде при +4°С, обрабатывают раствором №1ОН до рН 6,0-9,0, через 15-16 ч полученную суспензию центрифугируют, осадок подвергают повторной процедуре обработки раствором №1ОН. а надосадочную жидкость, содержащую растворенную капсулу бактерий штамма 2-9 ХЬ, нейтрализуют 0,5 N раствором ТХУ до рН 6,0, добавляют сульфат аммония до 30% насыщения, выдерживают при +4°С, центрифугируют, к надосадочной жидкости добавляют сульфат аммония до 100% насыщения, выдерживают при +4°С, при этом с порцией осадка повторно обработанного раствором №1ОН проводят нейтрализацию с помощью ТХУ и осаждения сульфатом аммония в вышеуказанной последовательности, два осадка, полученные после 100% насыщения сульфатом аммония, растворяют в ΡΒ8 буфере рН 7,0, диализируют против большого объема ΡΒ8 буфера, сконцентрированные растворы, содержащие ТБ-антиген, объединяют и подвергают очистке путем фракционирования гель-фильтрацией на Сефадексе 0-200 или с помощью ионообменной хроматографии, элюаты содержат очищенный ТБ-антиген с молекулярной массой от 55,0 до 75,0 кДа и наличием углеводов от 20 до 50%.
4. 4. Средство для формирования В- и Т-клеточного иммунитета против МисоЬас1егшт 1иЬегси1ок15 Н37 Κν, содержащее видоспецифический гликопротеиновый туберкулезный комплекс (ТБ-антиген) МусоЬас1егшт 1иЬегси1окщ Н37 Κν, продуцируемый штаммом 2-9ХЬ Асте1оЬас1ег ]ойикоип, охарактеризованным в п.1.
5. 5. Средство для диагностики туберкулеза, содержащее видоспецифический гликопротеиновый туберкулезный комплекс (ТБ-антигена) МусоЬас1егшт 1иЬегси1ок1к Н37 Κν, полученный способом по п.2.